CN102482328B

CN102482328B - 包含血凝素的嵌合流感病毒样颗粒

Info

Publication number: CN102482328B
Application number: CN201080035066.4A
Authority: CN
Inventors: 马农·科图雷; 米凯莱·达吉斯; 皮埃尔-奥列弗·拉瓦; 路易斯-菲利普·韦齐纳; 马克-安德烈·德奥斯特
Original assignee: Medicago Inc
Current assignee: Medicago Inc
Priority date: 2009-06-24
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2030-06-25
Also published as: WO2010148511A8; RU2012101946A; US20120189658A1; ES2669303T3; KR101377725B1; HRP20180706T1; WO2010148511A1; MX349924B; RU2569195C2; CA2762042A1; ZA201200481B; AU2010265766A1; SI2445928T1; JP6141228B2; AU2010265766B2; US10272148B2; IN2012DN00650A; CA2762042C; JP2014158483A; PT2445928T

Abstract

提供了在植物或植物部分中合成嵌合流感病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)的方法。该方法涉及在植物或植物部分中表达嵌合流感HA。本发明还涉及包含嵌合流感HA蛋白和植物脂质的VLP。本发明还涉及编码嵌合流感HA的核酸以及载体。VLP可用于配制流感疫苗，或者可用于加强现有的疫苗。

Description

包含血凝素的嵌合流感病毒样颗粒

发明领域

本申请要求于2009年6月24日提交的美国临时申请No.61/220,161的优先权。

本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言，本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样颗粒和生产嵌合流感病毒样颗粒的方法。

发明背景

流感是由呼吸道病毒引起的人死亡的首要原因，在流感季节，估计全世界10～20％的人口被感染，每年导致250～500,000的死亡。

目前抗击人流感的方法是每年接种。疫苗通常是几种毒株的组合，这些毒株被预测为即将到来的流感季节的强势毒株(dominant strain)，但是每年生产的疫苗剂数量不足以接种全世界人口。例如，根据目前的产量加拿大和美国获得足以免疫其约三分之一人口的疫苗剂，而仅有17％的欧洲人口可接种疫苗——在世界范围的流感大流行到来时，该产量是不够的。即使在给定年份中所需的年产量可以某种方式实现，但强势毒株逐年变化，因此在一年中的低需求时间大量储备是不实际的。经济、大规模地生产有效的流感疫苗是政府和私营企业等极为关注的。

流感血凝素(HA)表面糖蛋白是受体结合蛋白也是膜融合蛋白。它是具有相同亚基的三聚体，每个亚基包含两条二硫键连接的多肽HA1和HA2，它们来自前体HA0的蛋白水解切割，HA0的N端有信号肽序列，HA0的C端有膜锚定序列。形成HA1和HA2的切割产生较小多肽HA2的N端，HA2的C端有膜锚定序列。切割对膜融合活性是必需的，但对免疫原性不是必需的。HA2的N端序列被称为“融合肽”，因为类似疏水序列的切割也是其他病毒融合蛋白所需要的，并且该序列20个残基的合成肽类似物在体外与膜融合。

一般来说，球形“头部”的表面包含几个柔性环，其具有良好表征并且可变的抗原区域，称为位点A、B、C、D和E(综述见Wiley等，1987.Annu Rev Biochem 56：365-394)。已描述了在一些位点(例如B和E)插入或替换短肽序列以进行免疫研究(Garcia-Sastré等1995.Biologicals23：171-178)。大小从53至246个氨基酸的表皮生长因子(EGF)、单链抗体(scFV)和IgG的Fc结构域已被插入到H7的N端，并且已成功表达嵌合体(Hatziioannou等，1999.Human Gene Therapy 10：1533-1544)。最近，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)保护性抗原的90和140个氨基酸的结构域已被融合到H3的氨基末端(Li等，2005.J.Virol 79：10003-1002)。Copeland(Copeland等，2005.J.Virol 79：6459-6471)描述了在H3柄(stalk)上表达gp120Env HIV表面糖蛋白，其中gp120结构域替换了HA的整个球状头部。

已开发了几种重组产物作为候选重组流感疫苗。这些方法集中于甲型流感病毒HA和NA蛋白的表达、生产和纯化，包括用杆状病毒感染的昆虫细胞(Crawford等，1999 Vaccine 17：2265-74；Johansson，1999 Vaccine17：2073-80)、病毒载体和DNA疫苗构建体(Olsen等，1997 Vaccine15：1149-56)表达这些蛋白质。

生产用于疫苗目的的非感染性流感病毒株是避免意外感染的一种方法。作为替代，已研究了用作培养病毒之替代物的病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)。VLP模拟病毒衣壳的结构，但缺少基因组，因此不能复制或提供用于再次感染的工具。目前流感病毒VLP的生产技术依赖于多种病毒蛋白的共表达，这种依赖性是这些技术的缺点，因为在大流行和每年流行的情形中，响应时间对于接种来说是至关重要的。需要更简单的VLP生产系统(例如依赖于仅一种或几种病毒蛋白的表达而不需要表达非结构病毒蛋白)来加快疫苗的开发。

包膜病毒可在从被感染细胞“出芽”时获得脂质包膜，并且从质膜或内部细胞器的膜获得膜。例如在哺乳动物细胞或杆状病毒细胞系统中，流感病毒从质膜出芽(Quan等2007 J.Virol 81：3514-3524)。已知仅有几种包膜病毒感染植物(例如，番茄斑萎病毒(Tospovirus)和弹状病毒(Rhabdovirus)的成员)。已知的植物包膜病毒的特征在于从宿主细胞的内膜出芽，而不是从质膜出芽。虽然已在植物宿主中生产了少量重组VLP，但它们均不来源于质膜，这引出了如下问题，即是否可以在植物中生产质膜来源的VLP，包括流感病毒VLP。

在任何系统中形成VLP都对蛋白质结构要求很高——改变对应于选定球状结构之表面环的短序列可能对多肽本身的表达没有太大影响，但是缺乏证明这些改变影响VLP形成的结构研究。HA多个区域的协调和结构(例如膜锚定序列，将球状头部与膜分隔开的三聚体柄或茎区域)随病毒而进化，并且可能不能进行类似的改变而不对HA三聚体完整性和VLP的形成造成损失。

在WO 2009/009876中，本发明人已描述了流感HAVLP的生产。

发明内容

本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言，本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样颗粒和生产嵌合流感血凝素病毒样颗粒的方法。

本发明的一个目的是提供改进的嵌合流感病毒样颗粒(VLP)。

本发明提供了包含嵌合流感HA的多肽，该嵌合流感HA包含茎结构域簇(stem domain cluster，SDC)、头部结构域簇(head domain cluster，HDC)和跨膜结构域簇(transmembrane domain cluster，TDC)，其中：SDC包含F’1、F’2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他亚结构域来自一种或更多种第二流感HA。第一和第二流感HA可独立地选自H1、H3、H5和B。而且，多肽可以包含信号肽。

本发明还提供了编码包含嵌合流感HA之多肽的核酸，该嵌合流感HA包含茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中：SDC包含F’1、F’2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他亚结构域来自一种或更多种第二流感HA。，核酸还可以编码除所述SDC、HDC和TDC外包含信号肽的多肽。

还提供了在植物中生产嵌合流感病毒样颗粒(VLP)的方法，该方法包括：

a)向植物或其部分引入编码嵌合流感HA的核酸，该嵌合流感HA包含信号肽、茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中：SDC包含F’1、F’2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他亚结构域来自一种或更多种第二流感HA，和

b)在允许核酸表达的条件下孵育植物或其部分，从而生产VLP。

本发明包括上述方法，其中在引入步骤(步骤a)中，核酸以瞬时方式引入植物中。或者，在引入步骤(步骤a)中，核酸被引入植物并且稳定整合。该方法还可包括步骤：c)收获宿主并纯化VLP。

本发明提供了包含嵌合流感HA或编码嵌合流感HA之核酸序列的植物或其部分，该嵌合流感HA包含茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中：SDC包含F’1、F’2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他结构域来自一种或更多种第二流感HA。

该植物或其部分还可包含核酸，该核酸包含与在植物中有活性之调控区有效连接的编码一种或多于一种伴侣蛋白(chaperone protein)的核苷酸序列。所述一种或多于一种伴侣蛋白可选自Hsp40和Hsp70。

本发明涉及包含嵌合流感HA的病毒样颗粒(VLP)，该嵌合流感HA包含茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中：SDC包含F’1、F’2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他结构域来自一种或更多种第二流感HA。VLP还可包含植物特异性的N-聚糖或修饰的N-聚糖。

还提供了包含有效剂量的上述VLP和可药用载体的组合物。

在本发明的另一方面，提供了在对象中诱导对流感病毒感染的免疫的方法，包括向对象施用VLP。VLP可以经口、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下施用给对象。

可与编码嵌合HA蛋白之序列有效连接的调控区包括在植物细胞、昆虫细胞或酵母细胞中有效的调控区。这样的调控区可包括质体蓝素调控区、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)调控区、叶绿素a/b结合蛋白(CAB)调控区或ST-LS1调控区。其他调控区包括5’UTR、3’UTR或终止子序列。质体蓝素调控区可以是苜蓿质体蓝素调控区；5’UTR、3’UTR或终止子序列也可以是苜蓿序列。

本发明提供了嵌合流感HA多肽，由第一流感和第二流感构成，第一流感和第二流感可独立地选自B、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16；前提是第一流感和第二流感不是相同的流感类型、亚型或不具有相同的来源。

根据本发明的一些方面，嵌合流感HA多肽包含信号肽序列，所述信号肽序列可选自天然信号肽序列、苜蓿PDI信号肽序列、流感H5信号肽序列和流感H1信号肽序列。

本发明提供了在能够生产VLP的宿主(包括植物、昆虫或酵母)中生产包含嵌合流感血凝素(HA)的VLP的方法，其包括在宿主中引入编码嵌合流感HA的核酸，和在允许核酸表达的条件下孵育宿主，从而生产VLP，该嵌合流感HA包含茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中：SDC包含F’1、F’2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他结构域来自一种或更多种第二流感HA。

与在昆虫细胞培养物中生产VLP相比，在植物中生产这些颗粒具有若干优点。植物脂质可刺激特定免疫细胞并增强所诱导的免疫应答。植物的膜由脂质、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)构成，并且还包含植物和一些细菌及原生动物所特有的鞘糖脂。鞘脂类不常见的原因是它们不是甘油酯(例如PC或PE)，而是由与含有多于18个碳的脂肪酸链形成酰胺键的长链氨基醇组成。PC和PE以及鞘糖脂可结合哺乳动物免疫细胞(例如抗原呈递细胞(APC)，如树突状细胞和巨噬细胞)和另一些细胞(包括胸腺和肝脏中的B淋巴细胞和T淋巴细胞)表达的CD1分子。此外，除植物脂质的存在所具有的潜在佐剂作用外，植物N-聚糖促进抗原呈递细胞捕获糖蛋白抗原的能力对在植物中生产嵌合VLP也可以是有利的。不希望受理论限制，预计由植物生产的嵌合VLP比在其他生产体系中制得的嵌合VLP诱导更强的免疫反应，并且与由活或减毒全病毒疫苗诱导的免疫反应相比，由这些植物生产的嵌合VLP诱导的免疫反应更强。

与由全病毒制得的疫苗相比嵌合VLP具有优势，这是因为它们无感染性，因此限制性生物防范问题不再像使用感染性全病毒时那么重要，并且不是生产所必需的。由植物生产的嵌合VLP的另一优点是，允许表达系统生长在温室或田间，从而显著地更经济并适于扩大规模。

另外，植物不包含参与合成唾液酸残基以及将其添加到蛋白质中的酶。VLP的生产可以不需要神经氨酸酶(NA)，并且不需要共表达NA或者用唾液酸酶(神经氨酸酶)处理生产细胞或提取物以确保VLP在植物中的生产。

该发明概述未必描述本发明的所有发明特征。

附图简述

通过参照附图的以下描述，本发明的这些和其他特征会更加明显，在附图中：

图1显示HA亚结构域的示意图。SP：信号肽，F’1、F’2和F：融合亚结构域；RB：受体结合亚结构域，E1和E2：酯酶亚结构域，TMD/CT：跨膜和胞质尾区亚结构域。图1B显示基于质体蓝素的表达盒(构建体号774、540、660、690、691、696)的示意图，该表达盒表达天然和嵌合形式的血凝素H1A/布里斯班/59/2007(H1/Bri)、血凝素H1A/新喀里多尼亚/20/99(H1/NC)和血凝素H5A/印度尼西亚/5/05(H5/Indo)。Plasto pro：苜蓿质体蓝素启动子，Plasto ter：苜蓿质体蓝素终止子，SP：信号肽，RB：受体结合亚结构域，E1-RB-E2：酯酶和受体结合亚结构域，TMD/CT：跨膜和胞质尾亚结构域，PDI：苜蓿蛋白二硫键异构酶。图1C显示几种流感HA的氨基酸序列比对，附加了结构比对：(B/佛罗里达/4/2006(B佛罗里达)，SEQ ID NO：94(GenBank登录号ACA33493.1；B/马来西亚/2506/2004(B-马来西亚)，SEQ ID NO：95(GenBank登录号ABU99194.1)；H1/Bri(A-布里斯班)，SEQ ID NO：96(GenBank登录号ADE28750.1；H1A/所罗门群岛/3/2006(A-Sol.Isl)，SEQ ID NO：97(GenBank登录号ABU99109.1)；H1/NC(A-NewCal)，SEQ ID NO：98(GenBank登录号AAP34324.1；H2A/新加坡/1/1957(A-新加坡)，SEQ ID NO：99(GenBank登录号AAA64366.1)；H3A/布里斯班/10/2007(A-布里斯班)，SEQ IDNO：100(GenBank登录号ACI26318.1)；H3A/威斯康星/67/2005(A-WCN)，SEQ ID NO：101(GenBank登录号ABO37599.1)；H5A/安徽/1/2005(A-安徽)，SEQ ID NO：102(GenBank登录号ABD28180.1)；H5A/越南/1194/2004(A-越南)，SEQ ID NO：103(GenBank登录号ACR48874.1)；H5-Indo，SEQ ID NO：104(GenBank登录号ABW06108.1。标示了F’1、酯酶1、受体结合、酯酶2、F′2、肽融合、TMD/CT亚结构域之间的界限以及二硫桥。

图2显示用构建体690、734(SEQ ID NO：11)、696(SEQ ID NO：112)(上图)和691(SEQ ID NO：113)(下图)表达的嵌合HA所示亚结构域的氨基酸序列。SEQ ID NO：111的1-92位氨基酸是H5/Indo的F’1+E1结构域；93-263位氨基酸是H1/布里斯班的RB头部结构域，264-552位氨基酸是H5/Indo的E2+F’2结构域。SEQ ID NO：112的1-92位氨基酸是H5/NC的F’1+E1结构域；93-301位氨基酸是H5/Indo的RB头部结构域，302-586位氨基酸是H1/NC的E2+F’2结构域。SEQ ID NO：113的1-42位氨基酸是H5/Indo的F’1结构域；43-273位氨基酸是H1/布里斯班的E1-RB-E2头部结构域，274-552位氨基酸是H5/Indo的F’2结构域。

图3显示构建体690和734(SEQ ID NO：80)编码区的氨基酸序列，其包含H1/Bri的RB亚结构域、H5/Indo信号肽和包含H5/Indo F’1、E1、E2和F亚结构域的茎结构域复合体(stem domain complex，SDC)。

图4显示构建体691(SEQ ID NO：81)编码区的氨基酸序列，其包含H1/Bri头部结构域复合体(HDC)(包含E1、RB、E2)、H5/Indo信号肽和包含H5/Indo F’1、F’2和F亚结构域的茎结构域复合体(SDC)。

图5显示构建体696(SEQ ID NO：82)编码区的氨基酸序列，其包含H5/Indo的RB亚结构域、PDI信号肽和包含F’1、E1、E2和F’2的H1/NC茎结构域复合体。

图6显示在植物中天然形式、构建体774(包含H1/Bri)、构建体692(包含H1/Bri的头部结构域复合体(HDC))和构建体690(包含与H5/Indo茎结构域复合体(SDC)融合的H1/Bri的RB亚结构域)的H1/Bri表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白质为20微克。用抗HA单克隆抗体(抗H1-布里斯班；FII 10-I50)显示Western印迹。构建体774表达具有H1/Bri天然信号肽的H1/Bri；构建体690、691表达具有H5/Indo天然信号肽的HA。

图7显示天然形式、构建体660(包含H5/Indo)或构建体696(包含与H1/NC SDC、E1和E2亚结构域融合的H1/Indo RB亚结构域)的H5/Indo表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白质为20微克。用抗H5印度尼西亚多克隆抗体(ITC IT-003-005V)显示Western印迹。构建体660表达具有其天然信号肽的H5/Indo；构建体696表达具有PDI信号肽的嵌合HA。

图8显示基于35SCPMV/HT的表达盒的示意图，该表达盒表达天然(构建体732)和嵌合(构建体733和734)形式的H1/Bri。构建体733包含PDI信号肽和H1/Bri的HDC、SDC和跨膜结构域复合体(transmembrane domain complex，TDC)，构建体734包含H5/Indo信号肽、F’1、E1、E2、F’2、F和来自H1/Bri的RB。35S Dro：CaMV 35S启动子，NOS ter：胭脂氨酸合酶终止子，SP：信号肽，RB：受体结合亚结构域，E1-RB-E2：酯酶和受体结合亚结构域，TMD/CT：跨膜和胞质尾亚结构域，PDI：苜蓿蛋白二硫键异构酶；CPMV-HT：可过量翻译(hypertranslatable)的豇豆花叶病毒表达系统的5’和3’元件。

图9显示天然形式、构建体732(包含在基于35SCPMV/HT的表达盒控制下的H1/Bri)、构建体733(包含与H1/Bri融合的PDI信号肽；在基于35SCPMV/HT的表达盒的控制下)或构建体734(包含与H5/IndoSDC、E1和E2亚结构域融合的H1/Bri RB亚结构域；在基于35SCPMV/HT的表达盒的控制下)的H1/Bri表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样蛋白为5微克。用抗HA单克隆抗体检测(FII 10-I50)显示Western印迹。

图10显示基于35SCPMV/HT的表达盒的示意图，该表达盒表达H3A/布里斯班/10/2007(H3/Bri)和B/佛罗里达/4/2006HA(B/Flo)血凝素。构建体736包含与PDI信号肽融合的H3/Bri。构建体737包含与PDI信号肽融合的H3/Bri和H5/Indo TMD/CT。构建体739包含与PDI信号肽融合的B/Flo。构建体745包含与PDI信号肽融合的B/Flo和H5/IndoTMD/CT。35S pro：CaMV 35S启动子，NOS ter：胭脂氨酸合酶终止子，SP：信号肽，RB：受体结合亚结构域，E1-RB-E2：酯酶和受体结合亚结构域，TMD/CT：跨膜和胞质尾亚结构域，PDI：苜蓿蛋白二硫键异构酶；CPMV-HT：可过量翻译的豇豆花叶病毒表达系统的5’和3’元件。

图11显示构建体745和737中的融合边界。HA序列的起始用锥形头箭头标示。跨膜结构域的氨基酸为QILSIYSTVA，，其前面是部分胞外结构域的氨基酸。

图12显示嵌合H5/H3血凝素(SEQ ID NO：83，构建体737)的氨基酸序列，其包含PDI信号肽、H3A/布里斯班/10/2007的胞外结构域和H5A/印度尼西亚/5/2005的TMD/CT。

图13显示嵌合H5/B血凝素(SEQ ID NO：84)的氨基酸序列，其包含构建体号745的开放阅读框所编码的B/佛罗里达/4/2006的胞外结构域和H5A/印度尼西亚/5/2005的TMD/CT。

图14显示天然形式、构建体739(包含PDI-B/Flo)或构建体745(包含与H5/Indo TDC融合的B/Flo HDC和SDC)的B/Flo表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白为20微克。用抗HA B/佛罗里达多克隆抗体(NIBSC 07/356)显示Western印迹。

图15显示天然形式、构建体736(包含PDI sp-H3/Bri)或构建体737(与H5/Indo TDC融合的H3/Bri HDC和SDC)的H3/Bri表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白为20微克。用抗H3布里斯班多克隆抗体(NIBSC 08/124)显示Western印迹。

图16显示用构建体号745侵染之植物的叶蛋白质提取物的体积排阻色谱。对于每种级分，显示洗脱级分的相对蛋白含量。在级分7至15中使用抗HA B/佛罗里达多克隆抗体(NIBSC 07/356)对血凝素进行的免疫检测(Western印迹)在图下显示。箭头标示蓝葡聚糖2000的洗脱峰(级分8)。

图17显示合成片段的核酸序列(SEQ ID NO：52)，其包含完整H5(A/印度尼西亚/5/05(H5N1))编码区(包含信号肽和终止密码子)，在5’侧翼有HindIII位点，在3’侧翼有SacI位点。

图18显示构建体660的核酸序列(SEQ ID NO：53)，构建体660是HA表达盒，其包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、H5型A/印度尼西亚/5/05(H5N1)血凝素的编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图19显示无TmD和Ctail的野生型H1(A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1))(GenBank登录号AY289929)编码序列的核酸序列(SEQ IDNO：54)。

图20显示合成片段的核酸序列(SEQ ID NO：55)，该合成片段包含缺少TmD和Ctail的H1(A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1))编码序列。在5’区，最后几个核苷酸来自PDI SP并且包含BglII限制性位点，在3’SacI/StuI双位点位于紧邻终止密码子的下游。

图21显示包含C-ter H1(A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1))编码序列(包含TmD和Ctail)的合成片段的核酸序列(SEQ ID NO：56)，其从KpnI位点至终止密码子(3’侧翼是SacI/StuI双位点)。

图22显示来自紫苜蓿(Medicago sativa)蛋白二硫键异构酶mRNA的核苷酸序列。GenBank登录号Z11499(SEQ ID NO：57)。核苷酸32-103编码PDI信号肽。

图23显示PromPlasto-PDISP-Plasto 3’UTR质粒的核苷酸序列。图23A显示PromPlasto-PDISP(SEQ ID NO：58)的核苷酸序列。图23B显示Plasto 3’UTR(SEQ ID NO：85)的核苷酸序列。蛋白二硫键异构酶(PDI)信号肽序列用下划线表示。用于克隆的BglII(AGATCT)和SacI(GAGCTC)限制性位点以黑体显示。

图24显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：59；构建体540)，该表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、PDI信号肽和H1型A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)的编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。来自A/新喀里多尼亚/20/1999的H1编码序列用下划线表示。

图25显示合成片段的核酸序列(SEQ ID NO：60)，其包含完整H1(A/布里斯班/59/07(H1N1))编码区(包含信号肽和终止密码子)，在5’侧翼有以DraIII位点起始的苜蓿质体蓝素基因序列(对应于起始ATG上游前84个核苷酸)，3’侧翼有SacI位点。

图26显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：61，构建体774)，该HA表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、H1型A/布里斯班/59/07(H1N1)的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图27显示表达盒号828(SEQ ID NO：62)的核酸序列，从PacI(启动子上游)至AscI(紧邻NOS终止子的下游)。CPMV HT 3’UTR序列用下划线表示，其中突变的ATG用黑体表示。Apa1限制性位点用下划线和斜体表示。

图28显示嵌合H5/H1表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：63，构建体690)，该表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。嵌合HA编码序列用下划线表示。

图29显示嵌合H5/H1表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：64，构建体691)，该表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。嵌合HA编码序列用下划线表示。

图30显示嵌合H1/H5表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：65，构建体696)，该表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。嵌合HA编码序列用下划线表示。

图31显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：66，构建体732)，该HA表达盒包含CaMV 35S启动子、CPMV-HT 5’UTR、H1型A/布里斯班/59/07(H1N1)血凝素编码序列、CPMV-HT 3’UTR和NOS终止子序列。H1/Bri的编码序列用下划线标示。

图32显示中间构建体787从ATG到终止的编码序列的核酸序列(SEQ ID NO：67)。

图33显示SpPDI H1/Bri表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：68，构建体号733)，该表达盒包含CaMV 35S启动子、CPMV-HT 5’UTR、PDI信号肽编码序列、H1型A/布里斯班/59/07(H1N1)血凝素编码序列、CPMV-HT 3’UTR和NOS终止子序列。SpPDI H1/Bri编码序列用下划线表示。

图34显示嵌合H5/H1表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：69，构建体734)，该表达盒包含CaMV 35S启动子、CPMV-HT 5’UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMV-HT 3’UTR和NOS终止子序列。嵌合HA的编码序列用下划线表示。

图35显示合成片段的核酸序列(SEQ ID NO：70)，该合成片段包含完整H3(A/布里斯班/10/07(H3N2))编码区(包含信号肽和终止密码子)，5’侧翼有以DraIII位点起始的苜蓿质体蓝素基因序列(对应于起始ATG上游前84个核苷酸)，3’侧翼有SacI位点。

图36显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：71，构建体736)，该HA表达盒包含CaMV 35S启动子、CPMV-HT 5’UTR、PDI信号肽编码序列、H3型A/布里斯班/10/07(H2N3)血凝素编码序列、CPMV-HT3’UTR和NOS终止子序列。Sp PDI H3/Bris编码序列用下划线表示。

图37显示嵌合H5/H3表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：72，构建体号737)，该表达盒包含CaMV 35S启动子、CPMV-HT 5’UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMV-HT 3’UTR和NOS终止子序列。嵌合HA的编码序列用下划线表示。

图38显示合成片段的核酸序列(SEQ ID NO：73)，该合成片段包含完整HA(B/佛罗里达/4/06)编码区(包含信号肽和终止密码子)，5’侧翼有以DraIII位点起始的苜蓿质体蓝素基因序列(对应于起始ATG上游前84个核苷酸)，3’侧翼有SacI位点。

图39显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：74，构建体739)，该HA表达盒包含CaMV 35S启动子、CPMV-HT 5’UTR、PDI信号肽编码序列、HA型B/佛罗里达/4/06血凝素编码序列、CPMV-HT 3’UTR和NOS终止子序列。Sp PDI B/Flo编码序列用下划线表示。

图40显示嵌合H5/B表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：75，构建体745)，该表达盒包含CaMV 35S启动子、CPMV-HT 5’UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMV-HT 3’UTR和NOS终止子序列。嵌合HA的编码序列用下划线表示。

图41显示编码Msj1的核酸序列(SEQ ID NO：76)。

图42显示部分构建体号R850的核酸序列(SEQ ID NO：77)，从HindIII(在多克隆位点中，启动子上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游)。HSP40编码序列用下划线表示。

图43显示部分构建体号R860的核酸序列(SEQ ID NO：78)，从HindIII(在多克隆位点中，启动子上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游)。HSP70编码序列用下划线表示。

图44显示部分构建体号R870的核酸序列(SEQ ID NO：79)，从HindIII(在多克隆位点中，启动子5’上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游)。HSP40编码序列用下划线和斜体表示，HSP70编码序列用下划线表示。A)核苷酸1-4946；B)核苷酸4947-9493。

图45显示构建体R472的示意图。

图46显示甲型流感的二硫桥模式。桥编号：1)Cys4HA1-Cys137HA2、2)Cys60HA1-Cys72HA1、3)Cys94HA1-Cys143HA1、4)Cys292HA1-Cys318HA1、5)Cys144HA2-Cys148HA2和6)Cys52HA1-Cys277HA1。甲和乙亚型之间二硫桥的差异(图47)用箭头标示。使用成熟H3蛋白的编号。

图47显示乙型流感HA的二硫桥模式。桥编号：1)Cys4HA1-Cys137HA2、2)Cys60HA1-Cys72HA1、3)Cys94HA1-Cys143HA1、4)Cys292HA1-Cys318HA1、5)Cys144HA2-Cys148HA2、6)Cys52HA1-Cys277HA1、7)Cys54HA1-Cys57HA1和8)Cys178HA1-Cys272HA1。甲和乙亚型之间二硫桥的差异(图46)用箭头标示。使用成熟H3蛋白的编号。

图48显示结构域替换(swap)融合连接的示意图。图48A显示来自H1/Bri、H3/Bri和B/Flo的RB亚结构域与H5/Indo SDC的融合，和H5/Indo的RB亚结构域与H1/NC茎结构域的融合。图48B显示来自H1/Bri、H3/Bri或B/Flo的E1-RB-E2亚结构域(HDC)与H5/Indo SDC的融合，和H5/Indo HDC与H1/NC SDC的融合。

图49A显示H1A/加利福尼亚/04/09的核苷酸序列(SEQ ID NO：86)。苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列用下划线表示，成熟H1编码序列用黑体突出显示。图49B显示H1A/加利福尼亚/04/09的氨基酸序列(SEQID NO：87)。苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽序列用下划线表示。

图50显示用未稀释的AGL1/747侵染、与AGL1/443(空载体)共侵染和与AGL1/R870(HSP40/HSP70)共侵染后，H5/B嵌合血凝素(构建体747，包含与H5/Indo TDC融合的B/Flo HDC和SDC)表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白为20微克。用抗B/佛罗里达多克隆抗体(NIBSC)显示Western印迹。

图51A显示2X35S启动子序列(SEQ ID NO：88)的核苷酸序列。图51B显示构建体747(SEQ ID NO：93)从PacI(35S启动子上游)至AscI(紧邻NOS终止子下游)的核苷酸序列。嵌合HA的编码序列用下划线表示。2X35S启动子序列用斜体表示。

详细描述

下面描述的是一个优选的实施方案。

本发明提供了包含编码嵌合流感血凝素(HA)之核苷酸序列的核酸，其与在植物中有活性的调控区有效连接。

此外，本发明提供了在植物中生产病毒样颗粒(VLP)的方法。所述方法包括向植物或植物部分中引入编码嵌合流感HA的核酸序列(与在植物中有活性的调控区有效连接)，并且在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

本发明还提供了包含嵌合流感HA的VLP。可以通过本发明提供的方法生产VLP。

“嵌合蛋白”或“嵌合多肽”是指包含来自于两种或多于两种来源的氨基酸序列的蛋白质或多肽，例如但不限于，作为单个多肽融合的两种或更多种流感类型或亚型或者不同来源的流感。嵌合蛋白或多肽可以包含与剩余多肽或蛋白质相同或异源的信号肽。嵌合蛋白或嵌合多肽可以作为转录本从嵌合核苷酸序列中转录，嵌合蛋白或嵌合多肽在合成后被切割，并且根据需要结合形成多聚体蛋白。因此，嵌合蛋白或嵌合多肽还包括这样的蛋白质或多肽，其包含通过二硫桥连接的亚基(即多聚体蛋白)。例如，包含来自两种或更多种来源的氨基酸序列的嵌合多肽可被加工成亚基，该亚基通过二硫桥连接，产生嵌合蛋白或嵌合多肽(见图46和47)。多肽可以是血凝素(HA)，每个形成多肽的两条或更多条氨基酸序列可以从不同的HA获得，以生产嵌合HA或嵌合流感HA。嵌合HA还可以包括这样的氨基酸序列，其包含在蛋白合成后或过程中被切割的异源信号肽(嵌合HA前体蛋白)。优选地，嵌合多肽或嵌合流感HA不是天然的。编码嵌合多肽的核酸可以被描述成“嵌合核酸”或“嵌合核苷酸序列”。包含嵌合HA的病毒样颗粒可以被描述成“嵌合VLP”。

本发明多个实施方案的嵌合流感HA可包含茎结构域复合体(SDC)、头部结构域复合体(HDC)和跨膜结构域复合体(TDC)，其中SDC、HDC或TDC中的一个或多于一个亚结构域来自第一流感HA类型、亚型或者来自一个来源，并且SDC、HDC或TDC中的一个或多于一个亚结构域来自第二流感HA类型、亚型或者来自第二或不同来源。如本文所述，“SDC”包含F’1、F’2和F亚结构域，“HDC”包含RB、E1和E2亚结构域，“TDC”包含TmD和Ctail亚结构域(TMD/CT；参见图1A、46和47)。

术语“病毒样颗粒”(VLP)或“VLP”是指自组装并包含结构蛋白(如流感HA蛋白或嵌合流感HA蛋白)的结构。一般来说VLP和嵌合VLP的形态和抗原性类似于感染中产生的病毒粒，但是缺乏足以复制的遗传信息，因此不具有感染性。VLP和嵌合VLP可以在适当的宿主细胞(包括植物宿主细胞)中生产。从宿主细胞中提取后，在适当条件下分离并进一步纯化后，VLP和嵌合VLP可以作为完整结构被纯化。

本发明的产生于流感来源蛋白的嵌合VLP或VLP不包含M1蛋白。已知M1蛋白结合RNA(Wakefield and Brownlee，1989)，而RNA是VLP制备时的污染物。在嵌合VLP产品获得监管批准时，不希望存在RNA，因此缺失RNA的嵌合VLP制剂是有利的。

本发明的嵌合VLP可以在特征为缺少使蛋白质唾液酸化之能力的宿主细胞中产生，所述宿主细胞如植物细胞、昆虫细胞、真菌和其他生物(包括海绵动物、腔肠动物、环节动物、节肢动物、软体动物、线形动物(nemathelminthea)、trochelmintes、扁形动物、毛颚动物、触手动物、衣原体、螺旋体、革兰氏阳性细菌、蓝细菌、古细菌等。参见例如Gupta等，1999.Nucleic Acids Research 27：370-372；Toukach等，2007.NucleicAcids Research 35：D280-D286；Nakahara等，2008.Nucleic AcidsResearch 36：D368-D371。如本文所述生产的VLP通常不含有神经氨酸酶(NA)。然而，如果期望获得包含HA和NA的VLP，可以将NA与HA共表达。

本发明还提供包含从表达嵌合HA的细胞的质膜获得脂质包膜的嵌合HA的VLP。例如，如果嵌合HA在基于植物的系统中表达，那么得到的VLP可从该植物细胞的质膜获得脂质包膜。

一般而言，术语“脂质”是指脂溶性的(亲脂性)天然分子。根据本发明的一些方面在植物中生产的嵌合VLP可以与植物来源的脂质形成复合物。植物来源的脂质可以是脂双层的形式，并且还可以包含包裹VLP的包膜。植物来源的脂质可以包含生产VLP之植物的质膜脂质组分，包括磷脂，三、二和单甘油酯，以及脂溶性固醇或包含固醇的代谢物。实例包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、鞘糖脂、植物固醇或其组合。植物来源的脂质还可称为“植物脂质”。植物固醇的例子包括菜油甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、菜籽甾醇、Δ-7-豆甾醇、Δ-7-燕麦甾醇、daunosterol、谷甾醇，24-甲基胆固醇、胆固醇或β-谷甾醇——参见例如，Mongrand等，2004。本领域技术人员应理解细胞质膜的脂质成分可随获得细胞的细胞或生物或物种的培养或生长条件而异。一般而言，β-谷甾醇是最丰富的植物甾醇。

细胞膜通常包含脂双层以及多种功能的蛋白质。在脂双层中可发现局部集中的特定脂质，称为“脂筏(lipid raft)”。鞘酯和固醇中富含这些脂筏微结构域。不希望受理论限制，脂筏可在胞吞和胞吐作用、病毒或其他感染原的进入或逸出、细胞间信号转导、与细胞或生物的其他结构组分(例如细胞内和细胞外基质)的相互作用中起重要作用。

本发明包括包含嵌合HA的VLP，其中HA的亚结构域可以从可感染人的任何类型、亚型的流感病毒中获得，包括例如B、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16类型或亚型。在一些实施方案中，流感病毒可以是H1、H3、H5或B类型或亚型。H1、H3、H5或B类型或亚型的非限制性例子包括A/新喀里多尼亚/20/99亚型(H1N1)(“H1/NC”；SEQ ID NO：56)、H1A/加利福尼亚/04/09亚型(H1N1)(″H1/Cal″；SEQ ID NO：86)、A/印度尼西亚/5/05亚型(H5N1)(“H5/Indo”)、A/布里斯班/59/2007(“H1/Bri”)和B/佛罗里达/4/2006(“B/Flo”)和H3A/布里斯班/10/2007(“H3/Bri”)。并且，嵌合HA可以包含分离自一种或更多种现有或新鉴定流感病毒的一种或更多种血凝素亚结构域，。

本发明还涉及感染其他哺乳动物或宿主动物的流感病毒，所述动物如人、灵长类、马、猪、鸟类、水禽、候鸟、鹌鹑、鸭、鹅、家禽、鸡、骆驼、犬科动物、狗、猫科动物、猫、虎、豹、麝猫、水貂、石貂、雪貂、宠物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鲸等。一些流感病毒可以感染超过一种宿主动物。

对于流感病毒，本文所用术语“血凝素”或“HA”是指流感病毒颗粒的结构糖蛋白。流感血凝素的结构已有深入的研究，并且显示高度保守的二级、三级和四级结构。即使氨基酸序列变化仍观察到此结构保守性(参见例如Skehel和Wiley，2000 Ann Rev Biochem 69：531-69；Vaccaro等2005，通过引用并入本文)。编码HA的核苷酸序列是公知的并且可获得，参见例如BioDefense and Public Health base(例如URL：biohealthbase.org/GSearch/home.do？decorator＝Influenza)或美国国立生物技术信息中心(NCBI；参见URL：ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore&cmd＝search&term＝influenza)，两者均通过引用并入本文。

HA单体可进一步分为3个功能性结构域——茎结构域或茎结构域簇(SDC)、球状头部结构域或头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)。SDC包含4个亚结构域，融合肽F、F’1和F’2(该亚结构域一般可以称为“骨架”)。TDC包含两个亚结构域，跨膜(TmD)和C端尾部(CT)。HDC包含三个亚结构域，残留酯酶结构域E1’和E2以及受体结合结构域RB。SDC和HDC可以统称为“胞外结构域”。Ha等2002(EMBO J.21：865-875；通过引用并入本文)发表的文献根据X射线结晶结构，阐明了几个流感亚型中SDC和HDC多种亚结构域的相对定位。图1A显示与HA1和HA2多肽N端和C端相关的亚结构域示意图。图1C提供多种流感亚型的标示的结构比对。

流感病毒血凝素中允许氨基酸变化。该变化提供不断被鉴定的新毒株。新毒株之间感染性可以有差异。但是，保持了血凝素三聚体的形成，其随后形成VLP。因此本发明提供了包含嵌合HA的血凝素氨基酸序列或编码在植物中形成VLP的嵌合血凝素氨基酸序列的核酸，并且包括已知序列和可产生的变体HA序列。本发明还涉及包含TDC、SDC和HDC的嵌合HA多肽的用途。例如嵌合HA蛋白可以是HA0，或包含来自两种或更多种流感类型之HA1和HA2亚结构域的经切割嵌合HA。嵌合HA蛋白可以用于使用植物或植物细胞表达系统生产或形成VLP。

HA0可以表达并折叠形成三聚体，然后可组装成VLP。HA0的切割产生HA1和HA2多肽，它们通过二硫桥连接(参见图1C、46和47对二硫桥模式的图解)。对于感染性病毒颗粒，需要前体HA0的切割来引发HA2的构象变化，该变化释放融合肽(在HA2多肽的N端)并使其可用于融合细胞和病毒膜。但是，VLP没有感染性，不需要切割HA形成HA1和HA2(例如在疫苗生产中)。未切割的HA0前体也组装成三聚体并从质膜出芽形成VLP纳米颗粒。

HA0多肽包含几个结构域。HDC的RB亚结构域在抗原区包含几个环，称为位点A-E。可以中和感染性流感病毒的抗体经常靶向一个或更多个这些位点。残留酯酶亚结构域(E1和E2)可在融合中发挥作用，并且可结合Ca++。F、F’1和F’2结构域相互作用并协同形成茎，使得HA三聚体的头部位于膜之上。TmD和CT可参与折叠HA在膜上的锚定。TmD可在HA对脂筏的亲和中发挥作用，而CT可在HA的分泌中发挥作用，并且CT亚结构域中存在的一些半胱氨酸残基可是棕榈酰化的。信号肽(SP)还可存在于HA0多肽的N端。图2以及表4和5提供了一些流感病毒亚型的SP、F’1、F’2、E1、RB、E2和F结构域的氨基酸序列的实例。

在流感血凝素的表达和/或分泌过程中对N端信号肽(SP)序列进行加工可在HA折叠中发挥作用。术语“信号肽”一般是指通常见于血凝素多肽N端的短(约5-30个氨基酸)氨基酸序列，其可指导新翻译的多肽转位至特定细胞器，或者辅助多肽链的特定结构域相对于其他结构域的定位。血凝素的信号肽将蛋白质的转位靶向至内质网，已提出该信号肽辅助近N端结构域相对于新生血凝素多肽之膜锚定结构域的定位，以辅助成熟血凝素的切割和折叠。

HA在宿主细胞内质网(ER)膜内的插入、信号肽切割和蛋白质糖基化是共翻译事件。HA的正确折叠需要蛋白质糖基化和至少6个链内二硫键的形成(参见图46和47)。在图46中，显示甲亚型HA的每个单体具有6个保守二硫桥。通过比较，B HA的单体(图47)具有7个二硫桥，其中5个在甲型中有对应结构(综述见Skehel和Wiley，2000.Ann RevBiochem 69：531-569；在如Gamblin等2004，Science 303：1838-1842中描述了阐释分子内和分子间二硫桥和其他保守氨基酸及其相对位置的结构实例；两者均通过引用并入本文)。本领域技术人员应理解，重要的是制备嵌合HA时保证获得类似排列的二硫桥。

信号肽可以是血凝素中天然存在的，或者信号肽可与被表达血凝素的初级序列异源。嵌合HA可以包含来自第一流感类型、亚型或毒株的信号肽，而其余的HA来自一种或多于一种的不同流感类型、亚型或毒株。例如HA亚型B H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9或乙型流感的天然SP可用于在植物系统中表达HA。在本发明的一些实施方案中，SP可以来自乙型、H1、H3或H5流感；或来自亚型H1/Bri、H1/NC、H5/Indo、H3/Bri或B/Flo。

SP还可以是非天然的，例如来自非流感病毒之病毒的结构蛋白或血凝素，或者来自植物、动物或细菌多肽。可以使用的信号肽的非限制性实例是苜蓿蛋白二硫键异构酶(PDI SP；登记号Z11499的32-103位核苷酸；SEQ ID NO：34；图17)，其具有氨基酸序列：

MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE(32-103位核苷酸；SEQ ID NO：34)。

因此本发明提供了包含天然或非天然信号肽的嵌合流感血凝素和编码该嵌合血凝素的核酸。

血凝素的正确折叠对蛋白质稳定性、多聚体形成、VLP形成和HA的功能(血细胞凝集能力)等流感血凝素特性可以是重要的。蛋白质折叠可受一个或更多个因素影响，包括但不限于：蛋白质序列、蛋白质相对丰度、细胞内拥挤程度、可与折叠的、部分折叠的或未折叠的蛋白质结合或瞬时联合的辅因子的可获得性、一种或更多种伴侣蛋白的存在等。

热休克蛋白(Hsp)或应激蛋白是伴侣蛋白的实例，其可参与多种细胞过程，包括蛋白质合成、细胞内运输、错误折叠的防止、蛋白质凝集的防止、蛋白质复合物的组装和去组装、蛋白质折叠和蛋白质解聚。这样的伴侣蛋白的实例包括但不限于Hsp60、Hsp65、Hsp 70、Hsp90、Hsp100、Hsp20-30、Hsp10、Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、TF55、FKBP、亲环蛋白(cyclophilin)、ClpP、GrpE、泛素、钙联蛋白(calnexin)和蛋白质二硫键异构酶(参见例如Macario，A.J.L.，Cold Spring HarborLaboratory Res.25：59-70.1995；Parsell，D.A.&Lindquist，S.Ann.Rev.Genet.27：437-496(1993)；美国专利No.5,232,833)。如本文所述，伴侣蛋白(例如但不限于Hsp40和Hsp70)可以用于保证嵌合HA的折叠。

Hsp70的实例包括来自哺乳动物细胞的Hsp72和Hsc73、来自细菌特别是分枝杆菌(如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如卡介苗(Bacille-Calmette Guerin)：本文中称为Hsp71))的DnaK。来自大肠杆菌、酵母和其他原核生物的DnaK以及来自真核生物(例如拟南芥(A.thaliana))的BiP和Grp78(Lin等，2001(Cell Stress andChaperones 6：201-208))。Hsp70的具体实例是拟南芥Hsp70(由Genbankref：AY120747.1编码)。Hsp70能够特异性地结合ATP以及未折叠的多肽和肽，从而参与蛋白质折叠和去折叠和蛋白质复合物的组装和去组装。

Hsp40的实例包括来自原核生物(例如大肠杆菌和分枝杆菌)的DnaJ和来自真核生物(例如苜蓿)的HSJ1、HDJ1和Hsp40(Frugis等，1999.Plant Molecular Biology 40：397-408)。Hsp40的具体实例是紫花苜蓿(M.sativa)MsJ1(AJ000995.1或SEQ ID NO：76)。Hsp40在蛋白质折叠、耐热和DNA复制等细胞活动中作为分子伴侣起作用。图41显示编码Msj1的核酸序列(SEQ ID NO：76)。

在Hsp中，Hsp70及其辅伴侣蛋白(co-chaperone)Hsp40参与合成完成前正在翻译的和新合成的多肽的稳定。不希望受理论的限制，Hsp40与未折叠(新生或新转移的)多肽的疏水片区(patch)结合，从而有利于Hsp70-ATP复合物与多肽的相互作用。ATP水解导致多肽、Hsp70和ADP之间形成稳定的复合物并释放Hsp40。Hsp70-ADP复合物与多肽之疏水片区的联合阻止其与其他疏水片区的相互作用，防止不正确折叠和与其他蛋白质的凝集(综述见Hartl，FU.1996.Nature 381：571-579)。

天然伴侣蛋白可能能够利于低水平的重组蛋白质的正确折叠，然而随着表达水平的增加，天然伴侣蛋白的丰富可成为限制因素。农杆菌浸染叶中血凝素的高水平表达可导致血凝素多肽在胞质溶胶中累积，而共表达一种或更多种伴侣蛋白(例如Hsp70、Hsp40或者Hsp70和Hsp40两者)可降低错误折叠或凝集的血凝素多肽的水平，并且增加显示出允许血细胞凝集和/或病毒样颗粒形成之三级和四级结构特性的多肽数。SEQ IDNO：77是构建体号R850从HindIII(在多克隆位点中，启动子上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游)的部分核酸序列，其编码HSP40(下划线)。SEQ ID NO：78是构建体号R860从HindIII(在多克隆位点中，启动子上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游)的部分核酸序列，其编码HSP70(下划线)。SEQ ID NO：79是构建体号R870从HindIII(在多克隆位点中，启动子5’上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游)的部分核酸序列，其编码HSP40(下划线，斜体)和HSP70(下划线)。

因此，本发明还提供了在植物中生产嵌合流感VLP的方法，其中编码嵌合流感HA的第一核酸与编码伴侣蛋白的第二核酸共表达。第一和第二核酸可以在同一步骤中引入植物，或者可以顺次引入植物。

可通过例如血细胞凝集测定、电子显微镜观察或体积排阻色谱来评估VLP的结构和大小。

对于体积排阻色谱，可通过以下方法从植物组织中提取全部可溶性蛋白质：将冷冻粉碎的植物材料在提取缓冲液中匀浆(Polytron)，通过离心除去不溶性物质。用PEG进行沉淀也可以是有利的。定量可溶性蛋白质，并将提取物通过Sephacryl^TM柱。可用蓝葡聚糖2000作为校准标准。在进行色谱后，可通过免疫印迹进一步分析级分以确定级分中的蛋白质成分。

本发明还提供了这样的植物，其包含编码一种或更多种嵌合流感血凝素的核酸和编码一种或更多种伴侣蛋白的核酸。

本发明包括核苷酸序列：

SEQ ID NO：63(构建体690；包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列的嵌合H5/H1表达盒)，SEQ ID NO：63下划线部分编码H5/Indo的SP、F’1、E1-H1/Bri的RB-H5/Indo的E2、F’2、F、TMD/CT；

SEQ ID NO：64(构建体691；包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列的嵌合H5/H1表达盒)，SEQ ID NO：64下划线部分编码H5/Indo的SP、F’1-H1/Bri的E1、RB、E2-H5/Indo的F’2、F、TMD/CT；

SEQ ID NO：65(构建体696；包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列的嵌合H1/H5表达盒)，SEQ ID NO：65下划线部分编码PDI SP-H1/NC的F’1、E1-H5/Indo的RB-H1/NC的E2、F’2、F、TMD/CT；

SEQ ID NO：68(构建体733；包含CaMV 35S启动子、CPMV-HT5’UTR、PDI信号肽编码序列、H1型A/布里斯班/59/07(H1N1)血凝素编码序列、CPMV-HT 3’UTR和NOS终止子序列的SpPDI H1/Bri表达盒)，SEQ ID NO：68的下划线部分编码PDI SP-H1/BRI的F’1、E1、RB、E2、F’2、F、TMD/CT；

SEQ ID NO：69(构建体734；包含CaMV 35S启动子、CPMV-HT5’UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMV-HT 3’UTR和NOS终止子序列的嵌合H5/H1表达盒)。嵌合HA的编码序列用下划线表示，其编码与SEQID NO：63相同的嵌合HA；

SEQ ID NO：71(构建体736；包含CaMV 35S启动子、CPMV-HT5’UTR、PDI信号肽编码序列、H3型A/布里斯班/10/07(H2N3)血凝素编码序列、CPMV-HT 3’UTR和NOS终止子序列的HA表达盒)，SEQ IDNO：71的下划线部分编码PDI SP-H3/Bri的F’1、E1、RB、E2、F’2、F、TMD/CT；

SEQ ID NO：72(构建体737；包含CaMV 35S启动子、CPMV-HT5’UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMV-HT 3’UTR和NOS终止子序列的嵌合H5/H3表达盒)，SEQ ID NO：72下划线部分编码PDI SP-H5/Indo的F’1、E1、RB、E2、F’2、F、TMD/CT；

SEQ ID NO：74(构建体739；包含CaMV 35S启动子、CPMV-HT5’UTR、PDI信号肽编码序列、HA型B/佛罗里达/4/06的血凝素编码序列、CPMV-HT 3’UTR和NOS终止子序列的HA表达盒)，SEQ ID NO：74的下划线部分编码PDI SP-B/Flo的F’1、E1、RB、E2、F’2、F、TMD/CT；

SEQ ID NO：75(构建体734；包含CaMV 35S启动子、CPMV-HT5’UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMV-HT 3’UTR和NOS终止子序列的嵌合H5/B表达盒)，SEQ ID NO：75下划线部分编码PDI SP-B/Flo的F’1、E1、RB、E2、F’2、F-H5/Indo的TND/CT。

本发明还包括在严格杂交条件下与任一SEQ ID NO：63-65、68、69和71-75下划线部分杂交的核苷酸序列。本发明还包括在严格杂交条件下与任一SEQ ID NO：63-65、68、69和71-75下划线部分的互补序列杂交的核苷酸序列。这些与SEQ ID NO：63-65、68、69和71-75下划线部分或SEQ ID NO：63-65、68、69和71-75下划线部分的互补序列杂交的核苷酸序列编码嵌合血凝素蛋白，其表达形成嵌合VLP，并且当施用给对象时，嵌合VLP诱导抗体产生。例如，所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合VLP，所述嵌合VLP可用于产生能结合HA(包括一种或更多种流感类型或亚型的成熟HA、HA0、HA1或HA2)的抗体，当施用给对象时，所述VLP诱导免疫应答。

严格杂交条件下的杂交是本领域已知的(参见例如Current Protocolsin Molecular Biology，Ausubel等编，1995及增刊；Maniatis等，MolecularCloning(A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，1982；Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，2001；每个均通过引用并入本文)。一种该严格杂交条件的实例可以是在65℃下于4×SSC中杂交约16-20小时，然后在65℃下于0.1×SSC中清洗1小时，或在65℃下于0.1×SSC中清洗两次(每次20或30分钟)。或者，一个示例性严格杂交条件可以是在42℃下于50％甲酰胺，4×SSC中过夜(16～20小时)，然后在65℃下于0.1×SSC中清洗1小时，或在65℃下于0.1×SSC中清洗2次(每次20或30分钟)，或者过夜(16～20小时)，或者在65℃下于Church水性磷酸盐缓冲液(7％SDS；0.5M NaPO₄缓冲液pH 7.2；10mM EDTA)中杂交，在50℃下于0.1×SSC，0.1％SDS中清洗2次(每次20或30分钟)，或者在65℃下于2×SSC，0.1％SDS中清洗2次(每次20或30分钟)。

此外，本发明包括这样的核苷酸序列，其特征为与编码任一SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75下划线部分之嵌合HA的核苷酸序列有约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任意量的序列同一性或序列相似性，其中该核苷酸序列编码血凝素蛋白，其在表达时形成嵌合VLP，该嵌合VLP诱导抗体产生。例如，所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合VLP，该嵌合VLP可用于产生能结合HA(包括成熟HA、HA0、HA1或HA2)的抗体，当施用给对象时，所述VLP诱导免疫应答。

“免疫应答”一般是指获得性免疫系统的应答。获得性免疫系统通常包括体液应答和细胞介导的应答。体液应答是由B淋巴细胞谱系的细胞(B细胞)产生的分泌抗体所介导的免疫方面。分泌抗体结合入侵微生物(例如病毒或细菌)表面上的抗原，标示它们以进行破坏。体液免疫一般是指抗体产生和伴随其的过程，以及抗体的效应物功能，包括Th2细胞活化和细胞因子产生、记忆细胞形成、调理素促进胞吞作用、病原体清除等。术语“调节”是指根据通常知晓或使用的任意测定法(其中一些在本文中举例说明)测定的特定应答或参数的升高或降低。

细胞介导的应答是这样的免疫应答，其不涉及抗体，而涉及巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的活化，以及多种细胞因子应答于抗原的释放。细胞介导的免疫一般指一些Th细胞的活化、Tc细胞的活化和T细胞介导的应答。细胞介导的免疫在对病毒感染的应答中尤为重要。

例如，可使用ELISPOT测定来测量对抗原特异性CD8阳性T淋巴细胞的诱导；可使用增殖测定来测量对CD4阳性T淋巴细胞的刺激。可使用ELISA测定来定量抗流感病毒抗体的效价；还可使用抗同种型抗体(例如抗IgG、抗IgA、抗IgE或抗IgM)来测量抗原特异性或交叉反应性抗体的同种型。实施这些测定的方法和技术是本领域公知的。

血细胞凝集抑制(HI或HAI)测定也可用于证明由疫苗或疫苗组合物诱导的抗体的效力，所述疫苗或疫苗组合物包含可抑制由重组HA所致之红血细胞(RBC)凝集的嵌合HA或嵌合VLP。血清样品的血细胞凝集抑制性抗体效价可通过微量滴定HAI来评估(Aymard等，1973)。可使用任何来自几个物种的红细胞，例如马、火鸡、鸡等。该测定给出有关HA三聚体在VLP表面上组装的间接信息，证实HA抗原位点的正确展示。

交叉反应性HAI滴定还可用于证明免疫应答对与疫苗亚型相关的其他病毒株的效力。例如，可以在HAI测定中将用包含嵌合血凝素(包含第一流感类型或亚型的HDC)之疫苗组合物免疫的对象的血清与第二株全病毒或病毒颗粒一起使用，并且测定HAI效价。

不希望受理论限制，HA结合来自不同动物之RBC的能力是由HA对α2，3或α2，6键合唾液酸的亲和力以及这些唾液酸在RBC表面上的存在来驱动的。马和禽类的流感病毒HA使来自所有几个物种(包括火鸡、鸡、鸭、豚鼠、人、绵羊、马和牛)的红细胞凝集；而人HA结合火鸡、鸡、鸭、豚鼠、人和绵羊的红细胞(Ito T.等，1997，Virology，卷227，493-499；以及Medeiros R等，2001，Virology，卷289，74-85)。

细胞因子的存在或水平也可以被定量。例如，用ELISA(例如BDBiosciences OptEIA试剂盒)测量IFN-γ和IL-4分泌细胞来表征T辅助细胞应答(Th1/Th2)。可培养从对象得到的外周血单核细胞(PBMC)或脾细胞，并分析上清。还可使用标志物特异性荧光标记和本领域已知方法，通过荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)对T淋巴细胞定量。

还可进行微量中和测定来表征对象中的免疫应答，参见例如Rowe等，1973的方法。可通过几种方法得到病毒中和效价，包括：1)在对细胞进行结晶紫固定/着色之后，计数裂解斑(空斑测定)；2)显微镜观察培养物中的细胞裂解；3)对NP病毒蛋白(与病毒感染宿主细胞有关)进行ELISA和分光光度检测。

序列同一性或序列相似性可利用序列比较程序来确定，例如DNASIS所提供的(例如，使用但不限于下述参数：空隙罚分5、顶部对角线数(#of top diagonal)5、固定的空隙罚分10、k元祖2、游隙10，窗口大小5)。然而，其他用于比较的序列比对方法是本领域熟知的，例如Smith&Waterman算法(1981，Adv.Appl.Math.2：482)、Needleman&Wunsch算法(J.Mol.Biol.48：443，1970)、Pearson&Lipman算法(1988，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444)，以及这些算法的计算机执行(例如GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST(Altschul等，1990.J.Mol Biol215：403-410))，或者通过人工比对和目视检查。可以对核酸或氨基酸序列进行比较或比对，并使用任何现有技术已知的几种软件包测定共有序列，例如MULTALIN(Corpet F.，1988，Nucl Acids Res.，16(22)，10881-10890)、BLAST、CLUSTAL等；或者可以人工比对序列并确定序列间的相似度和差异。

蛋白质、融合蛋白或多肽的片段或部分包含含有特定蛋白质或多肽之一部分氨基酸组成的肽或多肽，前提是在表达时所述片段可形成嵌合VLP。例如所述片段可以包含抗原性区域、应激应答诱导区域或含有蛋白质或多肽之功能性结构域的区域。所述片段还可包含同一总家族的蛋白质共有的区域或结构域，或者片段可包含足以特异性鉴定其来源全长蛋白质的氨基酸序列。

例如，片段或部分可包含蛋白质全长的约60％至约100％或其间任意量，前提是在表达时该片段可形成嵌合VLP。例如，蛋白质全长的约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％，或其间任意量。或者，根据嵌合HA，片段或部分可以为约150至约500个氨基酸或其间任意量，前提是在表达时所述片段可形成嵌合VLP。例如，根据嵌合HA，片段或部分可以为约150至约500个氨基酸或其间任意量、约200至约500个氨基酸或其间任意量、约250至约500个氨基酸或其间任意量、约300至约500个氨基酸或其间任意量、约350至约500个氨基酸或其间任意量、约400至约500个氨基酸或其间任意量、约450至约500个氨基酸或其间任意量，前提是在表达时片段可形成嵌合VLP。例如，可从嵌合HA蛋白的C端、N端或者N和C两端去除约5、10、20、30、40或50个氨基酸或其间任意量，前提是在表达时所述片段可形成嵌合VLP。

任意给定序列中的氨基酸编号是相对于该特定序列的，然而，本领域技术人员可根据结构和/或序列容易地确定序列中特定氨基酸的“等同性”。例如，如果去除了6个N端氨基酸，那么这将改变氨基酸的具体编码标识(例如，相对于蛋白质全长而言)，但是不会改变结构中氨基酸的相对位置。

本发明描述了(但不限于)在植物、植物部分或植物细胞中编码嵌合HA的核酸的表达，以及适于生产疫苗的植物中生产嵌合流感VLP。这些核酸的实例包括但不限于，例如SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75。

本发明还提供了在植物、植物部分或植物细胞中表达编码嵌合HA的核酸(例如但不限于SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQID NO：74、SEQ ID NO：75)，以及在转化的植物细胞中生产包含重组流感结构蛋白的候选流感疫苗或试剂，所述重组流感结构蛋白自组装成功能性和免疫原性的同型大分子蛋白结构，包括亚病毒流感颗粒和嵌合流感VLP。

因此，本发明提供了嵌合VLP，和通过表达单个嵌合包膜蛋白在植物表达系统中生产嵌合VLP的方法。

编码流感亚型嵌合HA的核酸(例如SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75)可以通过使用HA RNA通过反转录和聚合酶链式反应(PCR)合成。例如，可以从H1/NC、H1/Bri、H3/Bri、B/Flo或H5/Indo中或者从感染了这些或其他流感病毒类型或亚型的细胞中分离RNA。对于反转录和PCR，可以使用HA RNA特异性寡核苷酸引物。另外，编码嵌合HA的核酸可以使用本领域技术人员已知的方法化学合成。

本发明还涉及包含编码嵌合HA之核酸(如上所述，其与在植物中有效的调控元件有效连接)的基因构建体。在植物细胞中有效并可用于本发明的调控元件的实例包括但不限于质体蓝素调控区(US 7,125,978；其通过引用并入本文)或核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO；US4,962,028；其通过引用并入本文)、叶绿素a/b结合蛋白(CAB；Leutwiler等；1986；其通过引用并入本文)、ST-LS1(与光系统II的放氧复合物相关，描述于Stockhaus等1987、1989中；其通过引用并入本文)的调控区。

本发明的基因构建体还包含组成型启动子，其指导与启动子有效连接的基因在植物各部分中表达并在整个植物发育过程中持续表达。组成型启动子的一个非限制性的实例是与CaMV 35S转录本相关的组成型启动子(例如，Odell等，1985，Nature，313：810-812，通过引用并入本文)。

包含质体蓝素调控区的序列的实例是SEQ ID NO：58的序列5’端至编码PDI信号肽的下划线序列。调控元件或调控区可增强与其有效连接的核苷酸序列的翻译，其中核苷酸序列可编码蛋白质或多肽。调控区的另一实例是源自豇豆花叶病毒(Cowpea Mosaic Virus，CPMV)非翻译区的调控区，其可用于优先翻译与其有效连接的核苷酸序列。这一CPMV调控区用于可过量翻译的CMPV-HT系统中，参见例如Sainsbury等，2008，Plant Physiology 148：1212-1218；Sainsbury等，2008 Plant BiotechnologyJournal 6：82-92，两者均通过引用并入本文)。

因此，本发明的一方面提供了包含与编码嵌合流感HA之序列有效连接的调控区的核酸。所述调控区可以是质体蓝素调控元件，所述嵌合流感HA可包含来自H5/Indo、H1/Bri、H3/Bri、H1/NC、B/Flo流感类型、亚型或毒株的亚结构域。包含质体蓝素调控元件和嵌合流感HA的核酸序列在本文中通过SEQ ID NO：63和64示例。包含35S调控元件和嵌合流感HA的核酸序列在本文中通过SEQ ID NO：68、69和71-75示例。

在另一方面，本发明提供包含CPMV调控区和嵌合流感HA(包含来自H5/Indo、H1/Bri、H3/Bri、H1/NC、B/Flo流感类型、亚型或毒株的亚结构域)的核酸。包含CPMP调控元件和嵌合HA的核酸序列在本文中通过SEQ ID NO：66-69和71-75示例。

在植物中产生的嵌合流感VLP从质膜中出芽，因而嵌合VLP的脂质组成反映产生它们的植物细胞或植物组织类型。根据本发明生产的VLP包含两种或多于多种类型或亚型流感的嵌合HA，其与植物来源的脂质复合。植物脂质可刺激特异免疫细胞并增强所诱导的免疫应答。

植物脂质如PC(磷脂酰胆碱)和PE(磷脂酰乙醇胺)以及鞘糖脂可结合哺乳动物免疫细胞(例如抗原呈递细胞(APC)，如树突状细胞和巨噬细胞)和其他细胞(包括胸腺和肝脏中的B淋巴细胞和T淋巴细胞)表达的CD1分子。(综述见Tsuji M.2006 Cell Mol Life Sci 63：1889-98)。CD1分子在结构上与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子相似，其作用是将糖脂抗原呈递给NKT细胞(自然杀伤T细胞)。活化后，NKT细胞激活固有免疫细胞(例如NK细胞和树突状细胞)并且还激活获得性免疫细胞(例如产生抗体的B细胞和T细胞)。

存在于与脂双层(例如质膜来源的包膜)复合之流感VLP中的植物固醇可提供有利的疫苗组合物。不希望受理论限制，与脂双层(例如质膜来源的包膜)复合的由植物生产的VLP(包括包含嵌合HA的VLP)比在其他表达系统中制得的VLP可诱导更强的免疫反应，并且可与由活或减毒全病毒疫苗所诱导的免疫反应相似。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了与植物来源的脂双层复合的VLP(包含嵌合HA)。在一些实施方案中，所述植物来源的脂双层可包括VLP的包膜。

在植物内生产的VLP可包含含有植物特异性N-聚糖的嵌合HA。因此，本发明还提供了包含具有植物特异性N-聚糖的嵌合HA的VLP。

此外，植物中N-聚糖的修饰是已知的(参见例如WO 2008/151440；其通过引用并入本文)，并且可产生含有经修饰N-聚糖的嵌合HA。可得到包含经修饰糖基化模式(例如岩藻糖基化减少、木糖基化减少、或岩藻糖基化和木糖基化二者均减少)之N-聚糖的HA，或者可得到含有经修饰糖基化模式的嵌合HA，其中蛋白质缺少岩藻糖基化、木糖基化或两者皆缺少，并包含增加的半乳糖基化。此外，与表达嵌合HA的野生型植物相比，翻译后修饰的调节(例如末端添加半乳糖)可导致所表达嵌合HA的岩藻糖基化和木糖基化降低。

例如(但不视为限制)，合成具有经修饰糖基化模式的嵌合HA可通过使目的蛋白质与编码β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)(例如但不限于哺乳动物GalT或人GalT，然而也可以使用其他来源的GalT)的核苷酸序列共表达来实现。还可将GalT的催化结构域与N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶(GNT1)的CTS结构域(即胞质尾、跨膜结构域、茎区)融合以产生GNT1-GalT杂合酶，并且该杂合酶可与HA共表达。HA还可与编码N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶III(GnT-III)(例如但不限于哺乳动物GnT-III或人GnT-III，还可使用其他来源的GnT-III)的核苷酸序列共表达。另外，还可使用包含与GnT-III融合的GNT1之CTS的GNT1-GnT-III杂合酶。

因此，本发明还包括含有嵌合HA的VLP，所述嵌合HA具有经修饰的N-聚糖。

不希望受理论限制，嵌合HA上存在的植物N-聚糖可通过促进抗原呈递细胞与HA的结合来刺激免疫应答。Saint-jore-Dupas等(TrendsBiotechnol 25：317-23，2007)已提出使用植物N聚糖来刺激免疫应答。此外，VLP的构象对于抗原呈递可以是有利的，并且当与植物来源的脂质层复合时增强VLP的佐剂作用。

“调控区”、“调控元件”或“启动子”是指通常(但不总是)位于基因的蛋白质编码区上游的一部分核酸，其可由DNA或RNA或者DNA和RNA两者构成。当调控区有活性并与目的基因有效相连或有效连接时，可导致目的基因的表达。调控元件可以介导器官特异性，或控制发育基因或时序基因的活化。“调控区”包括启动子元件、显示启动子基础活性的核心启动子元件、可响应于外部刺激而被诱导的元件、介导启动子活性的元件(例如负调控元件或转录增强子)。本文所用的“调控区”还包括在转录后具有活性的元件，例如调节基因表达的调控元件，例如翻译增强子和转录增强子、翻译抑制子和转录抑制子、上游激活序列和mRNA不稳定性决定子(mRNA instability determinant)。这后几种元件中有几种可位于编码区附近。

在本公开内容中，术语“调控元件”或“调控区”一般是指通常(但不总是)位于结构基因编码序列上游(5’)的DNA序列，其通过提供转录在特定位点起始所需的RNA聚合酶和/或其他因子的识别来控制编码区表达。然而，应当理解的是，位于内含子中或序列3’的其他核苷酸序列也可对调控目的编码区的表达有贡献。为确保在特定位点起始而为RNA聚合酶或其他转录因子提供识别的调控元件的一个实例是启动子元件。大多数(但不是全部)真核生物启动子元件包含TATA盒，其是由腺苷和胸苷核苷酸碱基对组成的保守核酸序列，通常位于转录起始位点上游约25个碱基对处。启动子元件包含负责起始转录的基础启动子元件以及调节基因表达的其他调控元件(如上文所述)。

存在几种类型的调控区，包括受发育调节的、诱导型的或组成型的调控区。受发育调节的调控区或对所控制基因的差异性表达进行控制的调控区在特定器官或器官之组织中、在该器官或组织发育过程的特定时间被活化。然而，受发育调节的一些调控区也可偏好性地在某些器官或组织的特定发育阶段具有活性，它们还可以以受发育调节的方式具有活性，或在植物的其他器官或组织内为基础水平。组织特异性调控区(例如参见特异性调控区)的实例包括napin启动子和cruciferin启动子(Rask等，1998，J.Plant Physiol.152：595-599；Bilodeau等，1994，Plant Cell 14：125-130)。叶特异性启动子的实例包括质体蓝素启动子(参见例如SEQ ID NO：58)；US 7,125,978，其通过引用并入本文。

诱导型调控区是能够响应于诱导物而直接或间接激活一种或更多种DNA序列或基因之转录的调控区。当不存在诱导物时，DNA序列或基因不会被转录。通常，特异性结合诱导型调控区以激活转录的蛋白因子可以以无活性形式存在，然后被诱导物直接或间接转化成活性形式。然而，也可以不存在蛋白因子。诱导物可以是化学剂，例如蛋白质、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或通过热、冷、盐或毒性元素直接施加的生理压力，或通过病原体或致病剂(例如病毒)的作用间接施加的生理压力。可通过向细胞或植物外部施加诱导物(例如通过喷洒、浇水、加热或类似方法)使含有诱导型调控区的植物细胞暴露于诱导物。诱导型调控元件可来源于植物基因或非植物基因(例如Gatz，C.和Lenk，I.R.P.，1998，Trends Plant Sci.3，352-358，其通过引用并入本文)。可用的诱导型启动子的实例包括但不限于四环素诱导型启动子(Gatz，C.，1997，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，89-108，其通过引用并入本文)、类固醇诱导型启动子(Aoyama，T.和Chua，N.H.，1997，Plant J.2，397-404，其通过引用并入本文)和乙醇诱导型启动子(Salter，M.G等，1998，PlantJournal 16，127-132；Caddick，M.X.等，1998，Nature Biotech.16，177-180，其通过引用并入本文)、细胞分裂素诱导型IB6和CKI1基因(Brandstatter，I.和Kieber，J.J.，1998，Plant Cell 10，1009-1019；Kakimoto，T.，1996，Science 274，982-985，其通过引用并入本文)以及生长素诱导型元件DR5(Ulmasov，T.等，1997，Plant Cell 9，1963-1971，其通过引用并入本文)。

组成型调控区指导基因在植物各部分表达并在整个植物发育过程中持续表达。已知的组成型调控元件的实例包括与以下相关的启动子：CaMV 35S转录本(Odell等，1985，Nature，313：810-812)、水稻肌动蛋白1(Zhang等，1991，Plant Cell，3：1155-1165)、肌动蛋白2(An等，1996，Plant J.，10：107-121)或tms 2(U.S.5,428,147，其通过引用并入本文)以及磷酸丙糖异构酶1基因(Xu等，1994，Plant Physiol.106：459-467)、玉米泛素1基因(Cornejo等，1993，Plant Mol.Biol.29：637-646)、拟南芥泛素1和6基因(Holtorf等，1995，Plant Mol.Biol.29：637-646)、烟草翻译起始因子4A基因(Mandel等，1995，Plant Mol.Biol.29：995-1004)。本文所用的术语“组成型”不一定指受所述组成型调控区控制的基因在所有细胞类型中以相同水平表达，而是指基因在多种细胞类型中表达，尽管常常观察到不同的丰度。组成型调控元件可与其他序列偶联以进一步增强与其有效连接之核苷酸序列的转录和/或翻译。例如，CMPV-HT系统源自豇豆花叶病毒(CPMV)的非翻译区，并显示增强相关编码序列的翻译。

“天然”是指核酸或氨基酸序列是天然存在的，或“野生型”。

“有效连接”是指特定序列(例如调控元件与目的编码区)直接或间接地相互作用以实现预定功能(例如介导或调节基因表达)。例如有效连接的序列之间的相互作用可通过与所述有效连接之序列相互作用的蛋白质来介导。

本发明的一种或更多种核苷酸序列可在被本发明核苷酸序列、或构建体或载体转化的任意合适的植物宿主中表达。合适宿主的实例包括但不限于农作物，包括苜蓿、油菜、芸苔属(Brassica spp.)、玉米、烟草属(Nicotianaspp.)、苜蓿、马铃薯、人参、豌豆、燕麦、水稻、大豆、小麦、大麦、向日葵、棉花等。

本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可包含3’非翻译区。3’非翻译区是指这样的基因部分，其包含含有多腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达之任意其他调控信号的DNA区段。多腺苷酸化信号的特征一般在于向mRNA前体的3’端添加多腺苷酸链。多腺苷酸化信号常通过存在经典形式5’AATAAA-3’的同源物来鉴定，但是也会出现变体。

合适的3’区的非限制性实例是含有以下基因的多腺苷酸化信号的3’转录的非翻译区：农杆菌致瘤(Ti)质粒基因(例如胭脂氨酸合酶(Nos基因))以及植物基因(例如大豆贮藏蛋白基因)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚基基因(ssRUBISCO；US 4,962,028，其通过引用并入本文)、用于调节质体蓝素表达的启动子(描述于US 7,125,978(其通过引用并入本文))。

本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可以进一步包括增强子，根据需要可以是翻译或转录增强子。增强子可以位于被转录序列的5’或3’。增强子区域是本领域技术人员公知的，并且可包括ATG起始密码子、邻近序列等。如果存在起始密码子，则其可在编码序列的读码框的相(phase)中(“框内”(“in frame”))，以提供转录序列的正确翻译。

为了帮助鉴定转化的植物细胞，可进一步处理本发明的构建体使其包含植物选择标记。可用的选择标记包括提供针对化学品(例如抗生素，如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素；或除草剂，如膦丝菌素(phosphinothrycin)、草甘膦、氯磺隆等)的抗性的酶。类似地，可使用产生可通过颜色变化进行鉴定之化合物的酶(例如GUS(β-葡萄糖醛酸酶))或提供发光的酶(如萤光素酶或GFP)。

认为是本发明一部分的还有包含本发明嵌合基因构建体的转基因植物、植物细胞或种子。由植物细胞再生完整植物的方法也是本领域已知的。一般而言，将转化植物细胞培养在合适的培养基中，所述培养基可包含选择剂(例如抗生素)，其中使用选择标记以帮助鉴定转化的植物细胞。愈伤组织形成后，可根据已知方法应用合适的植物激素来促进芽的形成，将芽移至生根培养基中以再生植物。然后，通过种子或利用植物无性繁殖技术，植物可用于建立可重复的世代。还可以不使用组织培养物来形成转基因植物。

认为是本发明一部分的还有包含嵌合基因构建体的转基因植物、树木、酵母、细菌、真菌、昆虫和动物细胞，所述嵌合基因构建体含有编码本发明之用于产生VLP的重组嵌合HA或HA0的核酸。

为了在多种可用于转化或瞬时表达的宿主生物中表达，还可以将本发明的调控元件与目的编码区相组合。这样的生物包括但不限于植物(单子叶植物和双子叶植物)，例如但不限于玉米、谷类植物、小麦、大麦、燕麦、烟草属、芸苔属、大豆、菜豆、豌豆、苜蓿、马铃薯、番茄、人参和拟南芥。

用于这些生物的稳定转化和再生的方法已在本领域中建立并且是本领域技术人员已知的。获得转化植物和再生植物的方法对本发明来说不是关键的。

“转化”是指表现为基因型、表型或二者兼有的遗传信息(核苷酸序列)在种间转移。遗传信息从嵌合构建体向宿主的种间转移可以是可遗传的并且认为遗传信息的转移是稳定的，或者转移可以是瞬时的并且遗传信息的转移是不可遗传的。

术语“植物物质”是指来源于植物的任何材料。植物物质可包括完整植物、组织、细胞或其任意部分。此外，植物物质可包括细胞内植物组分、细胞外植物组分、植物的液体或固体提取物或者其组合。此外，植物物质可包括来自植物叶、茎、果实、根或其组合的植物、植物细胞、组织、液体提取物或其组合。植物物质可包括未进行任何处理步骤的植物或其部分。植物的一部分可包含植物物质。然而，还考虑可对所述植物材料施加下定义的最少处理步骤或更严格的处理，包括使用本领域公知的技术(包括但不限于色谱、电泳等)进行部分或大量蛋白质纯化。

术语“最少处理”是指部分纯化包含目的蛋白的植物物质(例如植物或其部分)以得到植物提取物、匀浆、植物匀浆的级分等(即最少处理)。部分纯化可包括但不限于破坏植物细胞结构从而产生含有可溶性植物组分和不溶性植物组分的组合物，不溶性植物组分可通过例如但不限于离心、过滤或其组合进行分离。在此方面，可使用真空或离心提取容易地获得叶或其他组织的细胞外间隙中分泌的蛋白质，或可以通过穿过滚轴或研磨等在压力下进行组织提取，从而将蛋白从细胞外间隙中挤压或释放。最少处理还可包括制备可溶性蛋白质的粗提物，因为这些制备物中将具有可忽略的来自次级植物产物的污染。另外，最少处理可包括从叶中水性提取可溶性蛋白质，然后用任意合适的盐进行沉淀。其他方法可包括大规模的浸渍和汁液提取，以允许直接使用提取物。

可将植物物质(形式为植物材料或组织)经口递送给对象。植物物质可作为膳食补充剂的一部分与其他食物一起施用，或者被装入胶囊中。植物物质或组织还可以被浓缩以改善或增进适口性，或者按照需要与其他材料、成分或药物赋形剂一起提供。

可施用本发明VLP的对象或目标生物的实例包括但不限于人、灵长类、鸟类、水禽、候鸟、鹌鹑、鸭、鹅、家禽、鸡、猪、绵羊、马科动物、马、骆驼、犬科动物、狗、猫科动物、猫、虎、豹、麝猫、水貂、石貂、雪貂、宠物、家畜、兔、小鼠、大鼠、豚鼠或其他啮齿动物、海豹、鲸等。这些目标生物是示例性的，并且不视为限制本发明的应用和用途。

考虑根据需要和情形，以多种方式将含有本发明一些实施方式的嵌合HA或表达含有本发明一些实施方式之嵌合HA的VLP的植物施用给对象或目标生物。例如，可在使用之前将得自植物的嵌合HA以粗提物、部分纯化或纯化的形式被提取。如果嵌合HA是至少部分纯化的，那么其可以在可食用植物或不可食用植物中产生。此外，如果经口施用嵌合HA，则可以收集植物组织并直接给对象食用，或者可在食用之前干燥收集的组织，或者可以不预先收集而使动物在植物上进食。认为在本发明范围内的还有将收集的植物组织作为动物饲料的食物补充剂。如果向动物饲喂的植物组织不进行或几乎不进行进一步处理，则优选所施用的植物组织是可食用的。

转录后基因沉默(PTGS)可参与限制转基因在植物中的表达，来自马铃薯Y病毒的沉默抑制子(HcPro)的共表达可用于抵抗转基因mRNA的特异性降解(Brigneti等，1998)。可替代的沉默抑制子是本领域熟知的，并且可如本文所述使用(Chiba等，2006，Virology 346：7-14，其通过引用并入本文)，例如但不限于TEV-p1/HC-Pro(烟草蚀纹病毒-p1/HC-Pro)、BYV-p21、番茄丛矮病毒的p19(TBSV p19)、番茄皱缩病毒的衣壳蛋白(TCV-CP)、黄瓜花叶病毒的2b(CMV-2b)、马铃薯X病毒的p25(PVX-p25)、马铃薯M病毒的p11(PVM-p11)、马铃薯S病毒的p11(PVS-p11)、蓝莓枯黄病毒的p16(BScV-p16)、柑橘衰退病毒(Citrustristexa virus)的p23(CTV-p23)、葡萄卷叶相关病毒-2的p24(GLRaV-2p24)、葡萄病毒A的p10(GVA-p10)、葡萄病毒B的p14(GVB-p14)、白芷潜伏性病毒(Heracleum latent virus)的p10(HLV-p10)或大蒜普通潜伏性病毒的p16(GCLV-p16)。因此，沉默抑制子(例如但不限于HcPro、TEV-p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSV p19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-p14、HLV-p10、GCLV-p16或GVA-p10)可与编码目的蛋白的核酸序列共表达以进一步确保在植物中生产高水平的蛋白质。

此外，如本文所述生产的VLP不包含神经氨酸酶(NA)。然而，如期望包含HA和NA的VLP，可以将NA与HA共表达。

因此，本发明还包括合适的载体，其含有适用于稳定或瞬时表达系统中的嵌合HA序列。还可在一种或多于一种的构建体中提供遗传信息。例如，可将编码目的蛋白的核苷酸序列引入一种构建体，将编码修饰目的蛋白糖基化之蛋白质的第二核苷酸序列引入单独的构建体中。然后，可将这些核苷酸序列在植物中共表达。然而，也可使用这样的构建体，其包含编码目的蛋白和修饰目的蛋白糖基化之蛋白质两者的核苷酸序列。在此情形中，核苷酸序列将包含第一序列和第二序列，所述第一序列包含与启动子或调控区有效连接的编码目的蛋白的第一核酸序列，所述第二序列包含编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的第二核酸序列，该第二核酸序列与启动子或调控区有效连接。

“共表达”是指两种或两种以上核苷酸序列大致同时在植物中以及在植物的同一组织中表达。然而，核苷酸序列不必严格地同时表达。而是两种或更多种核苷酸序列的表达方式使得所编码产物有机会相互作用。例如，修饰目的蛋白糖基化的蛋白质可在目的蛋白表达前或表达期间表达，使得发生对目的蛋白的糖基化修饰。可使用瞬时表达系统共表达两种或两种以上的核苷酸序列，其中所述两种或更多种序列大致同时在适于这两种序列表达的条件下被引入植物中。或者，可以用编码目的蛋白的额外序列以瞬时或稳定方式转化含有核苷酸序列之一(例如编码修饰目的蛋白糖基化模式的蛋白质的序列)的平台植物(platform plant)。在此情形中，编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的序列可在期望的发育阶段表达在期望的组织内表达，或者可使用诱导型启动子诱导其表达，而编码目的蛋白的额外序列可在相似条件下在同一组织内表达，以确保核苷酸序列的共表达。

可使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔、侵染等将本发明的构建体引入植物细胞中。这些技术的综述参见例如Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academy Press，纽约VIII，421-463页(1988)；Geierson和Corey，PlantMolecular Biology，第2版(1988)以及Miki和Iyer，Fundamentals of GeneTransfer in Plants.Plant Metabolism，第2版，DT.Dennis，DH Turpin，DDLefebrve，DB Layzell(编)，Addison Wesly，Langmans Ltd.London，561-579页(1997)。其他方法包括直接DNA摄取、使用脂质体、电穿孔(例如使用原生质体)、显微注射、微弹(microprojectile)或whisker以及真空侵染。参见例如Bilang等(Gene 100：247-250(1991))、Scheid等(Mol.Gen.Genet.228：104-112，1991)、Guerche等(Plant Science 52：111-116，1987)、Neuhause等(Theor.Appl Genet.75：30-36，1987)、Klein等，Nature 327：70-73(1987)、Howell等(Science 208：1265，1980)、Horsch等(Science 227：1229-1231，1985)、DeBlock等，Plant Physiology 91：694-701，1989)、Liu和Lomonossoff(J.Virol Meth，105：343-348，2002)；美国专利No.4,945,050；5,036,006；5,100,792；6,403,865；5,625,136(所有这些文献均通过引用并入本文)。

可使用瞬时表达法表达本发明的构建体(参见Liu和Lomonossoff，2002，Journal of Virological Methods，105：343-348，其通过引用并入本文)。或者，可使用基于真空的瞬时表达法，如Kapila等1997 Plant Science122：101-108(其通过引用并入本文)所述。这些方法可包括，例如但不限于农杆菌接种法或农杆菌侵染法，然而，也可使用如上文所述的其他瞬时方法。使用农杆菌接种法或农杆菌侵染时，含有期望核酸的农杆菌混合物进入组织(例如叶、植物的地上部分(包括茎、叶和花)、植物的其他部分(茎、根、花)或整个植株)的细胞间隙中。穿过表皮后，农杆菌感染细胞并将t-DNA拷贝移至细胞中。t-DNA以附加体形式转录并且mRNA被翻译，使目的蛋白在感染细胞中产生，然而，t-DNA在核内的传代是瞬时的。

本发明提供的包含嵌合HA的VLP可与现有流感疫苗组合使用，以补充所述疫苗使其更加有效，或降低所需的施用剂量。如本领域技术人员所已知的，疫苗可针对一种或更多种流感病毒。合适的疫苗的实例包括但不限于从Sanofi-Pasteur、ID Biomedical、Merial、Sinovac、Chiron、Roche、MedImmune、GlaxoSmithKline、Novartis、Sanofi-Ayentis、Serono、Shire Pharmaceuticals等购得的疫苗。

如期望，可将本发明的VLP与本领域技术人员已知的合适佐剂混合。此外，VLP可用于疫苗组合物，其含有用于治疗上述靶标生物的有效剂量VLP。此外，根据本发明生产的VLP可与使用不同流感蛋白质(例如神经氨酸酶(NA))得到的VLP相组合。

因此，本发明提供了用于诱导动物或靶标生物中针对流感病毒感染的免疫的方法，其包括施用有效剂量的疫苗，所述疫苗含有一种或多于一种VLP。疫苗可经口、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下施用。

本发明多个实施方案的组合物可包含两种或更多种流感毒株或亚型的VLP。“两种或更多种”是指两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种毒株或亚型。所示毒株或亚型可以是单一亚型(例如，所有都为H1N1，或所有都为H5N1)，或者可以是亚型的组合。示例性亚型和毒株包括H5/Indo、H1/Bri、H1/NC、H3/Bri、B/Flo。对毒株和亚型之组合的选择可取决于对象可能暴露于流感的地区，动物物种(例如水禽类、农业动物(例如猪)等)与待免疫人群的接近程度以及所述动物物种携带、暴露于或可能暴露于的毒株，对亚型或毒株内抗原漂移的预测，或者这些因素的组合。过去几年所使用的组合的实例可见于世界卫生组织(WHO)保存的数据库(见URL：who.int/csr/dieease/influenza/vaccine recommendations1/en)。

两种或更多种VLP可单独表达，随后将纯化的或半纯化的VLP相组合。或者，VLP可在同一宿主(例如植物、植物部分或植物细胞)中共表达。VLP可以期望的比例(例如大致相等的比例)组合或生产，或者可以组合以使一种亚型或毒株占组合物中VLP的大部分。

因此，本发明提供了包含两种或更多种毒株或亚型的VLP的组合物。

还提供了包含包装材料和包含含有嵌合HA之VLP的组合物的产品。该组合物包含生理上或药理上可接受的赋形剂，包装材料可以包含标明组合物活性成分(例如VLP)的标签。

还提供了包含组合物的试剂盒，所述组合物包含编码本文所述嵌合HA之核酸以及使用该核酸生产嵌合HA或包含嵌合HA的VLP的说明书。该试剂盒可用于生产包含嵌合HA的VLP，说明书可以包括，例如在植物或植物细胞中表达核酸的信息，从植物或植物组织中收获和获得VLP的说明。

在另一个实施方案中，提供了用于制备药物的试剂盒，其包含含有嵌合HA的VLP及其使用说明书。说明书可以包含制备药物的一系列步骤，药物可用于在施用对象中诱导治疗性或预防性免疫应答。该试剂盒还可包含说明剂量浓度、剂量间隔、优选施用方法等的说明书。

本发明将通过下面的实施例更详细的说明。但是应当理解，这些实施例仅用于说明的目的，不应以任何方式用于限制本发明的范围。

本文描述的序列汇总如下。

材料与方法

1.HA表达盒的组装

A-pCAMBIAPlasto

使用Sambrook和Russell(2001；其通过引用并入本文)的一般分子生物学方案完成所有操作。表1显示用于表达盒组装的寡核苷酸引物。第一个克隆步骤是组装受体质粒，其包含苜蓿质体蓝素基因的上游和下游调控元件。使用寡核苷酸引物XmaI-pPlas.c(SEQ ID NO：1)和SacI-ATG-pPlas.r(SEQ ID NO：2)从苜蓿基因组DNA中扩增质体蓝素启动子和5’UTR序列。所得扩增产物用XmaI和SacI消化并与预先经同样的酶消化的pCAMBIA2300(Cambia，Canberra，Australia)连接，以形成pCAMBIApromoPlasto。类似地，使用引物SacI-PlasTer.c(SEQ IDNO：3)和EcoRI-PlasTer.r(SEQ ID NO：4)从苜蓿基因组DNA中扩增质体蓝素基因的3’UTR序列和终止子，所得产物用SacI和EcoRI消化，然后插入到pCAMBIApromoPlasto的相同位点中，以形成pCAMBIAPlasto。

B-Plasto-天然SP-H5A/印度尼西亚/5/05(构建体号660)

Epoch Biolabs(Sugar Land，TX，USA)合成了编码流感毒株A/印度尼西亚/5/05(H5N1；登录号LANL ISDN125873)之血凝素的片段。所产生的包含完整H5编码区的片段示于(SEQ ID NO：52，图17)，该编码区包含天然信号肽，其侧翼为紧邻起始ATG上游的HindIII位点以及紧邻终止密码子(TAA)下游的SacI位点。通过Darveau等(1995)所示的基于PCR的连接方法将H5编码区克隆到基于质体蓝素的表达盒中。简言之，使用引物Plato-443c(SEQ ID NO：5)和SpHA(Ind)-Plasto.r(SEQID NO：6)，以pCAMBIApromoPlasto作为模板进行第一PCR扩增。平行地，使用引物Plasto-SpHA(SEQ ID NO：7)和HA(Ind)-Sac.r(SEQ IDNO：8)，以H5编码片段(SEQ ID NO：52；图17)作为模板进行第二扩增。将由两个反应得到的扩增物混合，将混合物作为模板，使用Plato-443c(SEQ ID NO：5)和HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO：8)作为引物进行第三反应(组装反应)。用BamHI(在质体蓝素启动子中)和SacI(在片段的3’端)消化所得片段，并将其克隆到预先用相同酶消化的pCAMBIAPlasto中。所得质粒称为660，其示于图18中(SEQ ID NO：53)。

C-Plasto-PDI SP-H1A/新喀里多尼亚/20/99(构建体号540)

将流感毒株A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)H1基因的开放阅读框合成为两个片段(Plant Biotechnology Institute，National Research Council，Saskatoon，Canada)。所合成的第一片段对应于缺少5’端信号肽编码序列和3’端跨膜结构域编码序列的野生型H1编码序列(GenBank登录号AY289929；SEQ ID NO：54；图19)。片段的5’端由编码PDISP的末端核苷酸(含有BglII限制性位点)构成，并且将SacI/StuI双位点添加在紧邻该片段3’端终止密码子下游，得到SEQ ID NO：55(图20)。还合成了编码H1蛋白C端(包含跨膜结构域和胞质尾)的第二片段，其从KpnI位点至终止密码子，其3’侧翼是SacI和StuI限制性位点(SEQ ID NO.56；图21)。

第一H1片段用BglII和SacI消化，并克隆到含有质体蓝素启动子和5’UTR(与苜蓿蛋白质二硫键异构酶(PDI)基因(32-103位核苷酸；登录号Z11499；SEQ ID NO：57；图22)的信号肽融合)之二元载体(pCAMBIAPlasto)的同样位点中，得到位于质体蓝素调控元件的下游的PDI-H1嵌合基因。基于质体蓝素的表达盒序列示于SEQ ID NO.58(图23)，其含有启动子和BglII限制性位点上游的PDI信号肽，以及SacI位点下游的质体蓝素终止子。通过将预先用KpnI和SacI消化的合成片段(SEQ ID NO：56；图21)插入到H1表达质粒中来添加H1编码区的C端(编码跨膜结构域和胞质尾)。所得构建体称为540，其示于SEQ ID NO.59(图24)。

D-Plasto-天然SP-H1A/布里斯班/59/07(构建体号774)

按照下列步骤组装指导A/布里斯班/59/07的H1表达的表达盒号774。合成包含完整血凝素编码序列(从ATG到终止)的合成片段，其3’侧翼是对应于质体蓝素ATG上游前84个核苷酸以DraIII限制性位点起始的的苜蓿质体蓝素基因序列。该合成片段还包含紧邻终止密码子下游的SacI位点。

合成片段由Top Gene Technologies(Montreal，QC，Cahada)合成。所合成的片段示于SEQ ID NO.60(图25)。对于完整表达盒的组装，将合成片段用DraIII和SacI消化并克隆到预先用同样的酶消化的pCAMBIAPlasto中，得到构建体774(SEQ ID NO.61；图26)。

E-CPMV HT-LC C51(构建体号828)

CPMV-HT表达盒使用35S启动子来控制包含目的编码序列之mRNA的表达，目的编码序列的5′侧翼为来自豇豆花叶病毒(CPMV)RNA2的1-512位核苷酸(其在115和161位具有突变的ATG)并且3′侧翼为来自CPMV RNA2的3330-3481位核苷酸(对应于3′UTR)和其后的NOS终止子。使用质粒pBD-C5-1LC(Sainsbury等，2008；PlantBiotechnology Journal 6：82-92以及PCT公开WO 2007/135480)来组装基于CPMV-HT的血凝素表达盒。使用基于PCR的连接方法(Darveau等，Methods in Neuroscience 26：77-85(1995))实现CPMV RNA2第115和161位的ATG的突变。使用pBD-C5-1LC作为模板进行两个单独的PCR。用于第一扩增的引物是pBinPlus.2613c(SEQ ID NO：9)和Mut-ATG115.r(SEQ ID NO：10)。用于第二扩增的引物是Mut-ATG161.c(SEQ ID NO：11)和LC-C5-1.110r(SEQ ID NO：12)。将获得的两片段混合，并用作使用引物pBinPlus.2613c(SEQ ID NO：9)和LC-C5-1.110r(SEQ ID NO：12)之第三扩增的模板。所得片段用PacI和ApaI消化，并克隆至用同样的酶消化的pBD-C5-1LC中。所得构建体称为828，其示于图27中(SEQ ID NO：62)。

F-H5A/印度尼西亚/5/05骨架中的H1A/布里斯班/59/07受体结合(RB)结构域(构建体号690)

使用Darveau等(Methods in Neuroscience 26：77-85(1995))报道的基于PCR连接方法，用H1A/布里斯班/59/07的RB结构域替换H5A/印度尼西亚/5/05中的RB结构域来制备嵌合HA。在第一轮PCR中，将质体蓝素启动子区段融合到天然信号肽上，使用引物Plasto-443c(SEQ IDNO：5)和E1H1B-E1H5I.r(SEQ ID NO：13)，以构建体号660(SEQ IDNO：53，图18)为模板扩增H5A/印度尼西亚/5/05的F’1和E1结构域。使用引物E1 H5N-E1 H1B.c(SEQ ID NO：14)和E2 H5I-RB H1B.r(SEQID NO：15)，以构建体号774(SEQ ID NO：61；图26)为模板扩增含有H1A/布里斯班/59/07之RB结构域编码序列的第二片段。使用引物RBH1B-E2 H5I.c(SEQ ID NO：16)和HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO：8)，以构建体号660(SEQ ID NO 53；图18)为模板扩增含有H5A/印度尼西亚/5/05的E2、F’2、F、跨膜和胞质结构域的第三片段。然后混合扩增产物，并用作使用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：5)和HA(Ind)-SacI.r(SEQ IDNO：8)之第二轮扩增(组装反应)的模板。所得片段用BamHI(在质体蓝素启动子中)和SacI(在终止密码子后)消化，并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构建体号660(SEQ ID NO：53；图18)中，得到构建体号690(SEQ ID NO：63)。该构建体示于图28中。

G-H5A/印度尼西亚/5/05骨架中的H1A/布里斯班/59/07酯酶和受体结合结构域(E1-RB-E2)(构建体号691)

使用Darveau等(Methods in Neuroscience 26：77-85(1995))报道的基于PCR连接方法，用H1A/布里斯班/59/07的E1-RB-E2结构域替换H5A/印度尼西亚/5/05中的E1-RB-E2结构域来组装嵌合HA。在第一轮PCR中，将质体蓝素启动子区段融合到天然信号肽上，使用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：5)和E1H1B-F’1H5I.r(SEQ ID NO：17)，以构建体号660(SEQ ID NO：53，图18)为模板扩增H5A/印度尼西亚/5/05的F’1结构域。平行地，扩增其他两个片段。使用引物F’1H5N-E1H1B.c(SEQID NO：18)和F’2H5I-E2H1B.r(SEQ ID NO：19)，以构建体号774(SEQID NO：61；图26)为模板扩增含有H1A/布里斯班/59/07之E1-RB-E2结构域编码序列的第二片段。对于第三片段，使用引物E2H1B-F’2H5I.c(SEQ ID NO：20)和HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO：8)，以构建体号660(SEQ ID NO 53；图18)为模板扩增H5A/印度尼西亚/5/05的F’2、F、跨膜和胞质结构域。然后混合扩增产物，并用作使用引物Plasto-443c(SEQID NO：5)和HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO：8)之第二轮扩增(组装反应)的模板。所得片段用BamHI(在质体蓝素启动子中)和SacI(在终止密码子后)消化，并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构建体号660(SEQ IDNO：53；图18)中，得到构建体号691(SEQ ID NO：64)。该构建体示于图29中。

H-H1A/新喀里多尼亚/20/99骨架中的H5A/印度尼西亚/5/05受体结合(RB)结构域(构建体号696)

使用Darveau等(Methods in Neuroscience 26：77-85(1995))报道的基于PCR连接方法，用H5A/印度尼西亚/5/05的RB结构域替换H1A/新喀里多尼亚/20/99中的RB结构域来制备嵌合HA。在第一轮PCR中，将质体蓝素启动子区段融合到苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽(PDISP；登录号Z11499，SEQ ID NO：57第32-103位核苷酸；图22)上，使用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：5)和E1H5I-E1H1NC.r(SEQ ID NO：21)，以构建体号540(SEQ ID NO：59，图24)为模板扩增H1A/新喀里多尼亚/20/99的F’1和E1结构域。使用引物E1H1NC-E1H5I.c(SEQ ID NO：22)和E2H1NC-RB H5I.r(SEQ ID NO：23)，以构建体号660(SEQ ID NO：53；图18)为模板扩增含有H5A/印度尼西亚/5/05之RB结构域编码序列的第二片段。使用引物RB H5I-E2 H1NC.c(SEQ ID NO：24)和HA-SacI.r(SEQID NO：25)，以构建体号540(SEQ ID NO：59；图24)为模板扩增含有H1A/新喀里多尼亚/20/99的E2、F’2、F、跨膜和胞质结构域的第三片段。然后混合扩增产物，并用作使用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：5)和HA-SacI.r(SEQ ID NO：25)之第二轮扩增(组装反应)的模板。所得片段用BglII和SacI消化，并克隆至预先用同样的限制性酶消化的构建体号540(SEQ ID NO：59，图24)中，获得构建体号696(SEQ ID NO：65)。该构建体示于图30中。

I-将H1A/布里斯班/59/2007组装进CPMV-HT表达盒(构建体号732)

按照以下所述将来自H1A/布里斯班/59/2007的HA编码序列克隆进CPMV-HT中。通过使用构建体号774(SEQ ID NO：61；图26)作为模板，用引物ApaI-H1B.c(SEQ ID NO：26)和StuI-H1B.r(SEQ ID NO：27)进行PCR扩增，从而将限制性位点ApaI(紧邻ATG上游)和StuI(紧邻终止密码子下游)添加至血凝素编码序列中。所得片段用ApaI和StuI限制性酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体号828(SEQ ID NO：62，图27)中。所得的盒称为构建体号732(SEQ ID NO：66，图31)。

J-将SpPDI-H1A/布里斯班/59/2007组装进CPMV-HT表达盒(构建体号733)

按照以下所述将编码苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽的序列(PDISP；SEQ ID NO：57第32-103位核苷酸，图22；登录号Z11499)与来自A/布里斯班/59/2007之H1的HA0编码序列融合，并将所得片段克隆至CPMV-HT中。通过使用构建体774(SEQ ID NO：61，图26)作为模板，用引物SpPDI-H1B.c(SEQ ID NO：28)和SacI-H1B.r(SEQ ID NO：29)扩增得到H1编码序列。所得片段在H1编码序列5’侧翼为编码PDISP的最后几个核苷酸(包含BglII限制性位点)，3’侧翼为SacI限制性位点。将该片段用BglII和SacI消化，并克隆至预先用同样的限制性酶消化的构建体号540(SEQ ID NO：59，图24)中。称为构建体号787(SEQ ID NO67)的中间盒编码序列显示于图32中。通过使用构建体号787(SEQ IDNO：67；图32)作为模板，用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO：30)和StuI-H1B.r(SEQ ID NO：27)进行PCR扩增，从而将限制性位点ApaI(紧邻ATG上游)和StuI(紧邻终止密码子下游)添加至血凝素编码序列中。所得片段用ApaI和StuI限制性酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体号828(SEQ ID NO：62，图27)中。所得的盒称为构建体号733(SEQ ID NO：68，图33)。

K-在CPMV-HT表达盒中组装H5A/印度尼西亚/5/05骨架中的H1A/布里斯班/59/07受体结合(RB)结构域(构建体号734)

按照以下所述将嵌合HA的编码序列(在H5A/印度尼西亚/5/05骨架中具有H1A/布里斯班/59/07的RB结构域)克隆到CPMV-HT中。通过使用构建体690(SEQ ID NO：63；图28)作为模板，用引物ApaI-H5(A-Indo).1c(SEQ ID NO：31)和H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO：32)进行PCR扩增，从而将限制性位点ApaI(紧邻ATG上游)和StuI(紧邻终止密码子下游)添加至嵌合血凝素编码序列中。所得片段用ApaI和StuI限制性酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体号828(SEQ IDNO：62，图27)中。所得的盒称为构建体号734(SEQ ID NO：69，图34)。

L-将SpPDI-H3A/布里斯班/10/2007组装进CPMV-HT表达盒(构建体号736)

按照以下所述将编码苜蓿PDI信号肽的序列与来自H3A/布里斯班/10/2007的HA0融合，并克隆至CPMV-HT中。首先，合成包含完整血凝素编码序列(从ATG到终止)的合成片段，其3’侧翼是对应于质体蓝素ATG上游前84个核苷酸(以DraIII限制性位点起始)的苜蓿质体蓝素基因序列。该合成片段还包含紧邻终止子之后的SacI位点。合成片段由TopGene Technologies(Montreal，QC，Canada)合成。所合成的片段示于SEQID NO：70(图35)，并进一步用作基于PCR的连接的模板。

其次，按照以下所述将苜蓿蛋白二硫键异构酶(PDISP)(核苷酸32-103；登录号Z11499；SEQ ID NO：57；图22)信号肽与紧邻ATG上游的ApaI限制性位点和终止密码子下游的StuI限制性位点一起连接到来自A/布里斯班/10/2007之H3的HA0编码序列上。使用Darveau等(Methods in Neuroscience 26：77-85(1995))报道的基于PCR的连接方法，将PDISP与H3编码序列连接。在第一轮PCR中，使用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO：30)和H3B-SpPDI.r(SEQ ID NO：33)，以构建体540(SEQ ID NO：59；图24)为模板扩增PDISP信号肽。平行地，使用引物SpPDI-H3B.c(SEQ ID NO：34)和StuI-H3B.r(SEQ ID NO：35)，以先前合成的片段(SEQ ID NO：70；图35)为模板扩增含有H3A/布里斯班/10/2007部分编码序列(从密码子17到终止密码子)的另一片段。然后混合扩增产物，并用作使用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO：30)和StuI-H3B.r(SEQ ID NO：35)之第二轮扩增(组装反应)的模板。所得片段用ApaI和StuI限制性酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体号828(SEQ ID NO：62，图27)中。所得的盒称为构建体号736(SEQ ID NO：71，图36)。

M-在CPMV-HT表达盒中组装嵌合SpPDI-H3A/布里斯班/10/2007(胞外结构域)+H5A/印度尼西亚/5/2005(TmD+Cyto tail)(构建体号737)

按照以下所述将编码苜蓿PDI信号肽的序列融合到H3A/布里斯班/10/2007胞外结构域和H5A/印度尼西亚/5/2005的跨膜和胞质结构域上，并克隆到CPMV-HT中。使用Darveau等(Methods in Neuroscience 26：77-85(1995))报道的基于PCR的连接方法，将PDISP-H3编码序列与H5跨膜结构域融合。在第一轮PCR中，通过使用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ IDNO：30)和TmD H5I-H3B.r(SEQ ID NO：36)，以构建体号736(SEQ IDNO：71；图36)为模板扩增产生包含PDISP信号肽和H3布里斯班胞外结构域的片段。平行地，使用引物H3B-TmD H5I.c(SEQ ID NO：37)和H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO：32)，以构建体号660(SEQ ID NO：53；图18)为模板扩增含有H5印度尼西亚之跨膜和胞质结构域的另一片段。然后混合扩增产物，并用作使用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO：30)和H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO：32)之第二轮扩增(组装反应)的模板。所得片段用ApaI和StuI限制性酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体号828(SEQ ID NO：62，图27)中。所得的盒称为构建体号737(SEQ IDNO：72，图37)。

N-将SpPDI-HA B/佛罗里达/4/2006组装进CPMV-HT表达盒(构建体号739)

按照以下所述将编码苜蓿PDI信号肽的序列与来自HA B/布里斯班/4/2006的HA0融合，并克隆至CPMV-HT中。首先，合成包含完整血凝素编码序列(从ATG到终止)的合成片段，其3’侧翼是对应于质体蓝素ATG上游前84个核苷酸(以DraIII限制性位点起始)的苜蓿质体蓝素基因序列。合成片段还包含紧邻终止密码子之后的SacI限制性位点。该合成片段由Epoch Biolabs(Sugar Land，Texas，USA)合成。所合成的片段示于SEQ ID NO73(图38)，并进一步用作基于PCR的连接的模板。

其次，按照以下所述将苜蓿蛋白二硫键异构酶(PDISP)(SEQ IDNO：57核苷酸32-103位；图22；登录号Z11499)信号肽与紧邻上游ATG的ApaI限制性位点和终止密码子下游的StuI限制性位点一起连接到来自B/佛罗里达/4/2006之HA的HA0编码序列上。使用Darveau等(Methodsin Neuroscience 26：77-85(1995))报道的基于PCR的连接方法，将PDISP与HA编码序列连接。在第一轮PCR中，使用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ IDNO：30)和HBF-SpPDI.r(SEQ ID NO：38)，以构建体号540(SEQ IDNO：59；图24)为模板扩增PDISP信号肽。平行地，使用引物SpPDI-H3B.c(SEQ ID NO：39)和StuI-HBF.r(SEQ ID NO：40)，以先前合成的片段(SEQID NO：73；图38)为模板扩增含有来自B/佛罗里达/4/2006之HA的部分编码序列(从密码子16到终止密码子)的另一片段。然后混合扩增产物，并用作使用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO：30)和StuI-HBF.r(SEQ IDNO：40)之第二轮扩增(组装反应)的模板。所得片段用ApaI和StuI限制性酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体号828(SEQ ID NO：62，图27)中。所得的盒称为构建体号739(SEQ ID NO：74，图39)。O-在CPMV-HT表达盒中组装嵌合SpPDI-HA B/佛罗里达/4/2006(胞外结构域)+H5A/印度尼西亚/5/2005(TmD+Cyto tail)(构建体号745)。

按照以下所述将编码苜蓿PDI信号肽的序列融合到HA B/佛罗里达/4/2006胞外结构域和H5A/印度尼西亚/5/2005的跨膜和胞质结构域上，并克隆到CPMV-HT中。使用Darveau等(Methods in Neuroscience 26：77-85(1995))报道的基于PCR的连接方法，将PDISP-B/佛罗里达/4/2006胞外结构域编码序列与H5跨膜和胞质结构域融合。在第一轮PCR中，使用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO：30)和TmD H5I-B Flo.r(SEQ IDNO：41)，以构建体号739(SEQ ID NO：74；图39)为模板扩增产生包含与HA B/佛罗里达/4/2006胞外结构域融合的PDISP信号肽的片段。平行地，使用引物B Flo-TmD H5I.c(SEQ ID NO：42)和H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO：32)，以构建体号660(SEQ ID NO：53；图18)为模板扩增含有H5印度尼西亚跨膜和胞质结构域的另一片段。然后混合扩增产物，并用作使用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO：30)和H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO：32)之第二轮扩增(组装反应)的模板。所得片段用ApaI和StuI限制性酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体号828(SEQ ID NO：62，图27)中。所得的盒称为构建体号745(SEQ IDNO：75，图40)。

P-在2X35S-CPMV-HT表达盒中组装嵌合SpPDI-HA B/佛罗里达/4/2006+H5A/印度尼西亚/5/2005(TmD+Cyto tail)(构建体号747)

按照以下所述将编码苜蓿PDI信号肽的序列融合到来自HA B/佛罗里达/4/2006的HA0和H5A/印度尼西亚/5/2005的跨膜和胞质结构域上，并克隆到2X35S-CPMV-HT中。使用Darveau等(Methods in Neuroscience26：77-85(1995))报道的基于PCR的连接方法进行启动子转换。使用引物PacI-MCS-2X35S.c(SEQ ID NO：89)和CPMV 5’UTR-2X35S.r(SEQ IDNO：90)：

以含有2X35S启动子的质粒为模板通过PCR扩增含有2X35S启动子(SEQID NO：88：图50A)的第一片段。平行地，使用引物2X35S-CPMV 5’UTR.c(SEO ID NO：91)和ApaI-M prot.r(SEO ID NO：92)：

以构建体745(SEQ ID NO：75；图40)为模板进行第二PCR。然后混合所得的两种片段并用作使用引物PacI-MCS-2X35S.c(SEQ ID NO：89)和ApaI-M prot.r(SEQ ID NO：92)之第二轮PCR(组装反应)的模板。所得片段用PacI和ApaI消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体745(SEQID NO：75，图40)中。表达盒称为构建体747(SEQ ID NO：93)，其序列示于图50B中。

2.伴侣蛋白表达盒的组装

组装了两种热休克蛋白(Hsp)表达盒。在第一种盒中，拟南芥(哥伦比亚生态型)胞浆HSP70(Lin等(2001)Cell stress and Chaperones 6：201-208中的Athsp70-1)的表达被苜蓿亚硝酸还原酶(Nir)和苜蓿质体蓝素启动子的嵌合启动子组合元件(Nir/Plasto)控制。还组装了第二种盒，其包含嵌合Nir/Plasto启动子控制下的苜蓿胞浆HSP40(MsJ1；Frugis等(1999)Plant Molecular Biology 40：397-408)编码区。

首先，组装了在植物二元载体中含有苜蓿亚硝酸还原酶启动子(Nir)、GUS报告基因和NOS终止子的接纳质粒(acceptor plasmid)。用HindIII和EcoRI消化质粒pNir3K51(先前描述于美国专利No.6,420,548中)。将所得片段克隆进用同样的限制性酶消化的pCAMBIA2300(Cambia，Canberra，Australia)中，得到pCAMBIA-Nir3K51。

通过基于PCR的连接方法(Darveau等，Methods in Neuroscience26：77-85(1995))，将Hsp70和Hsp40的编码序列分别克隆进接纳质粒pCAMBIANir3K51中。

对于Hsp40，使用引物Hsp40Luz.1c(SEQ ID NO：43)和Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO：44)，通过RT-PCR从苜蓿(Rangclander生态型)叶总RNA中扩增Msj1编码序列(SEQ ID NO：76；图41)。使用构建体660(SEQ ID NO：53；图18)作为模板，用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：5)和Hsp40Luz-Plasto.r(SEQ ID NO：45)进行第二扩增。然后混合PCR产物，并用作使用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：5)和Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO：44)之第三扩增(组装反应)的模板。所得片段用HpaI(在质体蓝素启动子中)消化，并克隆进预先用HpaI(在Nir启动子中)和SacI消化并用T4DNA聚合酶处理以产生平末端的pCAMBIANir3K51中。筛选正确取向的所得克隆，并测序以检验序列完整性。所得质粒称为R850，其示于图42中(SEQ ID NO：77)。使用引物Hsp70Ara.1c(SEQ ID NO：46)和Hsp70Ara-SacI.1956r(SEQ IDNO：47)，通过RT-PCR从拟南芥叶RNA中扩增Athsp70-1的编码区。使用构建体660(SEQ ID NO：53，图18)作为模板，用引物Plato-443c(SEQID NO：5)和Hsp70Ara-Plasto.r(SEQ ID NO：48)进行第二扩增。然后混合PCR产物，并作使用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：5)和Hsp70ARA-SacI.1956r(SEQ ID NO：47)之第三扩增(组装反应)的模板。所得片段用HpaI(在质体蓝素启动子中)消化，并克隆进用HpaI(在Nir启动子中)和SacI消化并用T4DNA聚合酶处理以产生平末端的pCAMBIANir3K51中。筛选正确取向的所得克隆，并测序以检验序列完整性。所得质粒称为R860，其示于图43中(SEQ ID NO：78)。

按照以下所述组装双Hsp表达质粒。R860(SEQ ID NO：78；图43)用BsrBI(NOS终止子下游)消化，用T4DNA聚合酶处理以产生平末端，并用SbfI(嵌合NIR/Plasto启动子的上游)消化。将所得片段(嵌合Nir/Plasto启动子-HSP70编码序列-Nos终止子)克隆进预先用SbfI和SmaI(均位于嵌合Nir/Plasto启动子上游的多克隆位点中)消化的R850(SEQ ID NO：77；图42)中。所得质粒称为R870，其示于图44中(SEQID NO：79)。

3.其他表达盒的组装

HcPro表达盒

如Hamilton等(2002)所述制备HcPro构建体(35HcPro)。对所有克隆进行测序以证实构建体的完整性。通过电穿孔(Mattanovich等，1989)用质粒转化根瘤农杆菌(Agrobacteium tumefaciens)(AGL1；ATCC，Manassas，VA 20108，USA)。通过限制性图谱证实所有根瘤农杆菌株的完整性。

P19表达盒

通过基于PCR的连接方法(Darveau等，Methods in Neuroscience 26：77-85(1995))将番茄丛矮病毒(TBSV)p19蛋白的编码序列与苜蓿质体蓝素表达盒连接。在第一轮PCR中，使用构建体660(SEQ ID NO：53)作为模板，用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：5)和supP19-plasto.r(SEQ IDNO：49)扩增质体蓝素启动子的区段。平行地，使用构建体35S：p19(如Voinnet等，The Plant Journal 33：949-956(2003)所述)作为模板，用引物supP19-1c(SEQ ID NO：50)和SupP19-SacI.r(SEQ ID NO：51)扩增含有p19编码序列的另一片段。然后混合扩增产物，并用作使用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：5)和SupP19-SacI.r(SEQ ID NO：51)之第二轮扩增(组装反应)的模板。所得片段用BamHI(在质体蓝素启动子中)和SacI(在p19编码序列末端)消化，并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构建体号660(SEQ ID NO：53；图18)中，得到构建体号R472。质粒R472示于图45中。

构建体号443

构建体号443对应pCAMBIA2300(空载体)。

表1.用于表达盒组装的寡核苷酸引物。

表2：用于表达带有天然或PDI信号肽的流感血凝素的农杆菌菌株

农杆菌菌株	表达的HA	信号肽	表达盒
				AGL1/540	H1(A/新喀里多尼亚/20/99)	PDI	质体蓝素
AGL1/774	H1(A/布里斯班/59/2007)	天然	质体蓝素
				AGL1/787	H1(A/布里斯班/59/2007)	PDI	质体蓝素
AGL1/732	H1(A/布里斯班/59/2007)	天然	35S/CPMV-HT
				AGL1/736	H3(A/布里斯班/10/2007)	PDI	35S/CPMV-HT
AGL1/660	H5(A印度尼西亚/5/2005)	天然	质体蓝素
				AGL1/739	B(B/佛罗里达/4/2006)	PDI	35S/CPMV-HT
AGLI/828	CPMV HT-LC C51	C51LC	35S/CPMV-HT
				AGLI/690	H1/Bris RB+H5/Indo SDC	天然	Plasto
AGLI/691	H1/Bri E1-RB-E2+H5SDC	天然	Plasto
				AGLI/696	H5/Indo RB+H1/NC SDC	PDI	Plasto
AGLI/733	H1/Bri	PDI	35S/CPMV-HT
				AGLI/734	H1/Bri RB+H5/Indo SDC	天然	35S/CPMV-HT

AGLI/737	H3/Bri胞外结构域+H5/Indo TDC	PDI	35S/CPMV-HT
				AGLI/745	B/Flo胞外结构域_H5/Indo TDC	PDI	35S/CPMV-HT
AGL1/747	B/Flo胞外结构域_H5/Indo TDC	PDI	2X35S/CPMV-HT

4.植物生物质的准备、接种、农杆菌侵染和收获

在填装市售泥炭基质的平地上从种子培养本塞姆氏烟草(Nicotianabenthamiana)。使植物以16/8光照周期生长在温室中，温度放方案白天25℃/晚上20℃。播种3周后，挑出各株幼苗，移栽到盆中，并在同样的环境条件下在温室中再生长3周。转化前，在以下所述的不同时间通过掐掉植物的芽或通过化学处理植物而除去顶芽和腋芽。

在补充有10mM 2-[N-吗啉]乙磺酸(MES)、20μM乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧苄青霉素的YEB培养基(pH 5.6)中培养用每种构建体转染的农杆菌，直至其OD₆₀₀为0.6至1.6。使用前将农杆菌混悬液离心并重悬在侵染培养基(10mM MgCl₂和10mM MES，pH 5.6)中。如Liu和Lomonossoff(2002，Journal of Virological Methods，105：343-348)所述进行注射器侵染。对于真空侵染，将根瘤农杆菌混悬液离心，重悬在侵染培养基中，并储存在4℃过夜。在侵染当天，将分批培养物在2.5倍培养物体积中稀释并在使用前温热。在20-40托真空下，使本塞姆氏烟草或普通烟草(N.tabacum)的整个植株倒置于气密性不锈钢罐中的细菌混悬液中2分钟。注射器或真空侵染后，将植株移回温室中培养4-5天直至收获。除非另外指明，否则所有侵染均通过与AGL1/35S-HcPro以1∶1共侵染来进行，具有CPMV-HT盒的毒株除外(其与毒株AGL1/R472以1∶1共侵染)。

5.叶片取样和总蛋白质提取

培养后，收获植株的地上部分，冷冻在-80℃，破碎成碎片。通过将每个冷冻破碎植物材料的样品在3倍体积的冷50mM Tris(pH 8.0)0.15M NaCl，0.04％焦亚硫酸钠和1mM苯甲基磺酰氟中匀浆(Polytron)来提取总的可溶性蛋白质。匀浆后，于4℃下以20,000g离心浆液20分钟，将这些澄清的粗提物(上清液)用于分析。使用牛血清白蛋白作为参照标准，通过Bradford测定(Bio-Rad，Hercules，CA)来测定澄清的粗提物的总蛋白质含量。

6.蛋白质分析和免疫印迹

蛋白浓度通过BCA蛋白测定(Pierce Biochemicals，Rockport IL)来测定。在还原条件下通过SDS-PAGE分离蛋白质，并用考马斯蓝染色。对经染色的凝胶进行扫描，并使用ImageJ Software(NIH)进行密度分析。

用丙酮来沉淀来自SEC洗脱级分的蛋白质(Bollag等，1996)，重悬在1/5体积的平衡/洗脱缓冲液中，在还原条件下通过SDS-PAGE分离并电转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)上用于免疫检测。在免疫印迹之前，用Tris缓冲盐水(TBS-T)中5％脱脂奶和0.1％Tween-20在4℃下封闭膜16-18小时。

通过用2μg/ml的合适抗体(表6)(在2％脱脂奶、0.1％TBS-Tween20中)孵育进行免疫印迹。用于化学发光检测的第二抗体示于表4中，如所示将其在2％脱脂奶、0.1％TBS-Tween 20中稀释。使用luminol(Roche Diagnostics Corporation)作为底物，通过化学发光检测免疫反应性复合物。使用EZ-Link Plus活化辣根过氧化物酶缀合试剂盒(Pierce，Rockford，IL)进行人IgG抗体的辣根过氧化物酶缀合。用作检测H1、H3和B亚型之对照的失活全病毒(WIV)从National Institutefor Biological Standards and Control(NIBSC)购得。

表3：用于所表达蛋白质免疫印迹的电泳条件、抗体和稀释

FII：Fitzgerald Industries International，Concord，MA，USA；

NIBSC：National Institute for Biological Standards and Control；

JIR：Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，USA；

ITC：Immune Technology Corporation，Woodside，N Y，USA；

7.SEC前的澄清和浓缩

为了改善分辨率和增加洗脱级分的信号，使用以下方法对待加载到体积排阻色谱上的提取物粗蛋白提取物进行澄清和浓缩。提取物在4℃下以70000g离心20分钟，沉淀通过用1体积(相比最初的提取物体积)的提取缓冲液(50mM Tris，pH8.0，0.15M NaCl)重悬来清洗两次，并在4℃下以70000g离心20分钟。获得的沉淀重悬在1/3体积(相比最初的提取物体积)中，加入20％(w/v)PEG3350然后在冰上孵育1小时使蛋白(包括VLP)沉淀。在4℃下以10000g离心20分钟回收沉淀的蛋白质，并重悬在1/15体积(相比最初的提取物体积)的提取缓冲液中。完全重悬蛋白质后，在4℃下以20000g离心5分钟沉淀不溶物，回收清澈的上清液。

8.蛋白质提取物的体积排阻色谱

装填32ml Sephacryl^TMS-500高分辨率珠(S-500HR：GE Healthcare，Uppsala，Sweden，货号17-0613-10)的体积排阻色谱(SEC)柱，用平衡/洗脱缓冲液(50mM的Tris(pH8)，150mM NaCl)平衡。将1.5mL粗蛋白质提取物加载到该柱上，然后用45mL平衡/洗脱缓冲液进行洗脱步骤。以1.5mL级分收集洗脱液，洗脱级分的相对蛋白质含量这样通过将10μL级分与200μL稀释的Bio-Rad蛋白染色试剂(Bio-Rad，Hercales，CA)混合来监测。用2倍柱体积的0.2N NaOH清洗该柱，然后用10倍柱体积的50mM Tris(pH8)、150mM NaCl和20％乙醇清洗。每次分离之后用蓝葡聚糖2000(GE HealthCare Bio-Science Corp.，Piscataway，NJ，USA)校准柱。在每次分离之间对蓝葡聚糖2000和宿主可溶性蛋白质的洗脱曲线进行比较，以确保所用柱之间的洗脱曲线的一致性。

实施例1：流感亚型茎上RB和/或酯酶结构域的替换策略

H5/Indo的RB亚结构域可以用H1、H3或B HA的RB亚结构域替换。得到的嵌合HA提供SDC H5/Indo以形成VLP，并显示包含H1、H3或B免疫原性位点的RB亚结构域。H5/Indo RB亚结构域可以插入到H1茎上(H1/NC)。图15A和15B显示了所示亚结构域融合位点的氨基酸序列，相应亚结构域的氨基酸序列显示在图2(构建体690、734、696和691)和表4(构建体900和745)和表5(构建体910、920和930)中。图2和表4、5中显示的氨基酸序列不包含信号肽序列。

表4亚结构域和嵌合流感HA。包含异源RB亚结构域的嵌合流感HA。

序列SEQ ID NO：105的1-92位氨基酸是H5/Indo的F’1+E1结构域；93-259位氨基酸是H3/布里斯班的RB头部结构域，260-548位氨基酸是H5/Indo的E2+F’2结构域。

序列SEQ ID NO：106的1-92位氨基酸是H5/Indo的F’1+E1结构域；93-276位氨基酸是B/佛罗里达的RB头部结构域，277-565位氨基酸是H5/Indo的E2+F’2结构域。

表5亚结构域和嵌合流感HA。包含异源RB亚结构域的嵌合流感HA。

SEQ ID NO：107的1-42位氨基酸是H5/Indo的N端F’1结构域；43-228位氨基酸是H3/布里斯班的E1-RB-E2头部结构域，229-507位氨基酸是H5/Indo的F’2结构域。

SEQ ID NO：108的1-42位氨基酸是H5/Indo的N端F’1结构域；43-281位氨基酸是B/佛罗里达的E1-RB-E2头部结构域；282-556位氨基酸是H5/Indo的F’2结构域。

SEQ ID NO：109的1-42位氨基酸是H1/NC的N端F’1结构域；43-273位氨基酸是H5/Indo的E1-RB-E2头部结构域，274-548位氨基酸是H1/NC的F’2结构域。

各个嵌合体的融合位点选择在邻近(但不必然直接位于)各个亚结构域的N和C端——不希望被理论约束，选择这些融合位点以使嵌合HA的稳定性最大化。例如，在RB亚结构域的N端观察到结构和序列的保守性(Ha等2002，EMBO J.21：865-875；在此通过引用并入本文)。发现初级序列中变化较少的区域位于E1亚结构域15个氨基酸之前的C-F Y-P三联体中。此半胱氨酸参与在HA中保守的3号二硫桥(参见图46和47)。此半胱氨酸处的连接可以为嵌合HA提供相对天然序列更加适合或更优的稳定性。RB的C端提供保守特征：例如，在比对中，在所有HA中观察到的位点1处的保守丝氨酸残基和以β折叠起始的E2亚结构域(Ha等，2002，EMBO J.21：865-875；其通过引用并入本文)。因此，此RB的C端可以融合到E2亚结构域该β折叠结构的起始氨基酸上。并且，对于在H5/Indo SDC上包含H1/NC、H1Bri、H3/Bri或B/Flo的RB亚结构域的嵌合体和在H1SDC上包含H5/Indo RB亚结构域的嵌合体(共6个)，二硫桥模式没有变化或者没有实质性的变化，但是在H5茎上B RB的杂交HA上添加了二硫桥(8号二硫键)。添加此二硫桥不应当干扰HA的折叠(因为其位于RB结构域中，并且半胱氨酸在序列中邻近)，并且可以提供更加稳定的杂交HA。

第一流感类型的E1-RB-E2亚结构域被替换为第二流感类型的E1-RB-E2亚结构域。这种安排可以在H5-VLP表面显示更多的第二流感类型的氨基酸。在此实施例中，将H1、H3或B的HDC放置在H5/IndoSDC上，将H5/Indo的HDC放置在H1/NC SDC上(表5)。

用保守的半胱氨酸残基(构成HA类型A中的6号二硫桥和HA类型B中的7号二硫桥)确定HDC的连接。E2亚结构域C端的HDC连接用另一保守半胱氨酸残基确定，其构成H5/Indo SDC上流感类型H1或H3或者H1SDC上流感类型H5的6号二硫桥(F’2亚结构域的第二氨基酸)。对于乙型流感嵌合体，在第一个半胱氨酸处建立连接，该半胱氨酸构成4号二硫桥(在F’2亚结构域上相隔4个氨基酸的位置，并在HA之间保守)。所得嵌合体的二硫桥模式没有显示任何变化——H1/H3/H5杂交HA含有6个二硫桥，B杂交HA具有7个二硫键。

实施例2：用H1A/布里斯班/59/2007的受体结合(RB)或受体结合和酯酶(E1-RB-E2)亚结构域替换H5A/印度尼西亚/5/05的相应部分：嵌合体和天然形式的表达的比较。

为了将H5A/印度尼西亚/5/05的VLP高累积水平与H1A/布里斯班/59/2007的抗原性特点相联合，设计了包含与H5A/印度尼西亚/5/05茎结构域簇融合的H1A/布里斯班/59/2007结构域的嵌合血凝素。表达H5/H1血凝素融合蛋白的表达盒显示于图1，产生的成熟融合蛋白的氨基酸序列显示于图2。

为了比较H5/H1嵌合血凝素与其天然形式的累积水平，用AGL1/774、AGL1/691和AGL1/690侵染本塞姆氏烟草(NicotianaBenthamiana)植株，经过6天的孵育期后收获叶。为了确定农杆菌侵染的叶中每种HA形式的累积水平，从被侵染的叶组织中提取蛋白并用抗HA单克隆抗体进行Western印迹分析。在用AGL1/690侵染的叶子提取物中检测到约为75kDa的独特条带(图3)，大小对应流感血凝素未切割的HA0形式，但是在AGL1/774或AGL1/691中未检测到，这表明包含与H5A/印度尼西亚/5/05骨架融合的H1A/布里斯班/59/2007受体结合区的嵌合血凝素的累积水平高于H1A/布里斯班/59/2007的天然形式(AGL1/774)，也高于联合H1A/布里斯班/59/2007的酯酶和受体结合区和H5A/印度尼西亚/5/05骨架的嵌合血凝素。用作阳性对照的灭活全病毒(WIV)(H1A/布里斯班/59/2007)检测为多个条带，主要条带在约80kDa处，对应H1A/布里斯班/59/2007前体HA0的分子量。这些结果证明，用H1A/布里斯班/59/2007的受体结合区替换H5A/印度尼西亚/5/05的相应部分产生嵌合血凝素，其显示H1的抗原区并且其在植物中比天然H1A/布里斯班/59/2007累积水平更高。但是，其中H5A/印度尼西亚/5/05中酯酶和受体结合区被H1A/布里斯班/59/2007的对应部分替换的嵌合血凝素在植物中没有累积到可以检测的水平。

对将H1A/布里斯班/59/2007的受体结合区与H5A/印度尼西亚/5/05骨架的融合作为植物中呈递H1抗原之VLP的累积水平增加方法在基于CPMV-HT的强表达盒控制下进行了再次评价。还将此融合策略与增加累积水平的信号肽替换方法进行了比较。在CPMV-HT控制下表达H5/H1血凝素融合蛋白的表达盒显示于图8，产生的成熟融合蛋白的氨基酸序列显示于图2。

用AGL1/732、AGL1/733或AGL1/734侵染本塞姆氏烟草植株，6天的孵育期后收获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶中每种HA形式的累积水平，首先从被侵染的叶组织中提取蛋白并用抗H1(布里斯班)多克隆抗体进行Western印迹分析。在用AGL1/732、AGL1/733和AGL1/734侵染的叶提取物中检测到约为75kDa的独特条带(图6)，大小对应流感血凝素未切割的HA0形式，但是，虽然在所有分析的提取物中均检测到血凝素，仍然可以观察到累积水平的重要差异。在这些条件下，H1A/布里斯班/59/2007表达使用其天然信号肽(732)几乎检测不到，用PDI的信号肽替换信号肽后得到高累积水平的成熟H1A/布里斯班/59/2007(733)，嵌合H5/H1血凝素(734)累积水平最高。总之，这些结果表明，将H1的受体结合结构域与H5骨架融合导致呈递H1抗原之血凝素的高累积，并且在植物中这些融合蛋白的累积水平高于信号肽替换或未替换的天然形式所获得的累积水平。

实施例3：用H5A/印度尼西亚/5/05的受体结合(RB)亚结构域替换H1A/新喀里多尼亚/20/99的相应部分。嵌合和天然形式的表达的比较。

还评价了H1骨架(来自A/新喀里多尼亚/20/99)在呈递H5抗原区中的用途。表达H1/H5血凝素融合蛋白的表达盒显示于图1，产生的成熟融合蛋白的氨基酸序列显示于图2。

为了比较H1/H5嵌合血凝素与其天然形式的累积水平，用AGL1/660和AGL1/696侵染本塞姆氏烟草植株，经过6天的孵育期后收获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶子中每种HA形式的累积水平，从被侵染的叶组织中提取蛋白病用抗H5(印度尼西亚)多克隆抗体进行Western印迹分析。在用AGL1/660和AGL1/696侵染的叶提取物中检测到约为75kDa的独特条带(图7)，大小对应流感血凝素未切割的HA0形式，表明天然H5A/印度尼西亚/5/05和H1/H5嵌合血凝素两者均在植物中高水平累积。

实施例4：用H3或B型流感的相应部分替换H5A/印度尼西亚/5/05的胞外结构域。嵌合体和天然形式的表达的比较。

评价了呈递H3和B型毒株血凝素抗原区同时增加它们在植物中的累积的以下策略：将H3A/布里斯班/10/2007或B佛罗里达/4/2006的胞外结构域与来自H5A/印度尼西亚/5/05的跨膜和胞质亚结构域融合。表达H5/H3和H5/B血凝素融合蛋白的表达盒显示于图10，融合边界的氨基酸显示于图11。

比较H5/B嵌合血凝素(745)与天然HA B(739)在本塞姆氏烟草植株中的累积水平。用AGL1/739和AGL1/745侵染植株，经过6天的孵育期后收获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶中每种HA形式的累积水平，首先从被侵染的叶组织中提取蛋白并用抗B(佛罗里达)多克隆抗体进行Western印迹分析。在用AGL1/739侵染的一个植株的叶提取物中检测到约为75kDa的独特条带(图14)，大小对应流感血凝素未切割的HA0形式，而用AGL1/745侵染的3个植株显示相应血凝素阳性信号，表明血凝素的H5/B嵌合形式比B血凝素天然形式更经常获得高累积水平。

类似地，比较H5/H3嵌合血凝素(737)与其天然形式(736)在本塞姆氏烟草中的累积水平。用AGL1/736和AGL1/737侵染植株，经过6天的孵育期后收获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶子中每种HA形式的累积水平，从被侵染的叶组织中提取蛋白病并用抗H3(布里斯班)多克隆抗体进行Western印迹分析。在用AGL1/736和AGL1/737侵染的叶提取物中检测到约为75kDa的独特条带(图15)，大小对应流感血凝素未切割的HA0形式。该结果表明来自H5A/印度尼西亚/5/05的跨膜和胞质亚结构域与H3A/布里斯班/10/2007胞外结构域的融合获得与天然H3A/布里斯班/10/2007累积水平类似的嵌合血凝素。

使用体积排阻色谱评价来自H5/B嵌合血凝素(构建体号745)表达的VLP生产。通过体积排阻色谱(SEC)在Sephacryl^TM S-500HR柱(GEHealthcare Bio-Science Corp.，Piscataway，NJ，USA)上对来自AGL1/745侵染植株的浓缩蛋白提取物(1.5mL)进行分级。如图16所示，蓝葡聚糖(2M Da)洗脱峰早在组分8中出现。将200μL每种SEC洗脱级分中的蛋白质用丙酮沉淀法浓缩(5倍)并用抗B(佛罗里达)多克隆抗体进行Western印迹分析(图16)，嵌合血凝素主要出现在组分7中，表明HA整合成高分子量结构。不希望被理论束缚，这表明嵌合HA蛋白组装成大型超结构或者其粘附到高分子量结构上。所获得的结果表明，HA B佛罗里达/4/2006胞外结构域与H5A/印度尼西亚/5/05的跨膜和胞质亚结构域构成的嵌合HA组装成高分子量颗粒，并且这些高分子量颗粒的洗脱谱与流感VLP的不同。

实施例5：H5/B嵌合血凝素(构建体747；包含与H5/Indo TDC融合的B/Flo HDC和SDC)与Hsp70和Hsp40共表达并与信号肽修饰相组合。

在共同待决申请PCT/CA2009/000032中描述了在植物中表达Hsp40和Hsp70以及与流感血凝素共表达。植物来源的胞浆Hsp70和Hsp40(构建体号R870)可以与嵌合血凝素共表达以增加它们在植物中的累积水平。用含有表达期望嵌合HA之表达盒的AGL1和AGL1/R870以及AGL1/35ShcPro的混合物(比例为1∶1∶1)的细菌悬液农杆菌侵染本塞姆氏烟草植物进行共表达。

评价在塞姆氏烟草植株中与HSP40和HSP70共表达的H5/B嵌合血凝素(融合H5/Indo TDC的B/Flo HDC和SDC)的累积水平。用AGL1/747、AGL1/747+AGL1/443(空载体)或AGL1/747+AGL1/R870(HSP40/HSP70)侵染植株，经过6天的孵育期后收获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶中H5/B嵌合HA的累积水平，首先从被侵染的叶组织中提取蛋白并用抗B(佛罗里达)多克隆抗体进行Western印迹分析。在用AGL1/747+AGL1/R870侵染的3株植株的叶提取物中检测到约为75kDa的独特条带(图50)，大小对应流感血凝素未切割的HA0形式，而AGL1/747+对照载体(443)侵染的3个植株未显示信号(在所使用的暴露条件下)，表明H5/B嵌合形式的血凝素在与HSP40和HSP70伴侣蛋白共表达时高水平累积。

所有引用的文献均通过引用并入本文，就如同每个具体的文献均具体和单独显示为通过引用并入本文的一样，并且如同它们在本文中被完全给出一样。本文对参考文献的引用不被解释为或认为是认同这些参考文献是本发明的现有技术。

在说明书中大量使用了一些术语，并且提供了定义帮助理解本发明的多个方面。在说明书中使用的实例(包括术语的实例)仅用作说明目的，而不旨在限制本发明实施方案的范围和含义。数值范围包括定义范围的数值。在说明书中，词语“包含”用作开放式术语，基本上等同于术语“包括但不限于”，词语“含有”具有相应的含义。

本发明的一个或多个目前优选的实施方案已通过示例方式进行了描述。本发明包括基本如上文所述和参照实施例和附图的所有实施方案、修饰和变化。对本领域技术人员来说显然的是，在不偏离权利要求中限定的本发明范围的前提下，可以进行一些变化和修饰。这些修饰的实例包括本发明任何方面以基本相同的方法为获得相同结果而进行的已知等价方案的替换。

Claims

1.核酸，其包含在植物、昆虫或酵母细胞中有效的一个或更多个调控区，并且所述调控区与编码嵌合流感HA多肽的序列有效连接，所述嵌合流感HA多肽包含茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，所述一个或更多个调控区还包含在所述植物、昆虫或酵母细胞中有效的5’UTR、3’UTR或者5’UTR和3’UTR，并且其中：

a)所述SDC包含F’1、F’2和F亚结构域；

b)所述HDC包含RB、E1和E2亚结构域；

c)所述TDC包含TmD和Ctail亚结构域；而且

其中至少所述RB亚结构域来自第一流感HA，并且所述SDC、TDC或上述两者来自一种或更多种第二流感HA，其中所述E1、E2或上述两种亚结构域以及F’1、F’2或上述两种亚结构域来自相同的流感HA。

2.权利要求1的核酸，其中所述编码嵌合流感HA多肽的序列还包含选自以下的信号肽序列：HA天然信号肽序列、苜蓿PDI信号肽序列、流感H5信号肽序列和流感H1信号肽序列。

3.权利要求1的核酸，其中所述5’UTR、3’UTR或者5’UTR和3’UTR获得自质体蓝素UTR或CPMV UTR。

4.权利要求1的核酸，其中所述调控区获得自质体蓝素调控区、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)调控区、叶绿素a/b结合蛋白(CAB)调控区、CaMV35S调控区、肌动蛋白调控区、泛素调控区、丙糖磷酸异构酶1调控区、翻译起始因子4A调控区和ST-LS1调控区。

5.权利要求1的核酸，其中所述第一和第二流感HA独立地选自包含H1、H3、H5和B的组。

6.在植物中生产嵌合流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：

a)向所述植物或其部分中引入权利要求1的核酸，和

b)在允许所述核酸表达的条件下孵育所述植物或其部分，从而生产所述VLP。

7.权利要求6的方法，其中在所述引入步骤(步骤a)中，以瞬时方式将所述核酸引入所述植物中。

8.权利要求6的方法，其中在所述引入步骤(步骤a)中，将所述核酸引入所述植物中以使所述核酸稳定地整合入基因组中。

9.权利要求6的方法，其还包括步骤：

c)收获所述植物和纯化所述VLP。

10.权利要求1所述核酸所编码的多肽。

11.包含权利要求10所述多肽的病毒样颗粒(VLP)。

12.权利要求11的VLP，其还包含植物特异性N-聚糖或修饰的N-聚糖。

13.组合物，其包含有效剂量的权利要求12的VLP和可药用载体。

14.权利要求11的病毒样颗粒在制备用于在对象中诱导针对流感病毒感染之免疫的药物中的用途。

15.权利要求14的用途，其中所述病毒样颗粒适于经口、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下施用给对象。

16.权利要求1的核酸，其中所述RB亚结构域来自第一流感HA，并且所述E1、E2、SDC、TDC或其组合来自第二流感HA。

17.权利要求16所述核酸所编码的多肽。

18.包含权利要求17所述多肽的病毒样颗粒(VLP)。

19.在植物中生产嵌合流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：

a)向所述植物或其部分中引入权利要求16的核酸，和

20.权利要求1的核酸，其中所述SDC和HDC来自第一流感HA，并且所述TDC来自第二流感HA。

21.权利要求20所述核酸所编码的多肽。

22.包含权利要求21所述多肽的病毒样颗粒(VLP)。

23.在植物中生产嵌合流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：

a)向所述植物或其部分中引入权利要求20的核酸，和

24.核酸，其包含与编码嵌合流感HA多肽的序列有效连接的一个或更多个调控区，所述嵌合流感HA多肽包含茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中：

a)所述SDC包含F’1、F’2和F亚结构域；

b)所述HDC包含RB、E1和E2亚结构域；

c)所述TDC包含TmD和Ctail亚结构域；而且

其中所述RB亚结构域来自第一流感HA，并且所述E1、E2、SDC、TDC或其组合来自一种或更多种第二流感HA。

25.权利要求24的核酸，其中所述E1、E2或上述两种亚结构域以及F’1、F’2或上述两种亚结构域来自相同的流感HA。

26.权利要求24所述核酸所编码的多肽。

27.包含权利要求26所述多肽的病毒样颗粒(VLP)。

28.在植物中生产嵌合流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：

a)向所述植物或其部分中引入权利要求24的核酸，和