CN102475886A

CN102475886A - 新型抗乳腺癌多肽疫苗

Info

Publication number: CN102475886A
Application number: CN2010105615470A
Authority: CN
Inventors: 洪章勇; 尹芝南; 杨文娟; 杨昭慧; 周兴亮; 赵文哲
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2010-11-29
Filing date: 2010-11-29
Publication date: 2012-05-30

Abstract

本发明公开了新型抗乳腺癌多肽疫苗的研制方法，其特征在于包括一个来源于HER2/neu(表皮生长因子受体)的多肽片段(E75或342-350肽段)，一个效应T细胞(Th，T辅助细胞)抗原决定基，和一个TLR(toll-like receptor，toll样细胞受体)的配基，连接这三组分的半胱氨酸。这些TLR的配基可以结合到树突状细胞表面的某些TLR上，促进了树状细胞的成熟和炎症因子的释放，也增强了树突状细胞对衍生多肽的吞噬和递呈；第二部分由Th抗原决定基组成，抗体产生的过程中需要CD4⁺Th细胞的参与，递呈细胞(APC)将抗原递呈到细胞表面的MHC上，需要激活CD4⁺Th细胞，才能引起细胞免疫过程；第三部分是多肽片段，它是由HER2/neu蛋白衍生出的肽链(E75或342-350)，可有效诱导体液免疫，当其与免疫辅助物相结合，可以有效地诱导蛋白特异性免疫应答。

Description

新型抗乳腺癌多肽疫苗

所属技术领域：

本发明公开了新型抗乳腺癌多肽疫苗的制备，其特征在于包括一个来源于HER2/neu(表皮生长因子受体)的多肽片段(E75或342-350)，一个效应T细胞(Th，T辅助细胞)抗原决定基，和一个TLR(toll-like receptor，toll样细胞受体)的配基，以及连接这三组分的半胱氨酸。

背景技术：

每年约有120万妇女发生乳腺癌，约50万妇女死于乳腺癌。北美、北欧是乳腺癌的高发地区，其发病率约为亚非拉国家的4倍。我国虽是乳腺癌的低发地区，但其发病率正在逐年上升，发病的增长速度却高出高发国家1到2个百分点，尤其是沪、京、津及沿海地区是我国乳腺癌的高发区。更令人担忧的是，与西方国家比较，我国乳癌患者发病年龄较轻，发病高峰年龄在40-49岁，比西方妇女早10-15年。基于严峻的形势，乳腺癌的治疗与防复发引起了人们的广泛关注。

乳腺癌的传统治疗方法：1.手术治疗：手术适应症Halsted首创乳癌根治术，因手术合理，疗效明确，近百年来成为人们治疗乳癌所遵循的标准方式。近半个世纪以来，对乳癌术式进行了不少探索性修改，总的趋势不外保守和扩大两方面，至今仍争论不休。乳房局部切除和全乳切除是保守手术的代表性手术。2.放射治疗：可以提高手术切除率使部分不能手术的患者再获手术机会，由于放射抑制了肿瘤细胞的活力可降低术后复发率及转移率从而提高生存率，由于放射延长了术前观察时间有使部分已有亚临床型远处转移的病例避免一次不必要的手术。3.化疗：通过化疗科尽早控制微转移灶使原发癌及其周围扩散的癌细胞产生退变或部分被杀灭以减少术后复发及转移，进展期乳癌以及炎症型乳癌限制了手术治疗的实施术前化疗可使肿瘤缩小以便手术切除，可以根据切除肿瘤标本评价术前化疗效果作为术后或复发时选择化疗方案的参考。4.乳腺癌的最新治疗方法：肿瘤生物治疗技术是近年来因生物技术发展而兴起的一种全新的肿瘤治疗手段，被认为是除了手术、化疗、放疗之外的第四种肿瘤治疗模式，具有副作用小、抗肿瘤活性高、适应症广等特点。将生物技术用于肿瘤治疗是提高和改变患者自身机体免疫功能的治本的方法，被认为是攻克肿瘤的最终办法，其应用前景广阔。自从人类肿瘤分子特征的提高导致肿瘤相关抗原可以被人体的T淋巴细胞所识别后，发展抗肿瘤疫苗已成为一种趋势。肿瘤的疫苗是通过诱导肿瘤患者自身的免疫监测和杀瘤功能，有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿瘤细胞，达到治疗肿瘤，预防复发和转移和最终根治肿瘤的目的，具有特异性强，副作用轻等特点，正逐步成为肿瘤综合治疗中的一个重要环节，也是当前肿瘤治疗基础研究和临床应用的热点与发展方向。

发明内容：

本发明公开了新型抗乳腺癌多肽疫苗，其特征在于包括来源于HER2/neu(表皮生长因子受体)的多肽片段(E75或342-350)，一个效应T细胞(Th，T辅助细胞)抗原决定基，一个TLR(toll-like receptor，toll样细胞受体)的配基，和连接这三组分的半胱氨酸：①以半胱氨酸为底物，通过高氯酸的氧化作用形成二聚化的半胱氨酸，加入乙酸叔丁酯与氨基酸的羧基酯化，加入棕榈酰氯，在氨基处形成酰化反应，还原二硫键并加入环氧丙醇，在巯基处形成开环氧的氧化反应，再加入棕榈酰氯，在两个羟基处发生酰化反应，去掉最初半胱氨酸上的保护基，便制出Pam₃Cys化合物；②氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团Fmoc-保护的氨基酸共价连接在固相载体上，20％pipe(哌啶)的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了，DIEA提供一个碱性的反应环境，HBTu作为缩合剂，将第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽，重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，脱去保护基Fmoc-，水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽；③最后，将Pam₃Cys上的羧基和E75多肽上的氨基通过缩合反应连接。

本发明与现有同类疫苗相比，结构新颖，合成方法独到，具有广泛的应用价值。

具体实施方式：

1.TLR配基和化学合成

1.1.化合物(a)合成

准确称取10.00g胱氨酸(Cys)置于圆底烧瓶中，将体系置于冰浴中缓慢滴加29.75g高氯酸(HClO4)。保持体系低温，加入260ml乙酸叔丁酯并继续搅拌，初有白色不溶物而后逐渐消失。室温搅拌，见有大量固体析出时停止搅拌，室温静置过夜。将体系转入冰箱0℃放置24h，取出后迅速用布氏漏斗抽滤。滤渣用乙醚洗涤后加碳酸氢钠溶液溶解，用等体积乙醚萃取3次。有机相经饱和食盐水洗涤和无水硫酸钠干燥，去除溶剂得黄色油状液体11.85g即为化合物(a)，产率81％。

1.2.化合物(b)合成

将11.35g化合物(a)溶解于200ml二氯甲烷，将10.85g碳酸氢钠溶解于100ml蒸馏水。两相混合，边搅拌边滴加20.67g棕榈酰氯，室温搅拌过夜。薄层色谱监测(展开剂中石油醚∶乙酸乙酯＝7∶2，v/v)，反应结束后将体系转入分液漏斗静置待其分层，放出有机相，水相用3×20ml二氯甲烷萃取产物。所得有机相合并，用饱和食盐水洗2次，加无水硫酸钠干燥，去除溶剂得到白色固体21.39g即为化合物(b)，产率80％。

1.3.化合物(c)和(d)合成

称取10.30g化合物(b)溶解于二氯甲烷，加入5.67g锌粉，室温搅拌。逐渐滴加甲醇/浓盐酸(37％)/浓硫酸(98％)混合溶液(体积比100∶7∶1)作为活化剂开始反应。薄层色谱监测(展开剂为乙酸乙酯)反应结束后，不进行后处理直接进行下一步反应。

向体系加入碳酸氢钠粉末至体系pH＞7，加入1.61g环氧丙醇，室温搅拌过夜。薄层色谱监测(展开剂为乙酸乙酯)反应结束后，将体系用砂芯漏斗垫硅藻土过滤，滤渣用3×30ml二氯甲烷/甲醇混合液(体积比3∶1)洗涤。滤液合并旋转蒸发去除溶剂，用少量乙酸乙酯溶解，经过硅胶柱色谱分离产物，去除溶剂得到黄色油状液体8.41g即为化合物(d)，产率69％。

1.4.化合物(e)合成

称取7.91g化合物(d)溶解于160ml二氯甲烷中，依次加入5.10g三乙胺和0.79gDMAP(4-二甲氨基吡啶，用作催化剂)，混匀液体。边摇动边滴加10.31g棕榈酰氯，放热同时有酸雾产生。室温搅拌过夜。薄层色谱监测(展开剂中石油醚与乙酸乙酯体积比为7∶2)反应情况，追加2.98g棕榈酰氯(同时追加三乙胺保证体系碱性环境)后转化完全。旋转蒸发浓缩体系，用硅胶柱色谱分离产物，去除溶剂得到白色固体26.31g即为化合物(e)粗品。重溶解粗品于乙酸乙酯/石油醚混合液(体积比1∶6)中，室温静置3h，转入冰箱0℃静置3h进行重结晶。抽滤，用石油醚略洗滤渣，得到白色固体9.90g即为化合物(e)纯品，产率63％。

1.5.Pam3Cys合成

将(e)溶解于10ml二氯甲烷，加入95％三氟乙酸2ml，混匀后室温搅拌。薄层色谱(展开剂石油醚与乙酸乙酯体积比3∶1，加一滴冰醋酸)检测反应结束后，将体系用饱和食盐水洗涤至流出液为pH为中性。旋转蒸发去除溶剂得到白色蜡状物质。加入少量二氯甲烷至其完全溶解，再加入16倍体积的石油醚，室温静置12h冰箱0℃静置12h待其重结晶。抽滤取滤渣，烘干得到白色固体8.80g即为Pam3Cys纯品，产率94％。

2.Th抗原决定基和E75多肽的合成

2.1.称取树脂于DCM(二氯甲烷)，氩气鼓动5min；

2.2.称取Fmoc-Leu-OH 0.3mmol；

2.3.Fmoc-Leu-OH∶DIEA＝1∶2(n)氩气鼓动90min；

2.4.DCM洗涤5次(次/min)；

2.5.封闭树脂活性DCM∶DIEA∶MeOH＝3.4ml∶0.2ml∶0.4ml氩气鼓动10min；

2.6.DCM洗涤5次(次/min)，再DMF(二甲基甲酰胺)洗涤5次(次/min)，后20％pipe30min；

2.7.20％pipe洗涤一次，再DMF洗涤5次(次/min)，以脱出白色Fmoc粉末为宜；

2.8.Fmoc-Met-OH(0.3mmol)∶HBTu∶DIEA＝1∶1∶2(n)氩气鼓动90min；

2.9.DMF洗涤5次(次/min)；

2.10.20％pipe氩气鼓动30min；

2.11.20％pipe洗涤一次，DMF洗涤5次(次/min)；依次加入后续Fmoc-氨基酸，重复8-12的操作，按文献顺序连接多肽，最后用95％TFA，2.5％H2O，2.5％TIS将合成好的肽段与固相树脂脱离。但要注意的是后续氨基酸的当量要视情况依次递增0.3mmol，0.6mmol，0.9mmol，1.2mmol，氩气鼓动时间随氨基酸当量递增而递增90min，120min，150min，210min。氩气鼓动氨基酸连接以及20％pipe溶液脱Fmoc保护基团的时间应够长以保障反应充分。

3.Pam3Cys与E75多肽的连接

Pam3Cys和E75多肽置于TBTU(O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯)、HOBT(1-羟基-苯并三氮唑)、N-甲基吗啉、DMF、DCM的混合溶液中搅拌过夜。

Claims

1.一种新型抗乳腺癌E75多肽疫苗，其特征在于包括一个来源于HER2/neu(表皮生长因子受体)的E75多肽片段，一个效应T细胞(Th，T辅助细胞)抗原决定基，一个TLR(toll-likereceptor，toll样细胞受体)的配基，和连接这三组分的半胱氨酸，该疫苗的研制方法为：①以半胱氨酸为底物，通过高氯酸的氧化作用形成二聚化的半胱氨酸，加入乙酸叔丁酯与氨基酸的羧基酯化，加入棕榈酰氯，在氨基处形成酰化反应，还原二硫键并加入环氧丙醇，在巯基处形成开环氧的氧化反应，再加入棕榈酰氯，在两个羟基处发生酰化反应，去掉最初半胱氨酸上的保护基，便制出Pam₃Cys化合物；②氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团Fmoc-保护的氨基酸共价连接在固相载体上，20％pipe的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了，DIEA提供一个碱性的反应环境，HBTu作为缩合剂，将第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽，重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，脱去保护基Fmoc-，水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽；③最后，将Pam₃Cys上的羧基和E75多肽上的氨基通过缩合反应连接。

2.根据权利要求1所述的三组分疫苗的制备方法，其特征在于：半胱氨酸与高氯酸的物质的量比为1∶5。

3.根据权利要求1所述的三组分疫苗的制备方法，其特征在于：加入含4倍当量的碳酸氢钠的水溶液，加入2倍当量的棕榈酰氯。

4.根据权利要求1所述的三组分疫苗的制备方法，其特征在于：用锌粉还原二硫键是，逐渐滴加甲醇/盐酸(37％)/浓硫酸混合溶液(体积比100∶7∶1)作为活化剂，然后加入2倍当量的环氧丙醇。

5.根据权利要求1所述的三组分疫苗的制备方法，其特征在于：加入3倍当量的三乙胺和少量DMAP(4-二甲氨基吡啶)作催化剂，边摇动边滴加2倍当量的棕榈酰氯。

6.根据权利要求1所述的三组分疫苗的制备方法，其特征在于：Pam₃Cys连接肽段时，加入TBTU(O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯)、HOBT(1-羟基-苯并三氮唑)、N-甲基吗啉、DMF(二甲基甲酰胺)、DCM(二氯甲烷)，且DMF∶DCM＝5∶2。