CN102504101B

CN102504101B - 用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物及其制备方法

Info

Publication number: CN102504101B
Application number: CN201110353394.5A
Authority: CN
Inventors: 贺利民; 贺倩倩; 方炳虎; 曾东平; 刘戎; 汤有志; 苏贻娟
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2011-11-09
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2031-11-09
Also published as: CN102504101A

Abstract

本发明公开了一种用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物及其制备方法。所述聚合物是以乙酰甲喹为模板，以所述模板与功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂聚合得到所述聚合物。本发明所述检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物对乙酰甲喹具有高度交叉反应和显著选择性的分子印迹聚合物，作为分析乙酰甲喹的样品前处理材料有着广泛的应用前景。

Description

用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物及其制备方法

技术领域

本发明属于材料化学技术领域，具体涉及一种用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物及其制备方法。

背景技术

乙酰甲喹(Mequindox，MEQ)是一种喹噁啉类药物，又名“痢菌净”，其化学名为3-甲基-2-乙酰基喹恶啉-1，4-二氧化物或2-乙酰基-3-甲基喹噁啉-1，4-二氧化物，是我国白行研制的一类广谱抗菌药，对许多G⁺、G^-均具有良好的效果，其抗菌机理为抑制菌体的脱氧核糖核酸(DNA)合成，对多数细菌具有较强的抑制作用，对革兰氏阴性菌作用更强，对密螺旋体也有效，对猪痢疾、仔猪下痢有效，对仔猪黄、白痢有效，尤对密螺旋体所致猪血痢有独特疗效，且复发率低，安全性好。乙酰甲喹内服吸收性良好，有一定促生长作用，但是当使用剂量高于临床治疗量3～5倍时、或长时间应用会引起不良反应，甚至死亡，而且该药具有一定的残留毒性，该药物的残留对人类具有潜在的致癌性和产生抗药性的可能，国际上大多数国家将其列为限用药物，因此对其的检测也迅速成为国内外研究的热点。

目前所有乙酰甲喹检测的前处理方法都是采用传统的固相萃取小柱(如C₁₈、HLB等)净化，这种方法缺乏选择性，特异性不强，从而影响整个检测方法的灵敏度和准确定量。

基于类似抗原-抗体反应的分子印迹固相萃取技术具有高选择性和特异性，是一种具有广泛应用前景的固相萃取材料。如果能像抗体一样，合成某些类似抗体的对乙酰甲喹具有高选择性的高分子吸附材料，可大大提高乙酰甲喹检测的灵敏度和准确性。

分子印迹(molecular imprinting)是近年来基于分子识别理论而迅速发展起来的一个新的研究领域，分子印迹技术也被称为制造“塑料抗体”的技术。分子印迹聚合物(molecular imprinting polymers，MIPs)是一类内部具有固定大小和形状的孔穴并具有确定排列功能基团的交联高聚物。因为MIPs是根据印迹分子定做的，因此它具有特殊的分子结构和官能团，能选择性地识别印迹分子。

分子印迹聚合物的制备一般要通过如下三个步骤：

1、功能单体通过与模板分子相互作用(共价或非共价键)，聚集在模板分子周围形成可逆的复合物；

2、功能单体与过量交联剂在致孔剂存在下发生共聚生成高聚物；

3、将模板分子从高聚物中解离出来，在聚合物中就形成了能够识别模板分子的结合位点。

这种印迹聚合物可作为液相色谱的固定相、选择性催化剂、化学传感器的传感元件和固相萃取材料等，在临床药物分析中也有广泛的应用。

目前尚未见任何关于可实际应用于识别乙酰甲喹、可用于检测鉴别乙酰甲喹的分子印迹聚合物的技术报道。

发明内容

本发明的一个目的是克服现有乙酰甲喹的检测前处理方法中固相萃取的技术不足，提供一种能够高选择性和高特异性识别乙酰甲喹、可用于检测鉴定乙酰甲喹的分子印迹聚合物。

本发明的另一个目的是提供一种操作简单、成本低廉的制备上述分子印迹聚合物的方法。

本发明还提供所述分子印迹聚合物的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

提供一种用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物，是以乙酰甲喹为模板，与适宜的功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂，采用本体聚合法、溶液聚合法、原位聚合法、沉淀聚合法或悬浮聚合法或等本领域制备分子印迹聚合物常规方法制备而得。

本发明提供一种制备技术方案是将乙酰甲喹模板、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂在50～80℃热聚合固化制备得到分子印迹聚合物；聚合时间优选为8～48h；所得分子印迹聚合物经粉碎、10％(V/V)乙酸甲醇、甲醇去除模板后，制备得到分子印迹聚合物产品。

为了进一步提高本发明分子印迹聚合物对乙酰甲喹的特异性，本发明人对制备步骤进行优化，包括以下步骤：

(1)采用乙酰甲喹模板、致孔剂和功能单体混合后低温聚合制备得到预聚合物；

(2)往步骤(1)所述预聚合物中加入交联剂和引发剂，在50～80℃热聚合固化制备得到分子印迹聚合物，进一步提高分子印迹聚合物的特异性。

所述加入交联剂和引发剂后的热聚合固化反应时间优选为24h。

更为优选地，本发明针对关键原料、关键步骤进行了大量的实验研究，提供前述步骤(1)所述预聚合物的最优的制备方法是先将乙酰甲喹模板和致孔剂甲醇溶解混合后，再加入功能单体，混合后4℃静置过夜，形成预聚合物。

同时，确定所述乙酰甲喹模板、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂的比例为1mmol∶2～16mmol∶10～40mmol∶3～200mL∶10～60mg；优选的比例为：1mmol∶2～8mmol∶10～25mmol∶4～100mL∶20～50mg；更为优选的比例为1.0mmol∶8.0mmol∶15mmol∶7.5mL∶50mg。

所述功能单体选白丙烯酰胺、丙烯酸、4-乙烯吡啶或2-乙烯吡啶的一种；所述交联剂选白乙二醇二甲基丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯；所述引发剂可选择本领域常用的引发剂，水溶性引发剂或油溶性引发剂都可以实现本发明，如偶氮二异丁腈或过硫酸铵等。

所述致孔剂选白氯仿、甲醇或丙酮的一种。致孔剂在制备技术方案中并没有引起本技术领域技术人员的重视。在申请人早期的技术研究中，曾经采用乙腈作为致孔剂。本发明人长期大量的实验研究结合创造性地分析总结得到，致孔剂一方面要保证模板的充分溶解，另一方面致孔剂种类的选择、用量对制备的分子印迹聚合物强度、表面特性具有重要影响，同时致孔剂对印迹聚合物在使用介质体系中乙酰甲喹的识别也起着非常关键的作用。致孔剂的选择还需要考虑与其他原料共同产生的综合影响，这些因素之间并不相互孤立，而是复杂的交互影响关系。因此本发明在确定原料配伍及适宜的配比和其他的工艺步骤及条件基础上，对致孔剂进行了优化，确定致孔剂为氯仿、甲醇或丙酮，并进一步总结出最好的致孔剂为甲醇。

所述乙酰甲喹模板、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂的比例为1.0mmol∶8.0mmol∶15mmol∶7.5mL∶50mg，致孔剂选用甲醇，并先将乙酰甲喹模板和致孔剂甲醇溶解后，加入功能单体，混合，4℃静置过夜，形成预聚合物。让模板和单体在较低的温度下充分作用，形成预聚合物，防止在加热时模板和单体之间的空间结构和作用位点受到破坏；

在低温(4℃)下，再往预聚合物加入交联剂和引发剂，采用紫外光(365nm)引发，将预聚合物连接成网状，固定，然后在50～80℃热聚合固化，能够更好地制备出对乙酰甲喹具有高度特异性识别的分子印迹聚合物，保证较优的技术效果。

本发明分子印迹聚合物经粉碎、筛分，乙酸甲醇、甲醇去除模板和残留乙酸后，真空干燥得到的产品可作为分析乙酰甲喹的样品前处理材料。

本发明的分子印迹聚合物，经试验检测发现：将该聚合物用于固相萃取净化(200mg/柱)，聚合物结合乙酰甲喹的吸附量约为250μg/g聚合物；自来水、地下和地表水及海水添加乙酰甲喹回收率试验表明，在1～50μg/mL添加水平范围内，乙酰甲喹回收率大于95％；本发明分子印迹聚合物装填的固相萃取小柱，重复使用10次后，乙酰甲喹的回收率仍然大于80％。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的制备方法总结出所述分子印迹聚合物优选的制备方法是按照适宜的配比，采用甲醇作为致孔剂(40℃加热)，将模板加入甲醇，使模板充分溶解，保证制备得到的印迹聚合物特异性识别能力显著增强；然后在低温(4℃)下，让模板和单体充分作用，形成预聚合物，防止在加热时模板和单体之间的空间结构和作用位点受到破坏。再在低温下加入交联剂和引发剂，采用紫外光引发，将预聚合物连接成网状，固定，随后在50～80℃进一步热聚合充分固化，这样可获得更稳定的三维结构和更多的特异性孔穴，提高分子印迹聚合物的特异性；实验证明，本发明的分子印迹聚合物在水及含5％以下甲醇的水溶液中对乙酰甲喹呈现高的亲和性和选择性，回收率大于90％，对乙酰甲喹具有高度选择性，作为分析饲料、动物组织及环境水等基质中的乙酰甲喹的样品前处理材料有着广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例1制备的分子印迹聚合物红外光谱(IR)图；

图2为实施例2制备的分子印迹聚合物红外光谱(IR)图；

图3为乙酰甲喹水溶液介质MIP与NIP处理结果的色谱图比较，其中a代表MIP净化；b代表NIP净化；

图4为饲料空白介质与添加乙酰甲喹饲料介质经MIP处理结果的色谱图，其中a代表饲料空白；b代表MIP小柱净化；

图5为猪场环境空白水及添加乙酰甲喹环境水经MIP处理结果的色谱图，其中a代表猪场环境空白水；b代表MIP小柱净化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，除非特别说明，本发明实施例采用的试剂原料均为常规市购试剂原料。

实施例1用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物的制备

本实施例的分子印迹聚合物，其合成制备步骤如下：

(1)预聚合物的制备

称取0.218g(1mmol)乙酰甲喹模板于试管中，加入20mL甲醇，40℃加热溶解后，加入0.142g(2mmol)丙烯酰胺功能单体，超声处理5min，4℃静置过夜形成预聚合物。

(2)聚合固化

向步骤(1)制备得到的预聚合物中加入乙二醇二甲基丙烯酸酯1.2mL(6mmol)和偶氮二异丁腈30mg，超声5min，冰浴下通氮气2min，密封，60℃水浴聚合24h，得到块状聚合物，该块状聚合物即为本实施例的用于乙酰甲喹检测的分子印迹聚合物。分子印迹聚合物IR图谱见附图1所示。

将上述块状聚合物磨碎，过200目筛，用甲醇反复沉降除去细小颗粒，装入15mL固相萃取柱中，先用10％乙酸甲醇溶液200mL洗涤除去模板乙酰甲喹，流速控制在1mL/min以下，再用40mL甲醇洗涤除去乙酸，置60℃真空干燥箱中干燥12h，置干燥器中保存备用。制备好的颗粒填料与合成的块状聚合物相比，收率达60.5％。

非印迹聚合物(NIP)的制备除不加模板分子外，均按上述方法制备和处理。

实施例2用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物的制备

本实施例的分子印迹聚合物合成制备步骤如下：

(1)预聚合物的制备

称取0.218g(1mmol)乙酰甲喹模板于试管中，加入100mL甲醇，40℃加热溶解后，加入1.136g(16mmol)丙烯酰胺功能单体，超声处理5min，4℃静置过夜，形成预聚合物。

(2)聚合固化

向步骤(1)制备得到的预聚合物中加入乙二醇二甲基丙烯酸酯5.0mL(25mmol)和偶氮二异丁腈60mg，超声5min，冰浴下通氮气2min，密封，60℃水浴聚合24h，得到块状聚合物，该块状聚合物即为本实施例的用于乙酰甲喹检测的分子印迹聚合物，分子印迹聚合物IR图谱见附图2所示。

将上述块状聚合物磨碎，过200目筛，用甲醇反复沉降除去细小颗粒，装入15mL固相萃取柱中，先用10％乙酸甲醇溶液100mL洗涤除去模板乙酰甲喹，流速控制在1mL/min以下，再用20mL甲醇洗涤除去乙酸，置60℃真空干燥箱中干燥12h，置干燥器中保存备用。制备好的颗粒填料与合成的块状聚合物相比，收率达34.8％。

实施例3用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物的制备

本实施例的分子印迹聚合物合成制备步骤如下：

(1)预聚合物的制备

称取0.218g(1mmol)乙酰甲喹模板于试管中，加入15mL氯仿，40℃加热溶解后，加入0.142g(2mmol)丙烯酰胺功能单体，超声处理5min，4℃静置过夜，形成预聚合物。

(2)聚合固化

向步骤(1)制备得到的预聚合物中加入乙二醇二甲基丙烯酸酯2.0mL(10mmol)和偶氮二异丁腈20mg，超声5min，冰浴下通氮气2min，密封，60℃水浴聚合24h，得到块状聚合物，该块状聚合物即为本实施例的用于乙酰甲喹检测的分子印迹聚合物。

将上述块状聚合物磨碎，过200目筛，用甲醇反复沉降除去细小颗粒，装入15mL固相萃取柱中，先用10％乙酸甲醇溶液200mL洗涤除去模板乙酰甲喹，流速控制在1mL/min以下，再用40mL甲醇洗涤除去乙酸，置60℃真空干燥箱中干燥12h，置干燥器中保存备用。制备好的颗粒填料与合成的块状聚合物相比，收率达48.5％。

实施例4用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物的制备

(1)预聚合物的制备

称取0.218g(1mmol)乙酰甲喹模板于试管中，加入25mL丙酮，40℃加热溶解后，在低温下加入0.569g(8mmol)丙烯酰胺功能单体，超声处理5min，4℃静置过夜形成预聚合物。

(2)聚合固化

向步骤(1)制备得到的预聚合物中加入三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯4.6mL(15mmol)和过硫酸铵50mg，超声5min，冰浴下通氮气5min，密封，60℃水浴聚合24h，得到块状聚合物，该块状聚合物即为本实施例的用于乙酰甲喹检测的分子印迹聚合物。

将上述块状聚合物磨碎，过200目筛，用甲醇反复沉降除去细小颗粒，装入15mL固相萃取柱中，先用10％乙酸甲醇溶液200mL洗涤除去模板乙酰甲喹，流速控制在1mL/min以下，再用40mL甲醇洗涤除去乙酸，置60℃真空干燥箱中干燥12h，置干燥器中保存备用。制备好的颗粒填料与合成的块状聚合物相比，收率达40.6％。

实施例5

(1)预聚合物的制备

称取0.218g(1mmol)乙酰甲喹模板于试管中，加入10mL乙腈-水(20∶80，V/V)，40℃加热溶解后，加入0.569g(8mmol)丙烯酰胺功能单体，超声处理5min，4℃静置过夜形成预聚合物。

(2)聚合固化

向步骤(1)制备得到的预聚合物中加入三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯6.2mL(20mmol)和过硫酸铵20mg，超声5min，冰浴下通氮气2min，密封，60℃水浴聚合24h，得到块状聚合物，该块状聚合物即为本实施例的用于乙酰甲喹检测的分子印迹聚合物。

将上述块状聚合物磨碎，过200目筛，用甲醇反复沉降除去细小颗粒，装入15mL固相萃取柱中，先用10％乙酸甲醇溶液200mL洗涤除去模板乙酰甲喹，流速控制在1mL/min以下，再用40mL甲醇洗涤除去乙酸，置60℃真空干燥箱中干燥12h，置干燥器中保存备用。制备好的颗粒填料与合成的块状聚合物相比，收率达46.0％。

实施例6

(1)预聚合物的制备

称取0.218g(1mmol)乙酰甲喹模板于试管中，加入7.5mL甲醇，40℃加热溶解后，在低温下加入0.569g(8mmol)丙烯酰胺功能单体，超声处理5min，4℃静置过夜形成预聚合物。

(2)聚合固化

将上述块状聚合物磨碎，过200目筛，用甲醇反复沉降除去细小颗粒，装入15mL固相萃取柱中，先用10％乙酸甲醇溶液200mL洗涤除去模板乙酰甲喹，流速控制在1mL/min以下，再用40mL甲醇洗涤除去乙酸，置60℃真空干燥箱中干燥12h，置干燥器中保存备用。制备好的颗粒填料与合成的块状聚合物相比，收率达64.5％。

实施例7用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物的应用实验

本实施例选择实施例6制备的分子印迹聚合物(粒度为54μm～75μm)装填于3mL固相萃取空小柱(150mg/柱)中，依次用3mL甲醇、3mL水平衡活化。

本实施例的样品为0.5、2、10及50μg/mL系列浓度的乙酰甲喹水溶液，取2～5mL的样品上样，用3mL水、3mL 20％甲醇洗涤，压干，5mL甲醇洗脱。氮气小心吹干，用蒸馏水溶解，高速离心，用HPLC-UV检测。

实验结果见附图3所示，附图3为乙酰甲喹水溶液介质MIP与NIP处理结果的色谱图比较，其中a代表MIP小柱；b代表NIP小柱；横坐标为时间(分钟)，纵坐标为乙酰甲喹响应值。实验结果表明，系列浓度的乙酰甲喹水溶液在MIP固相萃取小柱上回收率大于95％，在NIP固相萃取小柱上回收率小于10％。聚合物结合乙酰甲喹的吸附量约为250μg/g聚合物，重复使用10次后，乙酰甲喹的回收率仍然大于80％。

进一步通过对本发明实施例制备的分子印迹聚合物(粒度为54μm～75μm)装填于3mL固相萃取空小柱(150mg/柱)用于水溶液中乙酰甲喹的分离、富集比较。实验结果表明，水溶液介质中乙酰甲喹在MIP固相萃取小柱上回收率不大于85％，NIP固相萃取小柱上回收率达30％(实施例1)；水溶液介质中乙酰甲喹在MIP固相萃取小柱上回收率不大于70％，NIP固相萃取小柱上回收率达40％(实施例5)。

实施例1、5及6制备的分子印迹聚合物用于水溶液介质中乙酰甲喹的分离、富集实验表明，实施例6(乙酰甲喹模板、丙烯酰胺功能单体、交联剂、甲醇致孔剂和引发剂的比例为：1.0mmol∶8.0mmol∶15mmol∶7.5mL∶50mg)较实施例1和5具有显著的优势，可作为分析饲料、动物组织及环境水等基质中的乙酰甲喹的样品前处理材料有着广泛的应用前景。实验结果见附图4和附图5所示，附图4为饲料空白介质与添加乙酰甲喹饲料介质经MIP处理结果的色谱图，其中a代表饲料空白；b代表MIP小柱净化。附图5为猪场环境空白水及添加乙酰甲喹环境水经MIP处理结果的色谱图，其中a代表猪场环境空白水；b代表MIP小柱净化。

Claims

1.一种用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物，是以乙酰甲喹为模板，与功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂采用本体聚合法、溶液聚合法、原位聚合法、沉淀聚合法或悬浮聚合法制备得到；其特征在于所述乙酰甲喹模板、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂的比例为1.0mmol﹕8.0mmol﹕15mmol﹕7.5mL﹕50mg；

所述功能单体为丙烯酰胺；

所述交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯；

所述致孔剂为甲醇；

所述引发剂为过硫酸铵。

2.一种权利要求1所述用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）采用乙酰甲喹模板、致孔剂和功能单体混合后低温聚合制备得到预聚合物；

（2）往步骤（1）所述预聚合物中加入交联剂和引发剂，热聚合固化制备得到分子印迹聚合物。

3.根据权利要求2所述用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于步骤（2）所述聚合时间为24h。

4.根据权利要求2所述用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将乙酰甲喹模板和甲醇溶解后，在低温下加入功能单体，混合后4℃静置过夜，形成预聚合物；

（2）在低温下，往步骤（1）所述预聚合物加入交联剂和引发剂，紫外光引发后在50～80℃热聚合固化即得所述分子印迹聚合物；

所述乙酰甲喹模板、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂的比例为1.0mmol：8.0mmol：15mmol：7.5mL：50mg。

5.一种权利要求1所述用于检测乙酰甲喹的分子印迹聚合物的应用，其特征在于应用于制备分析乙酰甲喹的样品前处理材料方面。