CN112679627B - 从褐藻中提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从褐藻中提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，是以经济褐藻为原料，以复合酶辅助和热水抽提相结合提取岩藻聚糖硫酸酯的方法，通过限制复合酶的加入量为每100g褐藻粉添加滤纸酶活61.5~75.06 FPU、内切纤维素酶活81~115.64 CMCU及纤维二糖酶活750.8~1117.34 CBU及限制提取流程的具体参数，可有效打破褐藻细胞壁结构对于岩藻聚糖硫酸酯的保护，在不填加蛋白酶、果胶酶且不使用微波、超声等辅助手段的情况下，所提取的岩藻聚糖硫酸酯的纯度可达87.13%、硫酸基含量20.25%。
Description
技术领域
本发明涉及一种岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，尤其是一种从褐藻中提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法。
背景技术
岩藻聚糖硫酸酯因具有多重生物活性而成为全球研究开发的焦点，其分布于褐藻细胞壁基质中，是一种具有较为复杂成分的水溶性大分子多糖。目前，岩藻聚糖硫酸酯的提取方法普遍基于其溶于热水而不溶于乙醇的特性，主要有热水提取法、酸碱提取法、微波/超声波辅助提取法、酶辅助提取法等。
中国专利号为CN201410213096.X的发明专利公开了一种褐藻多糖硫酸酯的提取方法，用pH12的氢氧化钠溶液在搅拌条件下处理干海带30min，再用盐酸调节pH至1.5-2，搅拌8h，再经过醇沉，减压干燥后得到褐藻多糖硫酸酯，提取率为0.3%。此方法效率偏低，对产物结构破坏较大，提取过程消耗大量的酸碱试剂，带来较大环境压力。
中国专利号为CN201110348242.6的发明专利公开了一种基于微波化学的褐藻活性多糖的提取方法，该方法采用了微波预处理（微波功率为每千克褐藻物料1kW~每千克褐藻物料10kW）结合水提分级醇沉工艺，以干海带粉为原料时，褐藻糖胶得率为4%，其中硫酸根含量为6.9%。此法设备成本较高，且微波作用过度会使糖苷键断裂，造成提取损失及结构破坏。
酶辅助提取法因过程条件温和、环境影响小、对多糖结构破坏小等优势而得到关注。Alboofetileh等（International journal of biological macromolecules，2019，124:131-137）对比了多种辅助提取方法，发现以单一纤维素酶辅助提取褐藻Nizamuddinia zanardinii岩藻聚糖硫酸酯的纯度并不理想（总糖含量为62.04%，硫酸基含量为20.06%）。付燕红等（食品工业，2019，40(08):49-53）报道了复合酶辅助提取海带岩藻聚糖硫酸酯工艺，其复合酶组成为：纤维素酶1.0%、中性蛋白酶0.5%、复合蛋白酶0.5%、果胶酶1.0%，此文发现复合酶法在提取得率与产物纯度上较传统水提法和超声波法均有大幅度提高，但是此方法所得产物的纯度和硫酸根含量仍然偏低，提取产物纯度43.7%，硫酸根含量11.05%。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种从褐藻中提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法。
本发明的技术解决方案是：一种从褐藻中提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，依次按照如下步骤进行：
（1）将新鲜的褐藻洗净50~60℃烘干，搅碎成粉末过50~60目筛，得到褐藻粉；
（2）将pH为4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液加入褐藻粉中，边加边搅拌，得到溶液Ⅰ，所述褐藻粉质量与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比为1g：15~20ml；
（3）将溶液Ⅰ升温至48~50℃，加入复合酶酶解1~2h，得到溶液Ⅱ，所述复合酶的加入量为每100g褐藻粉添加滤纸酶活61.5~75.06 FPU、内切纤维素酶活81~115.64 CMCU及纤维二糖酶活750.8~1117.34 CBU；
（4）将溶液Ⅱ升温至95~100℃，进行热水抽提3~5h，得到溶液Ⅲ；
（5）将溶液Ⅲ在4500~5000r/min下离心15min，得到上清液Ⅰ；
（6）向上清液Ⅰ中加入体积浓度为90~100%的乙醇至终浓度为20~30%，4500~5000r/min离心15min，得到上清液Ⅱ；
（7）向上清液Ⅱ中加入体积浓度为90~100%的乙醇至终浓度为60~70%，4500~5000r/min离心15min，得到沉淀Ⅰ；
（8）将沉淀Ⅰ用5~6倍体积的水溶解，加入体积浓度为90~100%的乙醇至终度为20~30%，4500~5000r/min离心15min，得到上清液Ⅲ；
（9）向上清液Ⅲ中加入体积浓度为90~100%的乙醇至终浓度为60~70%，4500~5000r/min离心15min，得到沉淀Ⅱ；
（10）将沉淀Ⅱ用无水乙醚清洗后冷冻干燥，得到产品。
本发明是以经济褐藻为原料，以复合酶辅助和热水抽提相结合提取岩藻聚糖硫酸酯的方法，通过限制复合酶的加入量为每100g褐藻粉添加滤纸酶活61.5~75.06 FPU、内切纤维素酶活81~115.64 CMCU及纤维二糖酶活750.8~1117.34 CBU及限制提取流程的具体参数，可有效打破褐藻细胞壁结构对于岩藻聚糖硫酸酯的保护，在不填加蛋白酶、果胶酶且不使用微波、超声等辅助手段的情况下，所提取的岩藻聚糖硫酸酯的纯度可达87.13%、硫酸基含量20.25%。
附图说明
图1是本发明实施例1所得产品与单糖标准品的高效液相色谱图。
图2是本发明实施例1所得产品的傅立叶红外变换光谱图。
图3是本发明实施例1所得产品的体外抗氧化指标示意图。
具体实施方式
实施例1：
本发明的一种从褐藻中提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，依次按照如下步骤进行：
（1）将新鲜的海带洗净去除表面的泥沙、盐和甘露醇等杂质，50℃烤箱烘干，搅碎成粉末过60目筛，得到海带粉；
（2）将pH为4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液加入50g海带粉中，边加边搅拌，得到溶液Ⅰ，所述海带粉质量与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比为1g：17ml；
（3）将溶液Ⅰ升温至50℃，加入复合酶酶解1.5h，得到溶液Ⅱ，所述复合酶的加入量为滤纸酶活34.15 FPU、内切纤维素酶活49.2 CMCU及纤维二糖酶活467.05 CBU；
可将外购的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶按照体积比为1：4~6混合制成复合酶，其中，纤维素酶制剂的蛋白质含量为157.61mg/ml；滤纸酶活（FPU）为17.19FPU/ml，内切纤维素酶活（羧甲基纤维素CMC法）为6.27CMCU/ml，纤维二糖酶活（CBU）为8.75CBU/ml。β-葡萄糖苷酶制剂的蛋白质含量为4.5mg/ml：滤纸酶活为3.39FPU/ml，内切纤维素酶活为8.59 CMCU/ml，纤维二糖酶活为91.66CBU/ml。检测方法为Ghose T K. Measurement of cellulaseactivities[J]. Pure and applied Chemistry, 1987, 59(2): 257-268.
如将纤维素酶和β-葡萄糖苷酶按照体积比1：5复配，所得复合酶各项活力分别为：5.69 FPU/ml、8.20CMCU/ml、77.84CBU/ml，按照每50g海带粉添加复合酶6ml即可；
（4）将溶液Ⅱ升温至98℃，进行热水抽提3h，得到溶液Ⅲ；
（5）将溶液Ⅲ在5000r/min下离心15min，得到上清液Ⅰ；
（6）向上清液Ⅰ中加入体积浓度为100%的乙醇至终浓度为20%（v/v），5000r/min离心15min，得到上清液Ⅱ；
（7）向上清液Ⅱ中加入体积浓度为100%的乙醇至终浓度为60%（v/v），5000r/min离心15min，得到沉淀Ⅰ；
（8）将沉淀Ⅰ用5倍体积的水溶解，加入体积浓度为100%的乙醇至终度为30%（v/v），5000r/min离心15min，得到上清液Ⅲ；
（9）向上清液Ⅲ中加入体积浓度为100%的乙醇至终浓度为70%（v/v），5000r/min离心15min，得到沉淀Ⅱ；
（10）将沉淀Ⅱ用无水乙醚清洗后冷冻干燥，得到产品。
实施例1制备的产品为黄白色粉末，其水解液高效液相色谱图与单糖标准液的高效液相色谱图对比如图1所示，其中（a）为单糖标准液，（b）为褐藻多糖水解液；结果表明水解液出现了六个特征峰，保留时间分别为17.122min、22.342min、26.911min、28.772min、29.713min、32.295min，与单糖标准液中甘露糖（17.135min）、葡萄糖醛酸（22.325min）、葡萄糖（26.68 min）、半乳糖（28.700min）、木糖（29.641min）、岩藻糖（32.214min）相符，说明产品中含有甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，且葡萄糖和岩藻糖占主要组成。实施例1所得产品的傅立叶红外变换光谱图如图2所示，图2中3369-3486cm-1范围中有强吸收峰，一般为糖类共有的O-H伸缩振动峰；在其右侧2956-2965cm-1范围内有一小峰，为C-H伸缩振动峰，应为岩藻糖中甲基的吸收峰；在1250cm-1处有强烈吸收峰，是S=O伸缩振动，在838-849cm-1附近为C-O-S伸缩振动（轴向配位），说明其硫酸根位于垂直位置，在816cm-1处的吸收是C-O-S的伸缩振动（赤道配位）。
实施例1所用产品的基本性质、检测方法等如表1所示。
表1
从表1可以看出，本发明实施例1所得产品基本性质如下：总糖含量：66.73±0.71%，硫酸基含量：20.18±0.31%，纯度：86.92±0.53%。岩藻糖含量：32.57%。体外抗氧化活性如图3所示，表明所得产品具有对DPPH、-OH自由基，超氧超氧阴离子自由基、ABTS自由基均具有一定的清除能力，说明本发明制备的产品具有一定的活性。
实施例2：
本发明的一种从褐藻中提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，依次按照如下步骤进行：
（1）将新鲜的海带洗净去除表面的泥沙、盐和甘露醇等杂质，50℃烤箱烘干，搅碎成粉末过60目筛，得到海带粉；
（2）将pH为4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液加入40g海带粉中，边加边搅拌，得到溶液Ⅰ，所述海带粉质量与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比为1g：15ml；
（3）将溶液Ⅰ升温至50℃，加入复合酶酶解1.5h，得到溶液Ⅱ，所述复合酶的加入量为滤纸酶活27.23 FPU、内切纤维素酶活39.36 CMCU及纤维二糖酶活373.64 CBU；
复合酶的来源同实施例1；
（4）将溶液Ⅱ升温至100℃，进行热水抽提3h，得到溶液Ⅲ；
（5）将溶液Ⅲ在4500r/min下离心15min，得到上清液Ⅰ；
（6）向上清液Ⅰ中加入体积浓度为95%的乙醇至终浓度为20%（v/v），4500r/min离心15min，得到上清液Ⅱ；
（7）向上清液Ⅱ中加入体积浓度为95%的乙醇至终浓度为60%（v/v），4500r/min离心15min，得到沉淀Ⅰ；
（8）将沉淀Ⅰ用6倍体积的水溶解，加入体积浓度为95%的乙醇至终度为30%（v/v），4500r/min离心15min，得到上清液Ⅲ；
（9）向上清液Ⅲ中加入体积浓度为95%的乙醇至终浓度为70%（v/v），4500r/min离心15min，得到沉淀Ⅱ；
（10）将沉淀Ⅱ用无水乙醚清洗后冷冻干燥，得到产品。
经检测：总糖含量为66.7%，硫酸基含量为20.18%，纯度86.88%。
实施例3：
本发明的一种从褐藻中提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，依次按照如下步骤进行：
（1）将新鲜的海带洗净去除表面的泥沙、盐和甘露醇等杂质，50℃烤箱烘干，搅碎成粉末过60目筛，得到海带粉；
（2）将pH为4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液加入100g海带粉中，边加边搅拌，得到溶液Ⅰ，所述海带粉质量与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比为1g：17ml；
（3）将溶液Ⅰ升温至50℃，加入复合酶酶解1.5h，得到溶液Ⅱ，所述复合酶的加入量为滤纸酶活68.3 FPU、内切纤维素酶活98.4 CMCU及纤维二糖酶活934.1 CBU；
复合酶的来源同实施例1；
（4）将溶液Ⅱ升温至95℃，进行热水抽提3h，得到溶液Ⅲ；
（5）将溶液Ⅲ在5000r/min下离心15min，得到上清液Ⅰ；
（6）向上清液Ⅰ中加入体积浓度为99%的乙醇至终浓度为25%（v/v），5000r/min离心15min，得到上清液Ⅱ；
（7）向上清液Ⅱ中加入体积浓度为99%的乙醇至终浓度为65%（v/v），5000r/min离心15min，得到沉淀Ⅰ；
（8）将沉淀Ⅰ用5倍体积的水溶解，加入体积浓度为99%的乙醇至终度为28%（v/v），5000r/min离心15min，得到上清液Ⅲ；
（9）向上清液Ⅲ中加入体积浓度为99%的乙醇至终浓度为72%（v/v），5500r/min离心15min，得到沉淀Ⅱ；
（10）将沉淀Ⅱ用无水乙醚清洗后冷冻干燥，得到产品。
经检测总糖含量为66.88%，硫酸基含量为20.25%，纯度87.13%。
Claims (1)
1.一种从褐藻中提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
（1）将新鲜的褐藻洗净50~60℃烘干，搅碎成粉末过50~60目筛，得到褐藻粉；
（2）将pH为4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液加入褐藻粉中，边加边搅拌，得到溶液I，所述褐藻粉质量与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比为1g：15~20ml;
（3）将溶液I升温至48~50℃，加入复合酶酶解1~2h,得到溶液II，所述复合酶是将纤维素酶和β-葡萄糖苷酶按照体积比为1:4~6混合制成，其中，纤维素酶制剂的蛋白质含量为157.61mg/ml；滤纸酶活为17.19FPU/ml，内切纤维素酶活为6.27CMCU/ml，纤维二糖酶活为8.75CBU/ml；β-葡萄糖苷酶制剂的蛋白质含量为4.5mg/ml；滤纸酶活为3.39FPU/ml，内切纤维素酶活为8.59CMCU/ml，纤维二糖酶活为91.66CBU/ml；复合酶的加入量为每100g褐藻粉添加滤纸酶活61.5~75.06 FPU、内切纤维素酶活81~115.64 CMCU 及纤维二糖酶活750.8~1117.34CBU；
（4）将溶液II升温至95~100℃，进行热水抽提3~5h，得到溶液III；
（5）将溶液III在4500~5000r/min下离心15min，得到上清液I；
（6）向上清液I中加入体积浓度为90~100%的乙醇至终浓度为20~30%，4500~5000r/min离心15min，得到上清液II；
（7）向上清液II中加入体积浓度为90~100%的乙醇至终浓度为60~70%，4500~5000r/min离心15min，得到沉淀I；
（8）将沉淀I用5~6倍体积的水溶解，加入体积浓度为90~100%的乙醇至终浓度为20~30%，4500~5000r/min离心15min，得到上清液III；
（9）向上清液III中加入体积浓度为90~100%的乙醇至终浓度为60~70%，4500~5000r/min离心15min，得到沉淀II；
（10）将沉淀II用无水乙醚清洗后冷冻干燥，得到产品。
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