CN111423514A - 一种氟代tf-muc1糖肽缀合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种氟代tf-muc1糖肽缀合物及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111423514A
CN111423514A CN202010118019.1A CN202010118019A CN111423514A CN 111423514 A CN111423514 A CN 111423514A CN 202010118019 A CN202010118019 A CN 202010118019A CN 111423514 A CN111423514 A CN 111423514A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glycopeptide
muc1
integers
formula
conjugate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202010118019.1A
Other languages
English (en)
Inventor
孟欣
廉旭静
李婷申
亚强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
Tianjin University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Science and Technology filed Critical Tianjin University of Science and Technology
Priority to CN202010118019.1A priority Critical patent/CN111423514A/zh
Publication of CN111423514A publication Critical patent/CN111423514A/zh
Priority to US17/007,805 priority patent/US20210260204A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4727—Mucins, e.g. human intestinal mucin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及一种氟代TF‑MUC1糖肽缀合物，所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure DDA0002392088350000011
其中，糖肽是如下通式(I)中的任一糖肽：
Figure DDA0002392088350000012
即
Figure DDA0002392088350000013
本发明氟代TF‑MUC1糖肽缀合物中，糖肽的化学结构是明确且单一的，可以通过化学方法大量合成。选择的连接体容易被活化，能够高效率与载体蛋白的偶联，提高载体蛋白的载糖肽量。值得一提的是，氟原子的引入能够增强糖抗原中糖苷键的稳定性，从而提高糖肽抗原的代谢稳定性、脂溶性和生物利用度，解决天然肿瘤相关MUC1糖肽免疫原性差和不稳定的问题。酶联免疫吸附(ELISA)测定显示，免疫后血清中的抗体能够识别天然MUC1，实现交叉识别。

Description

一种氟代TF-MUC1糖肽缀合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于肿瘤疫苗研制技术领域，尤其是一种氟代TF-MUC1糖肽缀合物及其制备方法和应用。
背景技术
TF抗原是Core 2O-聚糖的前体，由未唾液酸化的Core 1结构(Galβ1-3GalNAcαSer/Thr) 组成，最初是由Thomsen和Friedenreich在红细胞中决定血型的糖蛋白上发现的。它在正常细胞上会被进一步糖基化或被唾液酸修饰所掩蔽。然而，TF抗原暴露于很多癌症细胞表面，包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌和胰腺癌等。所以，TF抗原的表达已经作为检测肿瘤的工具并且作为愈后的标准，其分布密度可以用来预测癌症的组织病理学分级、癌细胞的侵袭潜力，以及乳腺、膀胱和前列腺肿瘤早期复发的可能性。Georg Springer是乳腺癌中TF抗原研究的先驱，他首先表明所有乳腺癌都表达TF抗原，而且来使用单克隆抗体研究证明TF 抗原在正常上皮或乳腺细胞中仅低水平表达。
黏蛋白1(MUC1)是一种I型跨膜糖蛋白，由两个亚基组成，高度糖基化的细胞外N端结构域(MUC1-N)，从细胞中突出表面可达200～500nm，由20个氨基酸残基串联重复序列(HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA)组成，重复数目从20到120个不等，同时序列中的有五个潜在的翻译后O-糖基化位点，位于其中的丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)残基上。MUC1属于肿瘤相关抗原高表达的范畴，在许多癌症的肿瘤细胞中都存在MUC-1高表达和异常糖基化。研究表明在近86％的腺癌中都有异常MUC-1的高表达。肿瘤细胞表面的糖基化模式发生了改变，通常被肿瘤相关糖抗原(TACA)覆盖。借此，MUC1通过TACA与凝集素相互作用而发挥的致癌功能。这些相互作用往往导致前肿瘤微环境的产生，有利于肿瘤的进展、转移和肿瘤的逃避。同时，由于肿瘤细胞表面MUC1的糖基侧链变短，新的肽段表位出现，有过量的Tn(GalNAcα-O-Ser/Thr)、TF(Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr)、sTn NeuAcα2-6-GalNAcα-O-Ser/Thr等抗原的表达，具有高免疫原性，因此MUC1成为一种非常有潜力的治疗性肿瘤疫苗的靶标。
长期以来一直流行使用蛋白质缀合物制备候选疫苗。不同的蛋白质载体如BSA(牛血清白蛋白)、KLH(匙孔血蓝蛋白)、TTox(破伤风类毒素)等已经被用来与MUC1糖肽缀合以产生免疫应答，因为这些蛋白质载体含有许多表位抗原，具有高度免疫原性。
除了将MUC1糖肽与载体蛋白偶联外，还可以通过对肿瘤相关糖抗原(TACAs)衍生或修饰来进一步增强MUC1糖肽疫苗的免疫原性。由于MUC1糖肽属于内源性结构，是T细胞非依赖性的自身抗原，因此易被免疫系统所耐受，所以为了提高这些内源性结构的免疫原性，可以使用氟原子替代糖分子中的羟基，以期利用电子等排性，增强糖抗原的代谢稳定性和生物利用度，从而进一步提高MUC1糖肽抗原的免疫原性。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种氟代TF-MUC1糖肽缀合物及其制备方法和应用，该氟代TF-MUC1糖肽缀合物能够激发高滴度的IgG抗体水平，因此能够应用在疫苗方面中。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种氟代TF-MUC1糖肽缀合物，所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure BDA0002392088330000021
其中，糖肽是如下通式(I)中的任一糖肽：
Figure BDA0002392088330000022
式(Ⅰ)和式(Ⅱ)中：
m是0到30中的任意一个整数；
R＝GalNAcα，GalNAcβ，GlcNAcα，GlcNAcβ，Galβ1-3GalNAcα，Galβ1-3GalNAcβ或上述糖基的氟代衍生物；
X选自：-CH2、-NH-、-O-、-C(O)-、-S-、或
Figure BDA0002392088330000023
之一；
连接体是糖肽与载体蛋白直接或间接连接后得到的结构部分；
n是载体蛋白连接的寡糖的数量，n是0到30中的任意一个整数；
载体蛋白选自：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、破伤风毒素、白喉毒素或白喉毒素无毒突变体。
而且，所述糖肽缀合物的结构通式为如下之一：
Figure 11
式中，j1是0到10中的任意一个整数，j2是0到10中的任意一个整数，j3是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
而且，所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure 100002_2
式中，j1是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
而且，所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure 100002_3
式中，j1是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
而且，所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure 100002_4
式中，j3是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
而且，所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure 100002_5
式中，j3是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
一种如上所述的氟代TF-MUC1糖肽缀合物的制备方法，包括如下技术路线：
Figure BDA0002392088330000042
如上所述的氟代TF-MUC1糖肽缀合物在制备疫苗方面中的应用。
而且，所述疫苗为肿瘤疫苗。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明氟代TF-MUC1糖肽缀合物中，糖肽的化学结构是明确且单一的，可以通过化学方法大量合成。
2、本发明选择的连接体容易被活化，可高效地实现与载体蛋白的偶联，提高载体蛋白的载糖肽量。
3、本发明氟原子的引入可以增强糖抗原中糖苷键的稳定性，从而提高糖肽抗原的代谢稳定性、脂溶性和生物利用度，解决了天然肿瘤相关MUC1糖肽免疫原性差和不稳定的问题。
4、酶联免疫吸附测定显示，氟代MUC1糖肽抗原免疫后的血清中的抗体能够识别天然 MUC1,实现交叉识别。
5、动物实验表明，该氟代TF-MUC1糖肽缀合物能够激活有效的T细胞反应，产生高滴度的IgG抗体水平。
6、本发明肿瘤疫苗作为治疗性疫苗应用，能够降低治疗过程中肿瘤化学药物的用量和减少抗癌药的副作用，提高癌症患者的生存率。
附图说明
图1为本发明中化合物7的1HNMR谱图；
图2为本发明中化合物10的MALDI-TOF图；
图3为本发明中化合物10的分析HPLC图；
图4为本发明中氟代TF-MUC1糖肽缀合物的MALDI-TOF图；
图5为本发明中氟代TF-MUC1糖肽缀合物的特异性三免抗体滴度图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种氟代TF-MUC1糖肽缀合物，所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure BDA0002392088330000051
其中，糖肽是如下通式(I)中的任一糖肽：
Figure BDA0002392088330000061
式(Ⅰ)和式(Ⅱ)中：
m是0到30中的任意一个整数；
R＝GalNAcα，GalNAcβ，GlcNAcα，GlcNAcβ，Galβ1-3GalNAcα，Galβ1-3GalNAcβ或上述糖基的氟代衍生物；
X选自：-CH2、-NH-、-O-、-C(O)-、-S-、或
Figure BDA0002392088330000062
之一；
连接体是糖肽与载体蛋白直接或间接连接后得到的结构部分；
n是载体蛋白连接的寡糖的数量，n是0到30中的任意一个整数；
载体蛋白选自：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血蓝蛋白(KLH)、破伤风毒素(TT)、白喉毒素(DT)或白喉毒素无毒突变体(CRM197)。
较优地，所述糖肽缀合物的结构通式为如下之一：
Figure 12
式中，j1是0到10中的任意一个整数，j2是0到10中的任意一个整数，j3是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
较优地，所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure 7
式中，j1是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
较优地，所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure 8
式中，j1是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
较优地，所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure 9
式中，j3是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
较优地，所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure 10
式中，j3是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
一种如上所述的氟代TF-MUC1糖肽缀合物的制备方法，包括如下技术路线：
Figure BDA0002392088330000081
氟代TF-MUC1糖肽片段是通过Fmoc保护的多肽固相合成方法实现，即通过活化树脂、加载氨基酸，脱除Fmoc保护基，根据需要重复第二和第三步骤多次，最后加载Linker部分，脱除Fmoc保护基，裂解，最终得到含保护基的糖肽，之后用水合肼脱除保护基，然后使用活泼酯活化糖肽，最后，将活化的糖肽与蛋白偶联制备出氟代TF-MUC1糖肽缀合物。
上述制备方法，只表示制备本发明的式(II)化合物的方法之一例子。本发明化合物的制备方法并不仅限于这些方法，在本说明书的实施例中，由于更具体地说明了本发明化合物的制备方法，所以，本领域的人员，根据上述说明和具体实施例的说明，根据需要，对此加以适当的修改，就能制造出氟代TF-MUC1糖肽缀合物。
具体地，本发明氟代TF-MUC1糖肽缀合物通用的一种合成方法，步骤如下：
(1)糖抗原的合成反应
取糖基供体(2.0个当量)，糖氨基酸受体溶于无水二氯甲烷，室温搅拌30min后将体系置于-20℃低温反应浴中，向其中滴加三氟甲磺酸三甲基硅酯(0.4个当量)，反应1h。经TLC检测显示反应完成，滴加三乙胺猝灭。经过滤，减压浓缩，硅胶柱层析分离纯化，得到中间体1(所用的洗脱液为石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA))。后续是对中间体1进行保护基转换操作，即将中间体1溶解于80％冰醋酸水溶液中，90℃反应4h，脱除苄叉保护基，随后在四氢呋喃/醋酐/冰醋酸(3:2:1，v/v/v)的混合溶液中，加入锌粉(15.0个当量)和饱和硫酸铜溶液，将叠氮基还原为氮乙酰基，之后，在吡啶/醋酐(50.0个当量)条件下将裸露的羟基进行乙酰化保护，最后以甲醇为溶剂，加入10％钯碳，通入氢气，常温反应1h，TLC监测反应完成后，过滤，减压浓缩，硅胶柱层析得到目标产物(所用的洗脱液为石油醚(PE) /乙酸乙酯(EA))。
(2)固相合成反应
首先，活化树脂阶段，取2-chlorotrityl chloride树脂(1.0个当量)于固相合成管中，室温真空干燥过夜，加入无水DCM，28℃，240r/min振摇30min，抽干；第二步，加载首个氨基酸，称取Fmoc保护的目标氨基酸(2.0个当量)，溶解于DCM中，超声溶解后加入固相合成管中，然后加入N,N-二异丙基乙胺(9.0个当量)。将固相合成管置于摇床(28℃， 240r/min)振摇3h，加入甲醇，继续振摇30min，过滤，用DMF/MeOH/DCM交替清洗树脂，最后将抽干，真空干燥；第三步，脱除Fmoc：向树脂中加入30％的吗啉(200.0个当量)，振摇30min后，抽干，重复该操作一次，然后取少量树脂于试管中，滴加茚三酮/苯酚显色剂，将试管置于120℃油浴中，5min后观察树脂颜色变化，若树脂全部变蓝色则表示反应完全。反应完成后用DMF/异丙醇/DMF依次清洗树脂，抽干；第四步，加载第二个氨基酸，称取 Fmoc保护的目标氨基酸(3.0个当量)、HBTU(3.0个当量)和HOBt(3.0个当量)，溶解于DMF中，后续操作同上述第二步和第三步；第五步，加载第三个糖氨基酸，称取步骤(1) 中制备的糖抗原(1.5个当量)、HATU(2.0个当量)和HOAt(2.0个当量)，溶解于NMP 中，加入N-甲基吗啉(4.0个当量)，后续操作同上述第二步和第三步；第六步，加载第四个和第五个氨基酸条件同第四步；第七步，加载Linker部分：加入Fmoc保护的Linker、HATU (3.0个当量)和HOAt(3.0个当量)，溶解于N-甲基吡咯烷酮中，加入N-甲基吗啉(6.0 个当量)，后续操作同上述第二步和第三步；最后一步，裂解反应：配制裂解液 (TFA:TIS:H2O＝15:0.9:0.9)，加入树脂中，振摇(34℃，240r/min)2h后，过滤，冷却，重结晶得到糖肽化合物。
(3)糖肽缀合物的制备
糖肽脱保护：取上述(2)中制备的糖肽化合物于小烧瓶中，加入一定体积的水合肼，室温条件下搅拌3h，反应完成后旋蒸浓缩，C18反相半制备柱纯化，得到脱保护的糖肽化合物。
活化糖肽：将脱保护的糖肽溶解于乙醇(EtOH)和水(H2O)的混合液中(EtOH：H2O＝1:1)，加入活泼酯(6.0个当量)，滴加饱和碳酸钠溶液调节反应液pH至8.0，室温反应3h。之后，浓缩，用C18反相半制备柱纯化，冻干，得到活化的糖肽。
糖肽蛋白缀合物的合成：按照48：1的摩尔比取活化的糖肽和蛋白(糖肽：蛋白＝48：1) 溶于缓冲溶液(0.07M Na2B4O7/0.035M NaHCO3，pH9.0)中，将混合液置于摇床上室温缓慢振摇2d。之后，经超滤，冻干，得到糖肽蛋白缀合物。
更具体地，相关制备及检测如下：
一、N-芴甲氧羰基-O-(2,3,4-三-O-乙酰基-6-脱氧-6F-β-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-4,6-二-O-乙酰-α-D-吡喃半乳糖基)-L-苏氨酸7的合成
Figure BDA0002392088330000101
Figure BDA0002392088330000111
首先，在50mL支口烧瓶中加入
Figure BDA0002392088330000112
分子筛，600℃下烘烤20min，待其冷却至室温后，称取氟代半乳糖糖基供体1(410mg，905.55μmol)，糖基受体2(320mg，452.78μmol) 加入到烧瓶中，加入10mL无水二氯甲烷，常温条件下搅拌30min后将体系置于-20℃中，向其中滴加三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf，35μL，181.11μmol)，-20℃反应1h。TLC (PE:EA＝2:1，Rf＝0.3)监测至反应结束后，滴加三乙胺猝灭促进剂，直至体系pH呈中性。利用带有硅藻土的砂板漏斗抽滤除去分子筛，旋蒸除去无水二氯甲烷，采用硅胶柱分离纯化，得到化合物3(340mg，341.02μmol，75％)。然后，将化合物3溶解于80％冰醋酸水溶液中，90℃油浴中反应脱除苄叉保护基，得到化合物4。随后在四氢呋喃/醋酐/冰醋酸(3:2:1， v/v/v)的混合溶液中，用锌粉将叠氮基还原为氮乙酰基，并在吡啶/醋酐条件下将裸露的羟基进行乙酰化保护，得到化合物6。最后以甲醇为溶剂，在10％钯碳及氢气流中进行氢解反应，脱除苏氨酸上的苄基。通过五步，以31％的总产率得到化合物7(如图1所示，126mg，137.12 μmol)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.81(d,J＝7.4Hz,2H),7.63(dd,J＝38.6,6.1Hz,2H), 7.43-7.28(m,4H),5.46-5.32(m,2H),5.00(d,J＝6.2Hz,2H),4.67(d,J＝6.8Hz,1H),4.52(m, 4H),4.41-4.30(m,2H),4.23(m,3H),4.13(dd,J＝11.4,4.5Hz,1H),4.07-3.87(m,3H),2.11(d,J ＝9.2Hz,6H),2.02(d,J＝10.0Hz,6H),1.97(s,3H),1.93(s,3H),1.22(d,J＝6.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ171.82,170.93,170.64,170.10,169.74,143.85,141.31,127.48,126.84,124.69,119.65,101.00,99.51,81.49,76.01,73.28,71.35,71.12,70.74,69.79,68.73,67.46,67.12, 66.22,62.78,58.46,21.88,19.58-18.96,17.78.19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-232.54(s).
二、氟代TF-MUC1糖肽8的固相合成
Figure BDA0002392088330000121
氟代TF-MUC1糖肽片段是通过Fmoc保护的多肽固相合成方法实现的。具体合成步骤如下：
(1)活化树脂：首先取2-chlorotrityl chloride resin(0.34mmol/g，100mg)于50mL固相合成管中，室温真空干燥过夜，然后向固相合成管中加入2mL无水DCM并将其置于摇床 (28℃，240r/min)振摇30min，最后将液体抽滤干净。
(2)加载首个氨基酸Fmoc-Pro-OH：称取Fmoc-Pro-OH(35.4mg,0.11mmol)于2mL 无水DCM中，超声溶解后加入盛有活化树脂的固相合成管中，然后再向其中慢慢加入N,N- 二异丙基乙胺(DIEA，52μL)。将固相合成管置于摇床(28℃，240r/min)振摇3h后，向反应混合液中加入甲醇(15μL)，继续振摇30min后，滤除反应液，依次用2mL DMF/MeOH/DCM交替清洗树脂，每次5min。最后将树脂抽干并真空干燥过夜。
(3)脱除Fmoc：向树脂中加入2mL 30％的吗啉，摇床振摇30min后抽干反应液，然后将该操作重复一次，反应结束后，取少量树脂于小试管中，滴加茚三酮/苯酚显色剂，将小试管置于120℃油浴中，5min后观察树脂颜色变化，若树脂全部变蓝则表示反应完全。反应完成后用DMF/异丙醇/DMF依次清洗树脂，清洗完后将树脂抽干。
(4)加载第二个氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH：称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(68.1mg,0.11mmol)、HBTU(39.8mg,0.11mmol)、HOBt(14.2mg,0.11mmol)于2mLDMF中，超声溶解后加入盛有树脂的固相合成管中，然后再向其中慢慢加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA， 35μL)。将固相合成管置于摇床(28℃，240r/min)振摇3h。反应结束后，取少量树脂于小试管中，通过上述显色反应观察树脂显色后若全部为白色则表示反应完全。反应完成后用 DMF/异丙醇/DMF依次清洗树脂，清洗完后将树脂抽干。脱除Fmoc操作同(3)。
(5)加载第三个氨基酸：称取先前合成的氟代TF抗原(47mg,0.05mmol)、HATU(30mg，0.08mmol)、HOAt(9.3mg，0.068mmol)于2mLNMP中，超声溶解后加入盛有树脂的固相合成管中，然后再向其中慢慢加入N-甲基吗啉(NMM，15μL)。将固相合成管置于摇床(28℃，240r/min)振摇18h。反应结束后，取少量树脂于小试管中，通过上述显色反应观察树脂显色后若全部为白色则表示反应完全。反应完成后用DMF/异丙醇/DMF依次清洗树脂，清洗完后将树脂抽干。脱除Fmoc操作同(3)。
(6)加载第四个氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH：称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(43.2mg，0.11 mmol)、HBTU(39.8mg，0.11mmol)、HOBt(14.2mg，0.11mmol)于2mLDMF中，其余操作同(4)。脱除Fmoc操作同(3)。
(7)加载第五个氨基酸Fmoc-Pro-OH：称取Fmoc-Pro-OH(35.4mg，,0.11mmol)、HBTU(39.8mg，,0.11mmol)、HOBt(14.2mg，,0.11mmol)于2mLDMF中，其余操作同(4)。脱除Fmoc操作同(3)。
(8)加载Linker：取Fmoc-NH-PEG3-CH2CH2COOH(45.2mg，0.102mmol)、HATU(38.8mg，0.102mmol)、HOAt(13.9mg，0.102mmol)于2mLNMP中，超声溶解后加入盛有树脂的固相合成管中，然后再向其中慢慢加入N-甲基吗啉(23μL，0.2umol)。将固相合成管置于摇床(28℃，240r/min)振摇3h。反应结束后，取少量树脂于小试管中，通过上述显色反应观察树脂显色后若全部为白色则表示反应完全。反应完成后用DMF/异丙醇 /DMF依次清洗树脂，清洗完后将树脂抽干。脱除Fmoc操作同(3)。
(9)裂解：配制裂解液(TFA:TIS:H2O＝15:0.9:0.9)10mL，取5mL裂解液加入树脂中，摇床振摇(34℃，240r/min)2h后，将反应液滤至冷却的乙醚中重结晶，然后将剩余的5mL裂解液再次加入树脂中反应2h，合并滤液于冷却的乙醚中，并将其于-20℃中静置2h。最后通过离心将乙醚中析出的白色固体收集到离心管中，并用氩气吹干得到糖肽化合物8(15mg， 10.6μmol，31％)。
三、氟代TF-MUC1糖肽缀合物的合成
Figure BDA0002392088330000141
取糖肽化合物8(15mg，10.6μmol)于10mL小烧瓶中，向其中加入2mL水合肼，室温条件下搅拌3h，反应完成后旋蒸浓缩，通过MALDI-TOF MS确定其分子量。C18反相半制备液相柱纯化得到脱乙酰化产物9(10mg，8.7μmol，82％)。
将化合物9(5mg，4.3μmol)溶于EtOH/H2O(2mL，1:1)中，随后缓慢加入方酸二乙酯(3.84μL，26.1μmol)，滴加饱和Na2CO3溶液至反应液pH为8.0。室温搅拌3h后，滴加冰醋酸猝灭反应。将反应液旋蒸浓缩，通过MALDI-TOF MS以DHB为基质确定其分子量。用C18反相半制备液相柱纯化，冻干得到产物10(4.9mg，3.8μmol，88％)。化合物10的分子量和纯度表征：MALDI-TOF MS：m/z for C47H79FN10O22[M+H]+calcd:1155.543,found: 1155.543，如图2所示。C18分析HPLC：流动相A：乙腈(含0.1％TFA)；流动相B：水；保留时间Rt＝10.5min(梯度洗脱30min，5-30％的流动相A，C-18column，λ＝220nm)，如图3所示。
取蛋白BSA(3.2mg，0.048μmol)溶于0.5mL缓冲液(Na2B4O7 0.07 mol/L，KHCO30.035 mol/L，pH9.0)中，加入化合物10(3mg，2.3μmol)，将混合液置于摇床上室温缓慢振摇2 d。反应结束后超滤，冻干，得到白色固体，即为氟代TF-MUC1糖肽缀合物V1(氟代 TF-MUC1-BSA，2.9mg)。通过MALDI-TOF MS确定糖肽与蛋白结合量，如图4所示。
四、氟代TF-MUC1糖肽缀合物的免疫原性测定
取6-8周Balb/c小鼠，每组四只，实验组小鼠分别用步骤三中制备的代TF-MUC1糖肽缀合物V1和同样方法制备的对照品V2(TF-MUC1-BSA)的溶液进行颈部皮下注射，每只小鼠每次免疫注射1μg糖肽(50μLPBS+50μL弗氏佐剂的乳化液)，免疫三次，每次免疫间隔两周，第一次免疫用完全弗氏佐剂，后两次免疫用不完全弗氏佐剂。第三次免疫后两周(第 42天)，分别对实验组和空白组小鼠进行眼球取血，随即将血液2500rpm/min离心两次，每次10分钟，收集上层血清于EP管中，-20℃保存。
制备抗血清研究其免疫原性，用对照品糖肽的OVA缀合物作为固定抗原，以酶联免疫法 (ELISA)检测糖肽特异性抗体的滴度，免疫滴度的结果如图5所示。经过免疫后，小鼠血清中IgG抗体滴度水平显著增高，免疫应答强烈，而且显示出剂量依赖性，说明缀合物诱导产生的免疫响应主要是IgG型，属于T细胞参与的免疫应答，此应答能够使宿主细胞产生免疫记忆，促进抗体成熟。动物免疫实验结果表明氟代TF-MUC1糖肽缀合物是一种非常有潜力的肿瘤疫苗。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (9)

1.一种氟代TF-MUC1糖肽缀合物，其特征在于：所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure FDA0002392088320000011
其中，糖肽是如下通式(I)中的任一糖肽：
Figure FDA0002392088320000012
式(Ⅰ)和式(Ⅱ)中：
m是0到30中的任意一个整数；
R＝GalNAcα，GalNAcβ，GlcNAcα，GlcNAcβ，Galβ1-3GalNAcα，Galβ1-3GalNAcβ或上述糖基的氟代衍生物；
X选自：-CH2、-NH-、-O-、-C(O)-、-S-、或
Figure FDA0002392088320000013
之一；
连接体是糖肽与载体蛋白直接或间接连接后得到的结构部分；
n是载体蛋白连接的寡糖的数量，n是0到30中的任意一个整数；
载体蛋白选自：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、破伤风毒素、白喉毒素或白喉毒素无毒突变体。
2.根据权利要求1所述的氟代TF-MUC1糖肽缀合物，其特征在于：所述糖肽缀合物的结构通式为如下之一：
Figure 6
式中，j1是0到10中的任意一个整数，j2是0到10中的任意一个整数，j3是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
3.根据权利要求1或2所述的氟代TF-MUC1糖肽缀合物，其特征在于：所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure 5
式中，j1是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
4.根据权利要求1或2所述的氟代TF-MUC1糖肽缀合物，其特征在于：所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure 2
式中，j1是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
5.根据权利要求1或2所述的氟代TF-MUC1糖肽缀合物，其特征在于：所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure 3
式中，j3是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
6.根据权利要求1或2所述的氟代TF-MUC1糖肽缀合物，其特征在于：所述糖肽缀合物的结构通式如下：
Figure 4
式中，j3是0到10中的任意一个整数，n是0到30中的任意一个整数。
7.一种如权利要求1至6任一项所述的氟代TF-MUC1糖肽缀合物的制备方法，其特征在于：包括如下技术路线：
Figure FDA0002392088320000032
8.如权利要求1至6任一项所述的氟代TF-MUC1糖肽缀合物在制备疫苗方面中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述疫苗为肿瘤疫苗。
CN202010118019.1A 2020-02-26 2020-02-26 一种氟代tf-muc1糖肽缀合物及其制备方法和应用 Withdrawn CN111423514A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010118019.1A CN111423514A (zh) 2020-02-26 2020-02-26 一种氟代tf-muc1糖肽缀合物及其制备方法和应用
US17/007,805 US20210260204A1 (en) 2020-02-26 2020-08-31 Fluoro-tf-muc1 glycopeptide conjugate, preparation method and application thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010118019.1A CN111423514A (zh) 2020-02-26 2020-02-26 一种氟代tf-muc1糖肽缀合物及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111423514A true CN111423514A (zh) 2020-07-17

Family

ID=71547199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010118019.1A Withdrawn CN111423514A (zh) 2020-02-26 2020-02-26 一种氟代tf-muc1糖肽缀合物及其制备方法和应用

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20210260204A1 (zh)
CN (1) CN111423514A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114306586A (zh) * 2022-01-04 2022-04-12 天津科技大学 基于tf抗原和壳寡糖内源性佐剂的肿瘤疫苗、方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AN XIAO等: "Synthesis and immunological evaluation of MUC1 glycopeptide conjugates bearing N-acetyl modified STn derivatives as anticancer vaccines.", 《ORG. BIOMOL. CHEM.》 *
DONELLA M. BECKWITH等: "Tumor-associated O-glycans of MUC1: Carriers of the glyco-code and targets for cancer vaccine design", 《SEMINARS IN IMMUNOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114306586A (zh) * 2022-01-04 2022-04-12 天津科技大学 基于tf抗原和壳寡糖内源性佐剂的肿瘤疫苗、方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20210260204A1 (en) 2021-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Danishefsky et al. From the laboratory to the clinic: a retrospective on fully synthetic carbohydrate‐based anticancer vaccines
Grigalevicius et al. Chemoselective assembly and immunological evaluation of multiepitopic glycoconjugates bearing clustered Tn antigen as synthetic anticancer vaccines
Kuduk et al. Synthetic and immunological studies on clustered modes of mucin-related Tn and TF O-linked antigens: The preparation of a glycopeptide-based vaccine for clinical trials against prostate cancer
Wang et al. Novel template-assembled oligosaccharide clusters as epitope mimics for HIV-neutralizing antibody 2G12. Design, synthesis, and antibody binding study
JP5484668B2 (ja) モノクローナル抗体ｍｂｒ１によって同定される乳ガン関連抗原の合成及びこれらの使用
RU2141527C1 (ru) Синтетический пептид, синтетический липопептид, иммуногенный конъюгат (варианты), способ получения олигомера, защищенный твердым монометиловым эфиром полиэтиленгликоля полисахарид
US6645935B2 (en) Synthesis of glycoconjugates of the lewis Y epitope and uses thereof
US20070134259A1 (en) Methods and compositions for pharmacologially controlled targeted immunotherapy
US20040102607A1 (en) Trimeric antigenic O-linked glycopeptide conjugates, methods of preparation and uses thereof
Xiao et al. Synthesis and immunological evaluation of MUC1 glycopeptide conjugates bearing N-acetyl modified STn derivatives as anticancer vaccines
CN103108654A (zh) 多价糖肽构建体及其用途
WO2006017180A2 (en) Glycopeptide dimers and uses thereof
Zheng et al. Improvement of the immune efficacy of carbohydrate vaccines by chemical modification on the GM3 antigen
WO1996040198A1 (en) Synthesis of asparagine-linked glycopeptides on a polymeric solid support
Wu et al. Synthesis and immunological evaluation of the unnatural β-linked mucin-1 Thomsen–Friedenreich conjugate
JP2006514981A (ja) Ｇｐ１２０特異抗原、その結合体；その調製と使用のための方法
EP1210355B1 (en) Glycoconjugates, glycoamino, acids, intermediates thereto, and uses thereof
CN111423514A (zh) 一种氟代tf-muc1糖肽缀合物及其制备方法和应用
CN113995834A (zh) 一种基于环糊精接枝壳聚糖的疫苗、制备方法及应用
Hevey et al. Conjugation Strategies Used for the Preparation of Carbohydrate‐Conjugate Vaccines
WO2011153815A1 (zh) 唾液酸(α-(2→6))-D-吡喃糖衍生物及其合成方法和应用
Fujita et al. Synthesis and immunological evaluation of self-adjuvanting glycolipopeptide vaccine candidates
US20080213297A1 (en) Method of producing conjugate vaccines
WO2002032963A1 (en) Immunoadjuvant systems
Fiore et al. Chemical synthesis of carbohydrate-based vaccines against cancers

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20200717