CN102516416A - 一种肝素酯化物的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肝素酯化物的合成方法，以粉末状的肝素钠、有机酸酐为原料，以吡啶为催化剂，在无水反应器内对肝素进行酯化反应，在肝素分子表面客观上形成高酯化区、低酯化区，对硫酸乙酰肝素表面的电荷进行模拟。依据本合成方法制得的肝素酯化物的表面电荷呈不均匀分布，这恰好与硫酸乙酰肝素表面的电荷分布相似。体外抗瘤活性实验和体内抗转移动物实验表明，本合成方法制得的肝素酯化物具有比原料药增强的抗肿瘤细胞增殖、抗肿瘤细胞转移活性的药理作用。本合成方法具有以下主要优点：1）产率高，收率可达80%左右。2）工艺步骤简单、操作方便、反应过程易于控制，整个生产过程的控制只要求对干燥度、反应温度、反应时间进行控制即可。3）反应后的滤液可回收利用，是环境友好型绿色合成方法。

Description

一种肝素酯化物的合成方法

技术领域

本发明涉及一种化合物的合成方法，具体涉及一种肝素酯化物的合成方法。

背景技术

肝素是一种抗凝抗血栓性药物，分子量在30KDa左右，而低分子肝素通常指平均分子量小于8000Da的肝素降解片断，两种肝素均早已成为临床常用药。而肝素的抗细胞增殖(牛肺动脉平滑肌细胞、肺癌A549细胞、MCF-7细胞等)活性也早已被学术界证实(Liuyinyu，HariG.Gargatol，Antitumor Effect of，Current Cancer Drug Targets[J].2010，10：229-241)。但由于肝素的抗血小板、引发出血等副作用，其抗瘤作用一直处于研究状态，未能作为抗瘤药物在临床得以应用。

蚌埠医学院蒋志文课题组从上世纪90年代初发现激素和生长因子可刺激硫酸乙酰肝素蛋白聚糖小时SPG的合成和分泌(Zhiwen Jiang.J Cell Physiol 1992；153：266)，90年代末离体实验证实HSPG的有抗肿瘤作用。先后在离体实验、荷瘤动物模型上进行了硫酸乙酰肝素蛋白聚糖HSPG、硫酸乙酰肝素HS的抗肿瘤作用和作用机制的研究(Liu H，JiangZW.Acta PHarmacol Sin，2006；S(1)：61)。研究证明：HSPG/HS能强烈抑制肿瘤细胞系的增殖，抑制荷瘤动物瘤体的生长和促发瘤体细胞坏死(刘浩，蒋志文，中国药理学通报，2008，24(5)：421～5)。其抗肿瘤作用机制有：1、HSPG/HS通过诱导肿瘤细胞Casepase 3表达(Western blot)，而诱导凋亡(FCM)(王秀，蒋志文.实用医学杂志，2008，24(13)：2205～7)；2、HSPG/HS通过抑制肿瘤细胞VEGF的表达而抑制肿瘤细胞的血管生成；3、HSPG/HS能抑制处于ERS/UPR肿瘤细胞的GRP78的表达和合成而增强ERS/UPR对细胞凋亡的诱导作用(杨芬，蒋志文。中国药理学通报，2009，25(6)：778～82)；4、HSPG/HS能抑制处于ERS/UPR肿瘤细胞HPSE的表达和合成而降低肿瘤细胞的浸润、转移能力(蒋志文，中国药理学通报，2002，18(1)：79-83)。进入21世纪后把HSPG的抗肿瘤作用转入到抗肿瘤药物研发上，开始设计合成硫酸乙酰肝素类似物，所采用的是与硫酸乙酰肝素分子结构相近的肝素。

肝素和硫酸乙酰肝素同属硫酸化多糖，硫酸乙酰肝素分子链存在着高度硫酸化区、过渡区和低度硫酸化区，三个区域共同完成对细胞生长、分化的调控。而肝素只具有相当于硫酸乙酰肝素的高度硫酸化区，进入血液后主要与血小板、凝血因子结合发挥抗血小板、抗凝血作用，虽具有抗增殖抗转移活性，但一直未能作为抗癌药物应用于临床。

研究显示，肝素可抑制选择素，进而抑制肿瘤细胞黏附，使肿瘤细胞更容易被吞噬，有抗转移的作用。美国最近研究也证实，肝素及其结构修饰物对牛的肺动脉平滑肌细胞的增殖有显著抑制活性。

如果对肝素的结构改造，可将其制备成硫酸乙酰肝素类似物，经体外抗瘤活性检测证明，这种硫酸乙酰肝素类似物具有比原料药肝素增强的抗癌细胞增殖的活性。

目前对肝素结构改造所采用的方法多为均相反应，即肝素乙酰化(或丙酸酯化、丁酸酯化、戊酸酯化、己酸酯化)修饰多采用先在液相均一酯化再选择性脱去部分修饰基团的方法进行。采用固相法进行肝素的乙酰化(或丙酸酯化、丁酸酯化、戊酸酯化、己酸酯化)修饰一直未见有研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种肝素酯化物的合成方法，该方法步骤简单、可控制性好，所合成的肝素酯化物能够满足硫酸乙酰肝素类似物的要求。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种肝素酯化物的合成方法，其特征在于：以肝素钠和有机酸酐为原料，以吡啶为催化剂、以惰性气体为保护剂，在无水反应器内通过酯化反应，制备肝素酯化物。

为能简洁说明问题起见，以下对本发明所述一种肝素酯化物的合成方法均简称为本合成方法。

具体说，本合成方法包括以下工艺步骤：

(1)按1∶(1-10)重量份比将肝素钠与吡啶混合得混合物；

(2)将与肝素钠的重量份比为1∶(1-10)的有机酸酐加入所述混合物中，在室温、常压、惰性气体保护下，搅拌3-10小时进行酯化反应；

(3)以无水乙醇为终止剂终止酯化反应后，过滤得到白色粉末，透析12-48小时后，冷冻干燥得肝素酯化物。

作为本合成方法的优化，所述肝素钠可以采用低分子肝素钠。

所述有机酸酐为乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、戊酸酐、己酸酐等任意酸酐。

所述吡啶可以是任意带氨取代基的吡啶。

所述肝素酯化物既可以是无选择性酯化物也可以是具有部分选择性的酯化物，比如选择性N位乙酰化物。

本合成方法制得的肝素酯化物在PBS缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液)中的pH值应为6.0-7.0，满足人体用药需求，如果所得酯化物不符合该酸度值要求，可以用碱溶液对其处理。

本合成方法中的酯化反应的反应式为：

本合成方法以粉末状的肝素钠、有机酸酐为原料，以吡啶为催化剂，在无水反应器内对肝素进行酯化反应，在肝素分子表面客观上形成高酯化区、低酯化区，对硫酸乙酰肝素表面的电荷进行模拟。所合成的肝素酯化物在PBS缓冲溶液中(10mg/ml)的pH值调整在6.0-7.0之间，满足临床用药的酸度要求。肝素酯化物的pH值，可以用碱水溶液进行调整。

依据本合成方法制得的肝素酯化物的表面电荷恰好与硫酸乙酰肝素表面的电荷分布相似。本合成方法主要为固相合成，可以在固液表面形成高酯化区，而分子链卷曲部分不发生任何化学反应，这种效果是液相反应所不能达到的。体外抗瘤活性实验和体内抗转移动物实验表明，本合成方法制得的肝素酯化物具有比原料药增强的抗肿瘤细胞增殖、抗肿瘤细胞转移活性的药理作用。

本合成方法制备的肝素酯化物，颜色符合药典的要求(药典三部2005)，其主要指标如下：

分子量1000～30000Da，

重金属≤3ppm，

细菌内毒素≤0.11IU/肝素单位。

本合成方法工艺步骤简单、反应条件温和、能耗少、产率高，当反应进行满足条件后，即可使用无水乙醇为终止剂终止酯化反应，反应的可控制性好。本合成方法的工艺步骤(3)得到的滤液主要成分为乙醇、乙酸乙酯、吡啶，加入适量的盐酸进行反应后，可得吡啶盐酸盐结晶(化学试剂)。过滤回收吡啶盐酸盐，对剩余的溶剂可减压蒸馏回收，重复利用。

综上所述，本合成方法具有以下主要优点：

1)产率高，收率可达80％左右。

2)工艺步骤简单、操作方便、反应过程易于控制，整个生产过程的控制只要求对干燥度、反应温度、反应时间进行控制即可。

3)反应后的滤液可回收利用，是环境友好型绿色合成方法。

4)本合成方法制得的肝素酯化物满足硫酸乙酰肝素类似物的要求，具有比原料药增强的抗肿瘤细胞增殖、抗肿瘤细胞转移活性的药理作用。

具体实施方式

下面通过实施例对本合成方法进行进一步具体描述：

实施例1

(1)取低分子肝素钠12g、吡啶12g，加入到干燥的反应器中混合均匀得混合物；

(2)将乙酸酐12g加入上述混合物中，在室温、常压、惰性气体保护下，搅拌10小时进行酯化反应；

(3)加入无水乙醇12g中止反应后，进行过滤得白色粉末，将该白色粉末溶解于去离子水中，装入透析袋透析12小时，冷冻干燥得目标化合物，即肝素酯化物。

得到的肝素酯化物的产率为80％，高效液相色谱检测纯度98％，平均分子量为：12KDa，重金属≤3ppm，细菌内毒素≤0.11IU/肝素单位。

制得的肝素酯化物可以用碱溶液处理，使其在PBS缓冲溶液中的pH值为6.0-7.0，满足人体用药需求。

酯化反应后得到的滤液的主要成分为乙醇、乙酸乙酯、吡啶，加入适量的盐酸后，可得吡啶盐酸盐结晶(化学试剂)。过滤回收吡啶盐酸盐，对溶剂可减压蒸馏回收，重复利用。

实施例2

(1)取肝素钠12g研磨成粉末、吡啶120g，加入到干燥的反应器中混合均匀得混合物；

(2)将丙酐120g加入上述混合物中，在室温、常压、惰性气体保护下，搅拌10小时进行酯化反应；

(3)加入无水乙醇120g中止反应后，进行过滤得白色粉末，然后用无水乙醇洗涤两次，将该白色粉末溶解于600ml去离子水中，装入透析袋透析48小时，冷冻干燥得目标化合物，即肝素酯化物。

得到的肝素酯化物的产率为79％，高效液相色谱检测纯度98％，平均分子量为：8000Da，重金属≤3ppm，细菌内毒素≤0.11IU/肝素单位。

制得的肝素酯化物可以用碱溶液处理，使其在PBS缓冲溶液中的pH值为6.0-7.0，满足人体用药需求。

酯化反应得到的滤液的主要成分为乙醇、乙酸乙酯、吡啶，加入适量的盐酸后，可得吡啶盐酸盐结晶(化学试剂)。过滤回收吡啶盐酸盐，对溶剂可减压蒸馏回收，重复利用。

实施例3

(1)取肝素钠12g研磨成粉末、氨基吡啶60g，加入到干燥的反应器中混合均匀得混合物；

(2)将己酸酐60g加入上述混合物中，在0℃、常压、惰性气体保护下，搅拌6小时进行酯化反应；

(3)加入无水乙醇60g中止反应后，进行过滤得白色粉末，冷冻干燥得目标化合物，即肝素酯化物。

得到的肝素酯化物的产率为80％，高效液相色谱检测纯度98％，平均分子量为：5000Da，重金属≤3ppm，细菌内毒素≤0.11IU/肝素单位。

制得的肝素酯化物可以用碱溶液处理，使其在PBS缓冲溶液中的pH值为6.0-7.0，满足人体用药需求。

酯化反应得到的滤液的主要成分为乙醇、乙酸乙酯、吡啶，加入适量的盐酸后，可得吡啶盐酸盐结晶(化学试剂)。过滤回收吡啶盐酸盐，对溶剂可减压蒸馏回收，重复利用。

以上所述的仅是本发明的三种具体实施方式。具体实施中，所述有机酸酐可以为乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、戊酸酐、己酸酐等任意酸酐。所述吡啶可以是任意带氨取代基的吡啶。所述肝素酯化物既可以是无选择性酯化物也可以是具有部分选择性的酯化物，比如选择性N位乙酰化物。惰性气体采用氦气、氖气等任一种惰性气体均可。

应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出显而易见的若干变换或替代以及改型，这些也应视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种肝素酯化物的合成方法，其特征在于：以肝素钠和有机酸酐为原料，以吡啶为催化剂、以惰性气体为保护剂，在无水反应器内通过酯化反应，制备肝素酯化物。

2.如权利要求1所述的肝素酯化物的合成方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：

（1）按1：（1—10）重量份比将肝素钠与吡啶混合得混合物；

（2）将与肝素钠的重量份比为1：（1—10）的有机酸酐加入所述混合物中，在室温、常压、惰性气体保护下，搅拌3—10小时进行酯化反应；

（3）以无水乙醇为终止剂终止酯化反应后，过滤得到白色粉末，透析12—48小时后，冷冻干燥得肝素酯化物。

3.如权利要求1或2所述的肝素酯化物的合成方法，其特征在于：所述肝素钠为低分子肝素钠。

4.如权利要求1或2所述的肝素酯化物的合成方法，其特征在于：所述有机酸酐为乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、戊酸酐、己酸酐等任意酸酐。

5.如权利要求1或2所述的肝素酯化物的合成方法，其特征在于：所述吡啶为任意带有氨取代基的吡啶。

6.如权利要求1或2所述的肝素酯化物的合成方法，其特征在于：所述肝素酯化物为无选择性酯化物。

7.如权利要求1或2所述的肝素酯化物的合成方法，其特征在于：所述肝素酯化物为具有部分选择性的酯化物。