CN102517220A - 黄瓜枯萎病的苗期人工接种方法及其接种物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄瓜枯萎病的苗期人工接种方法及其接种物。本发明提供了一种用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物。本发明所提供的用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物，由包括如下步骤的方法制备得到的：向灭菌后的培养基中加入黄瓜枯萎病菌，于28℃培养13-15天，即得到用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物；所述培养基由土壤、米糠、蔗糖和水组成；所述培养基中所述土壤、米糠、蔗糖和水的质量比为40∶8∶0.5∶12.5-40∶12∶0.7∶17.5。本发明所提供的接种方法适用于黄瓜品种的抗病性鉴定、黄瓜枯萎病菌生理小种分化、致病力的遗传变异等方面的研究。

Description

黄瓜枯萎病的苗期人工接种方法及其接种物

技术领域

本发明涉及黄瓜枯萎病的苗期人工接种方法及其接种物。

背景技术

由半知菌亚门尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum(Schl.)f.s p.cucumerinumowen)侵染引起的黄瓜枯萎病是设施栽培和露地栽培黄瓜上的一种世界性土传病害，常给黄瓜生产造成严重甚至毁灭性损失。在病害防治中，化学防治效果不理想；轮作倒茬虽然有效，但给蔬菜生产的茬口安排带来实际困难；选育和合理利用抗病品种是最经济、安全、高效的措施。而苗期人工接种是枯萎病抗病育种、抗病性遗传以及病菌生理小种鉴定的重要环节。目前，国内外枯萎病苗期接种方法主要有：

(1)胚根法：该接种法简便易行，但由于枯萎病菌侵染产生不出苗种子，而且不出苗种子比率与病原菌致病力及寄主抗病性不成正比，品种间差异小，因此认为胚根接种法所用的刚发根的幼植物体与成苗后的植物体可能有不同的抗病性。

(2)菌土法：该方法与胚根法一样存在枯萎病菌侵染产生不出苗种子而影响抗病性鉴定结果问题。

(3)灌根法：该方法由于人为对根部造成较大伤口，接种后植株发病迅速，但该方法难以检测植株根系分泌物等对抗病性的影响，且对不同植株很难做到伤根均匀，难以保证结果的准确性。

(4)沾根法：该方法拔出的幼苗由于机械损伤而使幼嫩根系出现多处微伤，依靠机械微伤给病菌提供侵入根部的条件以达到接种效果。同样存在灌根法的缺点。

综上所述，上述各种接种方法均存在一定弊端，因此探寻周期短、稳定可靠、能够正确反映品种抗病性的人工接种方法对黄瓜抗枯萎病的抗病性鉴定、生理小种分化研究具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物。

本发明所提供的用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物，由包括如下步骤的方法制备得到的：

向灭菌后的培养基中加入黄瓜枯萎病菌，于28℃培养13-15天，即得到用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物；

所述培养基由土壤、米糠、蔗糖和水组成；所述培养基中所述土壤、米糠、蔗糖和水的质量比为40∶8∶0.5∶12.5-40∶12∶0.7∶17.5。

所述加入黄瓜枯萎病菌的量为3.6×10⁵个孢子/g培养基-4.1×10⁵个孢子/g培养基；

所述黄瓜枯萎病菌为尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum(Schl.)f.sp.cucumerinum owen)。

本发明的另一个目的是提供一种用于接种黄瓜枯萎病菌的培养物。

本发明所提供的用于接种黄瓜枯萎病菌的培养物，由所述用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物和灭菌土组成。

所述接种物和所述灭菌土的质量比为1∶4。

所述黄瓜枯萎病菌为尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum(Schl.)f.sp.cucumerinum owen)。

本发明的又一个目的是提供一种接种黄瓜枯萎病菌的方法。

本发明所提供的接种黄瓜枯萎病菌的方法，包括以下步骤：

将黄瓜幼苗移栽于所述用于接种黄瓜枯萎病菌的培养物中，进行培养，即得到接种了黄瓜枯萎病菌的黄瓜幼苗。

所述黄瓜幼苗为子叶期的黄瓜幼苗。

所述培养是在温度为光照25℃-28℃和黑暗18℃的条件下培养10天-15天。

本发明的又一个目的是提供一种用于培养黄瓜枯萎病菌的培养基。

本发明所提供的用于培养黄瓜枯萎病菌的培养基，所述培养基由土壤、米糠、蔗糖和水组成；所述培养基中所述土壤、米糠、蔗糖和水的质量比为40∶8∶0.5∶12.5-40∶12∶0.7∶17.5。

所述黄瓜枯萎病菌为尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum(Schl.)f.sp.cucumerinum owen)。

所述黄瓜的品种名称为：傲雪、中农12号、中农21号、中农27号、中农203号、强大理想、谷雨07-1、荷兰绿剑、新北京自玉香黄瓜、魔尔优加优九号、北国寒秀、春冠王、中农10号、长春密刺、津春2号或津研2号。

采用本发明的方法接种后10d～15d调查的发病结果与田间成株期自然发病的结果相吻合，而且经多年多次抗病性鉴定，结果表明该方法接种后抗病反应比较稳定、可靠性强。本发明所提供的接种方法适用于黄瓜品种的抗病性鉴定、黄瓜枯萎病菌生理小种分化、致病力的遗传变异等方面的研究。

附图说明

图1为用本发明的接种方法接种后不同品种的病情指数。

图2为用灌根接种法接种后不同品种的病情指数。

图3为用浸根接种法接种后不同品种的病情指数。

图4为用胚根接种法接种后不同品种的病情指数。

图5为用菌土法接种后不同品种的病情指数。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、黄瓜枯萎病的苗期人工接种

方法I

一、菌悬液的制备

将保存于PDA斜面培养基上的黄瓜枯萎病菌，即尖孢镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum owen)(公众可从东北农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是：陈霞，刘东，张艳菊，秦智伟，周秀艳.黄瓜枯萎病株镰孢菌的分离与鉴定。东北农业大学学报，2010，41(7)：37-44)，接种于盛有150mL PL培养液(马铃薯200g，葡萄糖20g，定容至1000mL，灭菌)的锥形瓶中，置于28℃摇床上，以120rpm·min^-1培养7d。培养液经两层纱布过滤，滤液置于离心机中以4，000rpm·min^-1离心10min，倒除上清液，加适量蒸馏水稀释后，用血球计数板测定孢子数，再加水调至接种浓度为1×10⁶个小孢子·mL^-1，备用。

二、培养基配制

称取土壤80g，米糠20g，混匀后加入40g/L蔗糖溶液30mL，搅拌均匀后装于可灭菌的容器中，121℃灭菌20min，即得到用于培养黄瓜枯萎病菌的培养基，所述培养基由土壤、米糠、蔗糖和水组成，土壤、米糠、蔗糖和水的质量比为40∶10∶0.6∶15。

三、黄瓜枯萎病菌在培养基中的培养

向上述步骤二得到的132g培养基中加入50mL上述步骤一得到的浓度为1×10⁶个孢子/mL的黄瓜枯萎病菌悬液(即黄瓜枯萎病菌的加入量为3.8×10⁵个孢子/g培养基)，于无菌条件下充分搅拌均匀后，28℃培养14天，即得到用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物。

四、鉴定材料准备

设长春密刺(2005年购自哈尔滨蔬菜市场)为抗病对照品种，津研2号(2005年购自哈尔滨蔬菜市场)为感病对照品种。2009年以12份黄瓜品种及种质资源作为供试品种(见表1，各供试品种的来源见表2)，种子经5％次氯酸钠溶液消毒10min后，用清水冲洗，放入垫有两层滤纸的培养皿中，然后于恒温培养箱中28℃催芽。待胚根长至0.5cm左右时，将其播于塑料育苗钵内，播种基质为消毒的蛭石营养土(3∶1)，每钵1粒，每品种重复3次，每重复10株苗。20～25℃温室内育苗7天，得到子叶期的黄瓜幼苗。

五、接种

将上述步骤三得到用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物与灭菌土按质量比为1∶4的比例混合制成接种土，装入营养钵中，然后将子叶期的黄瓜幼苗移栽于营养钵中。在温度为光照26℃/黑暗18℃的条件下培养13天。调查发病率及病情指数。同时，以田间自然发病情况为对照。田间鉴定设在自然菌源较多、每年发病较重的温室内进行。

病情分级标准如下：

0级：无病症

1级：胚轴或子叶出现轻微病症，但生长正常

2级：胚轴或子叶出现明显坏死斑，或一片子叶黄化，影响生长

3级：两片子叶黄化，或一片子叶枯死

4级：两片子叶生长僵化，植株部分萎蔫或停止生长

5级：整株萎蔫、倒伏或枯死

计算病情指数，公式为：

抗性评价指标：

种质群体对枯萎病的抗性依苗期病情指数分5级。

六、结果

结果见表1。从人工接种与田间自然发病结果可以看出，两种方法接种后同一品种的抗感类型基本相同，具有明显的相关性。

表112份黄瓜品种及种质资源人工接种与田间自然发病比较

表2表1中12份黄瓜品种的来源

方法II

一、菌悬液的制备

与方法I相同。

二、培养基配制

称取土壤80g，米糠16g，混匀后加入40g/L蔗糖溶液25mL，搅拌均匀后装于可灭菌的容器中，121℃灭菌20min，即得到用于培养黄瓜枯萎病菌的培养基，所述培养基由土壤、米糠、蔗糖和水组成，土壤、米糠、蔗糖和水的质量比为40∶8∶0.5∶12.5。

三、黄瓜枯萎病菌在培养基中的培养

向上述步骤二得到的123g培养基中加入50mL上述步骤一得到的浓度为1×10⁶个孢子/mL的黄瓜枯萎病菌悬液(即黄瓜枯萎病菌的加入量为4.1×10⁵个孢子/g培养基)，于无菌条件下充分搅拌均匀后，28℃培养13天，即得到用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物。

四、鉴定材料准备

与方法I相同。

五、接种

将上述步骤三得到用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物与灭菌土按质量比为1∶4的比例混合制成接种土，装入营养钵中，然后将子叶期的黄瓜幼苗移栽于营养钵中。在温度为光照25℃/黑暗18℃的条件下培养10天。其余方法与方法I相同。

六、结果

与方法I无显著差异。

方法III

一、菌悬液的制备

与方法I相同。

二、培养基配制

称取土壤80g，米糠24g，混匀后加入40g/L蔗糖溶液35mL，搅拌均匀后装于可灭菌的容器中，121℃灭菌20min，即得到用于培养黄瓜枯萎病菌的培养基，所述培养基由土壤、米糠、蔗糖和水组成，土壤、米糠、蔗糖和水的质量比为40∶12∶0.7∶17.5。

三、黄瓜枯萎病菌在培养基中的培养

向上述步骤二得到的141g培养基中加入50mL上述步骤一得到的浓度为1×10⁶个孢子/mL的黄瓜枯萎病菌悬液(即黄瓜枯萎病菌的加入量为3.6×10⁵个孢子/g培养基)，于无菌条件下充分搅拌均匀后，28℃培养15天，即得到用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物。

四、鉴定材料准备

与方法I相同。

五、接种

将上述步骤三得到用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物与灭菌土按质量比为1∶4的比例混合制成接种土，装入营养钵中，然后将子叶期的黄瓜幼苗移栽于营养钵中。在温度为光照28℃/黑暗18℃的条件下培养15天。其余方法与方法I相同。

六、结果

与方法I无显著差异。

实施例2、不同接种方法的比较

2008年采用抗病品种中农10号(购自北京蔬菜市场)、长春密刺和感病品种津春2号(购自天津蔬菜市场)、津研2号，分别用灌根接种法、浸根接种法、胚根接种法、菌土法以及本发明的接种方法进行了几种抗病性鉴定方法比较试验。具体方法如下：

(1)本发明的接种方法：具体方法同实施例1中方法I。

(2)灌根接种法：以灭菌细砂为基质，温室育苗钵育苗，一片真叶期接种。接种时用一硬板片插入植株四周的砂子中数次，以达到伤根的目的。然后在育苗钵内砂子的插孔中倒入在培养液中振荡培养1周的接种液。5d～7d后，再用相同的方法浇灌第2次。

(3)浸根接种法：以灭菌细砂或珍珠岩为基质，温室育苗盘育苗，第一片真叶期将苗拔起，然后将其根部浸于浓度为10⁶个孢子·mL^-1的菌液中1～2秒钟，再将黄瓜苗定植于盛有灭菌细砂或跖石营养土的育苗钵内。

(4)胚根接种法：将胚根1.0cm的种子放入30mL浓度为1×10⁶个孢子·mL^-1菌液中轻轻摇动，浸泡30min后沥除菌液播种。

(5)菌土法：将在PDA培养液中28℃条件下振荡培养1周的接种液与灭菌细砂壤土混合，分装于育苗钵内，然后播种。

接种后置于白天25～28℃，夜晚18℃左右温室内培养。各方法分别于接种后7～20d调查发病情况，记录病株数及病级，单株分级标准同上。计算病情指数。病情分级标准及病情指数的计算方法与实施例1相同。

结果如图1-图5所示，图1为用本发明的接种方法接种后不同品种的病情指数；图2为用灌根接种法接种后不同品种的病情指数；图3为用浸根接种法接种后不同品种的病情指数；图4为用胚根接种法接种后不同品种的病情指数；图5为用菌土法接种后不同品种的病情指数。从图中可见，接种后7d进行第一次调查，结果菌土法和胚根法出苗情况较差，即使出苗也基本未发病。灌根法、浸根法及本发明接种方法接种后7天均已开始发病。接种11天后各方法均发病，其中胚根法接种的各品种发病迅速，进展较快，总体发病较重，但抗病品种和感病品种差异不明显，不能很好地区分抗病品种和感病品种。灌根法由于伤根较严重，发病也普遍较重，抗感差异不明显。菌土法由于部分种子未出苗，因此对试验结果有一定影响。浸根法和本发明的接种方法在接种15天后发病情况大致相近，与田间发病情况大致相同，而且两种方法均能够很好的区分抗病品种与感病品种，但浸根法如果接种量大、接种品种多时需分开逐一进行接种，比较繁琐，而本方法提供的是一种黄瓜幼苗移栽时菌土的配制方法，此方法为黄瓜幼苗提供了一种土壤带菌条件，与生产中土壤带菌自然发病条件相一致，因此本发明的接种方法较适合黄瓜枯萎病抗病性的鉴定。

Claims (10)

1.一种用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物，由包括如下步骤的方法制备得到的：

向灭菌后的培养基中加入黄瓜枯萎病菌，于28℃培养13-15天，即得到用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物；

所述培养基由土壤、米糠、蔗糖和水组成；所述培养基中所述土壤、米糠、蔗糖和水的质量比为40∶8∶0.5∶12.5-40∶12∶0.7∶17.5。

2.根据权利要求1所述的接种物，其特征在于：

所述加入黄瓜枯萎病菌的量为3.6×10⁵个孢子/g培养基-4.1×10⁵个孢子/g培养基；

所述黄瓜枯萎病菌为尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum(Schl.)f.sp.cucumerinum owen)。

3.一种用于接种黄瓜枯萎病菌的培养物，由权利要求1或2所述的接种物和灭菌土组成。

4.根据权利要求3所述的培养物，其特征在于：所述接种物和所述灭菌土的质量比为1∶4。

5.根据权利要求3或4所述的培养物，其特征在于：所述黄瓜枯萎病菌为尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum(Schl.)f.s p.cucumerinum owen)。

6.一种接种黄瓜枯萎病菌的方法，包括以下步骤：

将黄瓜幼苗移栽于权利要求3-5中任一所述的培养物中，进行培养，即得到接种了黄瓜枯萎病菌的黄瓜幼苗。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述黄瓜幼苗为子叶期的黄瓜幼苗。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述培养是在温度为光照25℃-28℃和黑暗18℃的条件下培养10天-15天。

9.一种用于培养黄瓜枯萎病菌的培养基，所述培养基由土壤、米糠、蔗糖和水组成；所述培养基中所述土壤、米糠、蔗糖和水的质量比为40∶8∶0.5∶12.5-40∶12∶0.7∶17.5。

10.根据权利要求9所述的培养基，其特征在于：所述黄瓜枯萎病菌为尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum(Schl.)f.s p.cucumerinum owen)。

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