CN101513577A

CN101513577A - 三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱及制备方法和应用

Info

Publication number: CN101513577A
Application number: CNA2009100146587A
Authority: CN
Inventors: 杨黄浩; 周文辉; 郭秀春; 林黎明; 王小如
Original assignee: First Institute of Oceanography SOA
Current assignee: First Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2009-03-01
Filing date: 2009-03-01
Publication date: 2009-08-26
Anticipated expiration: 2029-03-01
Also published as: CN101513577B

Abstract

本发明公开了三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱及制备方法和应用。三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，其特征是内底有一石英砂筛板的玻璃小柱中填充有三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒。将三聚氰胺、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯混合分散于甲醇或者乙醇的水溶液中，制得三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒填充于玻璃小柱内，得到三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱。本发明实现了对奶制品中三聚氰胺的高效分离、富集与纯化，与以往普通溶剂萃取法、C₁₈固相萃取法、离子交换固相萃取法等相关技术相比，富集、净化效率高，并且三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱可以重复使用，成本低，可望成为奶制品中三聚氰胺残留前处理的必备的手段。

Description

三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分析化学、食品安全领域，具体地说，是涉及三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱及制备方法和应用，并主要用于奶制品中三聚氰胺残留的高选择性分离、富集和纯化。

背景技术

三聚氰胺(melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料，简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精。由于我国采用估测食品和饲料工业蛋白质含量的方法，导致不法商人将三聚氰胺掺杂在食品或饲料中，以提升食品或饲料检测中的蛋白质含量指标。作为一种常见的化工原料，三聚氰胺被认为毒性轻微，但是长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。2007年，美国爆发宠物食品受污染事件，事后调查表明：掺杂了≤6.6％三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因。2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症，其原因也是奶粉中含有三聚氰胺。2008年10月8日，卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理值：婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，液态奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，含乳15％以上的其它食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。目前，对于奶制品中三聚氰胺残留含量的检测是一个及其复杂的过程，由于奶制品中基质非常复杂，样品的前处理过程非常重要。用固相萃取法对奶制品中的三聚氰胺进行预处理，方法简单、方便、快捷。但是，现有固相萃取小柱均是一次性使用，价格昂贵；三聚氰胺属于强极性化合物，在传统的C₁₈固相萃取小柱上的保留很差；而离子交换固相萃取小柱不能很好地分离三聚氰胺与奶制品中的内源性小分子成分的干扰。同时，普通固相萃取方法预处理的样品由于背景依然较为复杂，必须结合气相质谱联用仪、液相质谱联用仪等，需要专业人员操作，检测费用高昂，无法在常规检测中进行普及。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱及制备方法和应用，以方便、快捷、高效地选择性纯化和富集奶粉、牛奶等奶制品提取液中的三聚氰胺残留，结合高效液相色谱即可实现奶制品中三聚氰胺快速的分析，便于在例行分析检测中普及与推广。

本发明是通过以下技术方案实现的：

三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，其特征是内底有一石英砂筛板的玻璃小柱中填充有三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒。

本发明中三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)首先制备含有三聚氰胺的分子印迹聚合物颗粒：

将三聚氰胺、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基双丙烯酸酯按照1∶6～18∶30～100的比例超声分散于甲醇或者乙醇的水溶液中，在30～80度条件下搅拌过夜；加入偶氮二异丁腈之后，氮吹除氧10分钟密封反应器，在氮气保护下油浴60度反应24小时，得到块状分子印迹聚合物；将块状分子印迹聚合物用研钵磨碎，过100～1000目筛，得到大小为150～13微米且含有三聚氰胺的分子印迹聚合物颗粒；

(2)将上述含有三聚氰胺的分子印迹聚合物颗粒置于含10％乙酸的甲醇溶液中，在索氏提取器中提取48小时以除去三聚氰胺及未反应的化合物；再经丙酮洗涤并反复沉降，滤去丙酮，将获得的沉淀颗粒物真空干燥至恒重，即为三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒；

(3)最后制备三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱：

称取50～1000mg上述三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒，以乙腈为匀浆液填充于底端为石英砂筛板的1～5mL玻璃小柱内，自然凉干或氮气吹干玻璃小柱制得三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱。

以上步骤所述试剂中，三聚氰胺、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基双丙烯酸酯购自Sigma公司，甲醇、乙腈购自Merck公司。

本发明中所述的三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱应用于奶制品中三聚氰胺残留样品提取液的高选择性分离、富集、纯化，其特征包括以下步骤：

(1)将上述三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱依次用水1～10mL、甲醇1～10mL活化，最终用氮气吹干备用；

(2)奶制品三聚氰胺提取液1～5mL滴加至三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，以0.1～0.5mL/min的速度过固相萃取小柱，并用氮气吹干固相萃取小柱；

(3)依次用去离子水1～10mL和甲醇1～10mL淋洗固相萃取小柱，流速为0.1～0.5mL/min，并用氮气吹干固相萃取小柱；

(4)最后用1～10mL含5％～50％浓氨水的甲醇洗脱，流速为0.1～0.5mL/min，收集洗脱液；

(5)洗脱液氮吹浓缩至干，用甲醇定容至1mL，洗脱液用高效液相色谱仪测定三聚氰胺的含量。

本发明所制得的三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒是具有一定大小、形状和的特定的功能基团的高分子聚合物颗粒，对三聚氰胺的分子结构具有特定的“记忆”功能。所制备的三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱实现了对奶制品中三聚氰胺的高效分离、富集与纯化，与以往普通溶剂萃取法、C₁₈固相萃取法、离子交换固相萃取法等相关技术相比，富集、净化效率高，并且三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱可以重复使用，成本低，可望成为奶制品中三聚氰胺残留前处理的必备的手段。

具体实施方式

本发明的三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，其特征是内底有一石英砂筛板的玻璃小柱中填充有三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒。取50～1000mg的上述三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒，以乙腈为匀浆液填充于底端为石英砂筛板的玻璃小柱内，自然晾干或用氮气吹干玻璃小柱制得三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱。玻璃小柱的容积为1～5mL。

上述三聚氰胺、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯为分析纯试剂，最佳比例范围为1∶9～15∶40～80，分子印迹聚合物颗粒大小范围最佳为100～30微米，石英砂筛板最佳孔径范围为10～20微米。

实施例1.

一.三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱制备：

(1)含有三聚氰胺的分子印迹聚合物颗粒的制备：

将三聚氰胺、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基双丙烯酸酯按照1∶12∶60的比例超声分散于50％的甲醇水溶液中；50度条件下搅拌过夜；加入偶氮二异丁腈之后，氮吹除氧10分钟密封反应器，在氮气保护下油浴60度反应24小时，得到块状分子印迹聚合物；将块状分子印迹聚合物用研钵磨碎，过400目筛，得到颗粒大小为35微米且含有三聚氰胺的分子印迹聚合物颗粒；

(2)聚合物颗粒中三聚氰胺的洗脱：

将上述含有三聚氰胺的分子印迹聚合物颗粒置于含10％乙酸的甲醇溶液中，在索氏提取器中提取48小时，除去三聚氰胺及未反应的化合物；经丙酮洗涤并反复沉降，滤去丙酮，将获得的沉淀颗粒物真空干燥至恒重，即为三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒；

(3)三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱的制备：

称取100mg上述三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒，以乙腈为匀浆液填充于底端为石英砂筛板的1mL玻璃小柱内，自然凉干或氮气吹干玻璃小柱制得三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱。

二.三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱应用于奶粉中三聚氰胺残留样品提取液的高选择性分离、富集、纯化：

(1)0.5克奶粉加入甲醇5mL，漩涡振荡一分钟，超声提取30分钟。以10000转每分钟离心5分钟，上清液作为奶粉提取液；

(2)三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱依次用水2mL、甲醇2mL活化，用氮气吹干备用；

(3)奶制品三聚氰胺提取液1mL滴加至三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，以0.25mL/min的速度过固相萃取小柱，用氮气吹干固相萃取小柱；

(4)依次用去离子水2mL和甲醇2mL淋洗固相萃取小柱，流速为0.25mL/min，用氮气吹干固相萃取小柱；

(5)最后用3mL含10％浓氨水的甲醇洗脱，济速为025mL/min，收集洗脱液；

(6)洗脱液氮吹浓缩至干，用甲醇定容至1mL，洗脱液用高效液相色谱仪测定三聚氰胺的含量。

所制得的固相萃取小柱对奶粉中的三聚氰胺具有专一选择性地富集与纯化，对奶粉样品提取液加标2.5mg/L三聚氰胺，三聚氰胺的回收率为91.2％。

实施例2.

一.三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱制备：

(1)含有三聚氰胺的分子印迹聚合物颗粒的制备：

将三聚氰胺、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基双丙烯酸酯按照1∶9∶45的比例超声分散于75％乙醇的水溶液中；60度条件下搅拌过夜；加入偶氮二异丁腈之后，氮吹除氧10分钟密封反应器，在氮气保护下油浴60度反应24小时，得到块状分子印迹聚合物；将块状分子印迹聚合物用研钵磨碎，过200目筛，得到颗粒大小为75微米且含有三聚氰胺的分子印迹聚合物颗粒；

(2)聚合物颗粒中三聚氰胺的洗脱：

将上述含有三聚氰胺的分子印迹聚合物颗粒置于含10％乙酸的甲醇溶液中，在索氏提取器中提取48小时以除去三聚氰胺及未反应的化合物；再经丙酮洗涤并反复沉降，滤去丙酮，将获得的沉淀颗粒物真空干燥至恒重，即为三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒；

(3)三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱的制备：

称取1000mg上述三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒，以乙腈为匀浆液填充于底端为石英砂筛板的5mL玻璃小柱内，自然凉干或氮气吹干玻璃小柱制得三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱。

二.三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱应用于液态奶中三聚氰胺残留样品提取液的高选择性分离、富集、纯化：

(1)1mL液态奶加入乙腈3mL，静置3分钟，以10000转每分钟离心5分钟，上清液作为液态奶提取液。

(2)三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱依次用水5mL、甲醇5mL活化，用氮气吹干备用；

(3)奶制品三聚氰胺提取液3mL滴加至三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，以0.5mL/min的速度过固相萃取小柱，用氮气吹干固相萃取小柱；

(4)依次用去离子水5mL和甲醇5mL淋洗固相萃取小柱，流速为0.5mL/min，用氮气吹干固相萃取小柱；

(5)最后用5mL含10％浓氨水的甲醇洗脱，流速为0.5mL/min，收集洗脱液；

所制得的固相萃取小柱对液态奶中的三聚氰胺具有专一选择性地富集与纯化，对液态奶样品提取液中加标2.5mg/L三聚氰胺，三聚氰胺的回收率为95.1％。

Claims

1、三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，其特征是内底有一石英砂筛板的玻璃小柱中填充有三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒。

2、如权利要求1所述的三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，其特征在于上述三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒大小为150～13微米。

3、如权利要求1所述的三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，其特征在于上述石英砂筛板的孔径范围为10～20微米。

4、三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)首先制备含有三聚氰胺的分子印迹聚合物颗粒：

将三聚氰胺、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基双丙烯酸酯按照1∶6～18∶30～100的比例超声分散于甲醇或者乙醇的水溶液中，在30～80度条件下搅拌过夜；加入偶氮二异丁腈之后，氮吹除氧10分钟密封反应器，在氮气保护下油浴60度反应24小时，得到块状分子印迹聚合物；将块状分子印迹聚合物用研钵磨碎，过100～1000目筛，得到大小为150～13微米，含有三聚氰胺的分子印迹聚合物颗粒；

(3)最后制备三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱：

5、如权利要求4所述的三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于上述甲醇或者乙醇的水溶液是甲醇或者乙醇与水的体积比为1～10∶1的混合溶液。

6、三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱应用于奶制品提取液中三聚氰胺残留样品的选择性分离、富集、纯化，其特征包括以下步骤：

(1)将上述三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱依次用水1～10mL、甲醇1～10mL活化，用氮气吹干备用；

(2)奶制品三聚氰胺提取液1～5mL滴加至三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，以0.1～0.5mL/min的速度过固相萃取小柱，用氮气吹干固相萃取小柱；

(3)依次用去离子水1～10mL和甲醇1～10mL淋洗固相萃取小柱，流速为0.1～0.5mL/min，用氮气吹干固相萃取小柱；

7、如权利要求6所述三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱应用于奶制品提取液中，其特征在于上述奶制品三聚氰胺提取液制备方法是1克奶粉加入甲醇5～10mL，漩涡振荡一分钟，超声提取30分钟，以10000转每分钟离心5分钟，上清液作为固态奶提取液。

8、如权利要求6所述三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱应用于奶制品提取液中，其特征在于上述奶制品三聚氰胺提取液制备方法是1mL液态奶，加入乙腈1～5mL以除去蛋白，并以10000转每分钟离心5分钟，上清液作为液态奶提取液。