CN102499389A

CN102499389A - 可溶性鱿鱼墨黑色素的制备方法及其用途

Info

Publication number: CN102499389A
Application number: CN2011103261813A
Authority: CN
Inventors: 陈士国; 郭欣; 叶兴乾; 薛长湖
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-10-24
Filing date: 2011-10-24
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2031-10-24
Also published as: CN102499389B

Abstract

本发明公开了一种可溶性鱿鱼墨黑色素的制备方法，包括以下步骤：1)、将鱿鱼墨囊中的墨汁悬浊液用0～4℃的冰水洗涤，离心后去除上清液；得沉淀；2)、将步骤1)所得的沉淀真空冷冻干燥，得不溶性黑色素粗品；3)、将所述不溶性黑色素粗品溶于碱液中进行超声处理，处理时间为30～90分钟，不溶性黑色素粗品与碱液的料液比为：1g不溶性黑色素粗品/20～80ml碱液，碱液为摩尔浓度为0.1～1.0mol/L的NaOH溶液；4)、将步骤3)的所得物离心，取上清液真空冷冻干燥，得可溶性鱿鱼墨黑色素。本发明还同时提供了上述可溶性鱿鱼墨黑色素的用途：作为抗氧化剂。

Description

可溶性鱿鱼墨黑色素的制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及黑色素的制备方法，具体的说，涉及一种从鱿鱼墨中制备可溶性黑色素的方法，及其抗氧化活性的应用。

背景技术

鱿鱼是头足类海洋动物中枪乌贼和柔鱼的俗称。北太平洋鱿鱼是最重要的鱿鱼加工品种之一，年加工量在15-30万吨之间，其墨囊大约占整个由于体重的1.3％。鱿鱼加工后产生的大量废弃物尤其是墨囊却未得到很好的利用，也给环境造成了较大的污染。同时，鱿鱼墨中含多种生物活性物质如多肽片断、酸性多糖，酪氨酸酶等。因此，从鱿鱼墨中提取黑色素不仅提高鱿鱼加工过程中废弃物的综合利用率，从而为开发新的海洋生物活性物质开拓一个新的来源，更能促进我国远洋渔水产品加工废弃物的高值化利用的发展，具有重要的经济和社会意义。

黑色素是一种不溶于水的生物大分子多聚体，广泛存在于动植物体内。黑色素在动、植物和人体内，具有光吸收、还原性和金属螯合性质，同时具有诸多功能性质，如清除自由基功能，光保护作用，抗肿瘤活性，抗菌和抗病毒活性，黑色素还能够与一些抗生素类药物作用，减少此类药物对人体的损伤作用。

目前国内外对茶叶、乌骨鸡、黑米、泥鳅鱼中的黑色素都有所研究，其中在黑木耳的中黑色素的提取过程中，有部分文献报导其利用在碱液中进行超声提取技术提取黑色素，但是其目的是为了提取，而不是将不溶性黑色素降解成可溶性黑色素。不同来源的黑色素都有一定的特异性，具有很大应用潜力。鱿鱼墨黑色素的制备方法主要有离心法、酸水解、碱水解和酶解法，但制备的黑色素均不可溶于水。使用在碱液中进行超声处理从鱿鱼墨中获得可溶性黑色素的制备方法尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可溶性鱿鱼墨黑色素的制备方法，本发明克服了以往制备得到的黑色素不溶的特点，提供了一种简单，环保，高产率的方法，制得的鱿鱼墨可溶性黑色素具有溶解率高的特点，可用于生产具有抗氧化、清除自由基功能的保健食品、功能食品或药品。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种可溶性鱿鱼墨黑色素的制备方法，包括以下步骤：

1)、将鱿鱼墨囊中的墨汁悬浊液用0～4℃的冰水洗涤，离心后去除上清液(该上清液中含有杂质)；得沉淀；

2)、将步骤1)所得的沉淀真空冷冻干燥，得不溶性黑色素粗品；

3)、将所述不溶性黑色素粗品溶于碱液中进行超声处理，处理时间为30～90分钟，不溶性黑色素粗品与碱液的料液比为：1g不溶性黑色素粗品/20～80ml碱液，碱液为摩尔浓度为0.1～1.0mol/L的NaOH溶液；

4)、将步骤3)的所得物离心，取上清液真空冷冻干燥，得可溶性鱿鱼墨黑色素。

作为本发明的可溶性鱿鱼墨黑色素的制备方法的改进：将所得的可溶性鱿鱼墨黑色溶于水后，过超滤膜。超滤膜的截留分子量分别为10kDa和50kDa。

作为本发明的可溶性鱿鱼墨黑色素的制备方法的进一步改进：步骤3)中的超声功率为200～950w。

本发明还同时提供了利用上述制备方法制备所得的可溶性鱿鱼墨黑色素的用途：作为抗氧化剂。

在本发明的步骤3)中：最佳处理时间为60分钟，最佳料液比为：1g不溶性黑色素粗品/50ml碱液。

本发明使用水洗，离心法制得不溶性黑色素后，在碱液中进行超声处理使不溶性黑色素降解，从而获得可溶性黑色素。本发明的可溶性鱿鱼黑色素具有抗氧化功能，可用于保健食品、功能食品和药物中。用量一般为每KG保健食品、功能食品和药物(口服药物)中添加1～2g的可溶性鱿鱼墨黑色素，常用添加量可为1.2g。

本发明以鱿鱼墨为原料，利用离心后在碱液中超声降解获得可溶性黑色素。采用的原料丰富，制备得到的黑色素含量高，制备过程简单，无污染，所得产物可应用于抗氧化功能的保健食品、功能食品或药物的制备，具有极高的应用潜力和经济、社会意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是可溶性黑色素不同组分对超氧自由基活性抑制率图；

图1中：

0.1mol/L NaOH，分子量小于10Kda的组分；

0.1mol/L NaOH，分子量处于10-50Kda的组分；

0.1mol/L NaOH，分子量大于50Kda的组分；

0.5mol/L NaOH，分子量小于10Kda的组分；

0.5mol/L NaOH，分子量处于10-50Kda的组分；

0.5mol/L NaOH，分子量大于50Kda的组分；

1.0mol/L NaOH，分子量小于10Kda的组分；

1.0mol/L NaOH，分子量处于10-50Kda的组分；

1.0mol/L NaOH，分子量大于50Kda的组分。

图2是溶性黑色素不同组分对羟基自由基活性抑制率图；

图2中：

0.1mol/L NaOH，分子量小于10Kda的组分；

0.1mol/L NaOH，分子量处于10-50Kda的组分；

0.1mol/L NaOH，分子量大于50Kda的组分；

0.5mol/L NaOH，分子量小于10Kda的组分；

0.5mol/L NaOH，分子量处于10-50Kda的组分；

0.5mol/L NaOH，分子量大于50Kda的组分；

1.0mol/L NaOH，分子量小于10Kda的组分；

1.0mol/L NaOH，分子量处于10-50Kda的组分；

1.0mol/L NaOH，分子量大于50Kda的组分。

图3是0.5mol/lNaOH处理后的可溶性黑色素不同组分红外光谱图；

上图是波长为4000-2000cm^-1的红外光谱图；

下图是波长为2000-400cm^-1的红外光谱图；

图3中：

——分子量小于10Kda的组分；

分子量处于10-50Kda的组分；

分子量大于50Kda的组分。

具体实施方式

注：以下实施例1中所指的冰水均为0～4℃的冰水。

实施例1、一种可溶性鱿鱼墨黑色素的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、将冰冻后鱿鱼墨囊在室温下解冻(新鲜的鱿鱼墨囊无需此解冻步骤)，挤压去除墨囊表的皮膜和内部网状膜，可获得墨汁悬浊液。将墨汁悬浊液依次进行如下的洗涤工作：

A、将墨汁悬浊液20g用2体积倍的冰水(即，冰水为墨汁悬浊液体积的2倍)，0-4℃浸泡过夜，8000r/min离心20分钟，去除上清液(该上清中含有杂质)；

B、在所得的沉淀中加入两倍体积的冰水(即，冰水为沉淀体积的2倍)，8000r/min离心20分钟，去除上清液；

C、重复上述步骤B 2～3次；

D、所得的沉淀中加入20体积倍的冰水；8000r/min离心20分钟，去除上清液；

E、重复上述步骤D 4～6次。

2)、将步骤E所得的沉淀真空冷冻(10pa的真空度、-55℃的温度)干燥至恒重，得不溶性黑色素5.487g。

3)、取3份不溶性黑色素粗品(每份2.0g)，分别进行如下处理：

将2.0g不溶性黑色素溶于100ml的NaOH溶液中(NaOH的浓度分别为0.1mol/L、0.5mol/L、1mol/L)；于950W的功率下超声作用60min；

4)、将步骤3)的3种所得物分别进行以下操作：

冷却至室温，加浓度为1mol/l HCl溶液中和至PH7.0；8000r/min离心20分钟，所得的上清液进行真空冷冻干燥，得3种可溶性鱿鱼墨黑色素。

具体为：

步骤3)中溶于浓度为0.1mol/L的NaOH溶液的，所得的可溶性鱿鱼墨黑色素成为黑色素A，其重量为0.701g。

步骤3)中溶于浓度为0.5mol/L的NaOH溶液的，所得的可溶性鱿鱼墨黑色素成为黑色素B，其重量为0.728g。

步骤3)中溶于浓度为1.0mol/L的NaOH溶液的，所得的可溶性鱿鱼墨黑色素成为黑色素C，其重量为0.815g。

5)、将步骤4)所得到的3种黑色素(即黑色素A～C)分别进行以下操作：

溶于100ml水，过10kDa和50kDa的超滤膜，分别得到10kDa以下，10kDa-50kDa，50kDa以上的三种组分；具体如表1所述：

表1、不同的黑色素所对应的组份名称和重量

上述A-1、A-2、A-3、B-1、B-2、B-3、C-1、C-2、C-3的溶解度均大于10g/L；而步骤2)所得的不溶性黑色素和现有方法制备而得的鱿鱼墨黑色素(为不溶性)，其溶解度均小于0.2g/L。

实施例2、可溶性黑色素组分对超氧自由基活性抑制作用：

将实施例1所得的9种组分分别进行如下操作：

用PBS缓冲液(0.05mol/L，pH 7.8)配制浓度分别0、50、100、150、200、300、350、400ug/ml的溶液，各加400uL于小试管中，然后加入连苯三酚(0.625umol/L)50uL，迅速加入550uL鲁米诺(1mmol/L，用0.1mol/L NaCO₃配制)，拉上盖，开始测鲁米诺化学发光值C。每组实验都要做三个平行。抑制率(％)＝(C0-C)/C0×100％(C0为未加抗氧化剂的空白的发光值，C为加入抗氧化剂后的发光值)。

根据浓度与抑制率的关系曲线(图1)，可以得抑制率达50％时样品的浓度即为IC₅₀结果见表2，表明各可溶性黑色素组分对超氧自由基都有清除效果，特别是使用0.5mol/l NaOH和1mol/l NaOH降解得到的可溶性黑色素，分级组分后，分子量在10KDa-50KDa及50KDa以上的组分，O₂ ^·-的IC50值很低，处于50ug/ml-80ug/ml之间，显示出很强的超氧阴离子自由基(O₂ ^·-)清除效果。

表2不同浓度碱降解后的各组分可溶性黑色素对O₂ ^·-的IC50值

实施例3、可溶性黑色素组分对羟基自由基活性抑制作用：

将实施例1所得的9种组分分别进行如下操作：

用PBS缓冲液(0.05mol/L，pH 7.8)配制浓度分别0、50、100、150、200、250、350、450、550ug/ml的溶液，各加550uL于小试管中，再加入0.2mL抗坏血酸(2mmol/L)，0.4mL CuSO₄(2mmol/L)，50uL鲁米诺(0.1mmol/L，用0.1mol/L NaCO₃配制)，0.2mL酵母悬浮液(75mg/mL)，混匀后温育30min。再加入0.6mL H₂O₂(6.8mmol/L)启动反应。拉上盖，开始测鲁米诺化学发光值C。抑制率(％)＝(C0-C)/C0×100％(C0为未加抗氧化剂的空白的发光值，C为加入抗氧化剂后的发光值)。

根据浓度与抑制率的关系曲线(图2)可以得发光值抑制率达50％时样品的浓度IC₅₀，结果见表3，表明各可溶性黑色素组分对羟基自由基都有清除效果，特别是使用0.5mol/l NaOH和1mol/l NaOH降解得到的可溶性黑色素，分级组分后，分子量在10KDa-50KDa及50KDa以上的组分，对·OH的IC₅₀值很低，处于130ug/ml-170ug/ml之间，显示出很强的羟基自由基(·OH)清除效果。

表3不同浓度碱降解后的各组分可溶性黑色素对OH的IC50值

实施例4：

可溶性鱿鱼墨黑色素红外光谱分析：取清除自由基活性较好的B-1，B-2，B-3三个组分，扫描600～4000cm^-1波长范围的红外光谱吸收值(红外图谱见图3)，三种组分红外图谱相似，其中在3200-3500cm^-1区出现的共振强吸收宽峰，为吲哚和吡咯结构单元中的NH(3200cm^-1)和OH(3600cm^-1)的伸缩振动产生；2950cm^-1处的吸收为3000～2800cm^-1区脂肪族C-H的伸缩振动。1710cm^-1处为COOH中的C＝O伸缩振动；1610-1690cm-1为芳香环中C＝C和C＝N的弯曲振动以及C＝O的伸缩振动(非羧酸集团)；1580cm-1为离子化了的COO-中的C＝O振动；1250cm^-1处的振动显示含酚羟基和羧羟基；1037.1cm-1、1236cm-1处吸收为1300～1000cm-1区的C-O、C-N伸缩振动吸收，说明含有羟基结构。

通过进一步比较发现，B-2组分和B-3组分相对B-1，其活性基团破坏较低，这与上一部分中自由基清除试验中B-2，B-3组分具有较强的自由基清除活性是一致的。

对比例1、将实施例1的步骤3)改成：取1份不溶性黑色素粗品(2.0g)，进行如下处理：将2.0g不溶性黑色素溶于60ml 1.25mol/L NaOH溶液中；其余同实施例1。

步骤4)所得的可溶性鱿鱼墨黑色素0.526g。

对比例2、将实施例1的步骤3)改成：取1份不溶性黑色素粗品(2.0g)，进行如下处理：将2.0g不溶性黑色素溶于100ml 0.5mol/L NaOH溶液中；于600W或者180W的功率下超声作用80min；其余同实施例1。

步骤4)所得的可溶性鱿鱼墨黑色素0.515g(对应600W)、0.415g(对应180W)。

对比例3、对实施例1步骤2)所得的不溶性黑色素的超氧自由基活性抑制作用进行测定：用PBS缓冲液(0.05mol/L，pH 7.8)配制浓度分别0、50、100、150、200、300、350、400ug/ml的溶液，各加400uL于小试管中，然后加入连苯三酚(0.625umol/L)50uL，迅速加入550uL鲁米诺(1mmol/L，用0.1mol/LNaCO₃配制)，拉上盖，开始测鲁米诺化学发光值C。每组实验都要做三个平行。抑制率(％)＝(C0-C)/C0×100％(C0为未加抗氧化剂的空白的发光值，C为加入抗氧化剂后的发光值)。

可以得其IC₅₀为≥450ug/ml，表明不溶性黑色素对超氧自由基的清除效果与上述可溶性黑色素组分相比较低，而且其不溶性(其溶解度小于0.2g/L)更是大大降低了其在食品中的应用价值。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.可溶性鱿鱼墨黑色素的制备方法，其特征是包括以下步骤：

1)、将鱿鱼墨囊中的墨汁悬浊液用0～4℃的冰水洗涤，离心后去除上清液；得沉淀；

3)、将所述不溶性黑色素粗品溶于碱液中进行超声处理，处理时间为30～90分钟，不溶性黑色素粗品与碱液的料液比为：1g不溶性黑色素粗品/20～80ml碱液，所述碱液为摩尔浓度为0.1～1.0mol/L的Na0H溶液；

2.根据权利要求1所述的可溶性鱿鱼墨黑色素的制备方法，其特征是：将所得的可溶性鱿鱼墨黑色溶于水后，过超滤膜。

3.根据权利要求2所述的可溶性鱿鱼墨黑色素的制备方法，其特征是：所述超滤膜的截留分子量为10kDa和50kDa。

4.根据权利要求1、2或3所述的可溶性鱿鱼墨黑色素的制备方法，其特征是：所述步骤3)中的超声功率为200～950w。

5.如权利要求1～4中任一制备方法制备所得的可溶性鱿鱼墨黑色素的用途：作为抗氧化剂。