CN102512667B - 一种胰岛素的脂质复合物及其制备方法和制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胰岛素脂质复合物及其制备方法和制剂。本发明的胰岛素脂质复合物是由胰岛素与脂质材料在含低沸点酸的有机溶剂系统中复合、干燥而成，胰岛素与脂质材料的质量比为1∶3～1∶20，复合率高，稳定性好。本发明还提供了一种胰岛素的油溶液和一种胰岛素的新型囊泡。

Description

一种胰岛素的脂质复合物及其制备方法和制剂
技术领域
本发明涉及一种胰岛素脂质复合物及其制备方法，还涉及包含胰岛素脂质复合物的油溶液及其在制备缓释注射剂和非注射给药途径制剂中的用途，又涉及包含胰岛素脂质复合物的新型囊泡(脂质体)及其在制备非注射给药途径制剂中的用途，属医药制剂技术领域。
背景技术
1、脂质复合物研究进展及背景介绍
1.1复合物的构造特点及形成机制
磷脂复合物是由意大利学者Bombardelli在研究脂质体时发现的，早期磷脂复合物研究涉及的药物大多是含有酚羟基的黄酮或多酚类成分，后期更多的研究证实，除酚羟基外，一些醇羟基、酰胺基或羰基等极性基团均有可能与磷脂或其他脂质材料(如胆固醇、胆酸钠等)的亲水端通过分子间氢键或范德华力等相互作用形成复合物球状体。不论是亲水性药物还是亲脂性药物，只要含有能复合的极性基团，都可形成脂质复合物。脂质复合物的形成，可显著提高药物亲脂性和油溶性。
磷脂复合物的组成、结构与同样由磷脂构成的囊泡(又称脂质体)在构造上明显不同。脂质体是磷脂分子的亲水端向外、疏水端向内形成的双分子膜围成的囊泡结构。而磷脂复合物则是活性成分的极性基团与磷脂的亲水端部位通过分子间相互作用而被固定，将磷脂的亲水部位包裹，而疏水端不参与复合反应，可自由移动，形成一个亲脂性的球状体。
一个脂质体囊泡可能有成百甚至上千个磷脂分子包围而成，双分子膜的外层和内层均为磷脂的亲水端，而中间夹层则为疏水端。对于亲脂性药物，可被包封于双分子膜的夹层中(图中蓝色方块)，包封率通常较高且稳定，不易泄漏；而亲水性药物只能分散在双分子膜围成的囊泡内核或外围，由于药物进入内核比较困难，实际上亲水性药物大多数分布在外围，稳定性较差且易发生泄漏。在粘膜透过性方面，亲脂性药物的脂质体往往明显优于亲水性药物的脂质体。
因此，对于亲水性药物，如先制备脂质复合物提高亲脂性，再制备囊泡，可提高包封率和稳定性，改善粘膜转运特性。
2、胰岛素脂质复合物研究背景及现有技术的缺陷
2.1胰岛素脂质复合物研究背景
胰岛素易受胃酸及消化道各种蛋白水解酶的破坏，且因分子量大难以穿透胃肠粘膜屏障，常规口服制剂无效，皮下注射仍是目前最主要的给药途径，长期频繁的注射患者顺应性差。在过去的几十年中，国内外医药工作者为克服频繁注射的顺应性问题，开展了大量研究，一方面是通过结构修饰，制备中效和长效胰岛素，延长了药效维持时间，减少注射次数，另一方面是通过药剂学技术方法，制备脂质体、纳米粒、微球、微乳或油溶液，提高药物对抗酸碱及生物酶的稳定性、促进药物经上皮粘膜的转运与吸收，为口服、经皮、粘膜、肺部吸入等非注射给药制剂的发展提供释药载体。
由于胰岛素亲脂性差，限制了微粒载体的制备与发展。胰岛素脂质体是国内外报道最多的微粒载体，但由于胰岛素分子量大，亲水性强，药物大多存在于磷脂双分子膜的外围，包封率低，易发生泄漏，对胃肠稳定性及粘膜透过性的改善程度有限；而纳米粒、微球的制备大多是在有机溶剂系统中进行的，而胰岛素难溶于有机溶剂，包封率极低，且仅吸附于微粒表面，给药后药物易发生突释，稳定化效果同样较差；现有文献报道的微乳或自微乳，均将胰岛素溶于水相，无法避免药物与胃酸及生物酶的接触，不利于提高胃肠环境中的稳定性。
胰岛素分子中含有大量的酰氨基、酚羟基、羟基、羰基等极性基团，均有可能与脂质材料的亲水端发生分子间相互作用形成脂质复合物，从而改善其亲脂性，突破微粒载体制备的限制。近年来，关于胰岛素脂质复合物的研究成为国内外关注的热点。但胰岛素的亲脂性较差，同样限制了脂质复合物的制备，国内外文献报道和专利普遍存在复合率低、质量不稳定的缺陷。
2.2现有技术的不足与缺陷
胰岛素由A、B两个肽链组成，分子量接近6千，介于多肽和蛋白质之间。人胰岛素(Insulin Human)A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。胰岛素不溶于水及有机溶剂，但可溶于酸性稀醇、pH7.4的磷酸盐缓冲液、稀酸和稀碱中。
胰岛素中含有大量的可能与脂质材料亲水端发生分子间相互作用的极性基团，具备形成脂质复合物的条件。但胰岛素的蛋白质类结构特征及理化性质特点，使得脂质复合物的制备极其困难，最大的障碍就是复合溶剂的选择。
有机溶剂尤其是非质子传递溶剂有利于复合反应，但胰岛素在有机溶剂中不溶，且有机溶剂有可能导致胰岛素降解或构象变化，因此，单纯的有机溶剂无法制备胰岛素复合物，至今未见文献报道。如果选用pH7.4的磷酸盐缓冲液，虽然胰岛素具有一定的溶解度且质量稳定，但脂质材料不能够溶解成澄清透明的溶液，再加上水的极性太大，制得的复合物包封率极低，且分子间作用力极弱，质量不稳定。沃维汉[沃维汉，重组人胰岛素复合物、其制备方法及包含该复合物的药物组合物，中国专利：01140047，2004-10-06]采用磷酸盐缓冲液为溶剂，将胰岛素和磷脂分别溶于或混悬于水溶液中，混合均匀，冷冻干燥去除水分制备磷脂复合物，结果发现，当磷脂与药物的质量比为25∶1(摩尔比约为185∶1)时，复合率仅21.35％，150∶1(摩尔比约为1110∶1)时复合率为72.0％。
理论上分析，胰岛素含53个酰氨基，4个酚羟基，12个醇羟基，这些基团都有可能与磷脂复合，则1摩尔的药物理论上需要约70摩尔的磷脂(重量比约为1∶10)。通常，为确保药物复合完全，脂质材料的投料量应略高于理论值，按理论量的1.5倍计算，脂质材料最大用量应不超过药物质量的15倍，即磷脂用量应控制在胰岛素质量的15倍以下比较经济合理。但01140047专利技术中，磷脂的质量高达胰岛素的150倍时，仍未能完全复合，提示以水为溶剂复合效率太低。
另一公开文件[R·R·C·New，包含中链单酸甘油酯的疏水性制剂，中国专利：97196069，1999-07-28]被称为Macrosol技术，提供了一种含脂质复合物的胰岛素油溶液，其脂质复合物的制备方法也是将药物与双亲性的脂质材料共同溶于缓冲盐的水相溶剂中，经旋转蒸发或冻干技术除去溶剂，再溶于油相中制得油溶液(或将复合溶液直接与油混合，再进行冷冻干燥)。其确定的胰岛素与磷脂的重量比为1∶1至1∶20，优选1∶2至1∶8，但未提供复合率评价结果。鉴于01140047专利以水为溶剂难以获得高复合率的复合物，不难推测，97196069专利条件制备的复合物，大部分药物可能并未与磷脂复合。
本专利发明人对97196069专利方法进行了验证。首先根据胰岛素复合物在环己烷中易溶、而游离胰岛素不溶的特点，建立了复合率测定方法(HPLC方法定量)。根据97196069专利方法制备胰岛素磷脂复合物，当胰岛素/磷脂质量比为1∶2时，复合率低于8％；质量比为1∶8时，复合率未超过21％；质量比为1∶12时，复合率未超过25％。进一步将胰岛素/磷脂质量比为1∶8和1∶12的复合物溶于中链油中，搅拌制备药物浓度为1.5mg/g的中链油溶液，室温下放置1个月和冰箱(2-8℃)条件下放置3个月，均出现混浊现象。
虽然97196069专利确定的胰岛素/磷脂质量比例与理论值接近，但由于其制备方法中以水为复合溶剂，因此复合率极低，这与01140047专利技术结果相吻合。
综合以上两项专利，以水为溶剂制备胰岛素脂质复合物，复合率低，存在明显缺陷。
后续一些专利或报道，均在97196069基础上对溶剂系统进行了改进，选用含有冰醋酸的乙醇、含有冰醋酸的DMSO、或含有稀盐酸溶液的乙醚等为复合反应的溶剂。与水溶液相比，有机溶剂的极性相对较小，而酸的加入是为了增加胰岛素的溶解度，提高复合效率。本专利发明人也进行了验证试验，结果表明，由于冰醋酸和盐酸的酸性较强，且不易挥除干净，制备过程中胰岛素含量下降约5-10％，贮存过程中含量继续下降至20％或更多。
综上所述，关于胰岛素脂质复合物的制备，现有的专利或文献方法因溶剂系统选择的缺陷导致复合效率低、药物在制备过程中易发生降解、酸性成分或水分的残留影响贮存过程中的质量稳定性。此外，对药物/脂质材料用量比例未经科学优化，最终获得的复合物因复合率低而导致油中溶解度的改善程度有限，制成的油溶液载药量低且贮存过程中易出现混浊等不稳定现象。
发明内容：
本发明提供了一种胰岛素脂质复合物，由胰岛素和脂质材料在含低沸点酸的有机溶剂系统中复合而成，复合物中，胰岛素与脂质材料的质量比为1∶3～1∶15；优选地为1∶4～1∶12；更优选地为1∶5～1∶10。。
本发明的胰岛素脂质复合物，胰岛素可选自天然胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素、重组人胰岛素及各类中、长效胰岛素，优选地为重组人胰岛素；脂质材料选自天然磷脂、合成磷脂、胆甾醇、胆酸及其盐类的一种或它们的混合物，优选的脂质材料选自天然磷脂，优选的天然磷脂选自蛋黄磷脂或大豆磷脂。
本发明的胰岛素脂质复合物，还可包含一种或多种选自抗氧化剂、金属螯合剂和蛋白酶抑制剂的其它成分。
本发明的胰岛素脂质复合物，所使用的复合溶剂为含低沸点酸的有机溶剂，其中，低沸点酸选自三氟乙酸和氯化氢气体中的一种或它们的混合物，有机溶剂为甲醇、四氢呋喃、DMSO、三氯甲烷、二氯甲烷和乙醚中的一种或其混合物。
本发明的胰岛素脂质复合物，可采用如下方法制备：
方法1)取有机溶剂，先加入适量三氟醋酸或通入适量氯化氢气体，再加入胰岛素和脂质材料，搅拌使两者充分复合至形成澄清透明的溶液，旋转蒸法或喷雾干燥除去有机溶剂，残余物干燥即得。
方法2)取有机溶剂，将脂质材料先溶于其中，再加入胰岛素，搅拌条件下缓慢通入适量氯化氢气体或加入适量三氟醋酸，至胰岛素完全溶解形成澄清透明的溶液，常温条件下搅拌或超声处理一定时间，使胰岛素与脂质材料充分复合，旋转蒸法或喷雾干燥除去有机溶剂，残余物经干燥即得。
方法3)将胰岛素溶于含适量三氟乙酸或氯化氢气体的溶剂A中，制成澄清的胰岛素溶液，脂质材料溶于适量的溶剂B中制成澄清的脂质溶液，将胰岛素溶液与脂质溶液混合均匀后，水浴减压旋蒸，再经水泵抽干处理，干燥即得。
方法4)将胰岛素溶于含适量三氟乙酸或氯化氢气体的的溶剂A中，制成澄清的胰岛素溶液，脂质材料溶于适量的溶剂B中制成澄清的脂质溶液，将胰岛素溶液与脂质溶液混合均匀后，在一定温度下水浴减压旋蒸，在溶剂蒸除过程中，分次加入适量的溶剂B，继续旋蒸，水泵抽除溶剂，干燥即得。
上述的方法1)及方法2)中，所述的“有机溶剂”选自甲醇、四氢呋喃和DMSO中的一种或其混合物，优选地为甲醇。三氟乙酸的加入量或氯化氢气体的通入量，以能使加入的胰岛素完全溶解为准，优选地，酸在有机溶剂中的浓度为0.01-0.5％，优选0.05-0.1％。(重量/体积，g/ml)
在上述方法3)及方法4)中，所述的“溶剂A”可选自甲醇、四氢呋喃或DMSO中的任一种溶剂或它们的混合物，优选甲醇；所述的“溶剂B”可选自三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚中的一种或其混合物，优选二氯甲烷。三氯醋酸或氯化氢气体在溶剂A中的浓度约为0.01-0.5％，优选0.05-0.1％。溶剂B的用量约为溶剂A的3-8倍，优选4-6倍。
胰岛素与脂质材料的复合溶液中，胰岛素的浓度应控制在0.5～30mg/ml，优选1.0～10.0mg/ml。“常温条件下搅拌或超声处理一定时间”中的“常温条件”系指控制在15℃～30℃，例如15℃、20℃、25℃或30℃；“一定时间”是指控制在30分钟以内，例如30分钟、20分钟、10分钟或5分钟。“
在本发明的制备方法中，去除有机溶的方法可以是旋转蒸发法，也可以是冷冻干燥法，还可采用其它挥除溶剂的方法，只要能够将溶剂挥除干净，并且不影响药物的稳定性即可。旋转蒸发法去除溶剂时，应在不超过40℃的条件下进行，具体地说，可以是35℃、30℃或25℃。
本发明还提供一种胰岛素油溶液的制剂，其包含本发明所述的胰岛素脂质复合物和油。其中，油选自长链甘油三酸酯(长链油)、中链甘油酸三酯(中链油)、甘油单油酸酯、甘油单甘酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯中的一种或它们的混合物。
本发明的包含胰岛素脂质复合物的油溶液，其特征在于，油中还可任选地加入选地加入一种或多种选自吐温80、司盘20、汴泽、聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremphor RH40)、聚氧乙烯蓖麻油(Cremphor EL35)和Labrosal的乳化剂。
本发明的包含胰岛素脂质复合物的油溶液，其特征在于，油中还可任选地加入一种或多种选自丙二醇、PEG400、Transcutol P中的助乳化剂。
本发明的包含胰岛素脂质复合物的油溶液，药物含量可以是12mg/g，10mg/g，8mg/g，6mg/g，5mg/g，4mg/g，2mg/g或更低。
本发明制备的胰岛素脂质复合物，在制备胰岛素缓释注射剂中的应用。
本发明的包含胰岛素脂质复合物的油溶液，在制备胰岛素口服、经皮、粘膜和肺部吸入等非注射给药制剂中的应用。
本发明还提供了一种胰岛素新型囊泡，其包含本发明的胰岛素脂质复合物和磷脂，还可加入适量的Tween20，Span60等一种或几种混合表面活性剂，平均粒径约为20nm-200nm。
本发明包含胰岛素脂质复合物的新型囊泡，可以是水分散液，还可以经冷冻干燥或喷雾干燥后制成固体粉末。
本发明的包含胰岛素复合物的新型囊泡，在制备胰岛素口服、经皮、粘膜和肺部吸入等非注射给药制剂中的应用。
与现有技术方法相比，本发明的复合物具有以下优点：
1)含低沸点酸的有机溶剂系统作为复合溶剂：复合溶剂中不含水，低沸点的三氟醋酸和氯化氢气体易于蒸除，既为胰岛素的溶解提供了酸性环境，又缩短了有机溶剂挥除时间；选择的有机溶剂可保证胰岛素与脂质材料的复合溶液澄清，其极性可确保胰岛素与脂质材料的复合稳定性，且不影响胰岛素的质量稳定，制得的复合物中无酸性物质或水分残留，复合率在90％以上，制备及贮存过程中药物含量无明显变化。
2)药物/脂质材料用量合理：基于复合溶剂的突破，胰岛素与脂质材料的质量比为1∶3～1∶15，即可获得复合完全的复合物。脂质材料用量与理论推测值相吻合。
3)制备稳定的油溶液：复合物显著改善了胰岛素的油溶性，制得的油溶液不仅载药量高，且稳定性好，长期放置不发生混浊，物理性质和化学性质均较稳定。
4)制备稳定的新型囊泡：复合物显著改善了胰岛素的亲脂性，使药物分布在囊泡的双分子膜夹层中，药物在胃肠液中的稳定性及粘膜转运速率均明显改善。
在本发明中，如果没有特别地指出，本文所用的科学和技术术语以及名称都具有与本发明所属领域普通技术人员常规理解相同的意思；并且，如果没有特别地指出，其中所采用的物质及其含量或比例、装置、仪器、制备条件等都是本领域技术人员所熟知的或者其根据本发明的描述可得知的。
制备实施例
1.前期探索性研究结果
1.1有机溶剂对药物化学性质及空间结构的影响考察
本发明人在前期研究工作中，对不同的有机溶剂进行了系统考察，具体方法如下：取胰岛素溶液(pH7.4PBS)适量，加入适量的甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醚、氯仿，充分混匀放置1小时，氮吹吹干，加入pH7.4的PBS溶液复溶，过滤后进行HPLC测定，以相同浓度的胰岛素对照品PBS溶液为对照，依法测定，计算胰岛素含量的变化，结果显示，甲醇中药物含量无明显变化，最为稳定，其次为四氢呋喃，而乙醇和丙酮则使药物含量下降约5-10％，乙醚下降约15％，乙酸乙酯、氯仿和四氢呋喃中下降更为明显，约30-40％，提示在甲醇和四氢呋喃中胰岛素化学性质比较稳定。此外还考察了DMSO和DMF，由于DMSO和DMF沸点太高，氮吹法难以吹干，因此采用冷冻干燥法去除溶剂，再加入pH7.4的PBS溶液复溶，过滤后同上法进行HPLC测定并计算胰岛素含量，结果显示，DMF使胰岛素含量明显下降，可能与其碱性条件有关，而DMSO质量相对比较稳定。
进一步按上述甲醇、四氢呋喃和DMSO处理方法操作，去除溶剂后用5mM PBS(pH7.4)溶解成含胰岛素0.1mg/ml的供试溶液，照圆二色谱测定法，将供试溶液置于光径0.1cm的石英样品池中，于远紫外区(190nm～250nm)测定，记录二级结构图谱的特征峰峰位及最低椭圆率；另将供试溶液置于1cm的样品池，于近紫外区(250nm～350nm)测定，记录三级结构图谱的特征负峰峰位及最低椭圆率。结果表明，三种溶剂处理后的胰岛素，二级图谱均显示两个负峰，分别在210nm和223nm左右，最低椭圆率分别为-10.63和-8.45左右；三级图谱中均有一个负峰，峰位在274.5nm左右，最低椭圆率约为-2.26。与未经有机溶剂处理的胰岛素PBS结果相比，无明显变化，提示甲醇、四氢呋喃和DMSO不会导致空间结构的改变。
1.2冰醋酸和盐酸的加入对复合物质量的影响
现有文献中，为了使胰岛素形成澄清透明的溶液，大多在有机溶剂中加入冰醋酸或盐酸。
冰醋酸沸点高，旋转蒸发耗时长，随着有机溶剂的挥除，冰醋酸浓度越来越浓，导致胰岛素降解或变性。尤其是最终的复合物中残留的冰醋酸无法去除，会使复合物贮存稳定性变差。这种冰醋酸残留量较高的复合物，即使溶于油溶液中，药物含量仍会明显下降，在最初的24小时含量通常下降。
本发明人曾选用对胰岛素含量没有影响的甲醇为复合溶剂，加入1-5％的冰醋酸，以药物/磷脂质量比为1∶10制备复合物，35℃旋转蒸发法去除溶剂，真空条件下干燥48小时，对制得的复合物进行测定，复合率达98％以上，但气相色谱法测定冰醋酸残留量超出0.5％。制得的复合物在2-8℃条件下贮存4周后，与初始含量相比，胰岛素含量下降约20％。将复合物溶于中链油中，室温放置24小时，与初始含量相比，含量下降约15％。由此提示，冰醋酸的残留对产品稳定性有极为显著的影响。
本发明人进一步用含有稀盐酸的甲醇溶液作为反应溶剂进行试验，35℃旋转蒸发法(温度达到50℃即对胰岛素质量产生明显影响，通常需控制在40℃以下、且时间不宜过长)，结果发现，因引入了一定的水分，去除溶剂更加困难，复合物成形不好。气相色谱法测定盐酸残留量约0.2％，在2-8℃条件下贮存4周后，与初始含量相比，复合物中的胰岛素含量下降约10％。将复合物溶于中链油中，室温放置24小时，与初始含量相比，含量下降约5％。
1.3以甲醇(含0.1％三氟乙酸)-二氯甲烷为复合溶剂的考察
以甲醇(含0.1％三氟乙酸)-二氯甲烷为溶剂，设定药物质量浓度为1.5mg/ml，胰岛素与大豆磷脂的投料比分别为1∶1，1∶3，1∶5，1∶7.5，1∶10，1∶15和1∶20(w/w)。将胰岛素溶于甲醇中，磷脂加入二氯甲烷中，然后将两者混合，旋转蒸发除去溶剂，水浴温度为37℃，氮吹。
照如下方法测定复合率及油中溶解度
复合率(包封率)：利用胰岛素复合物在环己环中易溶，而游离胰岛素不溶于环己环的特征，进行复合率测定。
复合物药物总含量测定：精密称取胰岛素磷脂复合物适量，用含1％冰醋酸的甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试液；另精密称取胰岛素对照品适量，用PBS(pH7.4)溶液溶解制成浓度为1mg/ml的溶液，再用含1％冰醋酸的甲醇稀释成浓度为0.2mg/mL的溶液作为对照液。分别精密量取供试液和对照液各10μL，照HPLC方法，以0.2％TFA∶乙腈＝70∶30为流动相，柱温30℃，流速1mL/min，波长214nm，色谱柱为Agilent ZORBAX 300SB-C8，依法测定，根据峰面积按外标法计算复合中的药物总含量，记为W总。
复合物中与磷脂结合的药物含量测定：精密称取胰岛素磷脂复合物适量(含胰岛素约10mg)，置10mL容量瓶中，加环己烷溶解并定容，摇匀，经0.45μm有机膜滤除未被复合的游离胰岛素，精密量取续滤液2mL于10mL容量瓶中，氮吹除去溶剂，加入含1％冰醋酸的甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，照上述HPLC方法依法测定，按外标法计算溶液中的药物含量，记为W复合。
复合率按下式计算：复合率％＝(W复合/W总)×100％
油中溶解度：分别取适量的胰岛素及磷脂复合物，加入大豆油或中链油，置30℃磁力搅拌器中，搅拌6h使充分混合、溶解，30℃放置24h，观察药物是否析出，如无药物析出，再加适量胰岛素磷脂复合物，同法操作，直至药物析出。取样5mL，用0.45μm滤膜过滤，取续滤液用1％醋酸甲醇稀释适宜倍数，照HPLC依法测定，计算大豆油及中链油中的表观溶解度。
7组复合物测定结果如下表所示：
药物与磷脂比例对复合物的影响
结果表明：药物与磷脂的投料比例对药物的含量、复合率及溶解度影响较为显著。药物的含量随胰岛素在体系中所占比例的降低而增加；当胰岛素与磷脂质量比为1∶5时，两者基本复合完全，但比例大于1∶15时，复合率有下降趋势。在中链油中溶解度随磷脂在体系中所占比例的增加而增加，当两者比例大于1∶7.5时，溶解度趋于稳定。
1.4以甲醇(通入氯化氢气体)为复合溶剂的考察
以甲醇(通入适量氯化氢气体)为溶剂，设定药物质量浓度为2mg/ml，考察胰岛素与大豆磷脂的投料比分别为1∶1，1∶3，1∶5，1∶7.5，1∶10，，1∶15和1∶20(w/w)。将胰岛素和脂质体料一同溶于甲醇中，室温条件下搅拌10分钟使脂质材料和药物溶解至溶液澄清，移至旋蒸瓶中，在35℃条件下旋转蒸发去除溶剂，室温下减压真空干燥12小时以上。照上述3.3项下的方法测定复合率和中链油中溶解度，结果如下：
药物与磷脂比例对复合物的影响
本发明的目的，是选择合适的复合溶剂系统，提高胰岛素与脂质材料的复合效率和质量稳定性。所选择的溶剂系统可同时满足以下条件：1)脂质材料和胰岛素都能够溶解形成澄清透明的溶液；2)系统中不含水分，极性小，有利于胰岛素与脂质材料分子间的复合；3)溶剂系统蒸发效率高，易挥除，无酸性成分或水分残留；4)制备过程中胰岛素性质稳定。
实施例1：含不同比例大豆磷脂的胰岛素复合物的制备
将独立的9份0.2g胰岛素称至锥形小瓶中，分别加入大豆磷脂0.6g、1g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g、2.4g和3.0g，加入含氯化氢气体(浓度0.1％，重量/体积，g/ml)的甲醇溶液20ml，室温条件下搅拌10分钟使脂质材料和药物溶解至溶液澄清，移至旋蒸瓶中，在35℃条件下旋转蒸发去除溶剂，室温下减压真空干燥12小时以上，得药物/磷脂重量比为1∶3～1∶15的9组复合物粉末。
9组复合物经气相色谱法测定，均未见氯化氢气体的残留。
实施例2：含不同比例蛋黄磷脂的胰岛素复合物的制备
将独立的8份0.2g胰岛素称至锥形小瓶中，分别加入蛋黄磷脂0.6g、1g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g、2.4g和3.0g，加入含氯化氢气体(浓度0.1％，重量/体积，g/ml)的甲醇溶液20ml，室温条件下搅拌10分钟使脂质材料和药物溶解至溶液澄清，移至旋蒸瓶中，在35℃条件下旋转蒸发去除溶剂，室温下减压真空干燥12小时以上，得药物/磷脂重量比为1∶3～1∶15的9组复合物粉末。
9组复合物经气相色谱法测定，均未见氯化氢气体的残留。
实施例3：含不同比例大豆磷脂的胰岛素复合物的制备
将独立的9份0.2g胰岛素称至锥形小瓶中，加入甲醇(含0.1％，v/v三氟醋酸)适量，使胰胰岛素浓度控制在10mg/ml～2mg/ml，室温条件下搅拌使脂质材料和药物溶解至溶液澄清；另取大豆磷脂0.6g、1g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g、2.4g和3.0g，加入二氯甲烷适量(约为甲醇用量的3-6倍)，37℃水浴减压旋蒸，旋蒸过程可再次加入二氯甲烷(约为甲醇用量的1-2倍)，基本干燥后，换用水泵抽10min，即得。
9组复合物经气相色谱法测定，均未见三氟醋酸的残留。
实施例4：含不同比例蛋黄磷脂的胰岛素复合物的制备
将独立的9份0.2g胰岛素称至锥形小瓶中，加入甲醇含0.1％，v/v三氟醋酸)适量，使胰胰岛素浓度控制在10mg/ml～2mg/ml，室温条件下搅拌使脂质材料和药物溶解至溶液澄清；另取蛋黄磷脂0.6g、1g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g、2.4g和3.0g，加入二氯甲烷适量(约为甲醇用量的3-6倍)，37℃水浴减压旋蒸，旋蒸过程可再次加入二氯甲烷(约为甲醇用量的1-2倍)，基本干燥后，换用水泵抽10min，即得。
9组复合物经气相色谱法测定，均未见三氟醋酸的残留。
实施例5：含不同比例脱氧胆酸钠的胰岛素复合物的制备
将独立的8份0.2g胰岛素称至锥形小瓶中，分别加入脱氧胆酸钠1g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g、2.4g和3.0g，加入含氯化氢气体(浓度0.1％，重量/体积，g/ml)的四氢呋喃溶液20ml，室温条件下搅拌反应5分钟，移至旋转蒸发仪中，在35℃条件下蒸除溶剂，室温下减压真空干燥12小时以上，得1∶5～1∶15的8组复合物粉末。
8组复合物经气相色谱法测定，均未见氯化氢气体的残留。
实施例6：含不同比例脱氧胆酸钠的胰岛素复合物的制备
将独立的9份0.2g胰岛素称至锥形小瓶中，甲醇(含0.1％，v/v三氟醋酸)适量，使胰胰岛素浓度控制在10mg/ml～2mg/ml，室温条件下搅拌使脂质材料和药物溶解至溶液澄清；另取脱氧胆酸钠0.6g、1g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g、2.4g和3.0g，加入二氯甲烷适量(约为甲醇用量的3-6倍)，37℃水浴减压旋蒸，旋蒸过程可再次加入二氯甲烷(约为甲醇用量的1-2倍)，基本干燥后，换用水泵抽10min，即得。
9组复合物经气相色谱法测定，均未见氯化氢气体的残留。
实施例7：以DMSO代替甲醇制备胰岛素脂质复合物制备
将独立的3份0.2g胰岛素称至锥形小瓶中，分别加入大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱和脱氧胆酸钠各2.0g，加入含氯化氢气体(浓度0.1％，重量/体积，g/ml)的DMSO溶液15ml，室温条件下搅拌反应15分钟，-40℃以下预冻，经冷冻干燥法去除溶剂，得3组复合物粉末。
3组复合物经气相色谱法测定，均未见氯化氢气体的残留。
实施例8：包含胰岛素/磷脂复合物的油溶液
取大豆磷脂酰胆碱1.8g，加入甲醇溶液30ml，搅拌使溶解，加入胰岛素0.2g，通入氯化氢气体至溶液澄清透明，室温条件下搅拌5分钟，35℃条件下旋转蒸发蒸除溶剂，室温下减压真空干燥12小时以上，制得复合物。
分别称取复合物0.3g，共5份，分别加入甘油单油酸酯、中链甘油酸三酯(中链油)、油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯各2.7g，搅拌使溶解，制得载药量为10mg/g的油溶液，过滤即得。
上述油溶液室温放置24小时，溶液澄清，HPLC测定剩余含量，为零时的99.7％，提示药物未发生降解；在2-8℃条件下贮存6个月，溶液澄清，HPLC测定剩余含量，为初始时的99.1％，质量稳定。
实施例9：包含胰岛素/磷脂复合物的油溶液
称取实施例1至4的复合物(均选取药脂比例为1∶10，w/w)，每个实施例各取两份，分别加入中链甘油酸三酯(中链油)和长链甘油酸三酯(长链油)定量至10g，搅拌使溶解，分别制备成载药量为1mg/g、2mg/g、3mg/g和5mg/g的油溶液。
分别加入中链油或长链油定量至10g，制备成8份样品
上述油溶液室温放置24小时，溶液澄清，HPLC测定剩余含量，均为零时的98.5％以上，提示药物未发生降解；于2-4℃贮存6个月，溶液澄清，HPLC测定剩余含量，均为初始时的99.4％以上，质量稳定。
实施例10：包含胰岛素/磷脂复合物的油溶液(含乳化剂)
取中链甘油酸三酯(中链油)10g，共三份，分别加入1g、2g和4g吐温80，混匀，制得含乳化剂的油相；
称取实施例5至7的复合物适量(均选取药脂比例为1∶10，w/w)，共3份，分别加入上述3种不同乳化剂配比的油相各9.45g，搅拌使溶解，制得载药量为5mg/g的油溶液，过滤即得。
上述油溶液室温放置24小时，溶液澄清，HPLC测定剩余含量，均为零时的98.3％以上，提示药物未发生降解；于2-4℃贮存6个月，溶液澄清，HPLC测定剩余含量，均为初始时的97.7％以上，质量稳定。
上述油溶液含有乳化剂，加50倍的水，磁力搅拌3分种可发生乳化，乳化后的平均粒径≤1μm。
实施例11：包含胰岛素/磷脂复合物的油溶液(含乳化剂)
取中链甘油酸三酯(中链油)10g，分别加入Cremphor RH401g、2g和4g，混匀制得3种不同乳化剂配比的油相；
称取实施例2至4的复合物适量(均选取药脂比例为1∶10，w/w)，，共3份，分别加入上述3种不同乳化剂配比的油相各9.12g，搅拌使溶解，制得载药量为8mg/g的油溶液，过滤即得。
上述油溶液室温放置24小时，溶液澄清，HPLC测定剩余含量，均为零时的98.6％以上，提示药物未发生降解；于2-4℃贮存6个月，溶液澄清，HPLC测定剩余含量，均为初始时的99.2％以上，质量稳定。
上述油溶液中含有乳化剂，加50倍的水，磁力搅拌3分种可发生乳化，乳化后的平均粒径均≤1μm。
实施例12：包含胰岛素/磷脂复合物的油溶液(含乳化剂和助乳化剂)
称取实施例1至4的复合物适量(均选取药脂比例为1∶10，w/w)，共4份，按如下处方加入油、乳化剂和助乳化剂，搅拌使溶解，制得载药量为10mg/g的自微乳浓缩液。
加入中链油/长链油(1∶1)溶液至10g
4组油溶液室温放置24小时，溶液澄清，HPLC测定剩余含量，均为零时的98.3％以上；于-4℃贮存6个月，溶液澄清，HPLC测定剩余含量，均为初始时的97.8％以上，质量稳定。
4组油溶液中含乳化剂和助乳化剂，加5-500倍的水、稀盐酸或pH6.8的缓冲液，均可瞬间发生乳化，激光粒度仪测定，乳化后的平均粒径在20～50nm范围内。
实施例13：包含胰岛素/磷脂复合物的囊泡溶液
称取实施例1至3的复合物适量(均选取药脂比例为1∶10，w/w)，至圆底烧瓶中，再加入适量游离磷脂(游离磷脂与复合物中的磷脂量相当)，加入二氯甲烷20ml，使复合物及磷脂溶解，胰岛素浓度控制在1mg/mL-10mg/mL真空旋蒸，水浴温度为37度，待其挥干形成薄膜后，加入10mLPBS溶液水化1h，形成多室囊泡，再通过超声波破碎或者高压均质的方法处理，得到粒径为50nm左右的单室囊泡。
实施例14：包含胰岛素/磷脂复合物的囊泡溶液
称取实施例1至8的复合物适量(均选取药脂比例为1∶10，w/w)，至圆底烧瓶中，加入适量游离磷脂(游离磷脂与复合物中的磷脂量相当)，再加入Tween20或Span60等一种或几种混合表面活性剂适量，加入二氯甲烷20ml，使复合物及磷脂溶解，胰岛素浓度控制在1mg/mL-10mg/mL真空旋蒸，水浴温度为37度，待其挥干形成薄膜后，加入10mLPBS溶液水化1h，形成多室囊泡，再通过超声波破碎或者高压均质的方法处理，得到粒径为50nm左右的单室囊泡。
实施例15：包含胰岛素/磷脂复合物的囊泡粉末
将实施例13和14的囊泡溶液，经冷冻干燥，即得。
试验例
试验例1：含胰岛素复合物的油溶液在胃肠生物酶环境中的稳定性
试验样品：胰岛素溶液(INS)
胰岛素复合物(Phytosome)溶于水中制成混悬液
实施例8-实施例12的油溶液
将试验样品置于含有1％(重量/体积，g/ml)胃蛋白酶的人工胃液，置37℃水浴中孵育，涡旋混匀，1分钟、5分钟和30分钟和60分钟取样0.5ml，加冷的Tris溶液(取Tris试剂6.07g，加水至500ml)0.1ml，涡旋混匀后，离心，10000rpm，5min，取上清液照前述HPLC法依法测定胰岛素残余百分比，结果如下：
试验例2：含胰岛素复合物的囊泡溶液在胃肠生物酶环境中的稳定性
试验样品：胰岛素溶液(INS)
胰岛素普通囊泡(胰岛素代替胰岛素复合物，同法制备)
实施例13的包含复合物的新型囊泡
将试验样品置于含有1％(重量/体积，g/ml)胃蛋白酶的人工胃液，置37℃水浴中孵育，涡旋混匀，1分钟、5分钟和30分钟和60分钟取样0.5ml，加冷的Tris溶液(取Tris试剂6.07g，加水至500ml)0.1ml，涡旋混匀后，离心，10000rpm，5min，取上清液照前述HPLC法依法测定胰岛素残余百分比，结果如下：
 样品   1min   5min   30min   60min
 胰岛素溶液(INS)   0.76％   检测不到   检测不到   检测不到
 胰岛素普通囊泡   53.5-56.1％   33.2-37.4％   22.1-28.6％   11.5-14.7％
 实施例13的囊泡   82.2-85.2％   68.3-72.9％   43.2-45.7％   30.8-33.2％
试验例3：含胰岛素复合物的囊泡溶液Caco-2细胞透过性
试验样品：胰岛素溶液(INS)
胰岛素普通囊泡(胰岛素代替胰岛素复合物，同法制备)
实施例13的包含复合物的新型囊泡
精密量取0.5mL同浓度的胰岛素溶液、胰岛素普通囊泡和胰岛素磷脂复合物囊泡(实施例13)，加至培养在12孔板的Caco-2细胞上，在细胞下面加入1.5mL的HBSS溶液作为接受介质，37度空气浴中孵育，于30、60、120、180、240min取样200μl，HPLC方法测定，计算累计透过量，结果如下：
  样品   累积透过量(％)
  胰岛素溶液(INS)   1.65
  胰岛素普通囊泡   8.70
  实施例13的囊泡   17.52以上
试验例4：胰岛素复合物的油溶液及新型囊包降血糖效果
选用体重200±20g正常雄性大鼠，禁食12h后(过夜)，按60mg/kg剂量腹腔注射10mg/ml的链脲佐菌素柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液(pH4.5左右)，稳定一周，取血糖水平大于16.7mmol/l判定为糖尿病模型。
大鼠试验前禁食一夜，不禁水，实验期间自由饮水。大鼠35只，随机分成5组，按以下分组方案给药，于不同时间点尾尖取血，血糖仪测定血糖值。
第一组：不给药空白对照，
第二组：胰岛素普通囊泡，按剂量70IU/kg口服
第三组：实施例9处方1中链油制备的油溶液，按剂量为70IU/kg口服
第四组：实施例13制备的新型纳米囊泡，按剂量为70IU/kg口服
计算每只动物各个时间点的血糖百分比，以降糖百分比为纵坐标，时间为横坐标，绘制降糖效果曲线。

Claims (35)

1.一种胰岛素脂质复合物，其特征在于，所述的胰岛素脂质复合物由胰岛素和脂质材料复合而成，复合物中胰岛素与脂质材料的质量比例为1:5～1:20，所述复合物的复合率在90％以上，且所述复合物中无酸性物质残留，其中所述无酸性物质残留是指经气相色谱法测定未见酸性物质残留。
2.根据权利要求1的胰岛素脂质复合物，其特征在于，
所述的胰岛素选自天然胰岛素和重组人胰岛素中至少一种；
所述的脂质材料选自天然磷脂、合成磷脂、胆甾醇、胆酸及其盐类中至少一种。
3.根据权利要求1的胰岛素脂质复合物，其特征在于，
所述的胰岛素选自猪胰岛素和牛胰岛素中至少一种；
所述的脂质材料选自天然磷脂、合成磷脂、胆甾醇、胆酸及其盐类中至少一种。
4.根据权利要求1的胰岛素脂质复合物，其特征在于，
所述的胰岛素选自中效胰岛素和长效胰岛素中至少一种；
所述的脂质材料选自天然磷脂、合成磷脂、胆甾醇、胆酸及其盐类中至少一种。
5.根据权利要求2的胰岛素脂质复合物，其特征在于，
所述的胰岛素选自重组人胰岛素，所述的脂质材料选自天然磷脂，并且胰岛素与天然磷脂的质量比为1:5～1:10。
6.根据权利要求1-5中任一项的胰岛素脂质复合物，其特征在于，所述的胰岛素还包含选自抗氧化剂、金属螯合剂或蛋白酶抑制剂中至少一种。
7.根据权利要求1-5中任一项的胰岛素脂质复合物，其特征在于，所述的胰岛素脂质复合物在制备过程中采用含低沸点酸的有机溶剂系统为复合溶剂，其中所述的低沸点酸选自三氟乙酸和氯化氢气体中的一种或它们的混合物。
8.根据权利要求6的胰岛素脂质复合物，其特征在于，所述的胰岛素脂质复合物在制备过程中采用含低沸点酸的有机溶剂系统为复合溶剂，其中所述的低沸点酸选自三氟乙酸和氯化氢气体中的一种或它们的混合物。
9.根据权利要求7的胰岛素脂质复合物，其特征在于，
所述的有机溶剂选自甲醇、四氢呋喃、DMSO、三氯甲烷、二氯甲烷和乙醚中的一种或其混合物。
10.根据权利要求8的胰岛素脂质复合物，其特征在于，
所述的有机溶剂选自甲醇、四氢呋喃、DMSO、三氯甲烷、二氯甲烷和乙醚中的一种或其混合物。
11.一种胰岛素脂质复合物油溶液，其特征在于，含有权利要求1-10中任一项的胰岛素脂质复合物和油。
12.根据权利要求11的胰岛素脂质复合物油溶液，其特征在于，所述的油选自长链甘油三酸酯、中链甘油酸三酯、甘油单油酸酯、甘油单甘酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯中的一种或它们的混合物。
13.根据权利要求11-12中任一项的胰岛素脂质复合物油溶液，其特征在于，所述的油含有乳化剂。
14.根据权利要求13的胰岛素脂质复合物油溶液，其特征在于，所述的乳化剂选自吐温80、司盘20、汴泽、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油和Labrosal中至少一种。
15.根据权利要求11、12和14中任一项的胰岛素脂质复合物油溶液，其特征在于，所述的油中还含有助乳化剂。
16.根据权利要求13的胰岛素脂质复合物油溶液，其特征在于，所述的油中还含有助乳化剂。
17.根据权利要求15的胰岛素脂质复合物油溶液，其特征在于，所述的助乳化剂剂选自丙二醇、PEG400、Transcutol P中至少一种。
18.根据权利要求16的胰岛素脂质复合物油溶液，其特征在于，所述的助乳化剂剂选自丙二醇、PEG400、Transcutol P中至少一种。
19.根据权利要求11-18任一项的包含胰岛素脂质复合物油溶液在制备胰岛素缓释注射剂中的应用。
20.权利要求11-18任一项的包含胰岛素脂质复合物油溶液在制备胰岛素口服、经皮、粘膜和肺部吸入非注射给药制剂中的应用。
21.一种胰岛素新型囊泡，其特征在于，含有权利要求1-10中任一项的胰岛素脂质复合物和磷脂。
22.根据权利要求21的胰岛素新型囊泡，其特征在于，还含有表面活性剂。
23.根据权利要求22的胰岛素新型囊泡，其特征在于，所述的表面活性剂选自Tween20、Span60中至少一种。
24.根据权利要求21-23中任一项的胰岛素新型囊泡，其特征在于，所述的囊泡可以是水分散液，还可以经冷冻干燥或喷雾干燥后制成固体粉末。
25.权利要求21-24中任一项的胰岛素新型囊泡在制备胰岛素口服、经皮、粘膜和肺部吸入非注射给药制剂中的应用。
26.制备权利要求1至10中任一项的胰岛素脂质复合物的方法，包括如下步骤：取有机溶剂，先加入或通入适量的低沸点酸，再加入胰岛素和脂质材料，搅拌使两者充分复合至形成澄清透明的溶液，旋转蒸法或喷雾干燥除去有机溶剂，残余物干燥即得；
该制备方法的有机溶剂可选自甲醇、四氢呋喃或DMSO中的任一种溶剂或它们的混合物；
所述的低沸点酸选自三氟乙酸和氯化氢气体中的一种或它们的混合物。
27.根据权利要求26的方法，其中所述有机溶剂为甲醇。
28.制备权利要求1至10中任一项的胰岛素脂质复合物的方法，包括如下步骤：将脂质材料先溶于有机溶剂中，再加入胰岛素，搅拌条件下缓慢加入或通入适量低沸点酸，至胰岛素完全溶解形成澄清透明的溶液，常温条件下搅拌或超声处理一定时间，使胰岛素与脂质材料充分复合，旋转蒸法或喷雾干燥除去有机溶剂，残余物经干燥即得；
该制备方法的有机溶剂可选自甲醇、四氢呋喃或DMSO中的任一种溶剂或它们的混合物；
所述的低沸点酸选自三氟乙酸和氯化氢气体中的一种或它们的混合物。
29.根据权利要求28的方法，其中所述有机溶剂为甲醇。
30.制备权利要求1至10中任一项的胰岛素脂质复合物的方法，包括如下步骤：将胰岛素溶于含适量低沸点酸的溶剂A中制成澄清的胰岛素溶液，脂质材料溶于适量的溶剂B中制成澄清的脂质溶液，将胰岛素溶液与脂质溶液混合均匀后，水浴减压旋蒸，再经水泵抽干处理，干燥即得；
该制备方法中，溶剂A可选自甲醇、四氢呋喃或DMSO中的任一种溶剂或它们的混合物；溶剂B可选自三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚中的一种或其混合物；
所述的低沸点酸选自三氟乙酸和氯化氢气体中的一种或它们的混合物。
31.根据权利要求30的方法，其中所述溶剂A为甲醇。
32.根据权利要求30-31中任一项的方法，其中所述溶剂B为二氯甲烷。
33.制备权利要求1至10中任一项的胰岛素脂质复合物的方法，包括如下步骤：将胰岛素溶于含适量低沸点酸的溶剂A中制成澄清的胰岛素溶液，脂质材料溶于适量的溶剂B中制成澄清的脂质溶液，将胰岛素溶液与脂质溶液混合均匀后，在一定温度下水浴减压旋蒸，旋蒸过程中分次加入适量的溶剂B，继续旋蒸，水泵抽除溶剂，干燥即得；
该制备方法中，溶剂A可选自甲醇、四氢呋喃或DMSO中的任一种溶剂或它们的混合物；溶剂B可选自三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚中的一种或其混合物；
所述的低沸点酸选自三氟乙酸和氯化氢气体中的一种或它们的混合物。
34.根据权利要求33的方法，其中所述溶剂A为甲醇。
35.根据权利要求33-34中任一项的方法，其中所述溶剂B为二氯甲烷。
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