CN102480951A - 用于治疗局部缺血病症和与线粒体功能相关病症的方法和组合物 - Google Patents

用于治疗局部缺血病症和与线粒体功能相关病症的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于预防性和/或治疗性治疗与线粒体功能相关的病症的组合物和方法。在不同的方面，本发明包括以有效刺激细胞线粒体功能的量施用选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。本文描述的方法和组合物提供在持续性局部缺血或局部缺血/再灌注(IR)事件之后减少梗死面积或用于延迟、衰减或预防不利的心脏重塑的方法，并且可以帮助预防受损的线粒体生物发生并因此预防受损的线粒体生物发生在各种疾病和病症中的后果，以及提供可能已经发生的线粒体缺乏的活性疗法。

Description

用于治疗局部缺血病症和与线粒体功能相关病症的方法和组合物
本申请要求2009年4月17日提交的美国临时专利申请61/170,557和2009年9月17日提交的美国临时专利申请61/243,501的优先权，其每一个在此整体并入，包括所有表格、图和权利要求。
背景技术
发明背景的以下讨论仅为帮助读者理解本发明而提供，并且不承认描述或构成本发明的现有技术。
本专利申请涉及急性损伤的治疗和预防，以及慢性线粒体缺乏或功能障碍状态的预防或恢复。
局部缺血器官损伤和局部缺血/再灌注损伤相关病症伴随信号分子和代谢效应物的改变，其可以独立或共同触发各种形式的细胞死亡。这些包括细胞内pH、钙、神经酰胺、自由基、缺氧和腺苷三磷酸(ATP)消耗的改变。所有这些因素可以因急性坏死性细胞死亡而显著改变，它们在某些情况下也可以是凋亡特异性效应物。
凋亡性细胞死亡和细胞坏死对局部缺血病症例如心肌梗死和中风中的器官功能退化的贡献是公知的。由于心肌细胞坏死和凋亡，心肌梗死一般导致心室功能的即刻降低。这些梗死也可能扩张，引起肌细胞和结构事件的级联，最终导致不利的心脏重塑。在许多情况下，这种进行性心肌梗死扩张和不利的心室重塑(左心室壁变薄，瘢痕组织形成)导致心室功能退化和心力衰竭。
局部缺血性肾损伤通常伴随肾小管细胞坏死以及梗阻性管型形成、结构破坏和显著的炎症反应。最近，凋亡作为显著的细胞死亡方式在局部坏血性肾损伤期间出现。虽然凋亡性细胞死亡对器官功能退化的贡献在诸如心肌梗死和中风的病症中是明显的，但还不清楚肾小管细胞的凋亡性脱落如何可以影响肾小球滤过率(GFR)。然而，最近报告证明，对凋亡程序的干扰确实转化为对肾功能的保护作用。
尽管在凋亡和细胞坏死相关病症的诊断和治疗中取得了相当进步，但该领域依然需要用于治疗这些病症的预防性和治疗性方法。
本文使用的短语“与线粒体功能相关的病症”指以一种方式或另一种方式源于细胞中存在的负责产生超过90％的机体维持生命并支持生长所需能量的专门区室线粒体破坏的那些疾患。当线粒体功能失灵时，细胞内产生较少的能量。随后是细胞损伤和最终的细胞死亡。此类病症包括具有神经肌肉疾病症状的那些(通常称为“线粒体肌病”)、糖尿病、多发性硬化、亚急性硬化性脑病、痴呆、肌神经性胃肠脑病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、智力迟钝、耳聋和盲、肥胖、心力衰竭、中风、狼疮和类风湿性关节炎。此类病症还包括相对运动能力。这包括例如从身体固定恢复，部分或简单地改善一般运动能力。
线粒体疾病的影响是非常多变的，并且线粒体疾病具有独特特征，因为疾病方式通常是遗传的并且因为线粒体对于细胞功能是非常重要的。特定缺陷的严重度可以是大的或小的。一些较小缺陷仅引起″体力不支″，而无严重病态或残疾。缺陷通常影响线粒体运作，更严重的影响多个组织，导致多系统疾病。通常，线粒体疾病在缺陷型线粒体存在于肌肉、大脑或神经中时是恶化的，因为这些细胞比身体大部分细胞使用更多的能量。
尽管研究依然在继续，但目前的治疗选择是有限的，依然频繁使用维生素。最近还报道了丙酮酸盐作为治疗选择。本领域依然需要用于治疗这些病症的预防性和治疗性方法。
发明内容
本发明的目的是提供用于预防性和/或治疗性治疗与局部缺血引起的凋亡和细胞坏死相关的疾病和病症的组合物和方法。在下文描述的各个方面中，本发明提供了用于治疗急性冠状动脉综合征的组合物和方法，所述急性冠状动脉综合征包括但不限于心肌梗死和咽峡炎；其他器官和组织中的急性局部缺血事件，包括但不限于肾损伤、肾局部缺血和主动脉及其分支的疾病；源自医疗介入的损伤，所述医疗介入包括但不限于冠状动脉旁路移植(CABG)手术和动脉瘤修复；和代谢疾病，包括但不限于糖尿病。
本发明另一目的是提供用于治疗性和/或治疗性治疗与线粒体功能相关的病症的组合物和方法。在下文描述的各个方面中，本发明包括以有效刺激细胞线粒体功能的量施用选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。细胞线粒体功能的刺激包括线粒体呼吸和线粒体生物发生的一种或多种的刺激。本文描述的方法和组合物可以帮助预防受损的线粒体生物发生，并因此预防各种疾病和病症中受损线粒体生物发生的后果，以及提供可能已经发生的线粒体缺乏的活性疗法。
在第一方面，本发明涉及治疗受试者局部缺血或局部缺血/再灌注(IR)病症的方法。这些方法包括给有相应需要的受试者施用选自由表儿茶素、其衍生物及其药学可接受的盐的药物，最优选与对局部缺血疾病具有作用的一种或多种药物组合。
在优选实施方案中，主题基于心肌梗死的发生而选择。优选地，所述方法减少受试者心脏的梗死面积和/或延迟、衰减或预防受试者不利的心脏重塑。
在其他优选实施方案中，主题基于肾损伤的发生而选择。优选地，所述方法减少肾损伤向肾衰竭的进展。在其他优选实施方案中，主题基于冠状动脉完全闭塞的发生而选择。优选地，所述方法减少受试者心脏的梗死面积和/或延迟、衰减或预防受试者不利的心脏重塑。
在其他优选实施方案中，主题基于急性心肌局部缺血(例如，咽峡炎或AMI)的发生而选自。优选地，所述方法减少受试者对血管扩张剂药物(例如，尼可地尔或其衍生物)和特别是对硝酸根供体血管扩张剂例如尼可地尔、硝普盐和硝化甘油的耐受性发展。
在其他优选实施方案中，主题基于中风、主动脉瘤、心房颤动的发生而选择。
在其他优选实施方案中，主题基于引起暂时急性局部缺血的医疗介入例如CABG手术、动脉瘤修复、血管成形术或给受试者施用放射性造影剂的发生而选择。
在本发明的某些实施方案中，表儿茶素或其衍生物或药学可接受的盐与用于治疗局部缺血或局部缺血/再灌注事件的一种或多种其他药物一起施用给受试者。示例性的其他药物包括独立选自由以下组成的组的一种或多种化合物：四环素抗生素(例如，强力霉素)、糖蛋白IIb/IIIa抑制剂(例如，依替巴肽、替罗非班、阿昔单抗)；ADP受体/P2Y12抑制剂(例如，氯吡格雷、噻氯匹啶、普拉格雷)；前列腺素类似物(例如，贝拉司特、伊洛前列素、曲前列环素)；COX抑制剂(例如，阿司匹林、阿洛普令)；其他抗血小板药物(例如，双苯唑醇、氯克罗孟、潘生丁、吲哚布芬、吡考他胺、三氟醋柳酸)；抗凝剂(例如，香豆素类、1，3-茚满二酮抗凝剂)；肝素；直接因子Xa抑制剂；直接凝血酶(II)抑制剂(例如，比伐卢定)；和血管扩张剂(例如，非诺多泮、肼屈嗪、奈西立肽、尼可地尔、尼卡地平、硝化甘油和硝普盐)。该名单不是要限制。在特别优选的实施方案中，表儿茶素或其衍生物或药学可接受的盐与一种或多种四环素抗生素例如强力霉素一起施用。
虽然优选地两种或多种药物在同一药物组合物中“一起施用”，但本文使用的该短语不是要暗示必须如此。而是，如果每种药物从机体清除的T1/2至少部分与另一种药物重叠，则两种或多种药物是“一起施用”。例如，如果第一个药物具有1小时的清除T1/2并在时间＝0时施用，并且第二个药物具有1小时的清除T1/2并在时间＝45分钟时施用，则这两种药物被认为是一起施用。相反，如果第二个药物在时间＝2小时时施用，则这两种药物被认为不是一起施用。
本发明药物组合物的施用途径包括胃肠外和肠途径。优选的肠施用途径包括通过口腔(口服)、鼻、直肠和阴道途径递送。优选的胃肠外施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下和腹腔内途径。当施用超过一种药物组合物时，每种不需要通过相同途径施用。在特别优选的实施方案中，表儿茶素或其衍生物或药学可接受的盐与一种或多种四环素抗生素例如强力霉素一起静脉内施用，最优选以单一药物组合物。
优选地，本发明药物组合物以“有效量”施用。该术语在下文定义。除非另外明确或另一种方式指明，“有效量”不限于足以缓解病症的最小量，或者导致病症最佳或最大缓解的量。在两种或多种药物一起施用的情况下，一种此类药物的有效量在单独使用时可能不是有效量，但在与其他药物一起使用时可能是有效量。
在某些实施方案中，本发明药物组合物在局部缺血或局部缺血/再灌注事件发生的48小时内或提出医疗治疗的48小时内施用。事件的发生可以通过受试者的自我报告或者通过事件发生的一些客观量度来确定。
在涉及心脏的局部缺血事件的情况下，优选的客观量度包括一种或多种心脏标志物(例如，CK-MB、肌红蛋白、心肌肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白T、B型钠尿肽、NT-proBNP等)的增加；连续ECG描记的改变；和血管造影结果。
在涉及肾的局部缺血事件的情况下，优选的客观量度包括由Bellomo等，Crit Care.8(4)：R204-12，2004定义的那些，其在此通过引用整体并入。该参考文献提出了分别急性肾损伤患者的以下分类：“风险”：血清肌酸酐从基线增加1.5倍，或6小时的尿生成＜0.5ml/kg体重；“损伤”：血清肌酸酐从基线增加2.0倍，或12小时的尿生成＜0.5ml/kg；“衰竭”：血清肌酸酐从基线增加3.0倍，或肌酸酐＞355μmol/l(增加＞44)或24小时的尿排出量低于0.3ml/kg。
在优选实施方案中，本发明药物组合物在局部缺血或局部缺血/再灌注事件发生或患者提出的24小时内、更优选12小时内和最优选6小时内施用。
在相关方面，本发明涉及用于治疗急性局部缺血或局部缺血/再灌注(IR)事件的药物组合物。该组合物包括有效量的表儿茶素或其衍生物或药学可接受的盐和用于治疗局部缺血或局部缺血/再灌注事件的一种或多种其他药物。在特别优选的实施方案中，药物组合物包括表儿茶素或其衍生物或药学可接受的盐和一种或多种四环素抗生素、最优选强力霉素。最优选地，组合物被配制用于静脉内递送。
另一方面，本发明涉及增强或维持受试者受损心脏组织干细胞迁移、播种、增殖、分化和/或存活的方法，包括给有相应需要的患者施用选自由表儿茶素、其衍生物及其药学可接受盐组成的组的药物，任选地与用于治疗局部缺血或局部缺血/再灌注事件的一种或多种其他药物一起施用。
另一方面，本发明涉及治疗受试者代谢疾病的方法。这些方法包括给有相应需要的受试者施用选自由表儿茶素、其衍生物及其药学可接受盐组成的组的药物。在优选实施方案中，受试者基于糖尿病的发生而选择。优选地，所述方法降低受试者的血糖水平。
另一方面，本发明涉及某些表儿茶素衍生物。这些可以用于本文描述的方法，或者可以用于分离为药物化合物。
本文使用的术语“表儿茶素衍生物”指保留了表儿茶素自身的环结构和3R(-)立体化学但相对于表儿茶素具有一个或多个取代基的任何化合物。某些天然存在的表儿茶素衍生物是已知的，例如(-)-表焙儿茶素(EGC)、(-)-表儿茶素-3-棓酸酯(ECG)和(-)-表焙儿茶素-3-棓酸酯(EGCG)。该术语还包括当施用给受试者时释放表儿茶素或其衍生物的组合分子或前药。这种组合分子可以包括例如通过可水解连接基团连接的表儿茶素和尼可地尔。类似地，本文使用的术语“儿茶素衍生物”指保留了儿茶素自身的环结构和3R(+)立体化学但相对于儿茶素具有一个或多个取代基的任何化合物。
优选的表儿茶素衍生物具有以下结构：
Figure BDA0000104357160000061
其中
R1、R2和R4各自独立选自由-OH、-O-C1-6直链或支链烷基、-O-C1-12芳基烷基、-C1-6直链或支链烷基和-C1-12芳基烷基组成的组，其中每个所述直链或支链烷基或芳基烷基包括0-4个链杂原子和任选的独立选自由卤素、三卤代甲基、-O-C1-6烷基、-NO2、-NH2、-OH、-CH2OH、-CONH2和-C(O)(OR6)组成的组的一个或多个取代基，其中R6是H或C1-3烷基，条件是R1、R2和R4的至少一个不是-OH，并且条件是R1和R2各自为-OH时R4不是-CH3或-O-CH3；
R3是-OH或
Figure BDA0000104357160000071
并且
R5是-H或-OH，
或其药学可接受的盐。
在此类衍生物或药学可接受的盐的某些实施方案中，R1、R2和R4中的两个是-OH。在其他实施方案中，R1、R2和R4中的至少一个是-O-C1-6直链或支链烷基。
特别优选的表儿茶素衍生物包括具有选自由以下组成的组的结构的那些
Figure BDA0000104357160000072
此类衍生物可以被配制为包含本文所述衍生物或药学可接受的盐和药学可接受的赋形剂的药物组合物。这些可以被配制用于胃肠外或肠途径施用。
在某些实施方案中，该药物组合物还包括独立选自由四环素抗生素、糖蛋白IIb/IIIa抑制剂、ADP受体/P2Y12抑制剂、前列腺素类似物、COX抑制剂、抗血小板药物、抗凝剂、肝素、直接因子Xa抑制剂、直接凝血酶(II)抑制剂和血管扩张剂(例如，尼可地尔或其衍生物)组成的组的一种或多种化合物。
如上所述，本发明另一目的是提供用于预防性和/或治疗性治疗与线粒体功能相关病症的组合物和方法。在第一方面，本发明包括以有效刺激细胞线粒体功能的量施用选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组一种或多种化合物。
细胞线粒体功能的刺激包括线粒体呼吸和线粒体生物发生的一种或多种的刺激。本文描述的方法和组合物可以帮助预防受损的线粒体生物发生，并因此预防各种疾病和病症(慢性和急性)中受损线粒体生物发生的后果，以及提供可能已经发生的线粒体缺乏的活性疗法。
在某些实施方案中，化合物的施用包括给细胞施用至少0.1μM儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物，至少0.25μM儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物，至少0.5μM儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物，和至少1μM儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物。在不同实施方案中，至少预期浓度被维持至少30分钟、1小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时或更长时间。在不同实施方案中，至少预期浓度在至少24小时、48小时、72小时、1周、一个月或更长时间每12小时期间达到至少一次；或者在至少48小时、72小时、1周、一个月或更长时间每24小时期间达到至少一次。为了使预期浓度维持预期时间，可以采用一种或多种化合物的多剂。给药间隔可以基于每种感兴趣化合物从机体清除的T1/2来确定。
选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物可以有效刺激动物细胞线粒体功能的量通过胃肠外或肠途径地送给所述动物。优选的肠施用途径包括通过口腔(口服)、鼻、直肠和阴道途径递送。优选的胃肠外施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下和腹腔内途径。当施用超过一种化合物时，每种不需要通过相同途径施用。
优选地，本发明化合物以“有效量”施用。该术语在下文定义。除非另外明确或另一种方式指明，“有效量”不限于足以缓解病症的最小量，或者导致病症最佳或最大缓解的量。在两种或多种化合物一起施用的情况下，一种此类化合物的有效量在单独使用时可能不是有效量，但在与其他化合物一起使用时可能是有效量。
在其中递送表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素或儿茶素衍生物的那些方法中，优选的是所选化合物相对于选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素或儿茶素衍生物组成的组的其他化合物至少90％纯。例如，如果化合物是表儿茶素，它含有不超过10％的表儿茶素衍生物、儿茶素和儿茶素衍生物污染。更优选地，所选的表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素或儿茶素衍生物相对于选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素或儿茶素衍生物组成的组的其他化合物至少95％纯。注意，但这不排除与明显浓度的尼可地尔或尼可地尔衍生物组合。因此，在某些实施方案中，表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素或儿茶素衍生物在本方法中与尼可地尔或尼可地尔衍生物组合递送。这些优选以单一药物组合物提供。
动物可以基于如下诊断被选择施用有效刺激线粒体功能的量的选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物：所述动物罹患或有直接风险罹患涉及降低的线粒体功能的一种或多种病症。如上所述，此类病症可以包括线粒体代谢先天性障碍、皮肤老化(例如，由于光暴露)、营养或维生素缺乏、线粒体肌病、糖尿病、胰岛素抵抗、代谢综合征、弗里德赖希氏共济失调、肺动脉高压、慢性肾病、急性肾损伤、高血压、多发性硬化、亚急性硬化脑病、痴呆或其他与年龄相关的认知受损病症、血管疾病、代谢损伤或神经变性(例如，阿尔茨海默病)、肌神经性胃肠脑病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、智力迟钝、耳聋和盲、肥胖、心力衰竭、中风、狼疮和类风湿性关节炎。
动物可以基于增加运动能力的愿望被选择以有效刺激线粒体功能的量施用选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组一种或多种化合物。这包括例如从身体固定恢复，部分或简单地改善一般运动能力。此外，动物可以基于所述动物的年龄、活动状态或营养状态(例如，接受完全胃肠外营养、婴儿配方等的受试者)而选择。该名单不是限制性的。
因此，在不同实施方案中，本发明提供了用于改善肌肉结构或功能的方法；用于改善与运动相关的线粒体作用的方法；用于增强受年龄、不活动、饮食或前述疾病和病症的任何一个限制的那些动物的运动能力的方法；用于增强响应于运动的肌肉健康和功能的方法；用于在受限制的运动能力的临床环境下增强肌肉健康和功能的方法，不论受限制的运动能力是由于损伤、不活动、肥胖或前述疾病和病症的任何一种；和/或增强肌肉从剧烈活动或从与剧烈活动或持续活动相关的损伤恢复的方法。在每种情况下，所述方法包括以效刺激细胞线粒体功能的量施用选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。
在优选实施方案中，本发明包括以有效维持所述化合物在所述动物中至少0.1μM的血浆浓度至少12小时、24小时、48小时、72小时或更长时间的量通过口服途径递送儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物。在不同方面，所述方法维持所述化合物在所述动物中至少1μM的血浆浓度至少24小时或更长时间。在其他优选实施方案中，要求保护的发明包括以有效在至少24小时、48小时、72小时、1周、一个月或更长时间每12小时期间达到至少一次至少0.1μM的血浆浓度的量通过口服途径递送儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物。在其他优选实施方案中，要求保护的发明包括以有效在至少48小时、72小时、1周、一个月或更长时间每24小时期间达到至少一次至少0.1μM的血浆浓度的量通过口服途径递送儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物。在这些实施方案中，所述方法优选维持或达到至少1μM的血浆浓度持续如上所述不同的时间段。
在相关方面，本发明涉及治疗动物中涉及降低的线粒体功能的病症。这些方法包括以有效刺激所述动物细胞线粒体功能的量通过胃肠外或肠途径为动物递送选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。
在某些实施方案中，前述方法包括递送有效量的表儿茶素或表儿茶素衍生物。优选的表儿茶素衍生物具有如下结构：
Figure BDA0000104357160000111
其中
R1、R2和R4各自独立选自由-OH、-O-C1-6直链或支链烷基、-O-C1-12芳基烷基、-C1-6直链或支链烷基和-C1-12芳基烷基组成的组，其中每个所述直链或支链烷基或芳基烷基包括0-4个链杂原子和任选的独立选自由卤素、三卤代甲基、-O-C1-6烷基、-NO2、-NH2、-OH、-CH2OH、-CONH2和-C(O)(OR6)组成的组的一个或多个取代基，其中R6是H或C1-3烷基，条件是R1、R2和R4的至少一个不是-OH，并且条件是R1和R2各自为-OH时R4不是-CH3或-O-CH3；
R3是-OH或
Figure BDA0000104357160000112
并且
R5是-H或-OH，
或其药学可接受的盐。
在此类衍生物或药学可接受盐的某些实施方案中，R1、R2和R4中的两个是-OH。在其他实施方案中，R1、R2和R4中的至少一个是-O-C1-6直链或支链烷基。
特别优选的表儿茶素衍生物包括具有选自由以下组成的组的结构的那些
Figure BDA0000104357160000121
本文使用的术语“尼可地尔衍生物”指保留N-[2-(硝基氧基)乙基]-3-吡啶甲酰胺(尼可地尔)的N-乙基C-2硝基氧基部分但相对于尼可地尔具有一个或多个取代基的任何化合物。实例包括Boschi等，Bioorg.Med.Chem.8：1727-32，2000；和Satoh等，Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.344：589-95，1991.中公开的那些。该术语还包括当施用给受试者时释放尼可地尔或其衍生物的组合分子或前药。这种组合分子可以包括例如通过可水解连接基团连接的表儿茶素和尼可地尔。
上述化合物和衍生物可以被配制为包括本文描述的衍生物或药学可接受的盐和药学可接受的赋形剂的药物组合物。这些可以被配制用于胃肠外或肠施用途径。上述化合物和衍生物还可以被配置为下文描述的营养药物组合物。
本公开的一个或多个实施方案的细节在附图和以下说明书中提供。本公开的其他特征、目的和优点将通过说明书和附图以及权利要求书而明显。
附图说明
图1描述了表儿茶素及其各种衍生化形式对线粒体孔开放的抑制。
图2描述了实施例3的结果，显示I/R诱导的心肌损伤导致精氨酸酶酶活性的～5倍增加(图)。(-)-表儿茶素(1mg/Kg)预处理(10天)诱导了精氨酸酶活性的显著降低。
图3描述了实施例4的结果，显示细胞内Ca2+的增加与表儿茶素(EPI)处理的人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)中一氧化氮生成的增加不相关。分别测量用递增浓度的BK或EPI处理的HCAEC中的一氧化氮生成和细胞内Ca2+。在BK处理的HCAEC中，一氧化氮生成反映了较高浓度细胞内钙的增加。用10nM EPI和较高浓度处理的HCAEC显示一氧化氮生成大于细胞内钙增加。
图4描述了实施例4的结果，显示EPI和BK处理HCAEC导致细胞内Ca2+浓度增加，通过荧光测量。用[1mol/L]EPI和[1mol/L]BK处理的HCAEC表现出细胞内Ca2+增加。无细胞内Ca2+的HCAEC未证明荧光增加，尽管用EPI和BK处理。
图5描述了实施例4的结果，显示在用EPI处理的无Ca2+HCAEC中观察到了一氧化氮(NO)生成。在用[1mol/L]EPI处理的无Ca2+HCAEC中看到大约25％NO生成，与BK处理形成鲜明对比，BK处理在缺乏细胞内Ca2+时被完全废止。[1mol/L]BK处理具有2％NO生成，而[1mol/L]EPI具有25％。
图6描述了实施例4的结果，显示EPI在缺乏Ca2+时通过Ser-1177、633和615磷酸化活化内皮一氧化氮合成酶(eNOS)。在[1mol/L]EPI处理的HCAEC中，丝氨酸残基的磷酸化相对于总的基础eNOS磷酸化增加。与对照磷酸化相比，Ser-1177磷酸化增加100％，Ser-633增加75％，并且Ser-615增加65％。未观察到Thr-495磷酸化的变化。
图7描述了实施例4的结果，显示eNOS在无Ca2+HCAEC中被EPI活化，而不与窖蛋白-1(Cav-1)分离。来自EPI或BK处理的HCAEC的总蛋白被Cav-1或eNOS抗体沉淀。Western印迹在免疫沉淀相中针对关键的eNOS残留物eNOS和Cav-1进行。在对照HCAEC中，eNOS不被活化，也不与Cav-1分离。通过Ser-1177、Ser-633和Ser-615的磷酸化状态发现，BK处理不活化eNOS。而且，eNOS不与Cav-1分离。
图8描述了实施例4的结果，显示上清液相的Western印迹。对照、EPI和BK处理的HCAEC，上清液具有可忽略的eNOS残留物eNOS和Cav-1存在。
图9描述了实施例4的结果，显示在用EPI或BK处理的无Ca2+HCAEC以及对照中，eNOS不与钙调蛋白-1(CaM1)结合。HCAEC被裂解并用eNOS抗体沉淀。上清液相显示仅CaM1表达而eNOS不表达。
图10-15描述了实施例4的结果，显示eNOS被EPI活化并保留在对应于无Ca2+HCAEC的胞膜窖/脂质层的细胞低密度相中。来自HCAEC的总蛋白提取物在蔗糖梯度中排列。45、35、界面和5％梯度的蔗糖用于检测eNOS残留物、eNOS、Cav-1、运铁蛋白受体(TfR)和神经节苷脂M1(GM1)。图10：对照HCAEC在Ca2+存在下显示无活性的eNOS，与Cav-1和GM1一起位于低蔗糖密度级分中。图11：BK处理的HCAEC在规则Ca2+存在下具有活化eNOS并定位于高蔗糖密度级分。图13：无Ca2+的对照HCAEC具有在低蔗糖密度级分中的无活性eNOS。图14：在无Ca2+HCAEC中，BK不能活化和转移eNOS至高蔗糖密度级分。图15：在无Ca2+HCAEC中，EPI活化eNOS而不将它转移至高蔗糖密度级分。
图16描述了6ACA-EPI的合成。
图17描述了所观察到的IV应用Dx-EPI诱导的％IA/AAR降低。
图18描述了表儿茶素对C2C12细胞中内源呼吸速率的影响。OCR＝氧消耗速率，pmol O2/min/3x104细胞(平均值±SD)。
图19描述了用0.1、0.5或1微摩尔表儿茶素处理48小时的C2C2成肌细胞的内源、状态4(休息)和解偶联剂刺激的呼吸的氧消耗速率(OCR)。A.添加寡霉素诱导状态4和FCCP以诱导解偶联剂刺激的呼吸的随时间的速率。B.相同实验的平均速率的条线图。数据是平均值±SD(n＝3-4)。
图20描述了表儿茶素对线粒体电子运输链蛋白水平的影响。用1μM表儿茶素或儿茶素处理48小时的C2C12细胞的Western印迹用针对电子运输链蛋白的单克隆抗体混合物探测。
图21描述了内源、状态4(休息)和解偶联剂刺激的呼吸的氧消耗速率(OCR)，使用来自尼可地尔和表儿茶素处理的人骨骼肌肌细胞的原代培养物。
图22描述了尼可地尔和表儿茶素及这些的组合对解偶联剂刺激的呼吸的氧消耗速率(OCR)的对比作用，使用人骨骼肌肌细胞的原代培养物。
图23描述了尼可地尔和表儿茶素对线粒体孔开放对内源、状态4(休息)和解偶联剂刺激的呼吸的氧消耗速率(OCR)的对比作用，使用人骨骼肌肌细胞的原代培养物。
图24描述了表儿茶素对线粒体孔开放的作用。
图25-27描述了实施例10的结果。图25描述了EPI、NICO和EPI+NICO(0.5单独剂)对线粒体溶胀的作用；图26描述了EPI+NICO的几种组合的分析，表明非常低浓度下的协同作用；和图27描述了NICO(Y轴，[M])和EPI(X轴，[M])的组合的等辐射分析，通过位于指示加合作用的线之外的圆圈表明协同作用。
图28描述了(-)-表儿茶素(Epi)和/或尼可地尔(Nico)处理对梗死面积的作用，使用心肌局部缺血-再灌注(IR)损伤的大鼠模型。
具体实施方式
除非本文另外特别指明，否则使用的术语的定义是药物科学领域使用的标准定义。除非上下文另外明确指明，如说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式″一种″、″一个″和″该″包括复数指代物。因此，例如，对″药物载体″的提及包括两种或多种此类载体及类似物的混合物。
而且，除非另外指明，“或”的使用意思是“和/或”。类似地，“包括”、“包含”、“含有”、“包括”、“包括”和“包括”可互换使用并预期不是限制性的。
还要理解，当各种实施方案的描述使用术语“包括”时，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，实施方案可以可选地使用语言“基本由...组成”或“由...组成”来描述。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所述领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和试剂可用于实施本公开的方法和组合物，但现在描述示例性的方法和材料。
本文提及的所有出版物在此通过引用完整并入以描述和公开在所述出版物中描述的方法，其可结合本文的描述来使用。上文和通篇讨论的出版物仅为其公开在本公开申请日之前而提供。这里任何不被解释为承认本发明人无权借助在先公开而先于此类公开。
局部缺血和再灌注是生理上不同的事件，并且不必同时发生。因为局部缺血指通常由于血栓和栓塞和再灌注损伤结果导致的一部分的血液缺乏，当阻塞或限制被消除时，可能并预期减少局部缺血/再灌注事件中潜在的梗死面积和不利的重塑。本公开提供了用于抑制局部缺血和/或再灌注损伤的方法和组合物，包括例如在局部缺血期间施用表儿茶素，或可选地在局部缺血之后但在再灌注发生之前施用表儿茶素，或可选地在局部缺血之后和再灌注时施用表儿茶素。本文公开了其中表儿茶素、其衍生物或其药学可接受盐在局部缺血/再灌注时间期间、之前或之后施用的方法。
缺少血和氧的组织罹患局部缺血性坏死或梗死，经常导致持久的组织损伤。心脏局部缺血经常称为″咽峡炎″、″心脏病″或″心脏病发作″，而大脑局部缺血经常称为″中风″。心脏和大脑局部缺血都源于减少的血液和氧流，其经常伴随一定程度的脑损伤、对心脏组织的损伤、或两者。血流和氧合作用的减少可能是动脉闭合、血管破裂、发育畸形、血液改变的粘度或其他性质、或身体创伤的结果。糖尿病是局部缺血的风险因子。因此，本公开的方法和组合物可用于预防或抑制局部缺血风险，或抑制和减少由糖尿病患者局部缺血损伤引起的损伤。除了心脏和大脑局部缺血损伤以外，这可以包括导致视力丧失和溃疡的局部缺血。
至特定血管区域的血流损失被称为局部缺血；至整个脑的血流损失称为全缺血。当缺少血液并因此缺少氧和葡萄糖时，脑组织可能经历缺血性坏死或梗死。被认为是这种细胞变性和死亡的潜在原因的代谢事件包括：经由ATP缺失的能量衰竭；细胞酸中毒；谷氨酸释放；钙离子内流；膜磷脂降解和随后游离脂肪酸累积的刺激；和自由基产生。
脊索损伤是脊柱创伤以及用于治疗胸廓和胸腹动脉瘤的主动脉手术的最严重并发症(Kouchoukos，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.99：659-664，(1990))。如美国专利号5,648,331所述，脊索是对主动脉钳闭期间局部缺陷最敏感的器官，其中得到的损伤可以产生下肢轻瘫或下身麻痹。脊索局部缺血和下身麻痹在大约百分之十一(11％)的经历选择性下行胸廓和胸腹动脉瘤修复的患者中以及在接近百分之四十(40％)的经历紧急修复的患者中发生(Crawford，J.Vas.Surg.3：389-402，(1986))。
当心脏肌肉不接收足够的血液供应并因此缺乏必要水平的氧和营养素时发生心肌局部缺血。心肌局部缺血的常见原因是动脉硬化，其导致为心脏肌肉提供血流的血管(冠状动脉)堵塞。充血性心力衰竭(CHF)也可导致心肌梗死。
影响肠的局部缺血事件在许多患者的死亡和发病中起主要作用。如美国专利号6,191,109所述，对小肠的局部缺血损伤导致粘膜破坏、细菌转移和穿孔。
年龄相关的黄斑变性(AMD)是美国和其他地方65岁以上人的视力缺损和盲的主导原因。视网膜的氧化性损伤可能参与AMD的发病。
活性氧类(ROS)也称为自由基，包括单电键氧、超氧化物阴离子(O2-)、一氧化氮(NO)和羟基自由基以及其他化合物。线粒体特别易受ROS损伤，因为ROS由线粒体呼吸链连续产生。当细胞经历许多应激包括器官局部缺血和再灌注、紫外线暴露和其他形式辐射时，ROS生成增加。Reiter等(1998)Ann.N.Y.Acad.Sci.854：410-424；Saini等(1998)Res.Comm.Mol.Pathol.Pharmacol.101：259-268；Gebicki等(1999)Biochem.J.338：629-636。ROS也响应于大脑局部缺血而产生，包括由中风、创伤性头损伤和脊髓损伤引起的局部缺血。此外，当代谢增加或机体经受极端运动时，内源性抗氧化剂系统被颠覆，自由基损伤可能发生。据报道，自由基引起与一些毒素和不健康病症相关的组织损伤，包括毒素诱导的肝损伤。Obata(1997)J.Pharm.Pharmacol.49：724-730；Brent等(1992)J.Toxicol.Clin.Toxicol.31：173-196；Rizzo等(1994)Zentralbl.Veterinarmed.41：81-90；Lecanu等(1998)Neuroreport 9：559-663。
本公开提供了用于治疗和/或缓解哺乳动物受试者局部缺血病症症状的方法，包括给受试者施用单独或与对局部缺血病症有作用的一种或多种药物组合的有效量的表儿茶素或表儿茶素衍生物。本公开还提供了用于治疗和/或缓解哺乳动物受试者局部缺血病症症状的方法，包括给受试者施用单独或与对局部缺血病症有作用的一种或多种药物组合的有效量的表儿茶素或表儿茶素衍生物，并通过所述施用来减少与所述局部缺血病症相关的组织损伤。在一些实施方案中，局部缺血病症选自由以下组成的组：大脑局部缺血；小肠局部缺血；脊索局部缺血；心血管局部缺血；与心肌梗死相关的心肌局部缺血；与CHF相关的心肌局部缺血、与年龄相关的黄斑变性(AME)相关的局部缺血；肝局部缺血；肾脏/肾局部缺血；真皮局部缺血；血管收缩诱导的组织局部缺血；阴茎异常勃起和勃起功能障碍引起的阴茎局部缺血；与血栓栓塞疾病相关的局部缺血；与微血管疾病相关的局部缺血；和与糖尿病性溃疡、坏疽性病症、创伤后综合征、心跳停止复苏、低温、外周神经损伤或神经病相关的局部缺血。在一些实施方案中，组织局部缺血病症是大脑局部缺血。在其他实施方案中，受试者以每kg所述哺乳动物受试者体重约1至约1000mg的范围递送表儿茶素或表儿茶素衍生物。在其他实施方案中，受试者以每kg所述哺乳动物受试者体重约1至约50mg的范围递送表儿茶素或表儿茶素衍生物。
″局部缺血″或″局部缺血的″或″局部缺血病症″指作为病理起源的医疗事件，或者强加于受试者的手术介入，其中至组织区域的循环被阻碍或阻断，这是暂时的(如在大脑局部缺血中血管痉挛或短暂局部缺血发作(TIA))或永久的(如在大脑局部缺血中的血栓阻塞)。受影响的区域由于局部缺血事件而缺少氧和营养素。这种缺少导致梗死损伤或受影响区域的损伤。本公开涵盖大脑局部缺血；小肠局部缺血；脊索局部缺血；心血管局部缺血；与CHF相关的局部缺血、肝局部缺血；肾脏局部缺血；真皮局部缺血；血管收缩诱导的组织局部缺血，例如由于Raynaud疾患；阴茎异常勃起引起的阴茎局部缺血；和与以下相关的局部缺血：血栓栓塞疾病；微血管疾病；例如糖尿病和血管炎；糖尿病性溃疡；坏疽性病症；创伤后综合征；心跳停止复苏；和外周神经损伤和神经病；以及其他局部缺血，包括与眼健康关注例如年龄相关的黄斑变性(AMD)相关的局部缺血。局部缺血在例如中风、心跳停止、损伤或内出血引起的严重失血和破坏正常血流的其他类似病症期间发生在脑中。局部缺血由于例如粥样硬化和CHF发生在心肌组织。它也可以在组织创伤后发生，因为水肿引起的压力压迫并弄平组织内的动脉和静脉，从而降低它们经组织运输血液的能力。大脑局部缺血也可以由于大或小栓子而发生，例如可以在心肺旁路手术之后发生。年龄相关的黄斑变性可以与局部缺血病症导致的视网膜氧化损伤相关。如本文使用的，″非心血管″局部缺血病症特别排除心肺系统或循环系统的局部缺血病症。如本文使用的，″非大脑″局部缺血病症特别排除脑的局部缺血病症。
″大脑局部缺血″或″大脑局部缺血的″或″大脑局部缺血病症″指作为病理起源的医疗事件，或者强加于受试者的手术介入，其中至组织区域的循环被阻碍或阻断，这是暂时的(如血管痉挛或短暂局部缺血发作(TIA))或永久的(如血栓阻塞)。受影响的区域由于局部缺血事件而缺少氧和营养素。这种缺少导致梗死损伤或受影响区域的损伤。局部缺血在例如血栓栓塞性中风、出血性中风、大脑血管痉挛、头创伤、心跳停止、损伤或内出血引起的严重失血和破坏正常血流的其他类似病症期间发生在脑中。它也可以在头创伤后发生，因为水肿引起的压力压迫并弄平脑内的动脉和静脉，从而降低它们经脑运输血液的能力。大脑局部缺血也可以由于大或小栓子而发生，例如可以在心肺旁路手术之后发生。
“急性局部缺血”或“急性局部缺血事件”指与进行中的慢性事件相比突然发作的事件。
一方面，本公开方法涉及预防有风险发展归因于大脑局部缺血病症例如通过脑梗死的损伤的哺乳动物受试者的神经元损伤。减少神经元损伤的方法涉及通过缓解或减少否则将发生的损伤而使与大脑局部缺血病症相关或归因于大脑局部缺血病症的损伤程度和/或严重度最小化。本公开提供了预防性治疗神经元损伤，包括细胞死亡和/或组织水肿的存在和/或认知功能障碍和/或大脑梗死，其可能归因于局部缺血、低氧/缺氧或出血事件。该方法预期用于处于神经元损伤风险的受试者，所述神经元损伤与急性或慢性医学病症相关或源自急性或慢性医学病症。此类病症可以源于计划用于受试者的药物治疗或手术治疗(例如，血管成形术)，或者源于紧急医学病症例如中风或严重失血。使受试者处于与大脑局部缺血病症相关的神经元损伤风险的其他病症包括中风或被理解增加招致大脑梗死的概率的病症，例如粥样硬化、之前中风或暂时局部缺血性发作、糖尿病、高血压、高胆固醇血症、吸烟史，并且还可以包括精神分裂症、癫痫、神经变性疾患、阿尔茨海默病和亨廷顿病。中风受害者的诊断和/或病理表征已经鉴定了产生中风的许多其他医学病症，这是内科和神经病科从业人员普遍已知的。
另一方面，本公开方法涉及预防有风险发展归因于心血管局部缺血病症例如通过脑梗死或CHF的损伤的哺乳动物受试者的心肌损伤。减少心肌损伤的方法涉及通过缓解或减少否则将发生的损伤而使与心肌局部缺血病症相关或归因于心肌局部缺血病症的损伤程度和/或严重度最小化。本公开提供了预防性治疗心肌损伤，包括细胞死亡和/或心肌水肿的存在和/或心肌梗死，其可能归因于局部缺血、低氧/缺氧或出血事件。该方法预期用于处于心肌损伤风险的受试者，所述心肌损伤与急性或慢性医学病症相关或源自急性或慢性医学病症。此类病症可以源于计划用于受试者的药物治疗或手术治疗(例如，血管成形术)，或者源于紧急医学病症例如心肌梗死或严重失血。使受试者处于与心肌局部缺血病症相关的心肌损伤风险的其他病症包括心肌梗死遗传倾向或被理解增加招致心肌梗死的概率的病症，例如粥样硬化、CHR、之前心肌梗死或暂时局部缺血性发作、糖尿病、高血压、高胆固醇血症和吸烟史。
本文使用的术语“不利的心脏重塑”指在左和右心室和/或右和左心房损伤后心脏尺寸、形状和相关功能的变化。损伤通常是由于急性心肌梗死(例如，透壁或ST区段提升梗死)或诱导的损伤(例如心脏手术)，但是可以是由于导致心脏增加的压力或容量过度负荷(牵张形式)的许多原因。心脏重塑包括心肌肥大变薄、心肌瘢痕形成、心肌萎缩、心力衰竭进行及其组合。慢性高血压、Kawasaki病、心内分流的先天性心脏病和膜瓣性心脏病可以导致重塑。此外，重塑可以源自冠状动脉旁路手术、心脏移植和机械支撑装置例如左心室辅助装置(LVAD)的应用。
本文使用的“减少的心肌梗死面积”指用本发明组合物处理的受试者中心肌梗死面积与未接受处理的对照受试者的心肌梗死面积相比降低。在所公开的方法中，″减少″可以指心肌梗死面积5％、10％、20％、30％、40％或甚至50％降低的任何一种。可选地，″减少″可以指心肌梗死面积60％、70％或80％降低的任何一种。
如本领域技术人员已知的，对心肌的改变，特别是心肌梗死面积的测定，可以使用成像技术例如超声心电图、心脏MRI、心脏CT和心脏核扫描来进行。此外，一种或多种生物标记包括肌钙蛋白、CK-MB(肌酸激酶mb)和CPK(肌酸磷酸激酶)的提高已知指示死亡或正在死亡的心肌。还有证据表明，生物标记BNP(B型利钠肽)可以用作心脏重塑的标记。
本文使用的“有利的心脏重塑”指维持腔尺寸、形状、功能并预防心脏损伤后发生的心室壁薄化和瘢痕形成。
本文使用的“心房颤动”和“心房扑动”各自指其中心房不与心室有效配合搏动的心律不齐，通常伴随心输出量的降低。
本文提及心脏组织时使用的“诱导的损伤”指受损心肌，例如源自心脏手术的损伤，所述心脏手术包括但不限于冠状动脉旁路手术、心脏移植和机械支撑装置例如左心室辅助装置(LVAD)的应用。
本文使用的“局部缺血/再灌注事件”包括但不限于心肌局部缺血、心肌再灌注、蛛网膜下出血、缺血性中风(包括源自脑血栓形成、脑栓塞和心房颤动的中风)、出血性中风(包括源自动脉瘤和动静脉畸形的中风)和暂时缺血性发作、其中使用心肺机器的心脏手术例如冠状动脉分流术、和维持移植器官。
本文使用的“局部缺血/再灌注损伤”指当血液供应在一段局部缺血期之后返回至组织时引起的组织损伤。来自血液的氧和营养素的缺乏产生其中循环恢复通过诱导氧化应激而非正常功能恢复导致炎症和氧化损伤的病症。
儿茶素是植物中存在的多酚抗氧化剂。儿茶素是黄酮类并且更具体是黄烷-3-醇。儿茶素和表儿茶素是差向异构体，(-)-表儿茶素和(+)-儿茶素是天然存在的最常见的旋光异构体。
儿茶素构成新茶叶干重的约25％，尽管总含量根据茶叶品种和生长条件而有很大变化。
儿茶素或黄烷醇存在于茶叶和葡萄中，并且包括例如单体黄烷-3-醇儿茶素、表儿茶素、棓儿茶酸、表焙儿茶素和表儿茶素3-O-棓酸酯。处于局部缺血/再灌注事件风险的个体可以通过预防性地获取表儿茶素、其药学可接受的盐或其衍生物至不确定的时段而降低未来事件中坏死的风险。还要理解，许多局部缺血/再灌注事件在实际事件之前具有早期警告症状，这可以允许受试者寻求即刻治疗。
即使存在由未来局部缺血/再灌注事件引起的损伤，要理解，本发明组合物的预防性施用将减少梗死面积和不利的重塑。例如，本文公开了减少有相应需要的受试者中潜在梗死面积和不利的重塑的方法，包括在局部缺血/再灌注事件之前至少30分钟给受试者施用本发明组合物。本文公开了其中本发明组合物在局部缺血/再灌注事件之前15、30分钟、1、2、6、12、24小时、2、3天、1或2周或任何时间点施用的方法。
局部缺血/再灌注事件可以发生在未意识到即将发生的梗死或局部缺血事件的受试者中。在这类个体中，需要减少潜在的梗死面积和不利的重塑。因此，本文公开的方法可用于在局部缺血/再灌注事件之后减少潜在的梗死面积和不利的重塑。
在另一实施方案中，本发明组合物在施用四环素或其衍生物之前、之后或同时施用。示例性四环素衍生物包括但不限于氯四环素、金霉素、土霉素、地美环素、强力霉素、赖氨甲四环素、甲氯环素、甲烯土霉素、二甲胺四环素、金霉素、去甲去氧四环素、配位诺卡菌素、羟哌羧四环素；羟甲金霉素、胍甲四环素、甲葡四环素、mepylcycline、青四环素、羟哌四环素、乙胺双四环素、苄青四环素和吡咯烷甲基四环素。此外，化学修饰的四环素可用于本公开的方法和组合物中。化学修饰的四环素(CMT)的实例包括：
Figure BDA0000104357160000231
如本文所描述，本发明组合物可以包括再灌注/血栓溶解剂(例如，tPA或其他再灌注剂)。示例性的血栓溶解剂包括阿替普酶、替奈普酶、瑞替普酶、链激酶、尿激酶、帕米普酶、那替普酶、去氨普酶、度替普酶、孟替普酶、瑞替普酶、拉诺替普酶、微血纤蛋白溶酶、Bat-tPA、BB-10153及其任何组合。示例性NMDA受体拮抗剂包括3-α-醇-5-β-孕烷-20-酮半琥珠酸酯(ABHS)、氯胺酮、美金刚、右美沙芬、右啡烷和右美沙芬氢溴化物。
表儿茶素或其衍生物或盐可以如本文公开的配制，或者其存在可以与心脏患者中常用的其他剂组合产生或增加，所述其他剂包括但不限于ACE抑制剂、β阻断剂、利尿剂、血栓溶解剂、NMDA受体拮抗剂、旋转-捕获剂和阿司匹林。此外，表儿茶素可以与其他天然存在的剂配制，所述其他天然存在的剂包括但不限于白藜芦醇和维生素E。表儿茶素还可以与施用给健康个体的其他物质配制，所述其他物质包括但不限于蛋白、维生素、矿物质、抗氧化剂等。
本公开还提供了用于预防和/或治疗和/或缓解与哺乳动物受试者中线粒体功能相关的病症的症状的方法，包括给受试者施用有效量的选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。
处于与线粒体功能相关病症风险的个体可以通过预防性地获取表儿茶素、儿茶素、尼可地尔或其药学可接受的盐或衍生物至不确定的时段而降低未来事件中坏死的风险。在存在于线粒体功能相关病症的事件中，预期本发明组合物的预防性施用会减少此类病症的症状。
表儿茶素、儿茶素、尼可地尔或其衍生物或盐可以如本文公开配制，或者其存在可以与心脏患者中常用的其他剂组合产生或增加，所述其他剂包括但不限于ACE抑制剂、β阻断剂、利尿剂、血栓溶解剂、NMDA受体拮抗剂、旋转-捕获剂和阿司匹林。此外，表儿茶素可以与其他天然存在的剂配制，所述其他天然存在的剂包括但不限于白藜芦醇和维生素E。表儿茶素还可以与施用给健康个体的其他物质配制，所述其他物质包括但不限于蛋白、维生素、矿物质、抗氧化剂等。
在本文公开的实施方案或方面的任何一个的变化形式中，选自由表儿茶素、其衍生物及其药学可接受盐的药物被施用。在本文公开的实施方案或方面的任何一个的另一个变化形式中，表儿茶素或其药学可接受的盐被施用。经本文公开方式施用的表儿茶素、其衍生物或其盐可以是任何多种浓度，与其他成分或物质组合，最适合目标应用的温度或其他状态。
本公开化合物以约0.1mg/kg/剂至约100mg/kg/剂、可选地约0.3mg/kg/剂至约30mg/kg/剂的总日剂量口服施用。在另一实施方案中，剂量范围是约0.5至约10mg/kg/天。可选地，约0.5至约1mg/kg/天被施用。一般，可以施用每天约25mg至约1克；可选地，可以施用每天约25mg至约200mg。使用时间释放制剂控制活性成分的释放速率可能是优选的。剂量可以方便地以多个分开剂施用。当这些化合物如下讨论静脉内施用时容易维持这种速率。
为本公开目的，化合物可以含有药学可接受载体、佐剂和媒介物的制剂通过多种方式施用，包括但不限于口服、胃肠外、吸入喷雾、局部或直肠。本文使用的术语胃肠外包括但不限于使用多种输注技术皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、皮内、鞘内和硬膜外注射。本文使用的动脉内和静脉内注射包括通过套管施用。还考虑经冠状动脉内支架和冠状动脉内储器的施用。本文使用的术语口服包括但不限于舍下和口腔。口服施用包括流体饮料、能量棒和丸制剂。
含有活性成分的药物组合物可以是适合预期施用方法的任何形式。当用于口服使用时，可以制备例如片剂、锭剂、软锭、水性悬液或油性悬液、可分散粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、糖浆或酏剂。用于口服使用的组合物可以根据本领域已知用于生产药物组合物的任何方法制备，并且此类组合物可以含有包括以下的一种或多种物质以提供适口的制剂：甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。含有与适合生产片剂的无毒药学可接受赋形剂混合的活性成分的片剂是可接受的。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂例如碳酸钙或钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以未包衣，或者可以通过已知技术包衣，包括微囊包封以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供经更长时段的持续作用。例如，可以使用时间延迟材料，例如单独或与蜡混合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于口服使用的制剂可以被制备为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如磷酸钙或高岭土混合，或者被制备为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
所公开的水悬液含有与适合生产水悬液的赋形剂混合。此类赋形剂包括悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶、和分散剂或润湿剂例如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)、氧化烯与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七烯氧基鲸蜡醇)、氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)。水悬液可以含有一种或多种防腐剂，例如乙基或正丙基对羟基苯甲酸酯、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂例如蔗糖和糖精。
油悬液可以通过使活性成分悬浮于植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、或者矿物油例如液体石蜡中来配制。口服悬液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。甜味剂例如上述那些和调味剂可以被添加以提供适口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸来防腐。
适合通过添加水来制备水悬液的本公开的期望粉末和颗粒提供了与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。适合的分散剂和润湿剂和悬浮剂通过上文公开的那些来示例。还可以存在其他赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本公开的药物组合物还可以是水包油乳液形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油、矿物油例如液体石蜡或这些的混合物。适合的乳化剂包括天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶和黄蓍树胶、天然存在的磷脂例如大豆卵磷脂、衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯例如失水山梨糖醇单油酸酯、以及这些偏酯与氧化乙烯的缩合产物例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。乳液还可以含有甜味剂和调味剂。
糖浆和酏剂可以用甜味剂例如甘油、山梨糖醇或蔗糖来配制。此类制剂还可以含有缓和剂、防腐剂、调味剂或着色剂。
本公开的药物组合物可以是无菌注射制剂的形式，例如无菌注射水悬液或油悬液。该悬液可以使用上文提到的那些适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂根据已知技术来配制。无菌注射制剂还可以是无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬液，例如1，3-丁烷-二醇中的溶液，或者制备为冻干粉末。可以采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格式溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油可以常规配制为溶剂或悬浮介质。为此目的，任何固定油可以被配制包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸例如油酸可以类似地用于制备注射剂。
可以与载体材料组合以产生单剂型的活性成分的量将根据治疗的宿主和特定的施用模式而改变。例如，用于口服施用给人的时间释放制剂可以含有与适宜量的载体材料混合的0.07至1.7mmol(大约20至500mg)活性材料-其可以是总组合物的约5至约95％。优选地，药物组合物可以被制备为提供容易测量的量以施用。
如上所述，适合口服施用的本公开制剂可以提供为离散单位，例如胶囊、包衣片或片剂，每个含有预定量活性成分，作为粉末或颗粒；作为水或非水液体中的溶液或悬液，或作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分还可以作为大丸、药糖或糊剂施用。
片剂可以通过压制或模制制备，任选地使用一种或多种辅助成分。压制片剂可以通过在适合机器中压制任选地与粘合剂(例如，聚维酮、明胶、羟丙基乙基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉乙醇酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合的自由流动形式例如粉末或颗粒的活性成分来制备。模制片剂可以通过在适合机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物来制成。片剂可以任选地包衣或刻痕，并且可以被配制以提供其中活性成分的缓慢或控制释放，使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供预期的释放曲线。片剂可以任选地被提供肠溶衣，以提供肠而非胃的部分的释放。这对于式1化合物来说是特别有利的，此时这种化合物易受酸水解。
适合在口腔局部施用的制剂包括：软锭剂(lozenges)，包含在通常是蔗糖和阿拉伯树胶和黄蓍胶的调味基质中的活性成分；香锭剂(pastilles)，包含在惰性基质例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶中的活性成分；和漱口剂，包含在适合液体载体中的活性成分。
用于直肠施用的制剂可以提供为具有包含例如可可脂或水杨酸酯的适合基质的栓剂。
适合阴道施用的制剂可以提供为阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂，除了活性成分外还含有本领域已知适合的载体。
适合胃肠外施用的制剂包括可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质的水和非水等渗无菌注射溶液；和可以包括悬浮剂和增稠剂的水和非水无菌悬液。制剂可以提供于单剂或多剂密封容器例如安瓿和管形瓶中，并且可以贮存于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在即将使用之前添加无菌液体载体例如注射水。注射溶液和悬液可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
如上所述，药学可接受的盐包括但不限于乙酸盐、吡啶、铵、哌嗪、二乙胺、烟酰胺、甲酸、尿素、钠、钾、钙、镁、锌、锂、肉桂酸、甲氨基、甲磺酸、苦味酸、酒石酸、三乙基氨基、二甲基氨基和三(羟基甲基)氨基甲烷。其他药学可接受的盐是本领域技术人员已知的。
类似地，表儿茶素衍生物是化学领域技术人员已知的。此类衍生物包括但不限于表焙儿茶素、表儿茶素-3-棓酸酯和表焙儿茶素-3-棓酸酯。
本文使用的术语″局部缺血损伤减轻量″或″有效量″表示用于导致由局部缺血引起的组织损伤减轻的包含表儿茶素或其衍生物或盐的组合物的量。待施用的有效量取决于受试者体重。通常，待施用的有效量是约0.1mg/kg至约100mg/kg，并且取决于多种因素，包括例如受试者(例如，哺乳动物例如人)年龄和体重、需要治疗的确切病症及其严重度、施用途径，并且最终由主治医师或兽医确定。
本发明组合物还可以配制为营养药物组合物。本文使用的术语“营养药物组合物”指包含外源添加的儿茶素和/或表儿茶素的食物产品、食材、饮食补充剂、营养补充剂或用于食物产品或食材的补充剂组合物。配制和施用这种组合物的技术的细节可以参见Remington，The Science and Practiceof Pharmacy第21版(Mack Publishing Co.，Easton，PA)和Nielloud和Marti-Mestres，Pharmaceutical Emulsions and Suspensions：第2版(MarcelDekker，Inc，New York)。
本文使用的术语食物产品指适合人或动物消耗的任何食物或饲料。食物产品可以被良好制备和包装(例如，蛋黄酱、色拉酱、面包、谷物棒、饮料等)或动物饲料(例如，挤压和团粒化的动物饲料、粗混饲料或宠物食品)。如本文使用的术语食材指适合人或动物消耗的任何物质。
食品或食材是例如饮料，例如无酒精饮料和酒精饮料，添加至饮用水和液体食物、非酒精饮料的液体制品是例如软饮料、运动饮料、果汁，例如橙汁、苹果汁和葡萄汁；柠檬水、茶、纯水饮料和乳和其他乳饮料，例如酸乳饮料和饮食饮料。在另一实施方案中，食物产品或食材指包含根据本发明的组合物的固体或半固体食物。这些形式可以包括但不限于烘焙食物，例如蛋糕和饼干、布丁、乳制品、甜点、点心或冷冻甜点或小食品(例如，冰淇淋、奶昔)、制备的冷冻肉、冰糖、小吃产品(例如，炸土豆片)、液体食物例如汤、糊、汁、沙拉酱、制备的肉品、奶酪、酸乳和任何其他含脂肪或油的食物、以及食物成分(例如，小麦粉)。
包括宠物食品的动物饲料有利地包括预期提供必要的饮食需求的食物以及零食(例如，狗饼干)或其他食物补充剂。包含根据本发明的组合物的动物饲料可以是干组合物形式(例如，粗磨食物)、半湿组合物、湿组合物或其任何混合物。可选地或附加地，动物饲料是补充剂，例如肉汁、饮水、酸乳、粉末、悬液、口香糖、零食(例如，饼干)或任何其他递送形式。
术语饮食补充剂指以单剂量单位或多剂量单位包装的用于补充人或动物饮食的小量化合物。饮食补充剂一般不提供显著量的能量，但是可以含有其他微量营养素(例如，维生素或矿物质)。术语食物产品或食材还包括预包装用于人食用的功能食物和制备的食物产品。
术语营养补充剂指包含与能量源组合的饮食补充剂的组合物。在一些实施方案中，营养补充剂是肉替代物或补充物(例如，营养素或能量棒或营养饮料或浓缩物)。
本发明的饮食补充剂可以任何适合的形式递送。在优选实施方案中，饮食补充剂被配制用于口服递送。本发明饮食补充剂的成分包含于用于口服食用的可接受的赋形剂和/或载体。载体的实际形式和由此饮食补充剂本身不是关键的。载体可以是液体、凝胶、凝胶胶囊、胶囊、粉末、固体片(包衣或非包衣的、茶等。饮食补充剂优选为片或胶囊的形式，并且最优选为硬(外壳)胶囊形式。适合的赋形剂和/或载体包括麦芽糖糊精、碳酸钙、磷酸二钙、磷酸三钙、微晶纤维素、右旋糖、米粉、硬脂酸镁、硬脂酸、交联羧甲基纤维素纳、淀粉乙醇酸钠、交聚维酮、蔗糖、植物胶、乳糖、甲基纤维素、聚维酮、羧甲基纤维素、玉米淀粉等(包括其混合物)。优选的载体包括碳酸钙、硬脂酸镁、麦芽糖糊精及其混合物。各种成分和赋形剂和/或载体被混合并使用常规技术成型为预期形式。本发明片剂或胶囊可以用肠溶衣包衣，其在约6.0至7.0的pH下溶解。在小肠中溶解但在胃中不溶解的适合的肠溶衣是醋酞纤维素。
在其他实施方案中，饮食补充剂作为适合由消费者加入食物或饮料中的粉末或液体来提供。例如，在一些实施方案中，饮食补充剂可以粉末形式施用给个体，例如通过混合入饮料或通过搅拌入半固体食物例如布丁、顶端配料、汁、菜泥、煮熟的谷物或沙拉酱，或者通过其他方式加入食物或饮食补充剂，例如包封于食物或饮料容器的盖子中以在食用之前即刻释放。饮食补充剂可以包含一种或多种惰性成分，特别是当期望限制由饮食补充剂给饮食增加的能量时。例如，本发明的饮食补充剂还可以含有任选的成分，包括例如药草、维生素、矿物质、增强剂、着色剂、甜味剂、香料、惰性成分等。
在一些实施方案中，饮食补充剂还包括维生素和矿物质，包括但不限于三碱式的磷酸钙或乙酸钙；二碱式的磷酸钾；硫酸镁或氧化镁；盐(氯化钠)；氯化钾或乙酸钾；抗坏血酸；正磷酸铁；烟酰胺；硫酸锌或氧化锌；泛酸钙；葡萄酸铜；核黄素；β-胡萝卜素；盐酸吡哆醇；硝酸硫胺；叶酸；生物素；氯化铬或盐酸铬；碘化钾；硒酸钠；钼酸钠；叶绿醌；维生素D3；氰钴胺素；亚硒酸钠；硫酸铜；维生素A；维生素C；肌醇；碘化钾。例如通过参考美国RDA指南可以获得维生素和矿物质的适合剂量。
在其他实施方案中，本发明提供了包含根据本发明的组合物的营养补充剂(例如，能量棒或肉替代棒或饮料)。营养补充剂可以用作肉或小吃替代物，并且一般提供营养能量。优选地，营养补充剂提供平衡量的糖类、蛋白和脂肪。营养补充剂还可以包括简单的糖类、中链长度的糖类或多糖或其组合。单糖可以根据预期的器官感觉性质来选择。未煮熟的玉米淀粉是复杂糖类的一个实例。如果预期应该维持其高分子量结构，则应该仅在未煮熟或热加工的食物制剂或其部分中含有，因为热会分解复杂糖类成为简单的糖类，其中简单的糖类是单糖或二糖。在一个实施方案中，营养补充剂含有三个链长水平的糖类来源的组合(简单的，中等的和复杂的；例如，蔗糖、麦芽糖糊精和未煮熟的玉米淀粉)。
加入本发明营养补充剂的蛋白来源可以是营养制剂中使用的任何适合的蛋白，并且可以包括乳清蛋白、乳清蛋白浓缩物、乳清粉、卵、大豆粉、豆乳、豆蛋白、豆蛋白分离物、酪朊酸盐(例如，酪朊酸钠、酪朊酸钠钙、酪朊酸钙、酪朊酸钾)、动物和植物蛋白及其水解物或混合物。当选择蛋白源时，蛋白的生物值应该首先考虑酪朊酸盐、乳清、乳清蛋白、卵白蛋白和全卵蛋白中发现的最高生物值。在优选实施方案中，蛋白是乳清蛋白浓缩物和酪朊酸钙的组合。这些蛋白具有高生物值；即，它们具有高比例的必需氨基酸。参见Modern Nutrition in Health and Disease，第8版，Lea& Febiger，1986，特别是第1卷，第30-32页。营养补充剂还可以含有其他成分，例如其他维生素、矿物质、抗氧化剂、纤维和其他饮食补充剂(例如，蛋白、氨基酸、胆碱、卵磷脂)之一或组合。这些成分的一种或多种的组合是配制、设计、消费者偏好和终端用户的问题。添加到本发明饮食补充剂的这些成分的量是技术人员容易知道的。此类量的指南可以由针对儿童和成人的美国RDA剂量提供。可以添加的其他维生素和矿物质包括但不限于三碱式的磷酸钙或乙酸钙；二碱式的磷酸钾；硫酸镁或氧化镁；盐(氯化钠)；氯化钾或乙酸钾；抗坏血酸；正磷酸铁；烟酰胺；硫酸锌或氧化锌；泛酸钙；葡萄酸铜；核黄素；β-胡萝卜素；盐酸吡哆醇；硝酸硫胺；叶酸；生物素；氯化铬或盐酸铬；碘化钾；硒酸钠；钼酸钠；叶绿醌；维生素D3；氰钴胺素；亚硒酸钠；硫酸铜；维生素A；维生素C；肌醇；碘化钾。
营养补充剂可以多种形式和多种生产方法提供。在优选实施方案中，为了生产食物棒，液体成分被煮熟；干成分与液体成分一起添加至混合物并混合直至达到生面团相；生面团被放入挤出机并挤出；被挤出的生面团被切成适合的长度；产品被冷却。除了本文特别列出的成分外，棒可以含有其他营养素和填充剂以增强味道。
本领域技术人员理解，可以向本文描述的那些添加其他成分，例如填充剂、乳化剂、防腐剂等，以加工或生产营养补充剂。
此外，调味剂、着色剂、香料、坚果等可以加入营养药物组合物。调味剂可以是如下形式：调味提取物、挥发油、巧克力调味剂、花生酱调味剂、饼干屑、大米花、香草或任何商业途径可获得的调味剂。有用的调味剂的实例包括但不限于纯的茴香提取剂、模仿橡胶提取物、模仿樱桃提取物、巧克力提取物、纯柠檬提取物、纯橙提取物、纯薄荷提取物、模仿剥落提取物、模仿甜酒提取物、模仿草莓提取物或纯香草提取物；或挥发性油，例如滇荆芥油、月桂油、香柠檬油、雪松木油、核桃油、樱桃油、肉桂油、丁香油或薄荷油；花生酱、巧克力调味剂、香草饼干屑、奶油糖果或乳脂糖。在一个实施方案中，饮食补充剂含有可可或巧克力。
乳化剂可以为营养药物组合物稳定性而添加。适合的乳化剂的实例包括但不限于卵磷脂(例如，来自卵或大豆)和/或单甘油酯和二甘油酯。其他乳化剂对于技术人员来说是明显的，并且适合乳化剂的选择将部分取决于制剂和最终产品。防腐剂也可被添加至营养补充剂以延长产品自身寿命。优选地，使用诸如山梨酸钾、山梨酸钠、苯甲酸钾、苯甲酸钠或DETA钙二钠。
除了上述糖类，营养药物组合物可以含有天然或人工(优选低能量)甜味剂，例如糖、环己烷氨基磺酸盐、天冬酰胺、阿司帕坦、乙酰舒泛K和/或山梨糖醇。如果营养补充剂预期被超重或肥胖个体或容易高血糖的II型糖尿病个体食用，则此类人工甜味剂可以是需要的。
而且，多维生素和矿物质补充剂可以被添加至本发明营养药物组合物以获得足量的在一些饮食中缺乏的必要营养素。多维生素和矿物质补充剂还可用于疾病预防和防护归因于生命周期模式的营养损伤和缺陷。
经由功能食物施用的儿茶素和/或表儿茶素和其他组分的剂量和比例将根据已知因素而变化，所述因素例如特定组合物的生理特征及其施用方式和途径；接受者的年龄、健康和体重；症状的性质和程度；联合治疗的种类；治疗频率；和可以由本领域技术人员通过正常试验或关于营养药物组合物制剂的通常考虑而确定的预期效果。
然而，要理解，对于任何特定患者的具体剂量水平将取决于本领域技术人员公知的多种因素，包括采用的具体化合物的活性、被治疗个体的年龄、体重、健康状况、性别和饮食；施用时间和途径；排泄率；之前已经施用的其他药物；和经历治疗的特定疾病的严重度。
实施例
实施例1
表儿茶素的甲基化产生至少4种不同的产物，主要归因于其4个苯酚基团类似的反应性。
Figure BDA0000104357160000321
一般的甲基化反应参考Donovan，L.R.，等“Analysis of(+)catechin，(-)epicatechin and their 3′and 4′O-methylated analogs，A comparison ofsensitive methods”Journal of Chomatography B，726(1999)：277-283。无水K2CO3(0.7g)、(CH3)2SO4(0.44mL)和表儿茶素(1g)被搅拌入H2O(50mL)和丙酮(50mL)的混合物。反应在密封烧瓶中室温下进行3小时。减压下通过旋转蒸发除去丙酮。反应产物用乙酸乙酯萃取(50mL X 2)。该反应产物包括各自在R1、R2、R3和R4的-O-甲基化衍生物，通过制备型色谱分离并纯化。
实施例2
已知当线粒体暴露于钙超载时预防线粒体孔的开放与局部缺血损伤组织保护相关联。线粒体通透转换孔(MPTP)的小孔可以通过测量由钙添加引起的线粒体溶胀来评估。(Bernardi P，Krauskopf A.，Basso E.，等Themitochondrial permeability transition from in vitro artifact to disease target.FEBS Journal 273：2077-99，2006)。线粒体溶胀是水和电解质通过开放的钙诱导的MPTP内流入线粒体的结果。该现象诱导535-540nm处的光传输(浊度降低或535nm处吸光度降低)(Zoratti M和Szabo I.The mitochondrialpermeability transition.Biochemic and Biophysic acta 1241：139-176，1995)。
线粒体从雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g体重)的心脏制备，并测定其蛋白含量。线粒体悬浮于70mM-蔗糖/210mM-甘露糖醇/10mM-Tris/HCl，pH 7.2。孵育在25℃和1.0mg蛋白/ml介质进行，介质含有0mM琥珀酸盐(Na+)、1.0nmol/mg鱼藤酮蛋白、3mM Hepes(Na+)，pH7.4加甘露糖醇/蔗糖(3∶1摩尔比)，产生300mosm的总渗透强度。在裂隙梁模式下操作的分光光度计中在540nm处监测线粒体溶胀。溶胀记录为吸光度损失。记录的吸光度损失最大值被标准化为＝100％。
图1描述了各种甲基化表儿茶素衍生物对线粒体孔开放的作用。在1μM每种-O-甲基化衍生物(来自实施例1的各自在R1、R2、R3和R4)存在下获得的结果分别显示为实心三角形、空心三角形、空心方形和实心方形。为了对照比较，还使用了无化合物(实心圆形)和1μM未衍生表儿茶素(空心圆形)获得的结果。下表提供了这些实验的总结。
表1
Figure BDA0000104357160000331
Figure BDA0000104357160000341
从这些结果发现，该分析中在R1位置的衍生化提供了效价的最大增加，而在R4位置的衍生化减少了效价。然而，R4-O-CH3衍生物刺激培养物中人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)产生NO的能力被测定为比表儿茶素大～46％。
实施例3
内皮功能障碍已被提出作为促进局部缺血-再灌注(I/R)之后微血管损伤和再灌注不足的机制之一。L-精氨酸的利用率可以是通过一氧化氮合酶(NOS)的细胞一氧化氮(NO)生成的限速因素。精氨酸酶与NOS分享L-精氨酸作为底物，可能竞争优先的底物，从而调节血管内皮中NOS的活性。增加的精氨酸酶活性已经与低NO水平关联，并且已经报道精氨酸酶活性的抑制改善内皮依赖性血管舒张。我们已经证明，在大鼠中(-)-表儿茶素(EPI)可以降低局部缺血再灌注(I/R)心肌损伤，并且能够刺激培养物中人冠状动脉内皮细胞中NO的合成。
其他显示I/R通过增加精氨酸酶活性而抑制NO介导的冠状动脉扩张(1)。心脏组织中精氨酸酶活性水平升高与IR的临床发作相关(2-3)。我们假设IR诱导的精氨酸酶活性增加可以被表儿茶素预防。为了试验该假设，我们使用大鼠I/R损伤模型检查了EPI(1mg/Kg)预处理(10天)对心肌精氨酸酶的作用。
用于实现大鼠心肌I/R模型的一般方法在出版物中详述(4，5)。心肌局部缺血的总时间是45min。切离了来自以下的心脏：1)假的；2)假的+EPI(10天，1mg/Kg；管饲法)；3)I/R和4)I/R+EPI(10天，1mg/Kg；管饲法)。左心室组织(0.120g)用0.5ml 25mM Tris-HCl、0.1％Triton X-100、5mMPMSF裂解。裂解物在4℃离心(12000rpm)30min，并除去沉淀。25μL上清液被添加至25μL缓冲液(25mM Tris-HCl和5mM MnCl2(pH 7.4)。然后通过在56℃.加热细胞悬液10min来活化精氨酸酶。L-精氨酸水解通过在37℃孵育25μL活化的裂解物与25μL 0.5M L-精氨酸(pH 9.7)来进行。反应用400μL酸性混合物(H2SO4、H3PO4和H2O；1∶3∶7v/v)停止。在添加25μL 9％α-苯基甲酮(溶解于100％乙醇)并在100℃加热45min后在545nm测量尿素，以定量精氨酸酶活性。结果表明，I/R诱导的心肌损伤导致精氨酸酶活性～5倍增加(图2)。用(-)-表儿茶素(1mg/Kg)预处理(10天)诱导了精氨酸酶活性的显著降低(图2)。I/R增加左心室心肌精氨酸酶活性。用EPI处理抑制这种增加在IR之后48h。EPI诱导的心脏保护可能与经由精氨酸酶抑制的L-精氨酸对NOS利用率增加有关。
参考文献.
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实施例4
由eNOS生成NO已经被广泛研究，并且普遍接受eNOS活化可以既是Ca2+依赖性也是Ca2+非依赖性的。大部分体液配体包括BK和乙酰胆碱通过升高形成Ca2+/钙调蛋白(Ca2+-CaM)络合物的细胞内([Ca2+]i)的水平而刺激eNOS活性(Yong Boo)。另一方面，机械力例如液体剪切应力和伸展刺激Ca2+非依赖性机制的NO生成(Yong Boo)。而且，已经显示eNOS通过与其他正性和负性蛋白调节剂例如窖蛋白-1(Cav-1)和热激蛋白90(HSP90)的相互作用而被调节(20，41)。在基础状态下，大部分eNOS似乎与Cav-1结合，其酶活性在胞膜窖中受到抑制(27，33)。eNOS的这种紧张性抑制可以响应于Ca2+-动员激动剂通过用Ca2+/CaM结合替代来自eNOS的Cav-1而被释放(27)。
除了那些调节剂，在关键调节部位处eNOS的磷酸化在响应于几种生理刺激的酶活性调节中起重要作用(3，13，17，23，35)。已经显示，eNOS-Ser1177、Ser633和Ser615(人序列)的磷酸化与酶活性增加有关(19，32)，而eNOS在Thr495处的磷酸化在降低酶活性中起重要作用(8，23，35，36)。
有趣的是，在我们之前分析EPI诱导的对人内皮细胞的作用的工作中，我们显示在完全阻断缓激肽诱导的对eNOS活性的作用的细胞内途径的药理抑制(即PLC抑制)下，EPI依然能够至少部分地(～30％)诱导NO生成。这些结果表明，EPI可能以Ca2+非依赖性方式增加eNOS活性。我们假设，类黄酮EPI不依赖细胞内钙浓度的增加且不依赖其胞膜窖解离而活化eNOS。
HCAEC和HCAEC生长培养基购自Cell Applications，Inc.EPI，蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物、咖啡因、EGTA和霍乱毒素亚基B(CTB)过氧化物酶轭合物获自Sigma Chemicals。磷酸基-eNOS Ser-1177、磷酸基-eNOSSer-633、eNOS、Cav-1一级抗体、正常兔IgG对照和HRP-轭合的二级抗体来自Cell Signaling Technology。磷酸基-eNOS Thr-495、CaMI、磷酸基-CaMI、运铁蛋白受体一级抗体获自Santa Cruz Biotechnologies，磷酸基-eNOS Ser-615抗体来自Millipore，钙绿TM2来自Invitrogen。BK来自EMDBiosciences。亚硝酸盐/硝酸盐荧光测定试剂盒来自Cayman Chemical。
细胞培养
来自14、40和60岁健康雄性的HCAEC保持在37℃、5％CO2和95％O2湿润气氛中HCAEC-生长培养基中。处理通常应用于汇合的细胞培养物。
[Ca2+]i测量.
HCAEC培养物受胰蛋白酶作用并重悬于HCAEC生长培养基。1ml细胞悬液(3X105细胞/ml)放入24孔平板的每个孔并允许细胞附着并固定24小时。为了维持细胞处于稳定的活性状态，实验前24h使它们与DMEM加0.5％FBS孵育。细胞在实验前与无酚红或FBS并补充了200mM谷氨酰胺的M-199孵育。产生HCAEC的两个实验组：1)规律的钙和2)缺少钙。每个组根据随后的EPI或BK处理而被细分。HCAEC通过用无Ca2+或酚红并补充了1mM EGTA和1mM咖啡因的Epilife培养基洗涤而除去钙。细胞用由(以mM)137NaCl、6KCl、1.8CaCl2、1.2NaH2PO4、1.2MgSO47H2O、5右旋糖、2丙酮酸钠和10MOPS或构成的规律MOPS-Krebs-Henseleit溶液(Krebs 1)或用无Ca2+Krebs(Krebs 2)洗涤。细胞与500μl的稀释于其各自Krebs的3M钙绿TM2在37℃孵育2h。细胞用500μl的Krebs1或Krebs 2(无论哪个适用)被洗涤并加载，3X1min。允许细胞固定1h，然后将板插入Synergy HT荧光计(BioTek)。EPI或BK[0.1nM-1μM]被自动应用至细胞板以分别在503nm、536nm的激发和发射波长处测量细胞内钙浓度[Ca2+]i的剂量响应增加。
NO测量
使用商业试剂盒和荧光计(FLx800 Bio-Tek Instruments INC)在分别为360nm和430nm的激发和发射波长处测量NO水平。EPI稀释于水中，并且BK稀释于DMSO(使用水或DMSO作为对照细胞的媒介物)。产生EPI和BK诱导的NO剂量响应曲线。对于该实验，细胞用[0.1nmol/L-1μmol/L]EPI处理，培养基样品在10min(NO响应的峰时间)收集。
免疫印迹
生长在10cm培养皿的细胞在补充了1mmol/L PMSF、2mmol/LNa3VO4和1mmol/L NaF的含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的50μl裂解缓冲液(1％triton X-100、20mmol/L Tris、NaCl 140mmol/L、mmol/L EDTA2、0.1％SDS)中匀浆。匀浆液穿过胰岛素注射器5X，4℃声处理30min并离心(12,000X g)10min。测量上清液中的总蛋白含量。总共40μg蛋白加载在5或10％SDS-PAGE，电转移，在封闭液(5％干燥脱脂乳的TBS溶液加0.1％Tween 20[TBS-T])孵育1h，随后与一级抗体在室温孵育3h或在4℃孵育过夜。一级抗体通常在TBS-T加5％牛血清白蛋白中稀释1∶1000或1∶2000。膜在TBS-T中洗涤(3X持续5min)，并在封闭液中稀释1∶10,000的HRP轭合的二级抗体存在下室温孵育1h。膜再次在TBS-T中洗涤3X，使用ECL加检测试剂盒(Amersham-GE)显示免疫印迹。条带强度被数字定量。
免疫沉淀
细胞用补充了蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物加1mmol/L PMSF、2mmol/L Na3VO4和1mmol/L NaF的50μl非变性的提取缓冲液(0.5％，Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl ph 7.4；0.15mol/L NaCl；0.5mmol/LEDTA)裂解。匀浆液在冰上孵育10min并穿过胰岛素注射器5X。匀浆液在搅拌下冰上孵育10min并在4℃以12,000x g离心。通过添加1μg正常兔IgG对照和20μl prot-G-琼脂糖伴随搅拌30min(4℃)并随后在4℃以12,000x g离心10min，预先清除总共0.5mg蛋白。回收上清液并在温和搅拌下与3μg免疫沉淀抗体(抗Cav-1或抗CaMI持续3h)在4℃孵育。添加20μl蛋白G-琼脂糖，混合物在摇动下在4℃孵育3h。免疫沉淀混合物在4℃以12,000x g离心15min，并回收上清液并在4℃贮存。沉淀用提取缓冲液洗涤3X，在4℃以12,000x g 15分钟。沉淀中的免疫沉淀的蛋白以及保留在上清液中的那些被应用至5或10％SDS-PAGE以免疫印迹。共免疫沉淀用每种免疫沉淀抗体进行至少3X。
去污剂抗性膜(DRM)分离
去污剂抗性膜(脂质筏和胞膜窖)分离如之前所述进行(28，33)。简言之：大约4.5X106细胞用含有0.05％Triton X-100和蛋白酶和磷酸酶抑制剂的300μl冷TNE缓冲液(20mM Tris，140mM NaCl，2mM EDTA)裂解。裂解物与375μl 80％蔗糖的TNE-Triton X-100缓冲液混合并转移到超速离心管(目录号347356；Beckman Coulter)。放入45％蔗糖的细胞裂解物用1ml 35％蔗糖的TNE Triton X-100缓冲液轻轻覆盖，该后一级分用400μl 5％蔗糖的TNE-Triton X-100缓冲液覆盖。样品在Optima TLX超速离心机中4℃以170,000xg离心16h，使用TLS 55转子(Beckman Coulter)。离心后，收集8个250μl级分(从上到下)。
将5μl的每种蔗糖梯度级分放在PVDF膜上。允许液滴干燥并将PVDF膜在封闭溶液中室温下孵育1h。PVDF膜随后与在封闭溶液中1∶2000CT-B-HRP稀释液孵育。膜用ECL加检测试剂盒(Amersham-GE)显示。
数据分析
除非另外指出，否则进行最少三次实验(每次三个重复)。使用t检验或ANOVA进行统计分析，在P＜0.05时记录显著。
结果
基于记录细胞内Ca2+([Ca2+i])清除的内皮细胞中NO生成的现有文献，我们着手测量HCAEC中的NO合成和[Ca2+]i增加(图3)。细胞用从0(对照)至1μM递增浓度的EPI和BK处理。在EPI和BK处理两者中为1μM时的NO生成和[Ca2+]i达到最大水平。EPI和BK处理。有趣的是，当细胞用BK处理时，[Ca2+]i的增加与NO合成的增加平行，然而，在用EPI处理的细胞中，NO生成和[Ca2+]i的关系不平行，而是NO生成比率高于[Ca2+]I增加。换言之，NO/[Ca2+]I的比率在EPI诱导的作用中高于BK诱导的作用，这在10nM-1μM时特别明显。该结果表明，eNOS的活化在EPI处理的HCAEC中是Ca2+非依赖性的。
在内皮细胞中，通过特定受体活化的BK是细胞内钙动力学的已知诱导剂，因此，eNOS活化剂也是如此，有趣的是测定也是eNOS活化剂的EPI导致HCAEC中[Ca2+]i增加的可能性，因为还没有描述EPI的特定受体。EPI与BK一样诱导细胞内钙动力学；然而，EPI以比BK更低的水平进行(图4)。在通过添加咖啡因和EGTA(3X，在无Ca2+缓冲液下)清除HCAEC的[Ca2+]i之后，BK和EPI刺激不引发[Ca2+i]增加，表明该技术在清除HCAEC的[Ca2+]i中的效力(图4)。一旦我们证明了该技术去除[Ca2+]i的效力，我们着手测量各种条件下的NO生成。如预期的，BK和EPI都导致NO合成。然而，在无Ca2+条件下，仅BK诱导的NO合成被完全废除；而EPI处理的HCAEC尽管被清除Ca2+但依然能够生成NO(大约是正常钙条件下合成的30％(图5)。
Ser-1177、Ser-633、Ser-615和Thr-495的磷酸化状态是eNOS活性的量度。因此，为了评估在无Ca2+条件下的eNOS活化，我们测量了这些残基在EPI处理的HCAEC中的磷酸化。(图6)磷酸化状态的改变仅在残基Ser-1177、Ser-633和Ser-615(活化)中发现(活化)。与对照HCAEC相比，这些丝氨酸被显著磷酸化。与这些结果不同，Thr-495磷酸化(失活)状态未改变，表明其Ca2+依赖性。这些结果表明，在无Ca2+条件下的eNOS活化由Ser-1177、Ser-633、Ser-615而不是Thr-495的磷酸化改变所介导。因此，在无Ca2+条件观察到的NO合成可以归因于这些残基的磷酸化。
当存在Ca2+时，eNOS变得失活并且脱离窖蛋白-1(Cav-1)。因为我们发现在无Ca2+条件下EPI处理的HCAEC中的eNOS活化，我们决定考察它是否也在该条件下脱离。Cav-1在无Ca2+条件下在对照、EPI和BK处理的HCAEC中免疫沉淀。免疫沉淀相(IP)则用于eNOS残留物和总eNOS以及Cav-1的Western印迹分析(图7)。EPI和BK处理细胞以及对照细胞中eNOS不脱离Cav-1，这表明Ca2+是使eNOS脱离胞膜窖所必需的。在无Ca2+时，BK处理的HCAEC类似于对照条件，因为BK不引发eNOS残基中的磷酸化改变，也不引发其脱离Cav-1(图4A)。在比较重，EPI处理的HCAEC的IP相显示在Ser-1177、Ser-633和Ser-615的显著磷酸化而不脱离Cav-1，而且未发现Thr-495磷酸化改变，表明这不是eNOS活化所需的。IP的上清液(SN)相的WB未显示eNOS，也未显示Ser-1177、Ser-633和Ser-615的磷酸化，表明eNOS在处理之后依然结合胞膜窖(图8)。此外，我们显示在细胞处理之后eNOS和CaM之间无结合，这表明CaM不是该条件下eNOS活化所必需的(图9)。
eNOS在生理非刺激条件下定位于膜脂质筏和胞膜窖。为了进一步检查eNOS在无Ca2条件下在HCAEC中的定位，我们在45-35-界面(IF)-5％蔗糖梯度上产生了亚细胞分级分离。这些亚细胞级分的每一个用于测量总eNOS、Ser-1177、Ser-633、Ser-615和Thr-495的磷酸化。此外，Cav-1和运铁蛋白受体(TfR)的抗体用作对照，因为Cav-1存在于低密度级分，而TfR转移至高密度级分。(图10)在对照HCAEC中，Ser-1177、Ser-633和Ser-615未被磷酸化，而Thr-495被磷酸化，表明了eNOS失活。eNOS与Cav-1一起存在于低密度蔗糖级分，而TfR包含于45％蔗糖级分。(图11)BK处理的HCAEC的蔗糖梯度表明Ser-1177、Ser-633和Ser-615的磷酸化和Thr-495的去磷酸化，这是eNOS活化的特征。eNOS主要存在于35％蔗糖级分，表明其从低密度膜脂质向细胞质的转移。(图12)类似于BK，EPI处理的HCAEC的蔗糖梯度显示eNOS的活化，证据是Ser-1177、Ser-633和Ser-615的磷酸化和Thr-495的去磷酸化。而且，eNOS与TfR一起定位于密度更大的蔗糖级分45-35％。一旦我们发现eNOS相对于不同亚细胞级分蔗糖梯度的活性和位置，我们用排除Ca2+的相同刺激重复实验。在这一新的实验条件下，细胞被排除Ca2+。
对照HCAEC表现出定位于蔗糖梯度的低密度区的失活eNOS(图13)。用BK处理的无Ca2+的HCAEC不表达Ser-1177、Ser-633和Ser-615的磷酸化或Thr-495的去磷酸化，说明eNOS失活。而且，eNOS不转移至密度较大的蔗糖级分，并且发现它与Cav-1一起存在于5％蔗糖区(图14)。该结果与我们之前的实验一致，BK显示通过Ca2+发挥作用。如我们之前实验发现的，在无Ca2+条件下用EPI处理HCAEC导致eNOS失活。该实验的一个重要结果是活化的eNOS定位于低密度蔗糖级分(IF-5％)，并且Ser-1177、Ser-633和Ser-615残基被磷酸化(图15)。这些结果表明eNOS活化而不从膜脂质的低密度区移开。
EPI能够以新颖的钙非依赖方式活化eNOS，该作用不需要酶脱离胞膜窖(cav-1)并且不依赖钙调蛋白。EPI还增加eNOS蛋白水平～40％，并且还在诱导线粒体生物发生持续处理后48h。因此，独特的作用可以部分地负责EPI的心脏保护作用。EPI具有作为内皮细胞线粒体生物发生的有效诱导剂的前景。该作用被发挥至一定程度，它可以减轻其中内皮线粒体起调节作用的疾病例如DM的不良血管作用。
实施例5
使用心肌局部缺血-再灌注(IR)损伤的大鼠模型测定限制(-)-表儿茶素(EPI)专门接触血管官腔对梗死面积的影响。为此目的，合成了大分子(～270KDa)葡聚糖-EPI(Dx-EPI)复合物。通过预防EPI的自由扩散，我们由此仅评价了内皮处EPI诱导的作用
6ACA-EPI的合成通过几种化学步骤来实现，所述化学步骤在图16中概述。使用6-氨基己酸(6ACA:6原子)作为EPI和葡聚糖之间的间隔臂来合成Dx-EPI，减少了大分子葡聚糖对EPI相互作用分子的空间效应。6ACA的氨基被化学保护以允许其羧基与EPI反应形成酯结合。然后氨基被脱保护以使它结合至活化的葡聚糖。产生的希夫碱然后被还原生成稳定的化合物。
用于实现大鼠心肌IR模型的一般方法在其他地方详述。心肌局部缺血的总时间是45min。Dx-EPI(3mg/kg)在盐水溶液中混合并经由颈静脉IV给予。对照动物接受葡聚糖盐水溶液注射。在IR后48小时使用建立的程序检查梗死面积。
得到的产物具有～0.254mg EPI/mg大分子复合物。在IR研究中，我们使用了3mg复合物/kg大鼠(0.763mg/kg于碱中的EPI含量)。Dx-EPI的IV施用结果概述于图17。结果表明，与内皮细胞的相互作用(因为Dx-EPI实质上不能自由扩散)可能是EPI诱导的心脏保护作用的主要效应物。应用至大分子复合物的EPI的含量是～0.763mg/kg，这是小量的EPI(与诱导显著心脏保护作用所必需的10mg/kg游离EPI相比。
实施例6
线粒体呼吸被考虑为线粒体功能的总标志，增加的氧消耗速率(OCR)被认为是改善的线粒体功能的标志。XF24细胞外流动分析仪(SeahorseBioscience)使用基于荧光的技术来同时监测24孔板细胞单层培养基中O2和pH水平，这通过测量线粒体呼吸和糖酵解来定量细胞能量的生理改变。O2消耗和pH的测量都能够更具比较性地评估细胞能量和确定细胞质中糖解ATP生成与线粒体氧化磷酸化之间的动态相互关系的能力。
使用XF24分析仪，检查了表儿茶素在2.5-20μM剂量时对C2C12小鼠成肌细胞中内源呼吸速率的影响。培养的细胞用表儿茶素处理48小时，用胰蛋白酶收获，并且每孔添加30,000个细胞至XF24板，XF24板涂布Cell-Tak(BD Biosciences)的DMEM溶液，含有10mM葡萄糖、10mM丙酮酸盐和2mM谷氨酰胺。然后使板在800xg离心5分钟，并转移至XF24分析仪。
图18说明，表儿茶素以剂量依赖方式增加C2C12细胞的内源呼吸速率。根据电子显微照片，脊膜出现统计学显著的增加，其中定位由电子传递链和ATP酶组成的氧化磷酸化途径，表明表儿茶素处理的细胞与对照细胞相比具有更大的ATP生成能力。这种形态变化与通过Seahorse X24分析仪评估的改善的线粒体功能相关联。
实施例7
测量的内源呼吸速率反映了能量利用速率、能量生成速率和线粒体解偶联速率之间的净平衡。这之后通过加入1uM寡霉素以抑制ATP合成酶来诱导静息(状态4o)呼吸。状态4呼吸主要由跨线粒体内膜的质子泄露速率测定。然后通过添加300nM FCCP(一种氧化磷酸化的化学解偶联剂)来评估最大呼吸。在完整细胞中，该速率反映底物氧化的最大速率和电子传递链活性。最大速率的增加可以反映氧化酶、电子传递链组分或总线粒体质量的调节或表达水平的变化。后者受细胞中线粒体总质量影响。在添加100nM鱼藤酮和100nM粘噻唑以完全阻断呼吸链之后测量费线粒体O2消耗，作为对照。
如图19所示，浓度为0.1至1.0μM的表儿茶素刺激内源性状态4(静息)和解偶联剂刺激的呼吸。在高于5μM的浓度时，表儿茶素一般对所有呼吸速率是抑制性的(数据未显示)。这些数据表明，表儿茶素诱导微弱解偶联，并且还增加底物氧化最大速率、电子传递的限速组分的水平、或细胞中线粒体总质量。
如图21所示，这些结果使用人骨骼肌肌细胞(“HSKM细胞”)的原代培养物证实。细胞以30,000/孔铺板于XF24板，并用正常培养基中所示浓度的表儿茶素处理(图A中的上线；下线是对照)。完整细胞的呼吸在含有10mM葡萄糖、10mM丙酮酸盐和2mM谷氨酰胺的未缓冲的DMEM中测量。在图A中，内源呼吸对HSKM细胞测量，随后通过添加1uM寡霉素(指示为‘A’)测量状态4(静息)呼吸，然后在添加300nM FCCP(一种化学解偶联剂)(指示为‘B’)之后测量最大速率。然后添加鱼藤酮加粘噻唑(各自100nM)来评估非线粒体氧消耗。在图B中，用HSKM细胞进行对表儿茶素和尼可地尔48小时剂量响应，并通过添加300nM FCCP测量最大呼吸速率。如图B和图23所示，尼可地尔和儿茶素在该测定中各自有效刺激线粒体功能。如图22所示，尼可地尔和儿茶素一起的作用是协同的。
实施例8
细胞裂解物的Western印迹用于评估线粒体水平以确定改善的呼吸是否归因于增强的线粒体生物发生。用1μM的儿茶素或表儿茶素处理48小时的C2C12细胞用针对电子传递链蛋白的单克隆抗体混合物(MitoSciencesMS601)探测。如图20所示，表儿茶素或儿茶素处理明显增加复合物I的20kDa亚基的表达水平，并且可能诱导复合物III和IV的组分的略微增加。
实施例9
已知当线粒体暴露于钙超载时预防线粒体孔的开放与局部缺血损伤组织保护相关联。线粒体通透转换孔(MPTP)的小孔可以通过测量由钙添加引起的线粒体溶胀来评估。(Bemardi P，Krauskopf A.，Basso E.，等Themitochondrial permeability transition from in vitro artifact to disease target.FEBS Journal 273：2077-99，2006)。线粒体溶胀是水和电解质通过开放的钙诱导的MPTP内流入线粒体的结果。该现象诱导535-540nm处的光传输(浊度降低或535nm处吸光度降低)(Zoratti M和Szabo I.The mitochondrialpermeability transition.Biochemic and Biophysic acta 1241：139-176，1995)。
线粒体从雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g体重)的心脏制备，并测定其蛋白含量。线粒体悬浮于70mM-蔗糖/210mM-甘露糖醇/10mM-Tris/HCl，pH 7.2。孵育在25℃和1.0mg蛋白/ml介质进行，介质含有10mM琥珀酸盐(Na+)、1.0nmol/mg鱼藤酮蛋白、3mM Hepes(Na+)，pH7.4加甘露糖醇/蔗糖(3∶1摩尔比)，产生300mosm的总渗透强度。在裂隙梁模式下操作的分光光度计中在540nm处监测线粒体溶胀。溶胀记录为吸光度损失。记录的吸光度损失最大值被标准化为＝100％。
图24描述了递增浓度的表儿茶素对线粒体孔开放的抑制。缺少表儿茶素的3R(-)立体化学的儿茶素虽然在刺激线粒体功能方面是活性的，但在抑制线粒体孔开放方面是无活性的。因此，3R(-)儿茶素例如表儿茶素表现出相对于儿茶素及其衍生物在要求保护的方法中的额外益处。还值得一提的是，表儿茶素在减少梗死面积以及刺激HCAEC细胞中NO生成的能力方面优于儿茶素。因此，立体化学和取代模式的组合可以在儿茶素生物功能方面起重要作用。
实施例10
为了确定(-)-表儿茶素(EPI)和尼可地尔(NICO)联合治疗对高钙诱导的线粒体溶胀(损伤)的作用，通过监测光密度(OD，吸光度)变化来评估EPI或NICO以及EPI+NICO针对钙诱导的线粒体损伤(溶胀)的保护作用：来自雄性大鼠的心脏被切离并称重。左心室在溶液A(蔗糖2M，EDTA 0.01M，Hepes 0.5M：pH＝7.4)中匀浆(0.1g/mL)，4℃离心10min(800x g)，上清液在4℃离心10min(8000x g)，沉淀再悬浮于溶液B(蔗糖2M，EDTA 0.01M，Tris 0.5M-H2PO4-50mM：pH＝7.4)并在4℃离心10min(10000x g)。沉淀再次悬浮于10mL溶液C(蔗糖2M，EDTA 0.01M，Tris 0.5M-H2PO4-50mM，琥珀酸盐1M：pH＝7.4。然后添加33μM CaCl2，以诱导线粒体损伤(通过在535nm的吸光度变化测量的溶胀，在30min期间连续监测。
追踪线粒体溶胀对EPI和NICO处理的剂量响应作用。使用Michaelis-Menten(M-N)和概率(Probits)分析确定最大作用的30、40和50％时的有效剂量(ED)。我们分别测定了EPI和NICO的ED30作用以及每种混合物的混合物的理论作用(等于30％作用)并用数据进行等辐射分析。这些结果提供于图25-27。如所示的，EPI和NICO可以限制钙诱导的线粒体损伤。通过等辐射分析确定，联合治疗导致强的协同作用。
实施例11
为了进一步阐明表儿茶素和尼可地尔对生理功能的组合作用，再次使用大鼠心肌I/R模型。目的是比较低剂量的化合物单独或组合时在I/R后24期间重复施用(2或3次)时对梗死面积的影响。
本文描述了实施大鼠心肌IR模型的一般方法。心肌局部缺血的总时间是45min。处理被施用总共1、2或3次。初始剂在再灌注之前15min给予，然后在再灌注之后12小时给予(在2x和3x给药的情况下)并再次在24h给予(在3x给药的情况下)。Epi(0.5mg/kg)和/或Nico(33fxg/kg)在水中混合并使用颈静脉IV给予。对照动物仅接受水注射。在IR之后48小时使用建立的程序检查梗死面积。
结果显示于图28。图A描述了使用单一剂量的Epi和/或Nico获得的结果；图B是用2x剂量组合获得的结果；并且图C是用Epi和/或Nico的3x剂量获得的结果。结果表明，单独的Nico可以显著方式减少梗死面积37％。单独Epi以非显著方式减少梗死面积仅27％。与对照相比，两种药物的组合产生高显著的54％减少。因此，重复的低剂量Nico+Epi代表潜在有用的治疗法，其中副作用和毒性被最小化。
虽然本发明足够详细地被描述和示例以使本领域技术人员利用并使用它，但不背离本发明精神和范围的各种替代、调整和改进应该是明显的。本文提供的实施例是优选实施方案的代表，是示例性的，并且不是要限制本发明的范围。本领域技术人员能够想到其中的调整和其他使用。这些调整包含在本发明精神内并由权利要求书的范围限定。
对于本领域技术人员明显的是，可以对本文公开的发明进行各种替代和调整而不背离本发明的范围和精神。
说明书中提到的所有专利和出版物指示本发明所属领域普通技术人员的水平。所有专利和出版物在此通过引用并入，如同每个单独的出版物明确且单独地被说明通过引用并入。
本文示例描述的发明适当地可以在缺乏本文未明确公开的任何组成部分、限制下实施。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本由...组成”和“由...组成”的任何一个可以被另外两个术语所替代。已经采用的术语和表达用作术语描述而非限制，并且在此类术语和表达的使用中不是要排除所示和描述的特征的任何等同替代或其部分，而要知道，各种调整可能在要求保护的发明范围内。因此，应该理解，尽管本发明由优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的调整和变化，并且此类调整和变化被认为在所附权利要求所限定的本发明的范围内。
其他实施方案在下述权利要求书中提出。

Claims (87)

1.具有以下结构的(2R，3R)-2-(3，4-二羟基苯基)-3，4-二氢-1(2H)-苯并吡喃-3，5，7-三醇(“表儿茶素”)的衍生物
Figure FDA0000104357150000011
其中
R1、R2和R4各自独立选自由-OH、-O-C1-6直链或支链烷基、-O-C1-12芳基烷基、-C1-6直链或支链烷基和-C1-12芳基烷基组成的组，其中每个所述直链或支链烷基或芳基烷基包括0-4个链杂原子和任选的独立选自由卤素、三卤代甲基、-O-C1-6烷基、-NO2、-NH2、-OH、-CH2OH、-CONH2和-C(O)(OR6)组成的组的一个或多个取代基，其中R6是H或C1-3烷基，条件是R1、R2和R4的至少一个不是-OH，并且条件是R1和R2各自为-OH时R4不是-CH3或-O-CH3；
R3是-OH或
Figure FDA0000104357150000012
并且
R5是-H或-OH，
或其药学可接受的盐。
2.根据权利要求1的衍生物或药学可接受的盐，其中R1、R2和R4中的两个是-OH。
3.根据权利要求1的衍生物或药学可接受的盐，其中R1、R2和R4中的至少一个是-O-C1-6直链或支链烷基。
4.根据权利要求3的衍生物或药学可接受的盐，其中R1、R2和R4中的两个是-OH。
5.根据权利要求1的衍生物或药学可接受的盐，具有选自由以下组成的组的结构
Figure FDA0000104357150000021
6.根据权利要求5的衍生物或药学可接受的盐，其中R3是-OH并且R5是-H。
7.一种药物组合物，包括根据权利要求1-6任一项的衍生物或药学可接受的盐和药学可接受的赋形剂。
8.根据权利要求7的药物组合物，该药物组合物被配制用于胃肠外施用途径。
9.根据权利要求7的药物组合物，该药物组合物还包括独立选自由尼可地尔、尼可地尔衍生物、四环素抗生素、糖蛋白IIb/IIIa抑制剂、ADP受体/P2Y12抑制剂、前列腺素类似物、COX抑制剂、抗血小板药物、抗凝剂、肝素、直接因子Xa抑制剂、直接凝血酶(II)抑制剂和血管扩张剂组成的组的一种或多种化合物。
10.一种用于治疗动物局部缺血或局部缺血/再灌注病症或用于预防风险动物局部缺血或局部缺血/再灌注病症的方法，包括：
通过胃肠外途径或肠途径给所述动物施用有效量的根据权利要求1-6之一的衍生物或药学可接受的盐。
11.根据权利要求10的方法，包括给所述动物施用权利要求7-9之一的药物组合物。
12.根据权利要求10或11的方法，其中所述动物是哺乳动物。
13.根据权利要求10或11的方法，其中所述动物是人。
14.根据权利要求10或11的方法，其中所述施用是通过胃肠外途径。
15.根据权利要求10或11的方法，其中所述动物在急性局部缺血或局部缺血/再灌注事件发生48小时内或者在提出药物治疗急性局部缺血/再灌注事件48小时内被施用根据权利要求1-6之一的衍生物或药学可接受的盐。
16.根据权利要求10的方法，其中所述衍生物或药学可接受的盐与独立选自由尼可地尔、尼可地尔衍生物、四环素抗生素、糖蛋白IIb/IIIa抑制剂、ADP受体/P2Y12抑制剂、前列腺素类似物、COX抑制剂、抗血小板药物、抗凝剂、肝素、直接因子Xa抑制剂、直接凝血酶(II)抑制剂和血管扩张剂组成的组的一种或多种化合物一起施用。
17.根据权利要求10或11的方法，其中所述动物罹患或有直接风险罹患选自由心肌梗死、急性局部缺血性肾损伤、主动脉及其分支疾病和源于医疗介入的局部缺血性损伤组成的组的急性局部缺血或局部缺血/再灌注事件。
18.根据权利要求10-17之一的方法，其中所述局部缺血或局部缺血/再灌注事件是急性局部缺血或局部缺血/再灌注事件。
19.一种治疗受试者中局部缺血或局部缺血/再灌注(IR)病症的方法，包括：
给有相应需要的受试者施用有效量的药物组合，该药物组合包括选自由表儿茶素、其衍生物及其药学可接受的盐组成的组的第一化合物和独立选自由尼可地尔、尼可地尔衍生物、糖蛋白IIb/IIIa抑制剂、ADP受体/P2Y12抑制剂、前列腺素类似物、COX抑制剂、抗血小板药物、抗凝剂、肝素、直接因子Xa抑制剂、直接凝血酶(II)抑制剂和血管扩张剂组成的组的一种或多种第二化合物。
20.根据权利要求19的方法，其中所述局部缺血或局部缺血/再灌注(IR)病症是急性局部缺血事件。
21.根据权利要求20的方法，其中所述急性局部缺血事件是心肌梗死。
22.根据权利要求20的方法，其中所述急性局部缺血事件是急性咽峡炎事件。
23.根据权利要求20的方法，其中所述急性局部缺血事件是急性肾损伤。
24.根据权利要求20的方法，其中所述急性局部缺血事件是冠状动脉完全闭塞。
25.根据权利要求20的方法，其中所述急性局部缺血事件是急性中风。
26.根据权利要求20的方法，其中所述急性局部缺血事件是心房颤动。
27.根据权利要求19的方法，其中所述局部缺血或局部缺血/再灌注(IR)病症是引起暂时急性局部缺血的医疗介入的发生。
28.根据权利要求27的方法，其中所述医疗介入选自由CABG手术、涉及心肺分流术的心脏手术、动脉瘤修复、血管成形术和施用放射性造影剂组成的组。
29.根据权利要求27的方法，其中所述药物组合在所述医疗介入之前48小时至所述医疗介入之后48小时施用。
30.根据权利要求19的方法，其中所述一种或多种第二化合物选自由依替巴肽、替罗非班、阿昔单抗、氯吡格雷、噻氯匹啶、普拉格雷、贝拉司特、伊洛前列素、曲前列环素、阿司匹林、阿洛普令、双苯唑醇、氯克罗孟、潘生丁、吲哚布芬、吡考他胺、三氟醋柳酸、香豆素类、1，3-茚满二酮抗凝剂、肝素、比伐卢定、尼可地尔、非诺多泮、肼屈嗪、奈西立肽、尼卡地平、硝化甘油和硝普盐组成的组。
31.根据权利要求19的方法，其中所述药物组合还包括一种或多种四环素抗生素。
32.根据权利要求19的方法，其中所述第一化合物和所述一种或多种第二化合物各自通过肠施用途径递送。
33.根据权利要求19的方法，其中所述第一化合物和所述一种或多种第二化合物各自通过胃肠外施用途径递送。
34.根据权利要求19的方法，其中所述表儿茶素的衍生物具有以下结构
Figure FDA0000104357150000051
其中
R1、R2和R4各自独立选自由-OH、-O-C1-6直链或支链烷基、-O-C1-12芳基烷基、-C1-6直链或支链烷基和-C1-12芳基烷基组成的组，其中每个所述直链或支链烷基或芳基烷基包括0-4个链杂原子和任选的独立选自由卤素、三卤代甲基、-O-C1-6烷基、-NO2、-NH2、-OH、-CH2OH、-CONH2和-C(O)(OR6)组成的组的一个或多个取代基，其中R6是H或C1-3烷基，条件是R1、R2和R4的至少一个不是-OH，并且条件是R1和R2各自为-OH时R4不是-CH3或-O-CH3；
R3是-OH或
Figure FDA0000104357150000061
并且
R5是-H或-OH，
或其药学可接受的盐。
35.一种降低对血管扩张剂药物耐受性发展的方法，包括：
给有相应需要的受试者施用有效量的药物组合，该药物组合包括选自由表儿茶素、其衍生物及其药学可接受的盐组成的组的第一化合物和一种或多种血管扩张剂。
36.根据权利要求35的方法，其中所述一种或多种血管扩张剂独立选自由尼可地尔、尼可地尔衍生物、硝酸根供体血管扩张剂、ACE抑制剂和血管紧张肽受体阻断剂组成的组。
37.根据权利要求35的方法，其中所述一种或多种血管扩张剂独立选自由尼可地尔、硝普盐和硝化甘油组成的组。
38.根据权利要求35的方法，其中所述第一化合物和所述一种或多种血管扩张剂各自通过肠施用途径递送。
39.根据权利要求35的方法，其中所述表儿茶素的衍生物具有以下结构
其中
R1、R2和R4各自独立选自由-OH、-O-C1-6直链或支链烷基、-O-C1-12芳基烷基、-C1-6直链或支链烷基和-C1-12芳基烷基组成的组，其中每个所述直链或支链烷基或芳基烷基包括0-4个链杂原子和任选的独立选自由卤素、三卤代甲基、-O-C1-6烷基、-NO2、-NH2、-OH、-CH2OH、-CONH2和-C(O)(OR6)组成的组的一个或多个取代基，其中R6是H或C1-3烷基，条件是R1、R2和R4的至少一个不是-OH，并且条件是R1和R2各自为-OH时R4不是-CH3或-O-CH3；
R3是-OH或
Figure FDA0000104357150000071
并且
R5是-H或-OH，
或其药学可接受的盐。
40.一种刺激细胞线粒体功能的方法，包括：
以有效刺激所述细胞线粒体功能的量施用选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组一种或多种化合物。
41.根据权利要求40的方法，其中所述刺激所述细胞线粒体功能包括刺激所述细胞线粒体呼吸。
42.根据权利要求40的方法，其中所述刺激所述细胞线粒体功能包括刺激所述细胞线粒体生物发生。
43.根据权利要求40的方法，其中所述施用包括给所述细胞施用至少0.1μM儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物。
44.根据权利要求43的方法，其中所述至少0.1μM儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物维持至少30分钟、1小时、3小时、12小时、24小时或48小时。
45.根据权利要求40的方法，其中所述施用包括给所述细胞施用至少1μM儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物。
46.根据权利要求45的方法，其中所述至少1μM儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物维持至少30分钟、1小时、3小时、12小时、24小时或48小时。
47.根据权利要求40的方法，其中所述表儿茶素衍生物具有以下结构：
Figure FDA0000104357150000081
其中
R1、R2和R4各自独立选自由-OH、-O-C1-6直链或支链烷基、-O-C1-12芳基烷基、-C1-6直链或支链烷基和-C1-12芳基烷基组成的组，其中每个所述直链或支链烷基或芳基烷基包括0-4个链杂原子和任选的独立选自由卤素、三卤代甲基、-O-C1-6烷基、-NO2、-NH2、-OH、-CH2OH、-CONH2和-C(O)(OR6)组成的组的一个或多个取代基，其中R6是H或C1-3烷基，条件是R1、R2和R4的至少一个不是-OH；
R3是-OH或
Figure FDA0000104357150000082
并且
R5是H或OH，
或其药学可接受的盐。
48.根据权利要求47的方法，其中所述表儿茶素衍生物具有选自由以下组成的组的结构
Figure FDA0000104357150000091
49.根据权利要求40的方法，其中所述施用步骤包括以有效刺激动物细胞线粒体功能的量通过胃肠外或肠途径为所述动物递送选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。
50.根据权利要求49的方法，其中所述动物是人。
51.根据权利要求49的方法，其中所述动物基于如下诊断被选择所述施用步骤：所述动物罹患或有直接风险罹患选自由线粒体生物发生或生物能量的先天性障碍、饮食缺陷、维生素缺乏、糖尿病、代谢综合征、弗里德赖希氏共济失调、肺动脉高压、慢性肾病、急性肾损伤、高血压、痴呆、心力衰竭、肥胖、胰岛素抵抗、涉及降低的线粒体功能的肌肉病症、与年龄相关的认知受损、血管疾病、代谢损伤或神经变性和涉及降低的线粒体功能的神经病症组成的组的一种或多种病症。
52.根据权利要求49的方法，其中所述动物基于所述动物的年龄被选择所述施用步骤。
53.根据权利要求49的方法，其中所述动物基于所述动物的活动状态被选择所述施用步骤。
54.根据权利要求49的方法，其中所述施用步骤包括以有效维持所述化合物在所述动物中至少0.1μM的血浆浓度至少30分钟、1小时、3小时、12小时、24小时或48小时的量通过口服途径递送儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物。
55.根据权利要求49的方法，该方法包括以有效维持所述化合物在所述动物中至少1μM的血浆浓度至少30分钟、1小时、3小时、12小时、24小时或48小时的量通过口服途径递送儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物。
56.一种治疗动物中涉及降低的线粒体功能的病症的方法，所述方法包括：
以有效刺激所述动物细胞线粒体功能的量通过胃肠外或肠途径为所述动物递送选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。
57.根据权利要求56的方法，其中所述涉及降低的线粒体功能的病症选自由线粒体生物发生或生物能量的先天性障碍、饮食缺陷、维生素缺乏、糖尿病、代谢综合征、弗里德赖希氏共济失调、肺动脉高压、慢性肾病、急性肾损伤、高血压、痴呆、心力衰竭、肥胖、胰岛素抵抗、涉及降低的线粒体功能的肌肉病症、与年龄相关的认知受损、血管疾病、代谢损伤或神经变性和涉及降低的线粒体功能的神经病症组成的组。
58.根据权利要求56的方法，其中所述涉及降低的线粒体功能的病症与所述动物的年龄和/或活动状态有关。
59.根据权利要求56的方法，其中所述涉及降低的线粒体功能的病症与所述动物的营养状态有关。
60.根据权利要求56的方法，其中所述施用步骤包括以有效维持所述化合物在所述动物中至少0.1μM的血浆浓度至少30分钟、1小时、3小时、12小时、24小时或48小时的量通过口服途径为所述动物递送儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物。
61.根据权利要求56的方法，包括以有效维持所述化合物在所述动物中至少1μM的血浆浓度至少30分钟、1小时、3小时、12小时、24小时或48小时的量通过口服途径为所述动物递送儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物。
62.一种用于改善动物肌肉结构或功能的方法，包括：
以有效刺激所述动物细胞线粒体功能、从而改善肌肉结构或功能的量为所述动物施用选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。
63.一种用于改善动物中与运动相关的线粒体作用的方法，包括：
以有效刺激所述动物细胞线粒体功能、从而改善与运动相关的线粒体作用的量为所述动物施用选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。
64.一种用于增强动物运动能力的方法，包括：
以有效刺激所述动物细胞线粒体功能、从而增强运动能力的量为所述动物施用选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。
65.一种用于增强动物中响应于运动的肌肉健康和功能的方法，包括：
以有效刺激所述动物细胞线粒体功能、从而增强响应于运动的肌肉健康和功能的量为所述动物施用选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。
66.一种用于增强动物在受限的运动能力的临床环境中肌肉健康和功能的方法，包括：
以有效刺激所述动物细胞线粒体功能、从而增强肌肉健康和功能的量为所述动物施用选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。
67.一种用于增强动物肌肉从剧烈活动或从与剧烈活动或持续活动相关的损伤恢复的方法，包括：
以有效刺激所述动物细胞线粒体功能、从而增强肌肉恢复的量为所述动物施用选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。
68.根据权利要求56、62、63、64、65、66或67之一的方法，其中所述施用包括给所述动物施用至少0.1μM儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物。
69.根据权利要求56、62、63、64、65、66或67的方法，其中所述方法包括施用表儿茶素或表儿茶素衍生物，所述表儿茶素或表儿茶素衍生物相对于选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素或儿茶素衍生物组成的组的其他化合物至少90％纯。
70.根据权利要求68的方法，其中所述至少0.1μM儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物维持至少30分钟、1小时、3小时、12小时、24小时或48小时。
71.根据权利要求70的方法，其中所述至少1μM儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物维持至少30分钟、1小时、3小时、12小时、24小时或48小时。
72.根据权利要求68的方法，其中所述儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物以在所述动物中实现在第一个12小时期间至少一次至少0.1μM的血浆浓度、和在紧接着所述第一个12小时的第二个12小时和任选地在与所述第一和第二个12小时连续的一个或多个随后12小时期间至少一次至少0.1μM的血浆浓度的方式递送。
73.根据权利要求68的方法，其中所述儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物以在所述动物中实现在第一个24小时期间至少一次至少0.1μM的血浆浓度、和在紧接着所述第一个24小时的第二个24小时和任选地在与所述第一和第二个24小时连续的一个或多个随后24小时期间至少一次至少0.1μM的血浆浓度的方式递送。
74.根据权利要求67的方法，其中所述表儿茶素衍生物具有以下结构：
Figure FDA0000104357150000131
其中
R1、R2和R4各自独立选自由-OH、-O-C1-6直链或支链烷基、-O-C1-12芳基烷基、-C1-6直链或支链烷基和-C1-12芳基烷基组成的组，其中每个所述直链或支链烷基或芳基烷基包括0-4个链杂原子和任选的独立选自由卤素、三卤代甲基、-O-C1-6烷基、-NO2、-NH2、-OH、-CH2OH、-CONH2和-C(O)(OR6)组成的组的一个或多个取代基，其中R6是H或C1-3烷基，条件是R1、R2和R4的至少一个不是-OH；
R3是-OH或
Figure FDA0000104357150000132
并且
R5是H或OH，
或其药学可接受的盐。
75.根据权利要求74的方法，其中其中所述表儿茶素衍生物具有选自由以下组成的组的结构
Figure FDA0000104357150000141
76.根据权利要求67的方法，其中所述施用步骤包括通过胃肠外或肠途径为动物递送选自由表儿茶素、表儿茶素衍生物、儿茶素、儿茶素衍生物、尼可地尔和尼可地尔衍生物组成的组的一种或多种化合物。
77.根据权利要求67的方法，其中所述动物是人。
78.根据权利要求40的方法，其中所述儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物以在所述动物中实现在第一个12小时期间至少一次至少0.1μM的血浆浓度、和在紧接着所述第一个12小时的第二个12小时和任选地在与所述第一和第二个12小时连续的一个或多个随后12小时期间至少一次至少0.1μM的血浆浓度的方式递送。
79.根据权利要求40的方法，其中所述儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物以在所述动物中实现在第一个24小时期间至少一次至少0.1μM的血浆浓度、和在紧接着所述第一个24小时的第二个24小时和任选地在与所述第一和第二个24小时连续的一个或多个随后24小时期间至少一次至少0.1μM的血浆浓度的方式递送。
80.根据权利要求40、56、62、63、64、65、66或67任一项的方法，其中所述施用步骤包括施用儿茶素、儿茶素衍生物、表儿茶素或表儿茶素衍生物和尼可地尔或尼可地尔衍生物。
81.根据权利要求80的方法，其中所述施用步骤包括施用表儿茶素或表儿茶素衍生物和尼可地尔或尼可地尔衍生物。
82.根据权利要求81的方法，其中所述表儿茶素或表儿茶素衍生物与尼可地尔或尼可地尔衍生物一起以单一药物组合物施用。
83.一种药物或营养药物组合物，包括表儿茶素或表儿茶素衍生物和尼可地尔或尼可地尔衍生物。
84.一种药物或营养药物组合物，包括表儿茶素或表儿茶素衍生物与尼可地尔或尼可地尔衍生物的混合物。
85.表儿茶素或表儿茶素衍生物用于治疗选自由线粒体生物发生或生物能量的先天性障碍、饮食缺陷、维生素缺乏、糖尿病、代谢综合征、弗里德赖希氏共济失调、肺动脉高压、慢性肾病、急性肾损伤、高血压、痴呆、心力衰竭、肥胖、胰岛素抵抗、涉及降低的线粒体功能的肌肉病症、与年龄相关的认知受损、血管疾病、代谢损伤或神经变性和涉及降低的线粒体功能的神经病症组成的组的一种或多种病症的用途；或
用于治疗选自由线粒体生物发生或生物能量的先天性障碍、饮食缺陷、维生素缺乏、糖尿病、代谢综合征、弗里德赖希氏共济失调、肺动脉高压、慢性肾病、急性肾损伤、高血压、痴呆、心力衰竭、肥胖、胰岛素抵抗、涉及降低的线粒体功能的肌肉病症、与年龄相关的认知受损、血管疾病、代谢损伤或神经变性和涉及降低的线粒体功能的神经病症组成的组的一种或多种病症的方法，包括给有相应需要的患者施用表儿茶素或表儿茶素衍生物；或
用于预防有风险动物中线粒体生物发生或生物能量受损的方法，包括给有相应需要的患者施用表儿茶素或表儿茶素衍生物。
86.表儿茶素或表儿茶素衍生物与尼可地尔或尼可地尔衍生物组合治疗选自由线粒体生物发生或生物能量的先天性障碍、饮食缺陷、维生素缺乏、糖尿病、代谢综合征、弗里德赖希氏共济失调、肺动脉高压、慢性肾病、急性肾损伤、高血压、痴呆、心力衰竭、肥胖、胰岛素抵抗、涉及降低的线粒体功能的肌肉病症、与年龄相关的认知受损、血管疾病、代谢损伤或神经变性和涉及降低的线粒体功能的神经病症组成的组的一种或多种病症的用途；或
用于治疗选自由线粒体生物发生或生物能量的先天性障碍、饮食缺陷、维生素缺乏、糖尿病、代谢综合征、弗里德赖希氏共济失调、肺动脉高压、慢性肾病、急性肾损伤、高血压、痴呆、心力衰竭、肥胖、胰岛素抵抗、涉及降低的线粒体功能的肌肉病症、与年龄相关的认知受损、血管疾病、代谢损伤或神经变性和涉及降低的线粒体功能的神经病症组成的组的一种或多种病症的方法，包括给有相应需要的患者施用表儿茶素或表儿茶素衍生物与尼可地尔或尼可地尔衍生物的组合；或
用于预防有风险动物中线粒体生物发生或生物能量受损的方法，包括给有相应需要的患者施用表儿茶素或表儿茶素衍生物与尼可地尔或尼可地尔衍生物的组合。
87.尼可地尔或尼可地尔衍生物治疗选自由线粒体生物发生或生物能量的先天性障碍、饮食缺陷、维生素缺乏、糖尿病、代谢综合征、弗里德赖希氏共济失调、肺动脉高压、慢性肾病、急性肾损伤、高血压、痴呆、心力衰竭、肥胖、胰岛素抵抗、涉及降低的线粒体功能的肌肉病症、与年龄相关的认知受损、血管疾病、代谢损伤或神经变性和涉及降低的线粒体功能的神经病症组成的组的一种或多种病症的用途；或
用于治疗选自由线粒体生物发生或生物能量的先天性障碍、饮食缺陷、维生素缺乏、糖尿病、代谢综合征、弗里德赖希氏共济失调、肺动脉高压、慢性肾病、急性肾损伤、高血压、痴呆、心力衰竭、肥胖、胰岛素抵抗、涉及降低的线粒体功能的肌肉病症、与年龄相关的认知受损、血管疾病、代谢损伤或神经变性和涉及降低的线粒体功能的神经病症组成的组的一种或多种病症的方法，包括给有相应需要的患者施用尼可地尔或尼可地尔衍生物；或
用于预防有风险动物中线粒体生物发生或生物能量受损的方法，包括给有相应需要的患者施用尼可地尔或尼可地尔衍生物。
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