CN111269954B - 一种利用酶法辅助超声制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用酶法辅助超声制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其技术方案要点包括如下步骤：将粉碎后的灵芝孢子粉壁壳经筛分设备，得到粉径大于100目的灵芝孢子壁壳粉；将灵芝孢子壁壳粉先经过复合酶处理，再进行超声处理，然后经灭活后进行过滤，取上清液，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖的提取液；在提取液中加入无水乙醇进行醇沉，得到沉淀分离液，取沉淀分离液的底层沉淀物进行浓缩和干燥，最后得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖。本发明提取出的灵芝粗多糖得率高达11.25%，相比于直接提取粗多糖效率提高近百倍，同时粗多糖具有保湿效果和多种免疫功能，可广泛应用于保健品和美容市场等。
Description
技术领域
本发明涉及真菌有效物质提取的技术领域，具体涉及一种利用酶法辅助超声制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法。
技术背景
灵芝孢子是灵芝(Ganodermalucidum)在生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞即灵芝的种子。每个灵芝孢子只有4-6个微米，是活体生物体，双壁结构，外被坚硬的几丁质纤维素所包围，具有灵芝的全部遗传活性物质。其孢子粉、子实体均可入药。灵芝的化学成分非常复杂，含有灵芝多糖、三萜类化合物、蛋白质、氨基酸、甾醇、生物碱等活性成分。现代医学研究证明，灵芝多糖具有抗肿瘤、抗炎症、保护肝脏、降低胆固醇、降血糖、抗辐射、增强免疫力和抗病毒作用。灵芝多糖还具有良好的保湿作用,其保湿效果优于本领域常用的透明质酸。
现有研究表明，灵芝孢子粉中的有效物质不经过破壁难以被人体消化吸收，所以目前灵芝孢子粉的提取工艺流程大致为：灵芝孢子粉破壁-水加热提取-脱脂处理,剩余的细胞壁为灵芝孢子壁壳，目前对于灵芝孢子粉壁壳是作为废料来处理，造成了极大的资源浪费。
发明内容
为了避免灵芝孢子粉在提取有效成分后剩余灵芝孢子粉壁壳的处理问题，本发明的目的在于采用复合酶法处理灵芝孢子粉壁壳，并通过超声来辅助复合酶进行协同处理，从而得到一种高效提取灵芝壁壳中粗多糖的方法，不仅有效的提高灵芝粗多糖得率，而且具有高效、降低成本和节能环保的效果。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用酶法辅助超声制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，包括如下步骤：
S1、取得灵芝孢子粉在经过破壁、热水提取和脱脂处理后剩余的灵芝孢子粉壁壳，将灵芝孢子粉壁壳粉碎后经筛分设备，得到粒径大于100目的灵芝孢子壁壳粉；
S2、将步骤S1中的灵芝孢子壁壳粉与复合酶进行混合，得到混合物所述复合酶由几丁质酶、纤维素酶和半纤维素酶组成；在混合物中加入pH为4.5〜6.5的缓冲液后先置于45〜65℃的恒温培养设备内进行酶解，再进行超声处理，得到酶解液；
S3、将步骤S2中的酶解液灭活后进行过滤，得到过滤分离液，取过滤分离液的上清液，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖的提取液；
S4、在步骤S3中的提取液中加入无水乙醇进行醇沉，得到沉淀分离液，取沉淀分离液的底层沉淀物进行浓缩和干燥，最后得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖。
通过上述技术方案，本发明是首次针对灵芝孢子粉提取后的灵芝孢子粉壁壳废料进行处理，将灵芝孢子粉壁壳粉碎进行筛选，得到粒径大于100目的灵芝孢子壁壳粉。将灵芝孢子粉壁壳粉碎成粉末加大了原料与溶剂接触的表面积，方便灵芝粗多糖的溶解。经复合酶处理提取粗多糖后，再经超声处理，利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速粗多糖的释放、扩散和溶解，进一步提高粗多糖提取效率。
作为优选的，所述步骤S2中复合酶由几丁质酶、纤维素酶和半纤维素酶按质量比为1:0:0〜8:1:1的比例进行混合得到。
通过上述技术方案，复合酶作为生物催化剂，可以有效加速反应速度，使灵芝孢子粉壁壳粗多糖的提取过程更高效且有效降低成本。
作为优选的，所述步骤S2中灵芝孢子壁壳粉与复合酶的质量比为25：1〜10:1。
作为优选的，所述步骤S2中缓冲液的pH为5.0〜6.0。
作为优选的，所述步骤S2中恒温培养设备的培养温度为50℃，培养时间为1〜6h。
作为优选的，所述步骤S2中超声处理的温度为40〜65℃，功率为150〜500W，时间为10〜70min。
作为优选的，所述步骤S3中无水乙醇的浓度为提取液体积的1.5〜5倍，所述醇沉的时间为20〜50h。
作为优选的，所述步骤S3中浓缩和干燥的温度均为80〜180℃。
作为优选的，所述步骤S3中干燥的时间为20〜80min。
作为优选的，所述步骤S1中筛分设备为100目的筛网。
本发明的有益效果是：
将灵芝孢子粉壁壳粉碎至粒径大于100目后加入复合酶处理。再设置于一定超声条件下超声处理后沸水灭活。过滤后取上清液，加入无水乙醇。醇沉，取下层溶液干燥浓缩得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖。本发明用于提取的原料为灵芝孢子粉壁壳，灵芝孢子粉壁壳为第三代灵芝孢子粉提取有效成分后的剩余产物，经水提醇沉法后用硫酸苯酚法测得的灵芝孢子粉壁壳粗多糖含量不足0.25%。
灵芝孢子粉壁壳粗多糖得率=粗多糖含量/壁壳重量*100%，采用本发明提取出的灵芝孢子粉壁壳粗多糖得率高达11.25%，相比于直接提取粗多糖效率提高近百倍。酶法辅助超声作为一种新的提取灵芝孢子粗多糖的方法，不仅有效的提高灵芝粗多糖得率，而且具有高效、降低成本、节能环保的优点；同时粗多糖具有保湿效果和多种免疫功能，可广泛应用于食品药品以及化妆品市场等。
具体实施方式
本发明提供了一种利用酶法辅助超声制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，包括如下步骤：
S1、取得灵芝孢子粉在经过破壁、热水提取和脱脂处理后剩余的灵芝孢子粉壁壳，将灵芝孢子粉壁壳粉碎后经筛分设备，筛分设备为100目的筛网，得到粒径大于100目的灵芝孢子壁壳粉；
S2、将步骤S1中的灵芝孢子壁壳粉与复合酶按质量比为25：1〜10:1进行混合，得到混合物，所述复合酶由几丁质酶、纤维素酶和半纤维素酶按质量比为1:0:0〜8:1:1的比例进行混合得到；
在混合物中加入pH为4.5〜6.5的缓冲液后先置于45〜65℃的恒温设备内进行酶解，所述恒温设备的培养时间为1〜6h；
再进行超声处理，所述超声处理的温度为40〜65℃，时间为10〜70min，功率为150〜500W，得到酶解液；
S3、将步骤S2中的酶解液灭活后进行过滤，得到过滤分离液，取过滤分离液的上清液，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖的提取液；
S4、在步骤S3中的提取液中加入无水乙醇进行醇沉，无水乙醇的浓度为提取液体积的1.5〜5倍，所述醇沉的时间为20〜50h，得到沉淀分离液；取沉淀分离液的底层沉淀物进行浓缩和干燥，浓缩和干燥的温度均为80〜180℃，干燥的时间为20〜80min；最后得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖。
下面结合实施例对本发明提供的技术及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
试验材料:本发明实施例中采用的灵芝孢子粉提取废料均为灵芝孢子粉提取有效成分后的剩余产物，取两份灵芝孢子粉壁壳为样品1号和2号，1号和2号均是灵芝孢子粉在经过破壁、热水提取、脱脂处理后剩余的物料。
实施案例一
将样品1号粉碎经100目的筛分设备，得到粒径大于100目的灵芝孢子壁壳粉；精密称取0.5g的灵芝孢子壁壳粉,将0.02g的纤维素酶、0.02g的半纤维素酶、0.08g的几丁质酶进行混合得到复合酶，将复合酶加入灵芝孢子壁壳粉中进行混匀，得到混合物；在混合物中加入pH5缓冲液20mL后置于50℃的恒温培养箱中进行反应，酶解4h后，进行超声处理，超声功率250W，超声温度50℃条件下超声处理60min，将其取出，得到酶解液；将酶解液经沸水灭活10min后，进行离心(3500r/min,5min)过滤，得到过滤分离液，取过滤分离液的上清液，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖的提取液；在提取液中加入3倍量95%无水乙醇，醇沉48h,得到沉淀分离液，取沉淀分离液的底层沉淀物用无水乙醇多次洗涤后，进行浓缩和干燥，最后称重得灵芝粗多糖的质量为55.25mg。
实施案例二
将样品2号粉碎后经100目的筛分设备，得到粒径大于100目的灵芝孢子壁壳粉；精密称量0.5g的灵芝孢子壁壳粉，将0.03g的纤维素酶、0.03g的半纤维素酶和0.04g的几丁质酶进行混合得到复合酶，将复合酶与灵芝孢子壁壳粉混合均匀，得到混合物；在混合物中加入pH 5缓冲液后15mL后置于45℃的恒温培养箱中进行反应，酶解2h后将其取出，得到酶解液；将酶解液经灭活后加入2倍体积量的无水乙醇进行醇沉48h，得到沉淀分离液，收集沉淀分离液的底层沉淀物后进行浓缩和干燥，最后称重得到灵芝粗多糖的质量为41.25mg。
通过上述技术方案，恒温培养的温度更优选为50℃；实验表明此温度下的复合酶活性最高，灵芝孢子粉壁壳粗多糖的提取效果最好。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (7)
1.一种利用酶法辅助超声制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、取得灵芝孢子粉在经过破壁、热水提取和脱脂处理后剩余的灵芝孢子粉壁壳，将灵芝孢子粉壁壳粉碎后经筛分设备，得到粒径大于100目的灵芝孢子壁壳粉；
S2、将步骤S1中的灵芝孢子壁壳粉与复合酶进行混合，得到混合物，所述复合酶由几丁质酶、纤维素酶和半纤维素酶组成；在混合物中加入pH为4.5〜6.5的缓冲液后先置于45〜65℃的恒温培养设备内进行酶解，再进行超声处理，得到酶解液；
S3、将步骤S2中的酶解液灭活后进行过滤，得到过滤分离液，取过滤分离液的上清液，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖的提取液；
S4、在步骤S3中的提取液中加入无水乙醇进行醇沉，得到沉淀分离液，取沉淀分离液的底层沉淀物进行浓缩和干燥，最后得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖；
其中，所述步骤S2中复合酶由几丁质酶、纤维素酶和半纤维素酶按质量比为4:3:3、4:1:1、或8:1:1的比例进行混合得到；
所述步骤S2中灵芝孢子壁壳粉与复合酶的质量比为25：1〜10:1；
所述步骤S2中超声处理的温度为40〜65℃，功率为150〜500W，时间为10〜70min。
2.根据权利要求1所述的一种利用酶法辅助超声制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于：所述步骤S2中缓冲液的pH为5.0〜6.0。
3.根据权利要求1所述的一种利用酶法辅助超声制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于：所述步骤S2中恒温培养设备的培养温度为50℃，培养时间为1〜6h。
4.根据权利要求1所述的一种利用酶法辅助超声制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于：所述步骤S3中无水乙醇的浓度为提取液体积的1.5〜5倍，所述醇沉的时间为20〜50h。
5.根据权利要求1所述的一种利用酶法辅助超声制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于：所述步骤S3中浓缩和干燥的温度均为80〜180℃。
6.根据权利要求1所述的一种利用酶法辅助超声制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于：所述步骤S3中干燥的时间为20〜80min。
7.根据权利要求1所述的一种利用酶法辅助超声制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于：所述步骤S1中筛分设备为100目的筛网。
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