CN102520042A - 一种用于检测多巴胺的掺硼金刚石薄膜电极的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种用于检测多巴胺的掺硼金刚石薄膜电极的制备方法，以尖端状钨丝作为基底，在钨丝上沉积掺硼金刚石薄膜，并对金刚石薄膜表面氨基活化处理，然后在掺硼金刚石薄膜上直接制备络氨酸酶修饰层，钨丝通过银膏与导线相连；该掺硼金刚石薄膜电极用作生物探针，利用循环伏安法测定多巴胺含量，实现实时检测多巴胺的活体浓度。本发明的优点是：用于检测多巴胺具有更好的重复性和电化学稳定性，灵敏度高、选择性强，修饰后的BDD电极可以在含有数倍于DA的AA溶液中，把DA、AA的氧化峰有效分离且在比较宽的范围内得到了理想的线性响应关系；极好的抗污染能力及较长的寿命，不会产生钝化污染现象，针状电极更利于外科手术对传感器的植入性操作。

Description

一种用于检测多巴胺的掺硼金刚石薄膜电极的制备方法

技术领域

本发明涉及金刚石薄膜电极和生物传感器领域，特别是一种用于检测多巴胺的掺硼金刚石薄膜电极的制备方法。

背景技术

多巴胺(dopamine，简称DA，)作为下丘脑和脑垂体腺中的重要儿茶酚胺类神经递质，在健康和疾病的控制、预防中起着重要的作用。其含量的改变可导致一些疾病如精神分裂症和帕金森氏症。此外，多巴胺具有兴奋心脏、增加肾血流量的功能，可用于治疗失血性、心源性及感染性休克。因此，对其测定方法的研究在临床应用和相关疾病的诊断方面都具有重要的意义。

传统检测多巴胺的方法主要有微透析法、气相色谱-质谱法、分光光度法、离子色谱法、化学发光法、高效液相色谱法，这些方法一般需要样品的预处理，体积较大，不便于实现体内的在线监测。

DA分子内含有2个容易被氧化的酚羟基，因而具有电化学活性，可用电化学方法测定其含量。

化学修饰电极是指在电极表面涂敷单分子的、多分子的、离子的或聚合物薄膜，从而改变或改善电极原有性质，实现对电极的功能设计，提高电极作为分析敏感元件的选择性和灵敏度。利用其制作的电化学传感器易于操作、价格低廉，倍受分析工作者关注。

生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学和电子技术等多种学科相互渗透成长起来的高新技术。区别于电化学传感器的是利用具有分子识别能力的生物活性物质如细胞膜、酶、抗体和核酸修饰电极，以生物活性单元等作为生物敏感基元，通过各种物理、化学型信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应，然后将反应的程度用离散或连续的电信号表达出来，从而对目标检测物具有高度选择性的检测，优点是修饰电极具有更强的生物兼容，选用适当修饰物还可降低检测电位，提高选择性。并且蛋白质(酶)与电极之间的直接电子传递过程更接近生物氧化还原系统的原始模型，可实现更快的电子传递反应。生物传感器的结构一般由两个部分组成。其一是生物分子识别元件(感受器)，是具有分子识别能力的生物活性物质如组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗体和核酸；其二是信号转换器，主要有电化学电极(如电位、电流的测量)、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管及表面等离子共振器件。

传统的生物传感器电极包括玻碳(glassy carbon，GC)、碳纤维、碳纳米管、碳糊和无定形碳及热解石墨(highly ordered pyrolytic graphite，HOPG)等，在生物传感器领域有着很广泛的应用，尤其是GC电极。这是因为碳素类电极具有低廉、容易制备、形状可控及较宽的电化学势窗等优点。但是这些碳素类电极材料其本身或反应产物易吸附于电极表面，导致电极钝化，灵敏度低、及由于表面处理的不一致性造成的低重复性等缺点。

近年来，硼掺杂的金刚石(boron-doped diamond，BDD)膜以其突出的电化学特性和各种潜在的应用前景引起了科学家们的密切关注。硼掺杂的金刚石(BDD)薄膜电极除了具有金刚石的优异性能如高的物理、化学稳定性和良好的生物兼容性外，还拥有一系列突出的电化学特性：宽电化学视窗、低背景电流、高阻抗和很好的电化学稳定性。这些优势使得BDD可以弥补传统电极在检测多巴胺上的不足。BDD电极符合理想的电流型生物传感器的基底材料的要求。然而，到目前为止，有关利用BDD电极作为电流型生物传感器的基底材料的研究很少。

另外，目前人工合成高纯度、纳米级掺硼金刚石薄膜多采用MPCVD法，且多数采用MPCVD在二维平面衬底上沉积薄膜，这在一定程度上限制了薄膜电极形状，因此传统掺硼金刚石做电极用于检测受其形貌、大小限制，不利于检测的灵活性和灵敏度。主要表现在不利于在脑内植入电极，从而限制了电极检测多巴胺在临床上的应用。

发明内容

本发明的目的是针对上述存在问题，提供的一种灵敏度高、稳定性好的一种用于检测多巴胺的掺硼金刚石薄膜电极的制备方法。

本发明的技术方案：

一种用于检测多巴胺的掺硼金刚石薄膜电极的制备方法，以尖端状钨丝作为基底，在钨丝上沉积掺硼金刚石薄膜，并对金刚石薄膜表面氨基化处理，然后在掺硼金刚石薄膜上直接制备络氨酸酶修饰层，钨丝通过银膏与导线相连。

所述钨丝尖端的制备方法，通过将钨丝一端进行腐蚀而产生尖端，步骤如下：

1)将0.8mm的钨丝用800#砂纸打磨至表面光滑，在丙酮溶液中超声清洗5min；

2)将清洗后的钨丝放置于体积比为1∶1的HF酸与硝酸的混合溶液中进行腐蚀，钨丝垂直悬空放置，避免于容器壁接触，保持时间10min；

3)将腐蚀处理后的钨丝悬空在丙酮溶液中进行超声处理5min，氮气下吹干；

4)将上述钨丝置于含有0.25μm金刚砂的丙酮悬浊液中，金刚沙与丙酮的用量比为0.5mg/ml，超声1h进行预处理，然后用去离子水超声清洗5min，氮气下吹干待用。

所述沉积掺硼金刚石薄膜的方法，将预处理后的钨丝基底放入微波等离子CVD(MPCVD)反应室，反应室的真空抽至5×10^-4Pa以下，基底温度为500-600℃，以氢气作为主气源，把氢气分两路，一路通入混气室，另一路作为载气源，通入丙酮和甲醇的混合溶液中作为碳源，混合溶液中丙酮与甲醇的体积比为9∶1，同时将B₂O₃溶于混合溶液作为硼源，B₂O₃和混合溶液的质量比为1∶100，氢气通过缓慢鼓泡的方式，将含碳、含硼的蒸汽随氢气带入混气室内，氩气和氨气分别进入混气室，沉积工艺步骤如下：

1)形核过程为在钨丝表面形成金刚石原子核，微波功率为3.5kW，H₂与丙酮和甲醇的混合气体的体积比为110∶1，压强为20Torr，时间2min，；

2)生长过程为在钨丝基底上制备掺硼金刚石薄膜，微波功率5kW，Ar、H₂和丙酮与甲醇的混合气体的体积流量比为40∶10∶1，反应总压强为20Torr，时间60Min；

3)氨基修饰过程：经上述步骤后，将功率降至700W，关闭氢气阀，腔室压强抽至1Pa，打开Ar、氨气阀，Ar流量500sccm，氨气流量3sccm，气压20Pa，该过程保持10min；

4)降温过程：关闭氨气阀，在氩气气氛下保持100Torr真空冷却到室温后取出样片，冷却至室温即可得到BDD电极。

所述在掺硼金刚石薄膜电极表面制备络氨酸酶修饰膜，包括以下步骤：

1)将制得的BDD电极在质量百分比浓度为20％的三氟乙酸与二氯甲烷溶剂的混合液中浸泡1h，然后在质量百分比浓度为15％的氨水中浸泡5min，再用去离子水清洗，得到含活化的氨基BDD电极；

2)取0.3mg酪氨酸酶溶解于10μL0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)中，溶液pH为7，将该溶液缓慢地滴加到氨基化的BDD电极表面，直至滴完为止，持续约20min；

3)在上述电极表面滴定10μL浓度为4％的戊二醛水溶液，持续10min，将其置于冰箱中4℃下保持12小时；

4)取出电极后用浓度为0.1M、pH为7的PBS冲洗，将样品放在冰箱中0℃保存备用。

一种所述掺硼金刚石薄膜电极的应用，用作生物传感器的生物探针，利用循环伏安法测定多巴胺含量，实现实时检测多巴胺的活体浓度。

本发明的出发点在于，硼掺杂的金刚石(boron-doped diamond，BDD)薄膜电极具有优异性能如高的物理、化学稳定性和良好的生物兼容性，还拥有突出的电化学特性如宽电化学视窗、低背景电流、高阻抗和很好的电化学稳定性，具备制作高性能检测电极的优势；将电极的结构改良做成丝状，进行适当修饰可应用于体内多巴胺得检测，有望实现临床应用。

本发明的创新之处在于，实现了检测活体多巴胺的浓度。具体表现在以钨丝做基底，在其上生长掺硼金刚石薄膜，利用了掺硼金刚石特性如宽电化学视窗、低背景电流、高阻抗。掺硼金刚石薄膜电极同时具有生物兼容性好，抗污染，高稳定性等优点。用络氨酸酶修饰制作生物电极，可以提高响应时间，还可以降低多巴胺的氧化电位，避开了抗坏血酸(ascorbic acid，AA)的氧化电位，从而降低干扰，提高了灵敏度高。通过对BDD表面进行氨基化处理，使得络氨酸酶更易固化在电极表面，重复检测效果更好。该探针可置于大脑内部，达到对多巴胺实时原位检测，植入大脑内部可以对帕金森患者体内多巴胺浓度进行实时检测。

与现有技术相比，本发明所述的基于掺硼金刚石薄膜电极检测多巴胺的传感器具有明显的优势，具体表现在以下几点：

1)该掺硼金刚石薄膜电极用于检测多巴胺具有更好的重复性和电化学稳定性。

2)灵敏度高，线性范围内检测极限可达2.0×10^-6mol/L。

3)选择性强，修饰后的BDD电极可以在含有数倍于DA的AA溶液中，把DA、AA的氧化峰有效分离开(ΔE可达0.5V)，且在比较宽的范围内得到了理想的线性响应关系。

4)极好的抗污染能力及较长的寿命，掺硼金刚石由于其高的电化学析氧电位，具备自净化功能，不会产生钝化污染现象

5)针状电极更利于外科手术对传感器的植入性操作。

附图说明

图1为MPCVD制备掺硼金刚石薄膜的气路示意图。

图2为掺硼金刚石薄膜SEM照片。

图3为W电极上BDD的金相显微镜照片，(a)、(b)、(c)分别为倍数100、500、1000下的照片。

图4为BDD、碳纤维在0.5MNa₂SO₄缓冲溶液中对1mM[Fe(CN)₆]^2-/[Fe(CN)₆]^3-的在循环伏安曲线。

图5为生物探针结构示意图。

图中：1.BDD电极    2.银浆    3.环氧树脂    4.导线

具体实施方式

实施例：

一种用于检测多巴胺的掺硼金刚石薄膜电极的制备方法，以尖端状钨丝作为基底，在钨丝上沉积掺硼金刚石薄膜，并对金刚石薄膜表面氨基化处理，然后在掺硼金刚石薄膜上直接制备络氨酸酶修饰层，钨丝通过银膏与导线相连，具体制备方法如下。

1.制作尖端钨丝基底结构：

1)将8mm的钨丝用800砂纸打磨至表面光滑，在丙酮溶液中超声清洗5min；

2)将钨丝放置于HF酸与浓硝酸的混合溶液中(V/V＝1∶1)，钨丝垂直悬空放置，避免于容器壁接触，保持时间10min；

3)将钨丝悬空在丙酮溶液中进行超声处理5min，用氮气吹干；

4)钨丝表面预处理：在含0.25μm金刚砂悬浊液的丙酮中超声1h，金刚沙与丙酮比例为0.5mg/ml，再用去离子水超声波清洗5min，在氮气下吹干，上述过程避免钨丝尖端与容器壁的直接接触。

2、掺硼金刚石薄膜的沉积：

将预处理后的灯丝框架结构放入微波等离子CVD(MPCVD)反应室，反应室的气体真空抽至5×10^-4Pa以下，衬底温度500℃-600℃，以氢气作为气源，把氢气分两路，流量均可控，一路通入汇气室，另一路通入丙酮和甲醇的混合溶液(9∶1，V/V)作为碳源，B₂O₂和混合溶液的质量比为1∶100，氢气通过缓慢鼓泡的方式，将含硼的蒸汽随氢气带入反应室内，图1为沉积过程中气路示意图，沉积工艺包括：

1)形核过程：用3.5kW微波功率在H₂和丙酮与甲醇的混合气体中在钨丝基底上形核，体积比为110∶1，气体压强为20Torr，形核时间2min；

2)生长过程：用5kW微波功率在Ar，H2和丙酮与甲醇的混合气氛中，在钨丝基底上制备掺硼金刚石薄膜，流量比为40∶10∶1，反应总压强为20Torr，生长时间为60min；

3)氨基修饰过程：经上述步骤后，功率降至700W，关闭氢气阀，Ar阀，打开真空泵，抽至1Pa，打开Ar、氨气阀，Ar流量500sccm，氨气流量3sccm，气压20Pa，该过程保持10min；

4)降温过程：关闭氨气阀，在氩气气氛下保持100Torr真空冷却到室温后取出样片，逐渐冷却。

掺硼金刚石薄膜的沉积过程中各阶段的工艺参数汇总见表1。

表1

沉积结束后，通过扫描电子显微镜对金刚石薄膜的表面形貌进行观察，得到掺硼金刚石薄膜SEM照片，如图2所示。

在金相显微镜下观察BDD电极表面形貌如图3，(a)、(b)、(c)分别为倍数100、500、1000下的照片，显示：电极表面金刚石排列均匀，较为平整。

分别将BDD、CF(碳纤维)做电极，置于0.5MNa₂SO₄缓冲溶液中对1mM[Fe(CN)₆]^2-/[Fe(CN)₆]^3-的在循环伏安曲线如图4，说明BDD电极比CF有更高的导电活性

3、制备掺硼金刚石薄膜电极表面化学修饰膜：

1)将以上制得的BDD电极经20％三氟乙酸和二氯甲烷混合溶剂中浸泡1h，经15％氨水浸泡5min处理，再用去离子水清洗；

2)取0.3mg酪氨酸酶溶解于20μL0.1M PBS(pH＝7)中，滴到氨基化的BDD电极表面，持续20min，；

3)在电极上滴10μL浓度4％的戊二醛水溶液，持续10min。将其置于冰箱中4℃下过夜；

4)取出用0.1M PBS(pH＝7)冲洗经(3)得到的电极，将样品放在冰箱中0℃保存备用。

用作生物传感器的生物探针结构如图5所示，BDD电极1经固化上络氨酸酶后，晾干后，通过银膏2与导线4相连，绝缘部分涂上环氧树脂3，利用循环伏安法测定多巴胺含量。掺硼金刚石薄膜电极(BDD)在用于检测多巴胺时具有更好的重复性和电化学稳定性。BDD电极在经过两周暴露之后的伏安曲线跟暴露之前相差很小，电极的性质几乎保持不变，而碳纤维电极在经过仅仅一周之后，循环伏安曲线便发生比较明显的变化，表现出一定的不稳定性。BDD对于多巴胺的持续氧化达500h之久，在电极上没有发现侵蚀或失去活性的迹象。

Claims (5)

1.一种用于检测多巴胺的掺硼金刚石薄膜电极的制备方法，其特征在于：以尖端状钨丝作为基底，在钨丝上沉积掺硼金刚石薄膜，并对金刚石薄膜表面氨基化处理，然后在掺硼金刚石薄膜上直接制备络氨酸酶修饰层，钨丝通过银膏与导线相连。

2.根据权利要求1所述用于检测多巴胺的掺硼金刚石薄膜电极的制备方法，其特征在于：所述钨丝尖端的制备方法，通过将钨丝一端进行腐蚀而产生尖端，步骤如下：

1)将0.8mm的钨丝用800#砂纸打磨至表面光滑，在丙酮溶液中超声清洗5min；

2)将清洗后的钨丝放置于体积比为1∶1的HF酸与硝酸的混合溶液中进行腐蚀，钨丝垂直悬空放置，避免于容器壁接触，保持时间10min；

3)将腐蚀处理后的钨丝悬空在丙酮溶液中进行超声处理5min，氮气下吹干；

4)将上述钨丝置于含有0.25μm金刚砂的丙酮悬浊液中，金刚沙与丙酮的用量比为0.5mg/ml，超声1h进行预处理，然后用去离子水超声清洗5min，氮气下吹干待用。

3.根据权利要求1所述用于检测多巴胺的掺硼金刚石薄膜电极的制备方法，其特征在于：所述沉积掺硼金刚石薄膜的方法，将预处理后的钨丝基底放入微波等离子CVD(MPCVD)反应室，反应室的真空抽至5×10^-4Pa以下，基底温度为500-600℃，以氢气作为主气源，把氢气分两路，一路通入混气室，另一路作为载气源，通入丙酮和甲醇的混合溶液中作为碳源，混合溶液中丙酮与甲醇的体积比为9∶1，同时将B₂O₃溶于混合溶液作为硼源，B₂O₃和混合溶液的质量比为1∶100，氢气通过缓慢鼓泡的方式，将含碳、含硼的蒸汽随氢气带入混气室内，氩气和氨气分别进入混气室，沉积工艺步骤如下：

1)形核过程为在钨丝表面形成金刚石原子核，微波功率为3.5kW，H₂与丙酮和甲醇的混合气体的体积比为110∶1，压强为20Torr，时间2min，；

2)生长过程为在钨丝基底上制备掺硼金刚石薄膜，微波功率5kW，Ar、H₂和丙酮与甲醇的混合气体的体积流量比为40∶10∶1，反应总压强为20Torr，时间60Min；

3)氨基修饰过程：经上述步骤后，将功率降至700W，关闭氢气阀，腔室压强抽至1Pa，打开Ar、氨气阀，Ar流量500sccm，氨气流量3sccm，气压20Pa，该过程保持10min；

4)降温过程：关闭氨气阀，在氩气气氛下保持100Torr真空冷却到室温后取出样片，冷却至室温即可得到BDD电极。

4.根据权利要求1所述用于检测多巴胺的掺硼金刚石薄膜电极的制备方法，其特征在于：所述在掺硼金刚石薄膜电极表面制备络氨酸酶修饰膜，包括以下步骤：

1)将制得的BDD电极在质量百分比浓度为20％的三氟乙酸与二氯甲烷溶剂的混合液中浸泡1h，然后在质量百分比浓度为15％的氨水中浸泡5min，再用去离子水清洗，得到含活化的氨基BDD电极；

2)取0.3mg酪氨酸酶溶解于10μL0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)中，溶液pH为7，将该溶液缓慢地滴加到氨基化的BDD电极表面，直至滴完为止，持续约20min；

3)在上述电极表面滴定10μL浓度为4％的戊二醛水溶液，持续10min，将其置于冰箱中4℃下保持12小时；

4)取出电极后用浓度为0.1M、pH为7的PBS冲洗，将样品放在冰箱中0℃保存备用。

5.一种如权利要求1所述掺硼金刚石薄膜电极的应用，其特征在于：用作生物传感器的生物探针，利用循环伏安法测定多巴胺含量，实现实时检测多巴胺的活体浓度。

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