WO2011153815A1 - 唾液酸(α-(2→6))-D-吡喃糖衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents

唾液酸(α-(2→6))-D-吡喃糖衍生物及其合成方法和应用 Download PDF

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叶新山
杨帆
郑秀静
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Definitions

  • the present invention relates to a saccharide conjugate, and more particularly to a sialic acid (cc - (2 ⁇ 6) ) - D-aminopyranose derivative and a conjugate formed from the derivative with a protein or a polypeptide, and the above compound
  • the present invention also relates to the use of these compounds in the preparation of antitumor drugs, and belongs to the field of antitumor saccharide vaccines. Background technique
  • anti-tumor vaccines based on carbohydrate antigens have become a research hotspot (Keding, S. Carbohydrate vaccines. Chem. Eng. News. 2004, 82, 31-35.).
  • the antigen STn is a disaccharide structure containing sialic acid, which is expressed in human breast cancer, colorectal cancer, ovarian cancer, prostate cancer, and rarely expressed in normal tissues (Holmberg, L. Expert Rev. Vaccines 2004, 3, 655-663. ), thus becoming an important point in tumor immunotherapy.
  • Biomira Canada developed the STn-KLH (keyhole limpet hemocyanin) conjugate Theratope® (later acquired by Merk) for the prevention of colorectal cancer and breast cancer metastasis.
  • STn-KLH keyhole limpet hemocyanin conjugate Theratope®
  • Thera tope® alone did not improve disease progression time and overall survival, but only when combined with hormones, can improve disease progression time by 5.8 hormones alone.
  • the month increased to 8.3 months. Since the antitumor activity of Theratope® is dependent on the presence of hormones, its antitumor activity is compromised (Holmberg, L. Expert Rev. Vaccines 2004, 3, 655-663.).
  • Theratope® Similar to the difficulties encountered with Theratope®, the common problem with anti-tumor glucose vaccines today is that vaccines do not produce a satisfactory immune response in vivo.
  • the most common method currently used is to couple sugar antigens to carrier proteins, but One method is not very effective for tumor antigens, and Theratope® is one such example. Summary of the invention
  • the first technical problem to be solved by the present invention is to overcome the defects of low immunological activity commonly existing in anti-tumor saccharide vaccines, and to provide new tumor-associated saccharide antigen-modifying substances, thereby providing a kind of sugar having better activity for tumor treatment- Protein (polypeptide) conjugate.
  • Another technical problem to be solved by the present invention is to provide a method of synthesizing the above saccharide-protein (polypeptide) conjugate.
  • the technical problem to be solved by the present invention is achieved by the following technical solutions:
  • the present invention first provides a sialic acid ( ct - (2 ⁇ 6) ) - D-aminopyranose derivative, the structural formula of which is represented by the formula (I):
  • R (e) selected from the group consisting of an amide group, -NH 2 , - ⁇ or - OH; preferably, the amide group is selected from -NH C (0) CH x C l y ,
  • - NHC (0) C3 ⁇ 4F y -NHC (0) CH,Br y , -NHC (0) H , - NHC (0) C a H 2a+1 , — NHC (0) C a H 2a 0H , - NHC (0) C b H 2b-1 , -NHC (0) C b H 2b — 3 ; wherein x or y is selected from 0, 1, 2 or 3, and x+y is equal to 3; a is selected from 1 to 20 Any integer in the formula; b is selected from any of 2 to 20;
  • R 2 is selected from the group consisting of an amide group, -NH 2 , -N 3 or -OH; preferably, the amide group is selected from -NH C (0) CH p C l q , — NHC (0) CH P F , - NHC (0) CH p Br q , — NHC (0) H , — NHC (0) C a H 2a+1 , — NHC (0) C a H 2a 0H , - NHC (0) C b H 2b-1 , -NHC (0) C b H 2b-3 ; wherein p or q is selected from 0, 1, 2 or 3, and p + q is equal to 3; a is selected from any of 1 to 20; b is selected from 2 Any integer up to 20;
  • R 3 is selected from -C0 2 H, -CH 2 0H, -C0 2 M, -C(0)NHOH or hydrogen, wherein M is an alkyl group, an aryl group or a heterocyclic ring; 3 has a spatial orientation of a flat bond or an upright key;
  • R 4 is selected from a substituent having a double bond, an acetylenic bond, an azide, an aldehyde group, a protective acetal, a maleimide group, a fluorenyl group, a protective sulfhydryl group, a seleno group, a protected seleno group, - 13 ⁇ 4 or -0NH 2
  • R 4 is an allyl group
  • R 5 is 0H, and its spatial orientation is an upright key or a flat key
  • R 6 is selected from hydrogen or ⁇ -galactosyl
  • a glycoprotein (polypeptide) conjugate is obtained by conjugating a compound represented by the formula (I) to a polypeptide or a protein.
  • a compound represented by the formula (I) to a polypeptide or a protein.
  • base addition salts of the compounds of the invention may be prepared, and such salts are included in the present invention.
  • the base addition salt of the compound of the present invention is preferably pharmaceutically acceptable, forming a non-toxic salt with a suitable base (e.g., sodium hydrogencarbonate, potassium hydrogencarbonate, aqueous ammonia), in addition to a pharmaceutically acceptable salt, other salts Also included in the present invention.
  • a suitable base e.g., sodium hydrogencarbonate, potassium hydrogencarbonate, aqueous ammonia
  • the glycoprotein (polypeptide) conjugate of the present invention as an antitumor vaccine produces a strong immune response in mice, and the titer of the glycoprotein (polypeptide) conjugate antibody of the present invention is increased as compared with Thera tope®. Between 3 and 20 times, the ratio of IgG/I gM has also increased by a factor of 2 to 14.
  • Another technical problem to be solved by the present invention is to provide a process for producing a compound represented by the following formula (I).
  • the compound is used as a raw material, and is subjected to an acylation reaction with a hydrazine, a carboxylic acid or a carboxylic acid ester in a solvent under the action of a reaction assistant to obtain a disaccharide compound having a structure represented by the formula (I).
  • the starting material comprises allyl 4- 0-(5-amino-3,5-dideoxypyranylneuraminyl)-2-acetamido-2-deoxy- ⁇ - ⁇ pyran Glycoside, allyl 4-0 ⁇ (5-acetylamino-3,5-dideoxy- ⁇ - ⁇ pyranyl-neuraminyl)-2-amino-2-deoxy- ⁇ - ⁇ pyran Lactosyl or allyl (5-amino-3, 5-dideoxy- ⁇ - ⁇ ""pyranyl-neuraminic acid”-2-amino-2-deoxy- ⁇ - ⁇ -galactopyranoside;
  • the acid anhydride includes an acid anhydride of a fatty acid, and the aliphatic chain may have a substituent of a fluorine atom or a chlorine atom; preferably, the acid anhydride includes acetic anhydride, propionic anhydride, n-butyric anhydride, isobutyric anhydr
  • the reaction auxiliary agent may be an organic base or an inorganic base
  • the solvent may be water or an organic solvent.
  • Still another technical problem to be solved by the present invention is to provide a method of synthesizing a glycoprotein (polypeptide) conjugate, comprising:
  • the present invention synthesizes sialic acid (ot - (2 ⁇ 6) ) -D-aminopyranose derivative represented by formula (I) using D-galactosamine (glucose) and sialic acid as raw materials, and Coupling with a carrier protein or polypeptide yields a glycoprotein (polypeptide) conjugate.
  • the structure of the compound of the present invention uses a derivatized acyl group instead of an acetyl group, has a novel structure, and exhibits excellent activity in an antitumor vaccine.
  • Mouse experiments have shown that, by structure-derived, saccharide-based vaccines produce more efficient immune responses, producing more antibodies, and IgG/IgM is also evident.
  • STn antigen is expressed on a variety of tumors, such as human breast cancer, colorectal cancer, ovarian cancer, prostate cancer, the scope of application of the present invention is broad.
  • Fig. 1 shows the structural formula of the N-acyl modified sialic acid ( ⁇ -(2 ⁇ 6))-D-aminopyranose derivative of the present invention.
  • Figure 2 is a molecular structural formula of the compounds 1-42 and 61-64 of the present invention.
  • Figure 3 shows the structure of the compound 43-60 of the present invention and the synthetic route of some of the compounds
  • Figure 4 is a synthetic route diagram of compounds 60 and 53.
  • Figure 5 N acylation route of the invention; i) the corresponding anhydride, MeOH, NaHC0 3 ; or ii) the corresponding oxime ester, TEA, MeOH; or iii) the corresponding carboxylic acid, HBTU, DMF.
  • Example 1 Synthesis of Compound 2
  • Compound 48 (for its synthesis, see Example 42) (100 mg, 0.119 mmol) was dissolved in 10 mL of methanol, and NaOMe/MeOH solution (30%, 0.02 g, 0.11 mmol) was added and stirred at room temperature for 0.5 hour. After the reaction system was adjusted to pH 3 with 1N HCl / MeOH, the mixture was concentrated in vacuo. The primary product was passed through a P-2 column and eluted with water. Get pure. The yield was 95%.
  • Compound 14 is used as raw material (10-15 mg, 0.02-0.03 mmol), and HBTU (benzotriazole-oxime, hydrazine, ⁇ ', ⁇ '-tetradecylurea hexafluorophosphate) (each amino group 1) 3 equivalents of HBTU), monochloroacetic acid (2-4 equivalents of monochloroacetic acid per amino group) Dissolved in 2 mL of DMF under nitrogen and stirred at room temperature. Further add DIPEA (N, N-diisopropylethylamine) (13 equivalents to the starting material), the reaction is detected by TLC until the starting material is completely consumed (generally 1-4 hours).
  • DIPEA N, N-diisopropylethylamine
  • Compound 39 (the preparation method is shown in Example 38) (18.0 rag, 0.032 mmol) was dissolved in 5 mL of methanol, and 50% aqueous NH 2 0H (0.5 raL, 7.57 mmol) and KCN (1.0 mg, 0.016 raraol) were added. Stir at room temperature for 20 hours. The reaction solution was concentrated under vacuum, and the residue was passed through a C18 column, and then passed to a column, and eluted with water. Get pure. The yield was 50%.
  • Compound 48 (the preparation method is shown in Example 42) (100 mg, 0.119 mmol) was dissolved in 10 mL of methanol, and NaOMe/MeOH solution (30%, 0.02 g, 0.11 mmol) was added and stirred at room temperature for 4 hours. After the reaction system was adjusted to pH 6 with IN HCl / MeOH, the mixture was concentrated in vacuo. The primary product was passed through a C18 column and the water/sterol eluted. Get pure. Yield 95%.
  • the hapten (Compound 2, 10 mg) was dissolved in 2 ml of anhydrous methanol, and ozone-containing air was introduced at 72 ° C. When the system turned blue (about 10-30 minutes), the ozone was stopped. After 10 minutes, the system is still blue. Nitrogen gas was introduced into the reaction system for about 10 minutes to remove excess ozone. 0.5 ml of ruthenium ketone was added dropwise, and then the temperature of the reaction system was naturally raised to room temperature. After 2 hours, the solvent was removed under vacuum to obtain a hapten containing an aldehyde group.
  • glycoprotein conjugate STn-KLH was obtained.
  • the compounds 3-14, 16-24, 29-34, 42 prepared in Examples 3-47 of the present invention are coupled with a carrier protein (polypeptide) to obtain respective protein (polypeptide) conjugates.
  • a carrier protein polypeptide
  • the compounds 3-14, 16-24, 29-34, 42 prepared in Examples 3-47 of the present invention are coupled with a carrier protein (polypeptide) to obtain respective protein (polypeptide) conjugates.
  • a carrier protein polypeptide
  • Test compound glycoprotein (polypeptide) conjugate prepared in Example 49 of the present invention.
  • the titer of the mixed serum of each group of mice, and the serum titer of each mouse of the conjugates of 20, 31 and 21 were detected by ELISA.
  • washing and blocking Add 200 ul of washing buffer PBS-Tween20 (0.05%) to each well, wash the plate, wash 3 times, then add 200 ul of blocking solution (3% BSA-PBS) per well, 37 °C, 1 hour.
  • Antibody titer against STn in mouse serum was determined 13 days after the third immunization IgG IgM immunized with STn-KLH 50, 144 5763 immunized with 3-KLH ⁇ 2500 ⁇ 1000 immunized with 4-KLH 17, 040 1604 immunized With 5-KLH 38, 878 1872 immunized with 6-KLH ⁇ 2500 ⁇ 1000 immunized with 7-KLH 23, 279 4706 immunized with 8-KLH 43, 201 4963 immunized with 9-KLH 4714 2897 immunized with 10-KLH 55, 004 ⁇ 1000 immunized with 11- LH 4054 ⁇ 1000 immunized with 12-KLH 11, 783 ⁇ 1000 immunized with 13-KLH 24, 12 ⁇ 1000 immunized with 14-KLH ⁇ 2500 ⁇ 1000 immunized with 16-KLH ⁇ 2500 2571 immunized with 17

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Description

唾液酸（ α - (2→ 6) ) -D-吡喃糖^■生物及其合成方法和应用 技术领域
本发明涉及糖类缀合物， 尤其涉及唾液酸（ cc - (2→ 6) ) -D-氨基吡喃糖衍生物以 及由该衍生物与蛋白质或多肽所形成的缀合物以及上述化合物的合成方法， 本发明 还涉及这些化合物在制备抗肿瘤药物中的用途， 属于抗肿瘤糖疫苗领域。 背景技术
近年来，基于糖抗原的抗肿瘤疫苗成为一个研究的热点 （ Keding, S. Carbohydrate vaccines. Chem. Eng. News. 2004, 82, 31-35. ) 。 其中抗原 STn 是一个含有唾液酸的二糖结构， 在人类乳腺癌、 结直肠癌、 卵巢癌、 前列腺癌多有 表达， 而在正常组织中表达极少 ( Holmberg, L. Expert Rev. Vaccines 2004, 3, 655-663. ) , 因而成为肿瘤免疫治疗的重要耙点。 加拿大 Biomira公司以此为基础 研发了 STn- KLH (钥孔虫威血蓝蛋白） 偶联物 Theratope® (后来被 Merk收购） ， 用 于预防结直肠癌和乳腺癌转移。 但是在进行 III期临床试验时发现单独应用 The ra tope®不能改善疾病进展时间和总体存活率， 而仅当将其和激素合用时才可以 改善疾病进展时间， 使其由单独应用激素的 5.8个月提高到 8.3个月。 由于 Theratope®的抗肿瘤活性依赖于激素的存在，使其抗肿瘤活性打了折扣（ Holmberg, L. Expert Rev. Vaccines 2004, 3, 655-663. ) 。 和 Theratope®遇到的困难类似， 现在抗肿瘤糖疫苗遇到的普遍问题就是疫苗不能在体内产生满意的免疫应答， 目前 采用的最普遍的方法是将糖抗原偶联在载体蛋白上， 但这种方法对于肿瘤抗原并不 太有效， Theratope®就是这样的一个例子。 发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服抗肿瘤糖疫苗所普遍存在的免疫活性 较低等缺陷， 提供新的肿瘤相关糖抗原修饰物， 从而提供一类对于肿瘤的治疗具有 较好活性的糖 -蛋白 （多肽）缀合物。
本发明所要解决的另一技术问题是提供一种合成上述糖 -蛋白 （多肽） 缀合物 的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的： 本发明首先提供了唾液酸（ ct - (2→ 6) ) -D-氨基吡喃糖衍生物， 其结构式为式 ( I )所示：
Figure imgf000003_0001
式（ I ) R,选自酰胺基、 - NH2、 - ^或- OH; 优选的， 所述的酰胺基选自 -NH C (0) CHxC ly、
- NHC (0) C¾Fy 、 -NHC (0) CH,Bry 、 -NHC (0) H 、 - NHC (0) CaH2a+1 、 — NHC (0) CaH2a0H 、 - NHC (0) CbH2b-1、 - NHC (0) CbH2b—3; 其中， x或 y选自 0、 1、 2或 3， 且 x+y等于 3; a 选自 1至 20中的任一整数； b选自 2至 20中的任一整数；
R2选自酰胺基、 - NH2、 - N3或 -OH; 优选的， 所述酰胺基选自- NH C (0) CHpC lq、 — NHC (0) CHPF 、 - NHC (0) CHpBrq 、 — NHC (0) H 、 — NHC (0) CaH2a+1 、 — NHC (0) CaH2a0H 、 - NHC (0) CbH2b-1、 -NHC (0) CbH2b-3; 其中， p或 q选自 0、 1、 2或 3 , 且 p+q等于 3; a 选自 1至 20中的任一整数； b选自 2至 20中的任一整数；
R3选自- C02H、 - CH20H、 - C02M、 - C (0) NH0H或氢， 其中， M为烷基、 芳基或杂环； 3的空间取向为平伏键或直立键；
R4选自带有双键、 炔键、 叠氮、 醛基、 保护缩醛、 马来酰亚胺基、 巯基、 保护 巯基、 硒基、 保护硒基、 - 1¾或- 0NH2的取代基； 优选的， R4是烯丙基；
R5为 0H, 其空间取向为直立键或者平伏键；
R6选自氢或 β -半乳糖基；
将式（ I )所示的化合物与多肽或蛋白质相缀合就得到糖蛋白 （多肽）缀合物。 当然， 可以制备本发明化合物碱加成的盐， 这些盐包括在本发明之中。
本发明化合物的碱加成盐优选为药学上可接受的，与适当的碱（例如碳酸氢钠， 碳酸氢钾， 氨水）形成无毒的盐， 除了药物上可接受的盐以外， 其它的盐也包括在 本发明之中。
将本发明糖蛋白 （多肽）缀合物作为抗肿瘤疫苗， 在小鼠体内产生了很强的免 疫应答， 与 Thera tope®相比， 本发明糖蛋白 （多肽）缀合物抗体的滴度增加了 3倍 到 20倍， IgG/ I gM的比值也增加了 2倍到 14倍。 本发明所要解决的另一技术问题是提供一种制备下述式（ I ) 所示化合物的方 法。
本发明所要解决的另一技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种制备上述式 （ I )所示结构的二糖化合物的方法， 包括以下步骤： 以唾液酸 5-位氨基棵露和 /或氨基半乳糖（葡糖糖） 的 2-位氨基棵露的化合物 为原料， 在反应助剂作用下， 在溶剂中与酸酑、 羧酸或羧酸酯进行酰化反应， 即得 到通式（ I )所示结构的二糖化合物。
优选的， 所述原料包括烯丙基 4- 0- (5-氨基 -3， 5-二去氧 吡喃神经氨酸 基） -2-乙酰氨基- 2-去氧- α -^吡喃半乳糖苷， 烯丙基 4-0~ (5-乙酰氨基-3，5-二去 氧- α -^吡喃神经氨酸基） -2-氨基 -2-去氧- α -^吡喃半乳糖苷或烯丙基 (5- 氨基 -3, 5-二去氧- α -ί>"吡喃神经氨酸基） -2-氨基 -2-去氧- α -^吡喃半乳糖苷； 其中， 所述酸酐包括脂肪酸的酸酐， 其脂肪链上可以含有氟原子或氯原子的取 代基； 优选的， 所述的酸酐包括乙酸酐、 丙酸酐、 正丁酸酐、 异丁酸酐或正己酸酐； 所述羧酸包括脂肪酸的羧酸， 其脂肪链上可以含有氟原子或氯原子的取代基； 优选的， 所述的羧酸包括单氟乙酸、 二氟乙酸、 三氟乙酸、 单氯乙酸或二氯乙酸； 所述羧酸酯包括脂肪酸的羧酸酯， 其脂肪链上可以含有氟原子、 氯原子和溴原 子的取代基； 优选的， 所述羧酸酯包括单氟乙酸甲酯、 二氟乙酸甲酯、 三氟乙酸曱 酯或二氯乙酸曱酯。
所述反应助剂可以采用有机碱或无机碱；
所述溶剂可以是水或是有机溶剂。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种合成糖蛋白 （多肽）缀合物的方 法， 包括：
( 1 )将式（ I )所示的二糖化合物经臭氧氧化得到含有醛基的二糖； （ 2 )将 步骤（1 ) 所得到的产物在还原胺化的条件下与载体蛋白质或多肽进行偶联,就得到 了二糖缀合物。
本发明以 D-氨基半乳糖（葡萄糖）和唾液酸为原料， 合成了式（ I )所示的唾 液酸（ot - (2→6) ) -D-氨基吡喃糖衍生物， 并将其与载体蛋白质或多肽进行偶联， 得 到了糖蛋白 （多肽） 缀合物。 本发明化合物的结构中用衍生的酰基代替了乙酰基， 结构新颖，在抗肿瘤疫苗方面表现出了很好的活性。小鼠实验表明， 通过结构衍生， 基于糖抗原的疫苗能够产生更有效的免疫反应，产生更多的抗体， IgG/IgM也明显的 提高， 这些抗体特异地识别表达 STn的肿瘤细胞， 从而达到对抗肿瘤的作用。 由于 STn 抗原表达在多种肿瘤上， 例如在人类乳腺癌、 结直肠癌、 卵巢癌、 前列腺癌， 所以本发明应用的范围是广泛的。 附图说明
图 1 本发明 N-酰基修饰的唾液酸（α- (2→ 6))- D-氨基吡喃糖衍生物的结构 式。
图 2 本发明化合物 1-42和 61-64的分子结构式。
图 3 本发明化合物 43-60的结构及部分化合物的合成路线；
合成抗原的路线图。 试剂和条件： (a-b) UL United States Patent 60i n ); (c) 强酸性阳离子树脂， 甲醇， 回流， 97%; (d) TMSOTf, -72 °C ， THF, 对 48 (46+47): 84%, α/ β=1/1.2; 对 52 (46+51): 81%, α/ β =2.6/1; 对 54 (47+53): 58%, 纯 α 构型； (e) i) NaOMe/MeOH; ii) IN NaOH; iii) 2N NaOH, 90 °C; (f) 酰化反 应； （g) NaOMe/MeOH, 然后 2N NaOH, 86%; (h) i) NaOMe/MeOH, 然后 IN NaOH; ii) H2S/吡啶 /三乙胺， 67%; (i) 对 37, NH20H, KCN, THF, 50%; (j) 对 38, NaBH4 , MeOH, 94%。
图 4 化合物 60和 53的合成路线图。
图 5 本发明 N酰化路线； i) 相应的酸酐， MeOH, NaHC03; 或 ii) 相应的曱酯， TEA, MeOH; 或 iii) 相应的羧酸， HBTU, DMF。
图 6 本发明糖蛋白（多肽）缀合物第三次免疫之后 13天测定小鼠血清与肿瘤 细胞的结合。 具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明 , 本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。 但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。 本 领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 实施例 1 化合物 2的合成 化合物 48 (其合成见实施例 42 ) (100 mg, 0.119 mmol) 溶于 10 mL曱醇中， 加入 NaOMe/MeOH溶液 （30%, 0.02 g, 0.11 mmol) , 室温搅拌 0.5小时。 反应体系 用 IN HCl/MeOH调 PH至 3后， 反应液在真空下浓缩。 初产物过 P- 2柱， 水洗脱。 得到纯品。 收率 95%。
'H-NMR (400 MHz, D20) δ 5.90—5.77 (m, 1Η), 5.22 (dd, 1H, J; = 1.6 Hz,
J2 = 17.6 Hz), 5.14 (d, 1H, / = 10.4 Hz), 4.75 (d, 1H, / = 3.6 Hz, a eric H of GalNAc), 4.15 (dd, 1H, = 4.0 Hz, J2 = 13.6 Hz), 4.05 (dd, 1H, = 4.0 Hz, J2 = 10.8 Hz), 3.96-3.87 (m, 3H) , 3.82-3.74 (m, 5H) , 3.60—3.48 (m, 4H), 3.46 (dd, 1H, /, = 1.6 Hz, = 8.8 Hz), 2.59 (dd, 1H = 4.4 Hz, J2 = 12.4 Hz, siaH-3eg), 1.91 (s 6H) , 1.56 (t, 1H /= 12.4 Hz, s iaH- 3aAr) ; 13C- NMR (75 MHz, D20) 175.59, 175.16, 173.99, 134.221, 118.64, 100.94, 96.79, 73.14, 72.33, 70.09, 69.28 69.05, 68.80, 68.12, 64.32 63.17, 52.42, 50.42, 40.83, 22.59, 22.47; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C22H36N2Na014] +, 575.2059; found, 575.2050 实施例 1 化合物 3的合成
将化合物 14 (烯丙基 4- (5-氨基- 3, 5-二去氧 -α- 吡喃神经氨酸基） -2- 乙酰氨基 -2-去氧 -α-i) "吡喃半乳糖苷， 其合成见实施例 13)作为反应原料 10 mg, 溶于 1 mL曱醇， 加入 2-3 mg NaHC03, 冰浴下加入一滴对应的酸酐（丙酸酐， 约 5 μ 1 ) , 搅拌一小时后， 再加入一滴酸秆， TLC显示大部分原料完成转化。反应过夜， 逐渐升至室温。 TLC显示反应完全。 加强酸性树脂中和 NaOH, 抽滤， 浓缩溶剂后， 过 Bioge卜 P2柱， 水洗脱。 再过 C18柱， 水-水 /曱醇洗脱。 得到产品 8- 9mg。 （收 率 75-85%) 。
NMR (500MHz, D20) δ 6.02-5.96 (m, 1H), 5.35 (dq, 1H, J=l.5 Hz, 16.5 Hz), 5.29-5.24 (m 1H), 4.93 (d 1H, J=3.5 Hz, anomeric H of GalNAc), 4.21 (ddt, 1H, ]1 = J2 =1.5 Hz, J3 = 5.5 Hz, J4 = 13.0 Hz), 4.15 (dd, 1H, ]l =3.5 Hz, J2 =11.0 Hz), 4.08 (dd, 1H, =5.0 Hz, J2 =8.0 Hz) , 4.04-4.00 (m, 2H) , 3.93-3.80 (m, 5H) , 3.71—3.61 (m, 4H) , 3.56 (dd, 1H, J^l.5, J2=9.0 Hz) , 2.73 (dd, 1H, J, =5.0 Hz, J2 =12.5 Hz, siaH-3eq), 2.28 (q, 2H, J=12.5 Hz), 1.69 (t 1H = 2=12.5 Hz, siaH— 3ax 1.12 (t, 3H, J=8.0 Hz) 13C-NMR(75 MHz, D20) δ 179.58, 175.13, 173.98, 134.19， 118.63, 100.91, 96.76, 73.15, 72.31, 70.08, 69.26, 69.03, 68.80, 68.68, 68.09, 64.29, 63.13, 52.27， 50.40， 40.88, 29.80, 22.46， 10.08; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C23H38N2Na014] +， 589.2215; found, 589.2223 实施例 3 化合物 4 的合成
由化合物 14和正丁酸酐制备，具体操作步骤同化合物 3的合成。（收率 75-85% )。 'H-NMR (500MHz, D20) δ 6.02—5.96 (m, IH), 5.35 (ddd, IH, J,=l.5 Hz, J2=3.0 Hz, J3=17.0 Hz), 5.26 (dd, IH, J,=l.0 Hz, J2=3.0 Hz, J3=10.5 Hz), 4.92 (d, IH, J=3.5 Hz, anomeric H of GalNAc), 4.22 (ddt, IH, J,= J2=l.5 Hz, J3=5.5 Hz, J4=13.0 Hz), 4.15 (dd, IH, J, =3.5 Hz, J2 =11.0 Hz), 4.06 (dd, IH, Jt =4.0 Hz, J2 =8.0 Hz), 4.04-4.00 (m, 2H) , 3.93—3.80 (m, 5H) , 3.71-3.61 (m, 4H) , 3.56 (dd, 1H， J^l.5, J2=9.0 Hz), 2.73 (dd, IH, J! =4.5 Hz, J2 =12.5 Hz, siaH-3eq), 2.26 (t, 2H, J=7.5 Hz) , 2.03 (s, 3H) , 1.68 (t， IH, J!=J2=12.5 Hz, siaH-3ax), 1.60 (hexad, 2H, J=7.5 Hz), 0.91 (t, 3H, J=7.5 Hz) ； C-NMR(75 MHz, D20) δ 178.88, 175.31， 174.08， 134.40, 118.81, 101.08， 96.98, 73.36, 72.47, 70.26, 69.45， 69.22, 69.10, 68.80, 68.29, 64.46, 63.35, 52.50, 50.59, 41.10, 38.59, 22.66, 19.74, 13.56; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for
[C24H4。N2NaO"]+, 603.2372; found, 603.2379 实施例 4 化合物 5 的合成
由化合物 14和异丁酸酐制备， 具体操作步骤同化合物 3的合成。 产率 75 - 85
%。
NMR (500MHz, D20) δ 5.95-6.02 (m, IH), 5.36 (ddd, IH, J,=l.5 Hz, J 2=3.0 Hz, J3=17.5 Hz), 5.26 (m, IH), 4.92 (d, IH, J=3.5 Hz, anomeric H of GalNAc), 4.22 (ddt, IH, J,=J2=1.5 Hz, J3=5.5 Hz, J4=13.0 Hz), 4.15 (dd, 1H， Jt =3.5 Hz, J2 =11.0 Hz), 4.06 (dd, IH, =4.0 Hz, J2=8.0 Hz), 4.04—3.98 (ra, 2H), 3.94-3.78 (m, 5H) , 3.74-3.60 (m, 4H)， 3.52 (dd, 1H， J,=l.5 Hz, J2=9.0 Hz), 2.75 (dd, IH, J,=4.5 Hz, J2=12.5 Hz, siaH-3eq), 2.54 (heptad, IH, J=7.0 Hz), 2.02 (s, 3H), 1.68 (t, 1H， J JfU.5 Hz, siaH-3ax), 1.12 (d， 3H, J=7.0 Hz), 1.11 (d， 3H, J=7.0 Hz) ; 13C— NMR (125 MHz, D20) δ 182.92, 174.64, 134. 01， 119.50, 103.39, 101.79, 100.52, 78.99, 76.22, 75.91, 75.50, 75.14, 73.66, 73.54, 72.50, 71.40, 70.10, 68.95, 68.81, 68.19, 63.26, 61.76， 60.80, 52.19, 40.55， 35.95, 19.69, 19.16; HRMS (m/z) [M+Na]+ calcd. for [C24H40N2NaO14] +, 603.2372; found, 603.2379 实施例 5 化合物 6 的合成
由化合物 14和正己酸酐制备， 具体操作步骤同化合物 3的合成。 产率 100%。 Ή-NMR (500MHz, D20) δ 6.02—5.96 (m, 1H), 5.35 (dd, 1H, J^l.5 Hz, ],=3.0 Hz,
Figure imgf000008_0001
Hz, J3=10.5 Hz), 4.92 (d, 1H, J=4.0 Hz, anomeric H of GalNAc), 4.22 (ddd, 1H, J^l.0 Hz, J2=5.5 Hz, J3=13.0 Hz), 4.15 (dd, 1H, =3.5 Hz, J2 =11.0 Hz), 4.08—4.00 (m, 3H) , 3.93-3.80 (m, 5H) , 3.71-3.61 (m, 4H) , 3.56 (dd, 1H， J,=l.5, J2=9.0 Hz) , 2.73 (dd, 1H， ]l =4.5 Hz, J2 =12.5 Hz, siaH-3eq), 2.28 (t, 2H, J =7.5 Hz) , 2.03 (s, 3H) , 1.68 (t, 1H, J,=J2=12.5 Hz, siaH-3ax) , 1.60 (m, 2H) , 1.29 (m, 4H)， 0.86 (t, 3H, J =7.0 Hz) ； 13C- MR(75 MHz, D20) δ 179.14， 175.31, 174.12, 134.40, 118.82, 101.11, 96.98, 73.38, 72.51, 70.27, 69.45, 69.22, 69.16, 68.79， 68.29, 64.46， 63.41, 52.49, 50.59, 41.14, 36.62, 31.25, 25.82, 22.66, 22. 39, 13.95; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C26H44N2Na014]+， 631.2685; found, 631.2684 实施例 6 化合物 7 的合成
取化合物 14 作为反应原料 10 mg, 溶于 1 mL曱醇， N2保护下加入 0.4 mL 三乙 胺， 水浴下再加入 0.2 mL相应的卤代曱酯 （单氟乙酸曱酯） 。 然后升至室温， 必 要时加热。 TLC显示大部分原料完成转化后， 浓缩溶剂。 过 C18柱， 曱醇 /水洗脱。 过 P2柱，水洗脱。再过 C18柱，水-水 /甲醇洗脱。得到产品约 8- 9 mg。 (收率约 75-85% )。
Ή-NMR (500MHz, D20) δ 6.01-5.92 (ra, 1H), 5.38-5.30 (m， 1H) , 5.28—5.22 (m, 1H), 4.92 (d, 1H, J=4.0 Hz, anomeric H of GalNAc), 4.92 (d, 2H, J=46.0 Hz), 4.23—4.17 (m, 1H), 4.15 (dd, 1H, J, =3.5 Hz, J2 =11.0 Hz), 4.06 (dd, 1H， J!=4.0 Hz, J2=8.0 Hz), 4.04-3.80 (m, 9H) , 3.71 (dd, 1H, 1^ .5 Hz, J2=10.0 Hz), 3.64 (dd, 1H, J^.0 Hz, J2=12.5 Hz), 3.59-3.55 (m, 1H), 2.72 (dd, 1H, J,=4.5 Hz, J2=12.5 Hz, siaH— 3eq), 2.03 (s, 3H) , 1.79 (t, 1H, J-12.5 Hz, siaH-3ax)； 13C—丽 R (125 MHz, D20) δ 175.34, 172.48， 172 (d, IC, J=18.25 Hz), 134.37, 118.80, 100.02, 97.02, 80 (d, IC, J=180.25 Hz), 73.15, 71.89, 70.20, 69.50， 69.26, 68.94, 68.29， 68.15, 64.56， 63.60, 52.10, 50.56， 40.20, 22.64; HRMS (ffl/z): [M+Na]+ calcd. for [C22H35FN2NaOH]+， 593.1965; found, 593.1977 实施例 Ί 化合物 8 的合成
由化合物 14和二氟乙酸曱酯制备， 具体操作步骤同化合物 7的合成。 产率 69
%。
Ή-NMR (500MHz, D20) 5 6.17 (t, J=54.0 Hz), 6.02—5.92 (m, 1H)， 5.35 (dd,
1H, Hz, J,=3.0 Hz, J2=17.5 Hz), 5.26 (dd, 1H, J,=l.5 Hz, J3=10.5 Hz),
4.92 (d, 1H, J=3.5, anomeric H of GalNAc), 4.22 (dd, 1H, L =5.5 Hz, J2=13.0 Hz), 4.14 (dd, 1H, =3.5 Hz, J2 =11.0 Hz), 4.08-3.89 (m, 9H) , 3.75 (ddd, 1H， J!=4.5Hz, J2=9.5 Hz, J3 =12.0 Hz), 3.65-3.61 (m, 2H)， 3.56 (dd, 1H, J,=l.5, J 2=9.0 Hz) , 2.74 (dd, 1H, L =4.5 Hz, J2 =12.5 Hz, siaH-3eq), 2.03 (s, 3H) , 1.71 (t, 1H, J=12.5 Hz, siaH— 3ax); 13C-NMR (125MHz, D20) δ 175.32, 174.05, 166.30 (m, IC, CF2HC0-) , 134.41, 118.81， 109.03 (t, IC, J= 247.0 Hz, CF2HC0- ) , 101.13, 96.98, 72.70, 72.60, 70.28, 69.46, 69.24, 68.86, 68.73, 68.28, 64.55: 63.33, 52.62， 50.59, 40.95， 22.65; HRMS (m/z)： [M+H]+ calcd. for [C22H35F具 0„]+ : 589.2051; found, 589.2053. 实施例 8 化合物 9 的合成
由化合物 14和三氟乙酸曱酯制备， 具体操作步骤同化合物 7的合成。 产率 85
%。
Ή-NMR (500MHz, D20) δ 6.02-5.91 (m， 1H), 5.35 (dq, 1H, J=l.5 Hz, 17.5
Hz), 5.26 (dd, 1H, J^l.5 Hz, J3=10.5 Hz) 4.93 (d, 1H, J=4.0 Hz, anomerci H of GalNAc), 4.20 (ddd, 1H, J^l.0 Hz, J2=5.5 Hz, J3=13.0 Hz), 4.07 (dd, 1H, J! =4.0 Hz, J2 =11.0 Hz), 4.04-3.80 (m, 9H) , 3.70 (dd, 1H, Ji=4.0 Hz, J2=10.0 Hz), 3.66-3.60 (m， 1H) 3.53 (dd, 1H, =1 Hz, J2 =9.0 Hz), 2.73 (dd, 1H, J ,=4.5 Hz, J2=12.5 Hz, siaH-3eq), 2.03 (m, 3H) , 1.79 (t， 1H, 】 】2=12.5 Hz, siaH-3ax) ; 13C-NMR (125MHz, D20) δ 175.34, 172.69, 160.19 (q， J=37.2 Hz), 134.39, 118.80， 116.49 (q， J=284.5 Hz), 100.23, 97.02, 72.72, 72.01, 70.21, 69.50, 69.26, 69.00, 64.61， 63.54, 53.07, 50.57, 49.60, 40.36， 22.65; HRMS (ffl/z)： [M+H]+ calcd. for [C22H34F3N2014] +, 607.1957; found, 607.1936 实施例 9 化合物 1G 的合成
以化合物 14 为原料 (10-15 mg, 0.02-0.03 mmol), 和 HBTU (苯并三氮唑 - Ν,Ν, Ν' , Ν'-四曱基脲六氟磷酸酯） （每个氨基 1. 3当量 HBTU) , 单氯乙酸（每个氨 基 2-4 当量单氯乙酸） 在氮气保护下， 溶解于 2 mL DMF, 室温下搅拌。 再加入 DIPEA (N, N-二异丙基乙胺） （13当量于起始原料）， 反应由 TLC检测至原料基本完 全消耗（一般需要 1-4小时） .反应体系在真空下浓缩后， 过 C18柱， 曱醇 /水洗脱。 过 P2柱， 水洗脱。 再过 C18柱， 水-水 /曱醇洗脱。 得到产品。 收率 56%。
NMR (300MHz, D20) δ 5.84-5.65 (m, IH), 5.35 (d, 1H， J=17.5 Hz), 5.26 (d, IH, J=10.5 Hz), 4.72 (d， IH, J=3.6 Hz, anomeric H of GalNAc), 4.04—3.59 (m， 15H), 3.49-3.35 (m， 3H) , 2.52 (dd, IH, J^.5Hz, J2=12.5 Hz, siaH— 3eq)， 1.83 (m, 3H), 1.56 (t, IH, J!=J2=12.0 Hz, siaH— 3ax); 13C-NMR(75 MHz, D20) δ 175.13, 172.86, 170.99, 134.13， 118.60, 100.08， 96.78, 72.91， 71.86, 70.01, 69.28， 69.04, 68.75， 68.07, 64.37, 63.32, 52.72, 50.35, 42.82, 40.26, 22.42; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for C22H35ClN2Na014, 609.1669; found, 609.1675. 实施例 10 化合物 11 的合成
由化合物 14 和二氯乙酸曱酯制备， 具体操作步骤同化合物 7 的合成。 产率 46
%。
^-NMR (300MHz, D20) δ 6.14 (s, IH), 5.87-5.72 (m, IH) , 5.17 (d， IH, J=17.1 Hz), 5.08 (d, IH, J=10.2 Hz), 4.77 (d, IH, J =3.6 Hz, anomerci H of GalNAc), 4.06—3.56 (m, 18H), 2.56 (dd, IH,
Figure imgf000010_0001
Hz, siaH-3eq), 1.86 (s, 3H), 1.62 (t, IH, J:=J2=12.0 Hz, siaH-3ax); 13C-NMR (125MHz, D20) δ 175. 34, 172.45, 168.22, 134.39, 118.81， 100.03, 97.03, 73.09, 71.95, 70.20, 69.51, 69.27, 69.15, 68.30， 68.00, 66.93, 64.58, 63.61, 53.25, 50.56, 40.32, 22.65; HRMS ( /z) [M+Na]+ calcd. for [C22H34Cl2N2NaO"]+， 643.1279; found, 643.1304 实施例 11 化合物 12 的合成
由化合物 14和三氯乙酸曱酯制备， 具体操作步骤同化合物 7的合成。 产率 64
%。
'H-NMR (500MHz, D20) 5 6.02-5.92 (m， 1H), 5.35 (dd， 1H, Jt = 1.5Hz, J2 = 17.0Hz), 5.26 (d, 1H， J=10.5 Hz), 4.93 (d, 1H, J=3.5Hz, animeric H of GalNAc), 4.21 (dd, 1H, = 5.5Hz, J2 = 12.5Hz) , 4.15 (dd, 1H, J, = 4.0Hz, J2 = 12.5Hz), 4.09-3.83 (m, 9H) , 3.67-3.57 (m, 3H) 3.53 (dd, 1H, J, =1 Hz, J2 =9.0 Hz), 2.75 (dd, 1H,
Figure imgf000011_0001
Hz, siaH— 3eq), 2.03 (s, 3H) , 1.74 (t, 1H, 】!=】2=12.5 Hz, siaH-3ax)； 13C-NMR (125MHz, D20) δ 175.34, 173.76, 165.54, 134.42， 118.82, 100.90， 97.00， 72.67, 72.59, 70.28, 69. 8, 69.25, 69.22, 68.29, 64.58， 63.38, 54.58, 50.59, 41.13, 22.67; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C22H33Cl3N2NaO"]+, 677.0890; found, 677.0902 实施例 12 化合物 13 的合成
化合物 14 (15.0 mg, 0.029 mmol) 溶于 2.0 mL 曱醇中， 加入 CuS04 (0.5 mg, 0.003隱 ol)。 TfN3 ό p比11定溶液（0.56 mmol, 8. OmL, Tetrahedron Lett. 2005, 46, 8993-8995 .) 加入上述混合溶液中进行反应， 1小时后 TLC监测反应完全。 反 应体系在真空下浓缩后， 过 C18柱， 曱醇 /水洗脱。 过 P2柱， 水洗脱。 再过 C18柱， 水-水 /曱醇洗脱。 得到产品。 收率 96%。
Ή-NMR (500 MHz, D20) δ 5.93-6.00 (m, 1H), 5.35 (ddd, 1H, 1.5 Hz, J 2= 3.0 Hz, J3= 17.5 Hz), 5.26 (ddd, 1H, /, = 1.0 Hz, J2= 2.5 Hz, J3= 10.5 Hz) , 4.92 (d, 1H, J = 3.5 Hz, anomeric H of GalNAc), 4.21 (ddd, 1H, = 1.0 Hz, J 2= 5.5 Hz, J 3= 13.0 Hz) , 4.14 (dd, 1H, = 3.5 Hz, /,= 11.0 Hz) , 4.08—3.99 (m, 3H), 3.93-3.88 (m, 4H) , 3.80 (dd, 1H, Jj = 2.0 Hz, = 9.0 Hz) , 3.72-3.64 (m, 2H), 3.64-3.58 (m, 2H) , 3.47 (dd, 1H, = = 10.0 Hz) , 2.72 (dd, 1H, = 5.0 Hz, J2 = 13.0 Hz, siaH-3eq), 2.03 (s, 3H) , 1.68 (t, 1H, J, = J2= 12.5 Hz, siaH— 3aAT) ; 13C— NMR (125 MHz, D20) δ 175.33, 173.99, 134.42, 118.80, 101.11， 96.98, 73.27, 72.67, 70.28, 70. 13, 69.46, 69.29, 69.25, 68.28， 64.58: 63.49, 63. 33, 50.60, 40.80, 22.66; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for
[C2。H3 Na013]+， 559.1858; found, 559.1847 实施例 13 化合物 14 的合成
化合物 52 (其合成见实施例 44， 380 mg, 0.426 mmol) 溶于 20 mL甲醇中， 加入 NaOMe/MeOH溶液 （30%, 0.02 g, 0.11 mmol) , 室温搅拌 1小时。 反应体系在 真空下浓缩后， 加入 NaOH (2 N, lO mL) 水溶液， 室温搅拌 10小时。 用 IN HCl/MeOH 调 PH之 3后， 反应液在真空下浓缩。 初产物可以直接用于以后的反应。 也可以过 P2柱， 水洗脱。 得到纯品。 收率 86%。
'H—NMR (500 MHz, D20) δ 5.97 (m, 1Η), 5.35 (ddd, 1H, J, = 1.5 Hz, J2 =
3.0 Hz, /,= 17.5 Hz), 5.26 (ddd, 1H, /, = 1.5 Hz, J2= 3.0 Hz, /,= 10.5 Hz) , 4.93 (d, 1H， / = 4.0 Hz, anomeric H of GalNAc), 4.20 (ddd, 1H,
Figure imgf000012_0001
1.0 Hz, J2 = 5.5 Hz, J3 = 13.0 Hz), 4.14 (dd, 1H, = 3.5 Hz, J2 = 12.0 Hz), 4.07 (dd, 1H, J, = 4.0 Hz, = 11.0 Hz), 4.04-3.89 (m, 7H) , 3.80—3.71 (m, 3H) , 3.62 (dd, 1H, = 4.0 Hz, = 10.5 Hz) , 3.22 (t， 1H, J,= J2 = 10.0 Hz), 2.77 (dd, 1H, J, = 4.5 Hz, J 2 = 12.5 Hz, siaH-3eg) , 2.03 (m, 3H)， 1.71 (t, 1H, J,= J2 = 12.5 Hz, siaH- 3a ; 13C— NMR (75 MHz, D20) δ 175.06, 173.57, 134.14, 118.57, 100.80， 96.71, 72.25, 72.15, 70.04, 69.20, 69.04, 68. 37， 67.98, 67.72, 64.51; 62.77, 52.79, 50.34, 40.82， 22.45; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for
[C2aH„N2Na013]+， 533.1953; found, 533.1953 实施例 14 化合物 15 的合成
由化合物 14和溴代乙酸制备， 具体操作步骤同化合物 10 的合成。 产率 37%。
'H-NMR (500 MHz, D20) δ 6.02-5.92 (m, 1H), 5.35 (dq, 1H， J = 1.5 Hz,
17.5 Hz) , 5.26 (dq, 1H， /= 1.5 Hz, 10.5 Hz), 4.92 (d, 1H, /= 4.0 Hz, anomeric H of GalNAc), 4.22 (ddt, 1H, 1：= J2 = 1.5 Hz, J3 = 4.0 Hz, J3 = 13.0 Hz) , 4.15 (dd, 1H, = 3.5 Hz, = 6.0 Hz), 4.07 (dd, 1H， /； = 4.5 Hz, J2= 8.0 Hz) ,
4.05-4.00 (m, 2H) , 3.96-3.85 (m, 7H) , 3.80 (dd, 1H, = 1.5 Hz, J2 = 10.5 Hz), 3.71 (ddd, 1H, = 4.5 Hz, = 9.5 Hz, J3 = 12.0 Hz) , 3.66—3.59 (m, 3H)， 2.73 (dd， 1H, J, = 4. 5 Hz, J2= 12.5 Hz, siaH— 3e<j), 2. 04 (s, 3H) , 1.69 (dd, 1H, J} = J2= 12. 5 Hz, siaH- 3ar); 13C- NMR (125 MHz, D20) δ 175. 34, 174.12, 171.51， 134.42, 118.82, 101.15， 96.99， 73.13, 72.63, 70.29, 69.47， 69.24, 69.02， 68.30, 64.52, 63.38, 53.03, 50.61, 41.04， 28.73， 22.67; HRMS ( /z) [M+H]+ calcd. for [C22H36BrN2014] +, 631.1344; found, 631.1324 实施例 15 化合物 16 的合成
由化合物 26 (烯丙基 4- 0~(5-乙酰氨基 -3, 5-二去氧 - α-ΰ~吡喃神经氨酸 基) -2-氨基- 2-去氧- α-)"吡喃半乳糖苷，其合成见实施例 25 )和丙酸酐制备， 具 体操作步骤同化合物 3的合成。 产率 56 %。
Ή-NMR (500MHz, D20) δ 6.01-5.91 (m, 1H), 5. 35 (dd, 1H, J^l.5Hz, J2=17.5Hz), 5.25 (d， 1H, J=10.5Hz) , 4.92 (d， J=3.5Hz, anomeric H of GalN) , 4.21 (dd, 1H, J!=5.0Hz, J2=12.5Hz) , 4.15 (dd, 1H, J!=3.5Hz, J2=ll.5Hz) , 4.07 (dd, 1H, J,=4.5Hz, J2=7.5Hz), 4.04-3.99 (m, 2H) , 3.94-3.81 (m, 5H) , 3.73-3.62 (m, 4H), 3.57 (1H, J】=l.5Hz, J2=9.0Hz) , 2.72 (dd, 1H, J,=4.5 Hz, J2=12.5Hz, siaH— 3eq)， 2.03 (t， 1H, J!=J2=8.0Hz) , 2.29 (q, 2H， J=7.5Hz) , 2.03 (s, 3H) , 1.70 (t, 1H, =】2=12.0Hz, siaH-3ax), 1.11 (t, 3H, J!=J2=7.5Hz) ; 13C-NMR (125MHz, D20) δ 179.33, 175.76, 174.14, 134.36, 118.89, 101.13, 96.96， 73.33, 72.50， 70.28, 69.48， 69.25, 68.98, 68.22, 64.49, 63. 36, 52.59, 50.49， 41.00, 29.84, 22.76, 10.29; HRMS (m/z) [M+Na]+ calcd. for [C23H3gN2Na014] +, 589.2215; found, 589.2225 实施例 16 化合物 17 的合成
由化合物 26和正丁酸酐制备， 具体操作步骤同化合物 3的合成。 产率 53 %。
'H-NMR (500MHz, D20) δ 6.00-5.90 (m, 1Η) , 5.35 (dd, 1H, J, =1.5 Hz, J2
=17.5 Hz) , 5.26 (d, 1H, J, =1.0 Hz, J2 =10.5 Hz), 4.92 (d, 1H, J=3.5 Hz, anomeric H of GalN) , 4.20 (dd, 1H, J,=5.5 Hz, J2=13.0 Hz), 4.14 (dd, 1H, 1, =3.5 Hz, J2 =11.5 Hz), 4.06 (dd, 1H, 】,=4.5 Hz, J2=7.5 Hz) , 4.03-3.99 (m, 2H) , 3.94-3.80 (m, 5H) , 3.71-3.61 (m, 4H) , 3.78 (dd, 1H, =1.5 Hz, J2 =9.0 Hz), 2.73 (dd, 1H, J,=5.0, J2 =12.5 Hz, siaH— 3eq), 2.28 (t, 2H, J =7.0 Hz), 2.03(s, 1H), 1.68 (t, 1H, J^J^U.5 Hz, siaH— 3ax), 1.65-1.56 (m, 2H) , 0.93 (t, 3H, J =7.5 Hz)； UC-NMR(125 MHz, D20) δ 178.26, 175.59， 173.89, 134.14, 118.82, 100.88, 96.8473.16, 72.29, 70.10, 69.36, 69.10, 68.78, 67.96， 64.33, 63.19, 52.41, 50. 36, 40.79, 38.19, 22.59, 19.60， 13.26; HRMS (m/z) [M+Na]+ calcd. for [C2,¾„N2NaOI4] +, 603.2372; found, 603.2374 实施例 17 化合物 18 的合成
由化合物 26和异丁酸酐制备， 具体操作步骤同化合物 3的合成。 产率 76 %。
¾— NMR (500MHz, D20) δ 6.00-5.90 (m, 1H), 5.35 (dd, 1H, =1.5 Hz, J2 =17.0 Hz) , 5.26 (d, 1H， J, =10.0 Hz), 4.92 (d, 1H， J=4.0 Hz, anomeric H of GalN) , 4.20 (dd, 1H， J,=5.0 Hz, J2=13.0 Hz) , 4.14 (dd, 1H， J, =4.0 Hz, J2 =11.5 Hz), 4.06 (dd, 1H， Jt=4.5 Hz, J2=8.0 Hz), 4.03-3.99 (m, 2H) , 3.94-3.80 (m， 5H), 3.71-3.61 (m， 4H) , 3.78 (dd, 1H, Jt =1.5 Hz, J2 =8.5 Hz), 2.73 (dd, 1H，
J2 =12.5 Hz, siaH— 3eq)， 2.56 (septenary, 1H, J=7.0 Hz), 2.03 (s, 3H) , 1.83 (t, 1H, J,=J2=12.5 Hz, siaH-3ax), 1.10 (d, 3H, J =7.0 Hz), 1.09 (d, 3H, J =7.0 Hz)； 13C-NMR(125 MHz, D20) δ 182.45， 175.76, 174.12, 134.31, 119.00, 101.11, 96.91, 73.32， 72.49, 70.29, 69.50， 69.28, 68.97, 6810, 64.49, 63.36, 52.58, 50.43, 40.98, 35.71, 22.76, 19.61, 19. 19; HRMS ( /z) [M+Na]+ calcd. for [C24H4具 NaO„] +， 603.2372; found, 603.2384 实施例 18 化合物 19的合成
由化合物 26和正己酸酐制备， 具体操作步骤同化合物 3的合成。 产率 87 %。
— NMR (500MHz, D20) δ 6.01-5.93 (m, 1H) , 5. 35 (dd, 1H, J^l.5 Hz, J 2=17.5 Hz), 5.26 (dd, 1H, J^l.0 Hz, J2=10.5 Hz), 4.92 (d, 1H， J=3.5 Hz, anomeric H of GalN), 4.22 (dd, 1H, J,=5.0 Hz, J2=13.0 Hz), 4.15 (dd, 1H, 1, =4.0 Hz, J2 =11.0 Hz), 4.07 (dd, 1H, J, =4.0 Hz, J2 =8.0 Hz) , 4.08-4.00 (m, 2H), 3.93-3.80 (m, 5H)， 3.71-3.61 (m, 4H) , 3.56 (dd, 1H, J^l.5, J2=9.0 Hz) , 2.73 (dd, 1H, J, =4.5 Hz, J2 =12.5 Hz, siaH-3eq), 2.28 (m, 2H) , 2.03 (s, 3H) , 1.68 (t, 1H, J=12.5 Hz, siaH— 3ax)， 1.60 (m, 2H) , 1.29 (m, 4H) , 0.86 (t， 3H, J=7.0 Hz); 13C-NMR(125 MHz, D20) δ 178.62, 175.76, 174.12, 134.32, 118.98, 101.13, 97.02, 73.33, 72.50, 70.28, 69.54, 69.26, 68.98, 68.13， 64.48， 63.36, 52.59, 50.52, 40.99, 36.44, 31.14, 25.83, 22.76, 22.41, 13.95; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C26H4具 NaO„] +, 631.2685; found, 631.2678 实施例 19 化合物 20的合成
由化合物 26和单氟乙酸曱酯制备， 具体操作步骤同化合物 7的合成。 产率 77
%。
NMR (500MHz, D20) δ 6.02-5.92 (m, 1H), 5.35 (dd, 1H, J,=l.5 Hz, J2=17.0Hz), 5.26 (d, 1H， J = 10.5Hz) , 4.97 (d， J=4.0Hz, anomeric H of GalN), 4.97 & 4.88 (d, 2H, JF,„=46.5Hz) , 4.26 (dd, 1H, J,=4.0Hz, J2=ll.0Hz) , 4.22 (dd, 1H, J!=5.0Hz, J2=l 3.0Hz), 4.08 (dd, 1H, J !=4.5 Hz, J2=8.0Hz) , 4.05-3.99 (m, 3H), 3.94-3.81 (m, 4H) , 3.71-3.62 (m, 4H) , 3.58 (dd, 1H, J^l.5 Hz, J2=9.0Hz) , 2.72 (dd, J,=4.5 Hz, J2=12.5Hz, siaH-3eq), 2.03(s, 3H) , 1.68 (t, 1H J,=J2=12.5Hz siaH-3ax); 13C-NMR (125MHz, D20) δ 175.77, 174.14, 171.89, 171.74, 134.35, 118.94, 101.13, 96.88, 81.18, 79.74, 73.33, 72.50, 70.33, 69.50， 69.22, 69.00, 68.10, 64.45， 63.36, 52.59, 50.28, 41.00, 22.76; HRMS (m/z)： [M+Na] + calcd. for [C22H35FN2Na014]+, 593.1965; found, 593.1975 实施例 20 化合物 21的合成
由化合物 26和二氟乙酸曱酯制备， 具体操作步骤同化合物 7的合成。 产率 78
%。
^-NMR (500MHz, D20) δ 6.19 (t, 1Η， JF,„=53.6Hz) , 6.01-5.91 (m, 1Η), 5.34 (dq, 1H, J=l.5 Hz, 17.5Hz) , 5.25 (dq, 1H, J=l.5 Hz, 10.5Hz) , 4.99 (d, J=4.0Hz, anomeric H of GalN), 4.26-4.19 (m, 2H) , 4.10 (dd, 1H， ],=4.0 Hz, J2=8.0Hz) , 4.06-3.99 (m， 3H) , 3.99-3.93 (m, 1H), 3.90-3.84 (m, 3H) , 3.80-3.69 (m, 3H), 3.65 (dd, 1H， J,=6.5Hz, J2=12.5Hz) , 3.57 (dd, 1H, J^l.5 Hz, J2=8.5Hz) 2.71 (dd, 1H, 1^5.0 Hz, J2=13.0Hz, siaH— 3eq), 2.03 (s， 3H) , 1, 76(t, J!=J2=12.0Hz, siaH-3ax); 13C-NMR (125MHz, D20) δ 175.73, 172.88, 166.05 (t, 10, 134.29, 118.97, 118.79, 108.88 (t, 1C, JF-c=246.1Hz), 100.27, 96.61， 73.50, 71.99, 70.28, 69.55, 69.20, 69.02, 68.50, 67.93, 64.46， 63.57, 52.51, 50.90, 50.82, 40.36, 22.79; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C22H34F2N2Na014]+, 611.1870; found, 611.1861 实施例 21 化合物 22的合成
由化合物 26和三氟乙酸曱酯制备， 具体操作步骤同化合物 7的合成。 产率 76
%。
画 R (500MHz, D20) δ 5.92-5.82 (m, 1H)， 5. 35 (d, 1H, J =17.0 Hz) , 5.26 (d, 1H, J=10.5 Hz) , 4.92 (d, 1H, J =3.5 Hz, anomeric H of GalN), 4.20-4.11 (m, 2H), 4.01 (dd, 1H, 1^4.5 Hz, J2=7.0 Hz) , 4.00-3.91 (m, 3H) , 3.86— 3.72 (m, 5H), 3.65-3.51 (m, 4H) , 3.50 (d, 1H, J=9.0 Hz) , 2.65 (dd, 1H, 】 4.5 Hz, J2=12.5 Hz, siaH-3eq), 1.95 (s, 3H) , 1.60 (t, 1H, 】!=】2=12.5 Hz, siaH— 3ax) ;
13C-NMR (125MHz, D20) δ 175. 07, 173. 34, 159.38 (q, JF-C=37.5 Hz) , 133.59, 118. 30, 116 (q， JF_C=284.1 Hz), 100.40， 95.65, 72.63, 71.77， 69.62， 68.82 68.46， 68.29, 68.23, 66.97, 63.69, 62.68， 51.89， 50.75, 40.25 HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C22H33F具 Na014] +, 629.1776; found, 629.1787 实施例 12 化合物 23的合成
由化合物 26和单氯乙酸制备， 具体操作步骤同化合物 10的合成。 产率 54%。 Ή-NMR (500MHz, D20) δ 6.01-5.92 (m， 1H), 5.35 (dq, 1H, J =1.5 Hz, 17.5 Hz), 5.27 (dd, 1H, J^l.5 Hz, J2=10.5 Hz), 4.95 (d, 1H， J=4.0 Hz, anomeric H of GalN), 4.24-4.18 (m, 3H) , 4.16 (d, 1H, J=0.5 Hz), 4.08 (dd, 1H, J,=5.0 Hz, J2=8. 0 Hz) , 4.06-4.00 (m, 2H) , 3.96 (dd, 1H, J!=3.0 Hz, J2=ll.0 Hz) , 3.92-3.80 (m, 4H) , 3.70 (dd, 1H, J,=2.0 Hz, J2=8.5 Hz) , 3.68-3.60 (m, 3H) , 3.58 (dd, 1H, 1,=2.0 Hz, J2=9.0 Hz), 2.72 (dd, 1H, 1^4.5Hz, J2=12.5 Hz, siaH-3eq), 1.83 (s, 3H) , 1.56 (t, 1H, J=12.0 Hz, siaH-3ax); 13C-腿（125 MHz, D20) δ 175.77， 174.12, 170.85, 134.33, 118.98, 101.12, 96.75, 73. 33, 72.50, 70.34, 69.53, 69.21， 68.99， 68.21， 64.46, 63.36, 52.59, 51.11, 42.97, 40.99, 22.76; HRMS (m/z)： [M+NHJ+ calcd. for [C22H39C1N3014] +， 604.2115; found, 604.2112 实施例 13 化合物 24的合成
由化合物 26和二氯乙酸甲酯制备， 具体操作步骤同化合物 7的合成。 产率 54
%。
Ή-NMR (500MHz, D20) δ 6.35 (s, 1H) , 6.01-5.92 (m, 1H) , 5.35 (dd, 1H, J,=l.5 Hz, J2=17.5 Hz), 5.26 (d, 1H, J =10.5 Hz), 4.92 (d, 1H, J=4.0 Hz, anomeric H of GalN) , 4.22 (dd, 1H, =5.5 Hz, J2=13.0 Hz), 4.17 (dd, 1H, J, =3.5 Hz, J2 =6.0 Hz) , 4.08 (dd, 1H, J,=4.5 Hz, J2=8.0 Hz) , 4.05-4.00 (m, 2H) , 3.98 (dd, 1H, 1^3.0 Hz, J2=ll.0 Hz), 3.94-3.80 (m, 4H) , 3.71 (dd, 1H， J1=2.0 Hz, J2 =10.5 Hz), 3.69-3.62 (m， 3H) , 3.58 (dd, 1H, J^l.5 Hz, J2 =8.5 Hz) , 2.73 (dd, 1H, J:=5.5Hz, J2=12.5 Hz, siaH— 3eq), 2.03 (s, 3H)， 1.69 (t, 1H, J=12.0 Hz, siaH-3ax) ; 13C-NMR(125 MHz, D20) δ 175.77, 174.06, 168.02, 134.28, 119.15, 101.09, 96.40， 73. 34, 72.48, 70.36, 69.60, 69.24， 69.00, 68.96， 68.03, 66.77, 64.44, 63.38, 52.59, 51.64, 40.96, 22.77 ； HRMS (m/z)： [Μ+ΗΓ calcd. for [C22H35C12N20"]+, 621.1460; found, 621.1477 实施例 24 化合物 25的合成
化合物 54 (其合成见实施例 45 ) (145 mg, 0.176 讓 ol) 溶于 8 mL曱醇中， 加入 NaOMe/MeOH溶液 （30%, 0.02 g, 0.11 mmol) , 室温搅拌 2小时。 反应体系在 真空下浓缩后， 加入 NaOH (1 N, 3 mL) 水溶液， 室温搅拌 24小时。 用 IN HCl/MeOH 调 PH之 3后， 反应液在真空下浓缩。 初产物过 P2柱， 水洗脱。 得到纯品。 收率 100%。
'H— NMR (500 MHz, D20) δ 6.02—5.94 (m, 1Η), 5. 35 (ddd, 1H, = 1. 5 Hz, J2= 3.0 Hz,
Figure imgf000017_0001
2.5 Hz, J3= 10.5 Hz), 4.92 (d, 1H, / = 3.5 Hz, anomeric H of GalN3), 4.21 (ddd, 1H, J, = 1. 0 Hz, J2= 5.5 Hz, J3= 13.0 Hz), 4.14 (dd, 1H, /, = 3.5 Hz, Λ= 11.0 Hz), 4.08-3.99 (m， 3H), 3.93-3.88 (m， 4H) , 3.80 (dd, 1H, = 2.0 Hz, J2 = 9. Q Hz) , 3.72-3.64 (m， 2H), 3.64—3.58 (m， 2H) , 3.47 (dd, 1H, = 10.0 Hz), 2.72 (dd, 1H,
/；= 5.0 Hz, = 13.0 Hz, siaH-3eq), 2.03 (s， 3H) , 1.68 (t, 1H, / = 12.5 Hz, siaH- 3a ; 13C-NMR (125 MHz, D20) δ 175. 33, 173.99, 134.42, 118.80, 101.11, 96.98, 73.27, 72.67, 70.28, 70.13, 69.46， 69.29, 69.25， 68.28, 64.58, 63.49, 63.33, 50.60, 40.80, 22.66; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C2。H32N4Na013]+， 559.1858; found, 559.1851 实施例 25 化合物 26的合成
化合物 25 (94 mg, 0.176 mmol, 其合成见实施例 24) 溶于 15 mL吡啶、 10 mL 三乙胺和 5 mL水的混合溶剂中， 通入 H2S 气体反应 10小时。 在真空下浓缩反应液， 残留物过 P2柱， 水洗脱。 得到纯品。 收率 67%。
― NMR (500 MHz, D20) 5 6.02-5.97 (m, 1H) , 5. 38 (d， 1H, / = 17.0 Hz) , 5.28 (d， / = 10.0 Hz), 5.17 (d， 1H, / = 3.5 Hz, anomeric H of GalNH2), 4.28 (dd, 1H, Jl= 5.5 Hz, J2= 12.5 Hz), 4.14-4.00 (m, 4H) , 3.93-3.80 (m， 4H) , 3.71-3.56 (m, 5H) , 3.48 (dd, 1H, = 3.5 Hz, J2= 11.0 Hz) , 2.73 (dd, 1H, J, = 4.5 Hz, J2 = 12.5 Hz, siaH-3eg), 2.03 (s, 3H) , 1.68 (t， 1H， / = 12.0 Hz, siaH- 3a ; 13C— NMR (125 MHz, D20) δ 175.61, 173.94, 133.74, 119. 33, 100.95, 94.97, 73.16, 72. 34, 70.29, 69.56, 68.74， 68.56, 67.10, 64.04, 63.16, 52.40， 51.36, 40.78, 22.58; HRMS ( /z)： [M+Na]+ calcd. for [C2。H3具 Na013]+， 533.1953; found, 533.1957 实施例 26 化合物 27的合成
由化合物 50 (烯丙基 4- (?~(5-氨基- 3， 5-二去氧 - α-ΰ"吡喃神经氨酸基）- 2- 氨基- 2-去氧 -α- 吡喃半乳糖苷， 其制备方法见实施例 43 )和丙酸酐制备， 具体 操作步骤同化合物 3的合成。 产率 55 %。
Ή-NMR (500 MHz, D20) δ 6.01-5.92 (m, 1H), 5.35 (dq, 1H, / = 1.5 Hz, 17.5 Hz), 5.26 (dd, 1H, = 1.5 Hz, J3= 10.5 Hz), 4.91 (d, 1H, / = 4.0 Hz, anomeric H of GalN), 4.22 (ddd, 1H, /； = 1.0 Hz, J2= 5.5 Hz, J3= 13. 0 Hz)， 4.15 (dd, 1H, = 3.5 Hz, J2 = 11.0 Hz), 4.07 (dd, 1H, = 5.0 Hz, = 8. 0 Hz), 4.03-4.00 (m, 2H) , 3.96—3.81 (ra, 5H) , 3.75-3.62 (m, 4H) , 3.56 (dd, 1H, J1= l. S Hz, = 9.0 Hz)， 2.73 (dd, 1H, = 5.0 Hz, J2 = 12.5 Hz, siaH-3eg) , 2.30 (q, 4H, / = 7.5 Hz) , 1.68 (t, 1H, / = 12.5 Hz, siaH— 3aAr)， 1.17 (t, 6H, / = 7.5 Hz); 13C- NMR (75 MHz, D20) δ 134.13, 118.69， 100.91, 96.74， 73.14, 72.30， 70.09， 69.26, 69.05, 68.79, 68.68, 68.00, 64.32, 63. 11, 52.25, 50.29， 40.89 29.79, 29.64, 10.10, 10.07; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for
[C24H4 Na0"]+ 603.2372; found, 603.2378. 实施例 27 化合物 28的合成
由化合物 50和正丁酸酐制备， 具体操作步骤同化合物 3的合成。 产率 56 %
Ή-NMR (300MHz, D20) δ 5.83-5.68 (m, 1H), 5.35 (d, 1H, J=17.5 Hz), 5.26 (d, 1H, J=10.5 Hz) , 4.72 (d, 1H, J=3.6 Hz, a eric H of GalN) , 4.05-3. 36 (m 15H), 2.53 (dd, 1H, J,=4.5Hz, J2=12.5 Hz, siaH— 3eq) , 2.07 (t, 3H, J=7.2 Hz) , 1.49 (t, 1H, J=12.3 Hz, siaH- 3ax), 1.42 (hexad peaks, 4H, J=7.2 Hz) , 0.71 (t, 6H J=7.2 Hz) nC-NMR(125 MHz, D20) δ 178.89, 178.41 174.141, 134. 32, 118, 98, 101.12, 97.01, 73.35, 72.50, 70.28, 69.53, 69.26, 69.10, 68.83, 68.14, 64.48, 63. 33, 52.50, 50.53, 41.13 38.59, 38. 36, 19.74, 13.54, 13.42; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C26H44N2NaOH] +, 631.2685; found, 631.2675 实施例 28 化合物 29的合成
由化合物 50和异丁酸酐制备， 具体操作步骤同化合物 3的合成。 产率 60% :H-NMR (500MHz, D20) δ 6.02-5.91 (m, 1Η), 5.35 (dd, 1H, J^l.5 Hz, J2=17.5 Hz), 5.26 (dd, 1H, J,=l.0 Hz, J3=10.5 Hz) 4.92 (d 1H, J=3.5 Hz, anomeric H of GalN), 4.22 (dd, 1H, J, =5.5 Hz, J2=13.0 Hz), 4.14 (dd, 1H 1, =3.5 Hz, J2 =11.0 Hz), 4.07 (dd, 1H, J, =4.5 Hz, J2=7.5 Hz) , 4.04-4.00 (m 2H) , 3.94-3.86 (m, 5H) , 3.73-3.62 (m, 4H) , 3.52 (dd, 1H, J,=l.5Hz, J2=9.0 Hz) , 2.74 (dd, 1H, Jx =4.5 Hz, J2 =12.5 Hz, siaH-3eq), 2.56 (heptad peaks, 1H, J=7.0 Hz), 2.46 (heptad peaks, 1H, J=7.0 Hz) , 1.68 (t, 1H, J=12.5 Hz, siaH— 3ax 1.13-1. 09 (m, 12H); 13C— NMR (125MHz, D20) δ 182.93, 182.46, 174.17 134.32, 119.01 101.13 96.91, 73.37, 72.49, 70.30, 69.51 69.28, 69.08 68.72, 68.11, 64.49 63. 31, 52.36, 50.43, 41.17 35.96, 35.71, 19.71 19.61, 19.18 (2C); HRMS {m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C26H4具 Na014] +, 631.2685; found, 631.2673 实施例 29 化合物 30的合成
由化合物 50和正己酸酐制备， 具体操作步骤同化合物 3的合成。 产率 77%。 'H-NMR (500MHz, D20) δ 6.01-5.91 (m, 1H)， 5. 35 (dd, 1H， J, =17.0 Hz, J2 =1.0 Hz), 5.26 (d， 1H， J, =10.5 Hz), 4.91 (d， 1H, J=3.5 Hz), 4.21 (dd, 1H, Ji=5.5 Hz, J2=13.0 Hz), 4.16 (dd, 1H, J ,=5.5 Hz, J2=13.0 Hz), 4.07 (dd, 1H, J, =4.0 Hz, J2 =8.0 Hz), 4.02-3.99 (m, 2H) , 3.93-3.79 (m, 5H), 3.71-3.61 (m, 4H)， 3.55 (d， 1H, J =7.0 Hz) , 2.72 (dd, 1H, =5.0 Hz, J2 =13. 0 Hz, siaH-3eq ), 2.31-2.25 (m, 4H) , 1.68 (t, 1H, J=12.5 Hz siaH— 3ax)， 1.62-1.57 (m, 4H) , 1.36-1.24 (m， 8H) , 0.86 (m, 6H) ; 13C-NMR (125MHz, D20) δ 178.94, 178.48, 173.36, 134.11， 118.81, 100.51, 96.85, 73.28, 72.10， 70.08, 69.38， 69.10， 68.98, 68.40, 67.96, 64.35, 63. 31, 52.27, 50.34， 40.68, 36.46, 36.26, 31.08, 30.96, 25.66, 22.25, 13.78; HRMS (m/z)： [M+H]+ calcd. for [C3。H53N2014] +， 665.3491; found, 665.3495 实施例 30 化合物 31的合成
由化合物 50和单氟乙酸曱酯制备， 具体操作步骤同化合物 7的合成。 产率 67
%。
NMR (500MHz, D20) δ 5.90-5.85 (m, 1H), 5.27 (dd, 1H， J, =1.5 Hz, J2 =17.0 Hz), 5.27 (d, 1H, J=10.5 Hz ), 4.87 (d, 1H, J=3.0 Hz, anomeric H of GalN), 4.8 (d, 2H, JF-„=46.0 Hz ) , 4.7 (d, 2H, JF-„=46.0 Hz ) , 4.17 (dd, 1H, 1 =4.0 Hz, J2 =10.5 Hz), 4.13 (dd, 1H, J, =5.0 Hz, J2 =12.5 Hz), 4.00 (dd, 1H, J, =4.0 Hz, J2 =8.0 Hz), 3.96-3.72 (m， 8H) , 3.65 (ddd, 1H, =4.5 Hz, J2 =10.0 Hz, Hz), 3.57—3.49 (m, 2H) , 3.50 (dd, 1H, L =1.5 Hz, J2 =9.0 Hz), 2.72 (dd, 1H, J,=4.5 Hz, J2=12.5 Hz, siaH— 3eq), 1.79 (t， 1H, J!=J2=12.5 Hz, siaH— 3ax) ; "C-NMR (125 MHz, D20) δ 175.36, 171.5 (d， 1C， JF-C=18.12 Hz), 171.1 (d, 1C, JF-c=18.62 Hz), 133.65, 118.22, 100.44, 96.19, 80 (d, 1C, JF-c=189.53 Hz), 79 (d, 1C, JF-c=179.56 Hz), 72.21, 71.87, 69.62, 68.79, 68.51, 68.149, 68.08, 67.40, 63.77, 62.66, 51.50, 49.58, 40.27; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C22H32F4N2Na014]+, 611.1870; found, 611.1872 实施例 31 化合物 32的合成
由化合物 50和二氟乙酸甲酯制备， 具体操作步骤同化合物 7的合成。 产率 n
%。
Ή-NMR (500MHz, D20) δ 6.10 (t, IH, JF-H=53.6Hz) , 6.09 (dd, IH,
JF-„=53.6Hz), 5.92-5.86 (m, 1H)， 5.30 (d, IH, J = 17.5Hz) , 5.18 (d, IH, J = 10.5Hz), 4.91 (d, IH, J=3.5 Hz, anomeric H of Gal), 4.20—4. 13 (m， 2H), 4.02 (dd IH,
Figure imgf000021_0001
Hz) , 4.00-3.78 (m, 9H) , 3.71—3.65 (m, IH), 3.58-3.54 (m， 1H)， 3.49 (d, IH, J=9.0 Hz) , 2.67 (dd, IH, J,=4.5Hz, J2=12.5 Hz, siaH— 3eq)， 1.69 (dd, IH, J,=J2=12.5 Hz, siaH— 3ax); 13C-NMR (12 MHz, D20) δ 173.33, 165.3(m, 2C), 133.61, 118.26, 108.29 (t, 1C, JF— c=46.5 Hz)， 108.17 (t， 1C, JF-c=5.6 Hz) , 100.45, 95.86, 71.99, 71.91, 69.63, 68.81, 68.48， 68.16, 68.02, 67.21, 63.78, 51.91, 50.14, 40.24; HRMS (m/z) [M+Na]+ calcd. for
[C22H32F Na014]+, 647.1682; found, 647.1669 实施例 32 化合物 33的合成
由化合物 50和三氟乙酸曱酯制备， 具体操作步骤同化合物 7的合成。 产率 49
%。
'Η—丽 R (500MHz, D20) δ 6.01—5.92 (ra, IH), 5.35 (dq, IH, J=l.5 Hz, 17.5 Hz), 5.26 (dd, IH, J,=l.5 Hz, J3=10.5 Hz), 5.01 (d， IH, J=4.0 Hz, anomeric H of GalN), 4.21-4.27 (m, 2H) , 4.11 (dd, IH, J, =4.0 Hz, J2=8.0 Hz) , 4.07-3.86 (m, 8H), 3.76 (ddd, IH, J ,=4.5Hz, J2=9.5 Hz, J3 =12.0 Hz), 3.67-3.61 (m， 2H) , 3.56 (dd, IH, J,=l.5, J2=9.0 Hz), 2.76 (dd, IH, J, =4.5 Hz, J2 =12.5 Hz, siaH— 3eq)， 1.72 (t, IH, J=12.5 Hz, siaH-3ax); 13C-NMR(125 MHz, D20) δ 174.04 160.1 (m, 2C), 134.28, 119.01, 116.51 (dd, 2C, JF-„=285.12 Hz), 101.18, 96. 36, 72.66, 72.51, 70.35, 69.54, 69.19, 68.91, 68.65， 67.68, 64.53, 63. 32, 53. 13, 51.46， 40.99; HRMS (m/z) [M+Na] + calcd. for [C22H30F6N2NaO14]+, 683.1493; found, 683.1501 实施例 33 化合物 34的合成
由化合物 50和单氯乙酸制备， 具体操作步骤同化合物 10的合成。 产率 60%。 Ή-NMR (500MHz, D20) δ 6.02-5.93 (m， IH) , 5.35 (dq， IH, / = 1.5Hz, 17.5Hz), 5.27 (dq, IH, 7 = 1.5Hz, 10.5Hz) , 4.97 (d, IH, J=4.0 Hz, anomeric H of GalN), 4.21—4.18 (m, 2H) , 4.19-4.17 (m, 3H) , 4.09 (dd, 1H， Ji=4.0 Hz, Hz) , 4.06-4.01 (m, 2H) , 3.93-3.86 (m, 5H) , 3.78 (ddd, IH, =4.5 Hz， J2=9.5 Hz, J3=12.0 Hz), 3.68 (dd, IH, J,=4.5 Hz, J3=10.5 Hz), 3.65 (dd, IH, !,=6.5 Hz,
Figure imgf000022_0001
Hz, J2=12.5 Hz, siaH-3eq), 1.75 (t， J=12.0 Hz, siaH— 3ax); 13C—画 R (125MHz, D20) δ 173.29, 171.20, 170.86， 134.33, 118.98, 100.58, 96.79， 73.10, 72.24, 70.31, 69.57, 69.24, 68.98, 68.46， 68.21, 64.52, 63.49, 52.97, 51.09, 43.05, 42.97, 40.62; HRMS (m/z)： [M+Na] ÷ calcd. for [C22H34Cl2N2Na014]+， 643.1279; found 643.1306 实施例 34 化合物 35的合成
由化合物 50和二氯乙酸曱酯制备， 具体操作步骤同化合物 7的合成。 产率 43 %。
Ή-NMR (500MHz, D20) δ 6.35 (s, 1H)， 6.32 (s, IH) , 6.01-5.92 (m, IH), 5.35 (dq, 1H， J =1.5 Hz, 17.5 Hz), 5.26 (dq, IH, J =1.5 Hz, 10.5 Hz), 4.92 (d, IH, J=3.5 Hz, anomeric H of GalN), 4.22 (ddt, IH, J2=l.5Hz, J3=5.5 Hz, J 4=13.0 Hz), 4.18 (dd, IH, =3.5 Hz, J2 =11.0 Hz), 4.10 (dd, 1H， J! =4.5 Hz, J2 =8.0 Hz), 4.08-3.84 (m, 8H) , 3.75 (ddd, IH, ],=4.5 Hz, J2=9.0 Hz, J3=12.0 Hz), 3.66-3.61 (m， 2H) , 3.57 (dd, IH, J^l.5 Hz, J2 =9.5 Hz), 2.74 (dd, IH, J:=5.0Hz, J2=12.5 Hz, siaH— 3eq)， 1.69 (t, IH, J=12.0 Hz, siaH-3ax)； 13C-NMR (125 MHz, D20) δ 173.99, 168.21, 168.04， 134.29, 119.14, 101.10, 96.41， 72.89, 72.65, 70.37， 69.60, 69.25, 69.08， 68.67, 68.03, 66.96, 66.76， 64.52, 63.36, 53.32, 51.64, 41.04; HRMS (m/z)： [M+H]+ calcd. for [C22H33C14N20"]+, 689.0680; found, 689.0671 - 实施例 35 化合物 36的合成
由化合物 50和三氯乙酸甲酯制备， 具体操作步骤同化合物 7的合成。 产率 64 %。 -醒 (500MHz, D20) δ 6.01—5.91 (m, 1H)， 5.35 (dq, 1H, J =1.5 Hz, 17.5 Hz), 5.26 (dd, 1H, J, =1.5 Hz, J2=10.5 Hz), 5.01 (d， 1H, J=3.5 Hz, anomeric H of GalN), 4.25 (ddt, 1H,
Figure imgf000023_0001
Hz), 4.20 (dd, 1H, Jt =3.5 Hz, J2=ll.0 Hz), 4.14-3.80 (m, 10H), 3.66 (dd, 1H, J =4.0 Hz, J2=ll.0 Hz), 3.63 (dd, 1H， J! =6.5 Hz, J2=ll.5 Hz), 3.59 (dd, 1H, J, =1.5 Hz, J2=9.5 Hz), 2.76 (dd, 1H, J, =4.5 Hz, J2 =12.5 Hz, ， siaH-3eq), 1.72 (t, 1H， J^Jf .5 Hz, siaH- 3ax); 13C—丽 R (75 MHz， D20) δ 173.96, 165.38, 134.06, 119.05, 100.98, 96.14, 72.60, 72.46, 70.26, 69.47, 69.18, 69.18, 69.01, 68.27， 67.56, 64.41, 63.14, 54.42， 52.84, 41.14; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C22H3。Cl6N2Na014] +, 778.9720; found, 778.9698 实施例 36 化合物 37的合成
化合物 39 (其制备方法见实施例 38 ) (18.0 rag, 0.032 mmol) 溶于 5 mL曱 醇中， 加入 50% 的 NH20H 水溶液 (0.5 raL, 7.57 mmol) 和 KCN (1.0 mg, 0.016 raraol) , 室温搅拌 20小时。 真空下浓缩反应液， 残留物先过 C18柱， 再过 Ρ2柱， 水洗脱。 得到纯品。 收率 50%。
丽 R (500 MHz, D20) δ 6.01-5.93 (m, 1H) , 5.36 (d, 1H, /, = 17.0 Hz), 5.26 (d, 1H, Jj = 10.5 Hz), 4.92 (d， 1H, / = 4.0 Hz, anomeric H of GalN) , 4.20 (ddd, 1H, = 1.0 Hz, J2= 5.5 Hz, 13.0 Hz), 4.15 (dd, 1H, = 3.5 Hz, J2 = 11.0 Hz), 4.06 (dd, 1H, = 4.0 Hz, = 8.0 Hz) , 4.04—3.98 (m, 2H) , 3.96—3.82 (m, 5H) , 3.79-3.72 (m, 2H) , 3.71-3.62 (ra, 3H) , 2.73 (dd, 1H, J1 = 4.5 Hz, J2= 13.5 Hz, siaH-3eg), 2.03 (s, 6H)， 1.83 (t, 1H, J, = J2= 12.5 Hz, siaH-3aA-); 13C— NMR (125 MHz, D20) δ 175.64, 175.22, 166.20, 134.26, 118.61， 100.03, 96.91， 74.23, 71.78, 70.02, 69.34, 69.08， 68.28， 68.14, 67.62, 63.76, 63.44, 52.16, 50.41， 39.13, 22.64, 22.52; HRMS (m/z)： [M+Na] + calcd. for [C22H37N3Na014]+， 590.2168; found, 590.2163. 实施例 37 化合物 38的合成 化合物 39 (10.0 mg, 0.0177隱 ol) 溶于 2 mL曱醇中， 分三批加入 NaBH4 (6.0 mg, 0.158 mmol) , 室温搅拌 1小时。 真空下浓缩反应液， 残留物先过 C18柱， 水 / 曱醇洗； 再过 Ρ2柱， 水洗脱。 得到纯品。 收率 94%。
'H-NMR (500 MHz, D20) δ 6.02-5.92 (m， 1Η), 5.34 (dd, 1H, = 1.5 Hz, J 2 = 12.5 Hz), 5.25 (d， 1H, / = 10.5 Hz), 4.94 (d, 1H, / = 3.5 Hz, anomeric H of GalN), 4.21 (ddd, 1H, J,= 1.0 Hz, J2= 5.5 Hz, J3= 13.0 Hz), 4.16 (dd, 1H, ^ = 3.5 Hz, J2= 11.0 Hz), 4.08-4.00 (m, 3H) , 3.95-3.78 (m, 8H) , 3.74-3.68 (m， 2H), 3.62 (dd, 1H, Js= 6.0 Hz, J2= 12.0 Hz), 3.52 (d, 1H, / = 9.0 Hz) , 2.30 (dd, 1H, J,- 5.5 Hz, J2= 13.5 Hz, siaH-3eq), 2： 04 (s, 3H) , 2.03 (s, 3H), 1.75 (t, 1H, / = 13.0 Hz, siaH— 3ax); 13C— NMR (125 MHz, D20) δ 177.44, 177.09, 136.14, 120. 4, 102.79, 98.77, 74.09， 73.07, 72.25, 71.21, 71.04, 70.80, 70.25, 70.08, 65.59, 63.56, 62.79, 54.69, 52.33, 38.67, 24.54, 24.38. HRMS (m/z) [M+Na]+ calcd. for [C22H38N2Na013]+, 561.2266; found, 561.2267 实施例 38 化合物 39的合成
化合物 48 (其制备方法见实施例 42 ) (100 mg, 0.119 mmol) 溶于 10 mL曱 醇中， 加入 NaOMe/MeOH溶液 (30%, 0.02 g, 0.11 mmol)， 室温搅拌 4小时。 反应 体系用 IN HCl/MeOH调 PH至 6后， 反应液在真空下浓缩。 初产物过 C18柱， 水 / 曱醇洗脱。 得到纯品。 收率 95%。
'H-NMR (500 MHz, D20) δ 6.02-5.92 (m, 1Η) , 5.35 (dq, 1H, / = 1.5 Hz,
17.5 Hz), 5.27 (dd, 1H， J, = 1.5 Hz, J2= 10.5 Hz) , 4.92 (d， 1H， J = 3.5 Hz, anomeric H of GalN), 4.21-4.14 (ra, 2H) , 4.06-3.96 (m, 4H) , 3.93-3.83 (m, 8H), 3.7 (ddd, 1H, = 4.5 Hz, J2= 10.0 Hz, J3= 12.0 Hz), 3.71-3.64 (m， 2H), 3.56 (d, 1H， /= 9.5 Hz), 2.71 (dd, 1H, /,= 4.5 Hz, J3= 13.0 Hz, , siaH-3eg) 2.04 (s， 6H), 1.83 (t, 12.5 Hz, siaH— 3ax); 13C— NMR (125 MHz, D20) δ
175.70, 175.36, 170.58, 134.36, 118.79, 99.64， 97.06, 73.62, 71.30, 70.10, 69.51， 69.25, 69.01, 68.31, 67.89, 64.55, 63.85， 54.16, 52.44, 50.53, 39.83, 22.82, 22.64; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C23H38N2Na014] +, 589.2215; found, 589.2223. 实施例 39 化合物 40的合成
由化合物 61 (其制备方法见实施例 47 ) 制备， 具体操作步骤同化合物 3的合 成。 产率 95%。
Ή-NMR (500 MHz, D20) δ 6.04-5.95 (m, 1H), 5. 38 (dq, 1H, / = 1.5 Hz, 17.5 Hz), 5.28 (dd, 1H， J} = 1.5 Hz, J2 = 10.5 Hz), 4.97 (d， 1H, / = 3.5 Hz, anomeric H of Gal), 4.21 (ddd, 1H, J,= 1.0 Hz, J2: 5.5 Hz, J3= 13.0 Hz), 4.16 (dd, 1H, = 3.5 Hz, J2 = 11.0 Hz), 4.10-4.02 (m, 2H) , 3.98 (d， 1H, / = 2.5 Hz), 3.96-3.60 (m， 9H) , 3.58 (dd, 1H, = 1.5 Hz, /, = 8.5 Hz) , 2.72 (dd, 1H, J,= 4.5 Hz, J3= 13.0 Hz, , siaH— 3eg)， 2.03 (s， 3H)， 1.74 (t, J = 12.5 Hz, siaH- 33 ； 13C-NMR (125 MHz, D20) δ 175.76, 173.21, 134.35， 119.10， 100.47, 98.31, 73.45, 72.13, 70.07, 70. 00, 69.54, 69.02, 68.85, 68.63, 64.45， 63.51， 52.55, 40.56, 22.80; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C2。H33NNa014] +, 534.1793: found, 534.1789 实施例 40 化合物 41的合成
由化合物 63 (其制备请见实施例 48 )制备， 具体操作步骤同化合物 3的合成。 产率 95%。
Ή-NMR (500 MHz, D20) δ 6.01-5.92 (m, 1H), 5. 35 (dq, 1H, / = 1.5 Hz, 17.0 Hz), 5.28 (dd, 1H， J} = 1.5 Hz, J2= 10.5 Hz), 4.97 (d, 1H， / = 3.5 Hz, anomeric H of GlcNAc), 4.21 (ddd, 1H, J, = 1.5 Hz, J2= 5.0 Hz, J3= 13.0 Hz), 4.02 (ddd, 1H， = 1.5 Hz, J2= 6.0 Hz, J3= 13.0 Hz) , 3.98 (dd, 1H, J, = 5.0 Hz, J 2 = 10.5 Hz), 3.93 (dd, 1H, = 4.0 Hz, J2 = 10.5 Hz), 3.91—3.79 (m, 4H), 3.78-3.61 (m， 5H) , 3.59 (dd, 1H, ^ = 1.5 Hz, J2 = 9.0 Hz) , 3.53 (dd, 1H, = 9.5 Hz, = 10.0 Hz), 2.75 (dd, 1H, ^= 4.5 Hz, = 12.0 Hz, , siaH- 3e<2), 2.04 (s， 3H), 1.71 (t， /= 12. 0 Hz, siaH- 3a ); nC-NMR (125 MHz, D20) δ 175.80 175.16, 174.15, 134.32, 118.80, 100.89, 96.77， 73.24, 72.51, 71.75, 71.32, 70.68， 69.38, 69.00, 63.56, 63.36, 54. 31, 52.63, 40.87, 22.76, 22.58; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C22H36N2Na014] +， 575.2059; found, 575.2067 实施例 41 化合物 42的合成 由化合物 49 (其合成见实施例 42 ) 制备， 具体操作步骤同化合物 3的合成。 产率 95%。
Ή-NMR (500 MHz, D20) δ 6.02-5.94 (m, 1H), 5. 35 (dd， 1H， = 17.0 Hz, ) , 5.26 (d, 1H, J! = 10.5 Hz), 4.95 (d， 1H, / = 3.5 Hz, anomeric H on GalNAc), 4.21 (dd, 1H, = 5.0 Hz, J2= 13.0 Hz) , 4.18 (dd, 1H, = 4.5 Hz, = 8.5 Hz), 4.11-4.02 (m, 4H) , 3.93-3.83 (m, 5H), 2.75 (dd, 1H， = 5.5 Hz, J2 = 10.0 Hz) , 3.76 (dd, 1H, = 5.5 Hz, 12.0 Hz), 3.56 (d, 1H, / = 9.0 Hz) , 3.47 (dd, 1H, /； = 8.5 Hz, /,= 10.0 Hz), 2.39 (dd, 1H, = 5. 0 Hz, = 13.0 Hz, sialH-3eg), 2.05 (s， 3H) , 2.04 (s, 3H) , 1.68 (dd, 1H, = 12.5 Hz, J2 = 12.0 Hz, sialH- 3ax); 13C- NMR (125 MHz, D20) δ 177.45, 177.20, 174.52, 136.43, 120.45, 101.42, 99.08, 73.28， 72.59, 72.01, 71.44， 71.27, 70.52, 70.24, 69.11, 65.92, 65.00， 54.50, 52.45, 41.92, 24.70, 24.53; HRMS (m/z) [M+Na]+ calcd. for C22H3 Na014, 575.2059; found, 575.2050. 实施例 42 化合物 48和 49的合成
化合物 46 (1.07 g, 2.93 mmol, 1.00 eq, 参 United States Patent 制备）、 化合物 47 (2.06 g, 3.38 mmol, 1.15 eq, 参照 /. Org. Chem. 2000， 65, 144- 151制备） 及分子筛放入 100 mL两口瓶中， 氩气保护下加入 40 mL THF, 室温 搅拌半小时。 冷至- 72 °C, 在 15分钟内 TMSOTf (70 μ L， 0.36 mmol, 0.11 eq) 分 三批加入反应体系。 4小时后， TLC监测原料反应完全， 加入三乙胺（1.0 mL) , 硅 藻土床过滤， 滤液真空下浓缩后经硅胶柱分离得到纯品。 产率 84 %， 48/49 =1/1.2„ 化合物 48: - NMR (500 MHz, CDC13) δ 8.08-8.05 (m, 2H) , 7.60—7.50 (m, 1H), 7.50-7.40 (m, 2H) , 5.97-5.87 (m, 1H), 5.75 (d, 1H, 10.0 Hz, NHAc) , 5.42 (d， 1H, / = 10.0 Hz, NHAc) , 5.40-5.31 (ra, 3H) , 5.29 (dd, 1H, = 3.0 Hz, = 11.0 Hz), 5.23 (ddd, 1H, /,= 1.0 Hz, J2= 3.0 Hz, J3= 10.5 Hz), 4.96 (d, 1H, / = 3.5 Hz, anomeric H of GalNAc), 4.92-4.85 (m, 2H) , 4. 36 (dd, 1H, = 2.5 Hz, = 12.5 Hz), 4.25-4.20 (m, 2H) , 4.18—4.00 (m, 5H) , 3.88 (dd, 1H, /, = 5.5 Hz, J2 = 10.0 Hz), 3.80 (s, 3H) , 3.75 (dd, 1H, = 7.0 Hz, J2 = 10.0 Hz), 3.02 (d, 1H, / = 3.0 Hz, OH) , 2.59 (dd, 1H, /； = 5.0 Hz, J2= 13.0 Hz, sialH— 3eg), 2. 14 (s, 3H, OAc)， 2.11 (s, 3H, OAc)， 2.01 (s， 3H， OAc)， 1.98 (t, 1H， / = 13.0 Hz, sialH- 3aA：)， 1.97 (s, 3H, OAc), 1.88 (s， 3H, NAc) , 1.87 (s, 3H, NAc); 13C-丽 R (125 MHz, CDC13) δ 170.93, 170.86, 170.25, 170.18, 170.15, 169.92, 168.03, 166.67， 133.53， 133.31, 129.92, 129.52, 128.46, 117.90, 98.70, 96.96, 72.78, 72.19, 69.10, 69.03, 68.68, 68.36， 67.40, 66.89: 62.96, 62.54, 23.30, 23.13, 21.03, 20.82, 20.77， 20.63. HRMS (m/z) [M+Na] + calcd. for [C38H5 Na019] +, 861.2900; found, 861.2903
化合物 49: Ή-NMR (500 MHz, CDC13) δ 8.12-8.08 (m, 2H) , 7.60—7.52 (m, 1H)， 7.47-7.40 (m， 2H) , 5.96—5.84 (m, 2H) , 5.62 (d, 1H, /= 10.0 Hz, NHAc)， 5. 4-5.28 (m， 5H) , 5.23 (dd, 1H, = 1.5 Hz, J2 = 10.5 Hz), 4.94 (d, 1H, / = 3.5 Hz, anomeric H of Gal NAc), 4.85 (ddd, 1H, ^= 4.0 Hz, J2= 10.0 Hz, J3= 11.0 Hz), 4.78 (dd, 1H, = 2.0 Hz, J2 = 12.5 Hz), 4.40-4.32 (m, 2H)， 4.21 (ddt, 1H, 1.0 Hz, J3= 5.0 Hz, J4= 12.5 Hz), 4.16 (dd, 1H, /,
= 8.0 Hz, J2 = 12.5 Hz), 4.11 (dd, 1H, 7, = 5.0 Hz, = 8.5 Hz), 4.02-3.96 (dd, 1H, = 6.0 Hz, J2 = 12.0 Hz), 3.88 (t, 1H, J, = J2= 9.0 Hz), 3.82 (s, 3H), 3.82-3.72 (m, 1H) , 3.57 (d， 1H, / = 4.0 Hz, OH), 3.50 (dd, 1H, ^ = 5.0 Hz, = 9.0 Hz) , 2.51 (dd, 1H, = 5.0 Hz, J2= 13.0 Hz, sialH— 3eg), 2.14 (s， 3H, OAc), 2.16-2.10 (1H, overlapped, sialH-3aAr), 2.11 (s, 3H, OAc), 2.05 (s， 3H, OAc), 1.98 (s, 3H, OAc), 1.85 (s， 3H, NAc), 1.80 (s, 3H, NAc); 13C-腿 (125 MHz, CDC13) δ 171.43, 170.77, 170.47， 170.00, 167.13, 166.73, 133.54, 133.31, 129.97, 129.44, 128.40, 117.63, 98.29， 97.08, 72.07, 71.59, 70.95, 68.88, 68.38, 68.23, 68.11, 66.46, 62.45, 61.57, 52.77, 49.90， 47.83, 37.41, 23.19, 23.14, 21.09, 20.85, 20.81, 20.75. HRMS (m/z) [M+Na] + calcd. for [C38HsoN2Na019]+, 861.2900; found, 861.2882 实施例 43 化合物 50的合成
化合物 48 (100 mg, 0.119 mmol) 溶于 10 mL甲醇中，加入 NaOMe/MeOH溶液 （30% 0.02 g， 0.11 ramol) , 室温搅拌 4小时。 蒸干溶剂， 加入 NaOH水溶液（2 N, 3 mL) , 加热至 90 °C反应 8小时。 用 IN HCl/MeOH调 PH至 4- 7后。 反应液在真空下浓缩。 初产物过 P- 2柱， 水 /甲醇洗脱。 得到纯品。 收率 88%。 'H-NMR (500 MHz, D20) δ 6.02—5.96 (m, 1H), 5. 37 (ddd, 1H, = 1.5 Hz, J 2= 3.0 Hz, Λ= 17.5 Hz), 5.29 (dd, 1H, J, = 1.5 Hz, J2 = 10.5 Hz) , 5.11 (d, 1H, / = 3.5 Hz, aneraoeric H of GalN), 4.26 (dd, 1H, /； = 5.5 Hz, J2= 12.5 Hz), 4.09-4.05 (m, 2H) , 3.99—3.96 (m, 2H) , 3.93-3.88 (ra, 3H) , 3.80 (dd, 1H, / = 2.0 Hz, J2= 9.0 Hz), 3.73-3.68 (m, 2H) , 3.61 (dd, 1H, = 4.0 Hz, J2 = 10.5 Hz), 3.57-3.54 (m, 1H), 3.38-3. 35 (m, 1H)， 2.95-2.91 (m, 1H), 2.72 (dd, 1H, 4.5 Hz, J2= 12.5 Hz, sialH-3eg) , 1.64 (t, 1H, J = 12.5 Hz, sialH-3aA:); 13C-画 R (75 MHz, D20) δ 176.08, 135.91, 121.21, 102.96, 8.07, 76.19, 74.57, 72.38, 71.83, 71.58, 70.82, 70.60， 70.18, 66.26, 65.07, 54.99， 53.35, 42.87; HRMS ( /z) [M+Na]+ calcd. for [C18H32N2Na012] +, 491.1847; found, 491.1852 实施例 44 化合物 52和 55的合成
由化合物 51 (参照 United States Patent 6013779的方法制备）和化合物 46 (参照 United States Patent 6013779制备）制备， 具体操作步骤同化合物 48的 合成。 收率 81%, 52/55 = 2.6 。
合物 52: 'H-NMR (500 MHz, CDC13) δ 8.08-8.04 (m， 2Η) , 7.60-7.52 (m, 1Η)， 7.50-7. 39 (m, 2Η) , 7.10 (d, 1Η, /= 10.0 Hz, NHTFA) , 5.98—5.87 (m, 1H), 5.78 (d, 1H, / = 10.0 Hz, NHAc) , 5.38—5.27 (m, 4H)， 5.25 (dd, 1H, J, = 1.0 Hz, J2 = 10.0 Hz) , 5.23 (ddd, 1H, = 4.5 Hz, J2 = 10.5 Hz, J3 = 12.0 Hz), 4.96 (d, 1H, / = 3.5 Hz, anomeric H of GalNAc), 4.88 (ddd, 1H, = 4.0 Hz, J2 = 10.0 Hz, J3 = 11.0 Hz), 4.38 (dd, 1H， J, = 2.0 Hz, J2 = 12.5 Hz), 4. 30 (dd, 1H, = 2.0 Hz, J2 = 12.5 Hz), 4.25-4.20 (m, 2H) , 4.08 (dd, 1H, = 6. 0 Hz, J2 = 12.5 Hz) , 4.06-4.00 (m, 3H) , 3.88 (dd, 1H, = 5.5 Hz, = 9.5 Hz), 3.80 (s, 3H, COOMe) , 3.78 (dd, 1H, = 7.0 Hz, = 9.5 Hz), 3.08 (d, 1H, / = 3.0 Hz, OH), 2.63 (dd, 1H, = 5.0 Hz, J2= 13.0 Hz, sialH-3eq) , 2.14 (s, 3H, OAc), 2.11 (s, 3H, OAc)， 2.12 (s, 3H, OAc)， 1.97 (t, 1H, J,=J2 = 12.5 Hz sialHH 1.99 (s, 3H, OAc), 1.96 (s， 3H, OAc), 1.88 (s, 3H, NAc) ; 13C— NMR (125 MHz, CDC13) δ 170.90， 170.86, 170.42, 170.13, 169.94, 167.86, 166.86， 157.59 (q, 1C, /= 37.5 Hz, carbonyl in TFA) 133.51, 133. 37, 129.89, 129.46, 128.46, 117.92, 115.05 (q, 1C， J= 286.2 Hz, CF3) , 98.70, 96.96, 72.21, 71.99， 69. 31, 68.71, 68.47, 68.38, 67.26, 66.84, 63.06, 62.38， 53.10, 49.91, 47. 32, 37.10, 23.24, 21.00, 20.59, 20.57, 20.54; HRMS (m/z) [M+Na]+ calcd. for [C3SH47F3N2Na019]+， 915.2617; found, 915.2615.
化合物 55: Ή-NMR (500 MHz, CDC13) δ 8.10-8.04 (m, 2H) , 7.56 (t， IH,
J = 7.5 Hz), 7.43 (q, 2H, / = 8.0 Hz) , 5.98-5.87 (m, IH), 5.88 (d, IH, J = 10.0 Hz, NHTFA) , 5.42-5.28 (m, 4H) , 5.25 (dd, 1H， J, = 1.0 Hz, J2 = 10.0 Hz), 4.96 (d, 1H， / = 3.5 Hz, anomeric H of GalNAc), 4.84 (ddd, IH, J,= 4.0 Hz, J2 = 10.0 Hz, J3 = 11.0 Hz), 4.78 (dd, IH, = 2, 0 Hz, J2 = 12.0 Hz), 4.46 (dd, IH, J, = 2. Q Hz, J2 = 10.5 Hz), 4.35 (br, IH), 4.21 (dd, IH, = 5.0 Hz, J2 = 12.5 Hz), 4.14 (dd, IH, = 8.0 Hz, J2 = 12.0 Hz), 4. 10 (dd, IH, J, = 5.0 Hz, = 8.0 Hz) , 4.00 (dd, IH, = 5.5 Hz, J2 = 12.5 Hz)， 3.96-3.88 (m, 2H), 3.83 (s, 3H, COOMe)， 3.58—3.50 (m, 2H) , 3.45-3.87 (br, IH) , 2.54 (dd, IH, /;= 5.0 Hz, J2= 13.0 Hz, sialH— 3eg), 2.26 (br, IH) 2.13 (s， 3H, OAc), 2.07 (s, 3H, OAc) , 2.05 (s， 3H, OAc) , 1.99 (s, 3H, OAc) , 1.96 (s, 3H, OAc), 1.86 (s， 3H, NAc) , 1.86 (t, IH, /； = J2= 12.5 Hz, overlapped, sialH— 3ax); 13C— NMR (75 MHz, CDC13) δ 171.56, 170.84, 170.64, 170.27, 170.20: 166.89, 157.76 (q, 1C， /= 37.7 Hz, carbonyl in TFA), 133.48, 129.95， 129.29, 128.51, 117.87, 115.40 (q, 1C, /= 285.7 Hz, CF3) 98.30, 97.05， 72.09, 71.81, 70.57， 68.67， 68.48, 68.03, 67.88, 66.53, 62. 31, 61.69, 52.92, 50.13, 47.70, 37.35, 23.22, 21.02, 20.79, 20.58; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for
[C38H47F3N2Na019] +, 915.2617; found, 915.2626 实施例 45 化合物 54的合成
由化合物 47 ( reirahedron Leii. 1992, 33, 6123- 6126. )和化合物 53 (其 制备方法见实施例 46 ) 制备， 具体操作步骤同化合物 48的合成。 收率 58%。
Ή-NMR (500 MHz, CDC13) δ 8.14-8.10 (m, 2H) , 7.62-7.56 (m, IH) ,
7.50-7.39 (t, 2H, / = 8.0 Hz) , 6.00-5.91 (m， IH), 5.49 (dd, IH, = 3.5 Hz,
J2 = 11.0 Hz) , 5.42-4.80 (m， 3H) , 5.25 (dd, IH, = 1.5 Hz, J2 = 10.5 Hz), 5.22 (d， IH, /= 10.0 Hz, NHAc) , 5.11 (d, IH, /= 3.5 Hz, anomeric H of GalNAc), 4.88 (ddd, 1H, = 4.5 Hz, J2 = 9.5 Hz, J3= 12.0 Hz), 4.38 (dd, 1H, = 2.0 Hz, = 12.5 Hz), 4.36-4.33 (m， 1H), 4.28 (ddt, 1H, J;= = 1.5 Hz, = 5.0 Hz, = 13.0 Hz) , 4.13—3.97 (m， 6H) , 3.87 (dd, 1H, = 5.5 Hz, = 9.5 Hz) , 3.81 (s， 3H, COOMe) , 3.78 (dd, 1H, = 7.0 Hz, J2 = 9.5 Hz), 3.20 (d， 1H， / = 4.5 Hz, OH), 2.57 (dd, 1H, /； = 4.5 Hz, /,= 13.0 Hz, sialH-3eg), 2.12 (s, 3H, OAc), 2.10 (s, 3H， OAc) , 2.03 (s, 3H, OAc) , 2.02 (t， 1H, J, =J2 = 12.5 Hz sialH- 3ax)， 1.91 (s， 3H, OAc), 1.87 (s， 3H, NAc) ; 13C-画 R (75 MHz, CDC13) δ 171.00, 170.86, 170.45, 170.29, 170.11, 167.96， 165.66, 133.29, 133.15, 129.89, 129.46, 128.35, 117.85, 98.54， 97.13, 72.76, 71.55, 69.36, 68.91, 68.55， 68.45, 67.32, 66.78, 62.77, 62.54， 57.60, 52.98, 49.07, 36.70, 23.00, 20.97, 20.73, 20.66, 20.48; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C36H46N4Na018] +, 845.2699; found, 845.2690 实施例 46 化合物 60和 53的合成
化合物 56 (7.91 g， 21.2 mmol, 参照 reirahedro/i Leii. 2005, 46, 8993-8995 制备） 溶于 66 mL二氯曱烷中， 加入 AllylOH (7.0 ml, 102 mmol), 和 BF3Et20 (25 ml, 197.5 mmol) , 并加热回流 3小时。 补加 BF3Et20 (10 mL, 79 mmol)后， 继续加 热回流 3小时。 减压蒸干溶剂， 乙酸乙酯萃取（150 mLx 3) , 合并有机相， 并用无 水 Na2S04干燥， 过滤， 浓缩， 硅胶柱过滤得到 5.68 g不可分得异头混合物 57。
化合物 57 ( 4.82 g, 13.0 mmol, 制备方法见前段） 溶于 70 mL 甲醇中， 加 入 NaOMe/MeOH (30%, 0.5 g, 2.78 mmol) , 室温搅拌半小时。 强酸性树脂中和， 过 滤， 真空下蒸干溶剂， 得到 2.88 g化合物 58, 收率 91%。
化合物 58 (制备方法见前段） 溶于 10mL乙腈中， 加入 PhCH(0Me)2 (2.15 g, 14.13 mmol) 和 CSA (203 mg, 0.88 mmol) , 室温搅拌 18小时。 加入三乙胺（0.2 g， 2.0 mmol) , 减压蒸干溶剂， 硅胶柱纯化， 得到 2.78化合物 59, 尽管该步骤可以分 开 α异构体， 但是并不是太稳定， 因此得到的是未完全分纯的异构体。
化合物 59 ( 2.78 g, 8.35 mmol, 其制备方法见前段） 溶于 10 mL吡啶中， 加 入 DMAP (70 mg, 0.6 mmol) , 水 7j浴冷却。 滴加 BzCl (1.8 mL, 15 mmol) , 加毕， 室温搅拌 24小时。 减压蒸干溶剂， 用 KHC03溶液中和， 乙酸乙酯萃取（150 mLx 3) , 合并有机相， 无水硫酸钠干燥， 减压蒸干溶剂， 浓缩物用硅胶柱纯化。 得到化合物
60。 收率 88 %„
化合物 60: NMR (300 MHz, CDC13) δ 8.14-8.07 (m, 2H) , 7.63-7.55 (m, 1H), 7.48-7.43 (m, 4H) , 7. 37-7.33 (m. 3H)， 6.02-5.95 (m, 1H), 5.60 (dd， 1H, = 3.6 Hz, J2= 11.1 Hz, H-3), 5.55 (s, 1H)， 5.37 (dq, 1H, /,= 1.5 Hz, 17.1 Hz, terminal H of vinyl in allyl), 5.26 (dd， 1H, = 1.5 Hz, J2= 10.2 Hz, terminal H of vinyl in allyl), 5.19 (d, 1H, / = 3.0 Hz, anomerci H) , 4.63 (d, 1H, J = 2.7Hz) , 4.29 (dd, 1H, Jt = 2. S Hz, /,= 12.3 Hz, H— 6a) , 4.28 (ddt, 1H, Ji =J2 = 1.5 Hz, J3 = 5.4 Hz, = 13.0 Hz, — 0CH2 in allyl), 4.16-4.08 (m, 3H), 3.90-3.86 (br， 1H), 13C— NMR (75 MHz, CDC13) δ 171.89, 165.95, 137.44, 133.68, 133.44, 133.04, 130.13, 129.90, 129.29， 128.89, 128.74, 128.44, 128.08, 125.96, 118.20， 100.48, 97.50， 73.51, 70.05, 69.07， 68.83， 62.67, 57.53; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for [C23H23N3Na06] +, 460.1479; found, 460.1488.
化合物 60 ( 688 mg, 1.57 醒 ol, 其制备方法见前两段） 溶于 10 mL曱醇溶液 中， 加入强酸性树脂（668 mg) , 40 °C 反应 4小时。 过滤， 滤液在真空下浓缩， 浓 缩物用硅胶柱纯化， 得到 402 mg白色固体 53。 收率 73%。
Ή-NMR (500 MHz, CDC13) δ 8.09-8. 05 (m, 2H) , 7.60-7.55 (m, 1H), 7.46-7.42 (m, 2H) , 5.97—5.88 (m, 1H) , 5.45 (dd, 1H, = 3.0 Hz, J2= 11. 0 Hz, H-3), 5.34 (dq, 1H, J7 = 1.5 Hz, =17.5 Hz, terminal H of vinyl in allyl), 5.24 (dq, 1H, J= 1.5 Hz, =10.0 Hz, terminal H of vinyl in allyl), 5.08 (d, 1H， J = 3.5 Hz, animeric H) , 4.39 (d, 1H, J = 2.5 Hz, H-4) , 4.22 (ddt, 1H, = = 1.5 Hz, J3 = 6.5 Hz, J4= 13.0 Hz, -0CH2 in allyl), 4.05 (ddt, 1H, = = 1.5 Hz, J3= 6.5 Hz, J4= 13.0 Hz, — 0CH2 in allyl), 4.00—3.94 (m, 2H) , 3.91-3.81 (m, 2H) , 3.55 (br, 1H, OH) , 2.93 (br, 1H， OH); 13C-NMR (75 MHz, CDC13) δ 165.74, 133.55, 133.04, 129.81, 129.10, 128.49， 118.03, 97.28, 71.61， 69.14, 68.73, 62.85, 57.45; HRMS (m/z)： [M+Na]+ calcd. for
[C16H19N3Na06]+, 372.1166; found, 372.1158 实施例 47 化合物 61的合成 由化合物 47和化合物 62 (Carbohydr. Res. 1994, 253, 167- 183. )制备， 具 体操作步骤同化合物 48的合成。 收率 51%。
!H-NMR (500 MHz, D20) δ 8.05-7.98 (m, 4Η) , 7.53-7.48 (m, 2Η)， 7.40-7.35 (m, 4H), 5.90-5.81 (m, 1H), 5.73-5.67 (m, 2H) , 5.40-5.26 (m， 5H), 5.16—5.12 (m, 1H), 4.90 (ddd, 1H, /； = 4.5 Hz, = 9.5 Hz, J3= 11.5 Hz), 4.41-4. 37 (m, 2H), 4.25 (ddt, 1H, J, = J2= 1.5 Hz, /,= 5.5 Hz, J4= 13.5 Hz) , 4. 18 (t， 1H, = = 6.0 Hz) , 4. 16-4.02 (m， 4H)， 3.92 (dd, 1H, = 5.5 Hz, J2 = 9.5 Hz) , 3.82 (s, 3H, COOMe, overlapped), 3.84-3.80 (m， 1H, overlapped), 3.12 (b， 1H, OH), 2.59 (dd, 1H, = 5.0 Hz, J2= 13.0 Hz, sialH-3eq) , 2.14 (s, 3H, OAc), 2.11 (s, 3H, OAc), 2.03 (s, 3H, OAc), 2.02 (t, 1H, 12.5 Hz sialH— 3a ), 1.94 (s, 3H, OAc), 1.88 (s， 3H, NAc) ; 13C-丽 R (125 MHz, CDC13) δ 170.93, 170.27, 170.23, 170.19, 168.05， 165.99, 165.92, 133.57, 133. 12, 129.79, 129.77, 129.66, 129.52, 128.33, 117. 38, 98.70, 95.73, (77.25, 77.00, 76.74 CDC13), 72.85, 71.13, 69.24, 68.96, 68.87, 68.51, 68.22, 67.65, 67.40, 62.93, 62.57, 53.03, 49.35, 36.98， 23.14, 21.04, 20.81, 20.76， 20.54; HRMS (ffl/z)： [M+Na]+ calcd. for [C„H51NNa02。]+, 924.2897; found, 924.2905 实施例 48 化合物 63的合成
由^ ί匕合物 47和化合物 64 (Monatshefte fuer Chemie. 2002, 133, 531-540. ) 制备， 具体操作步骤同化合物 48的合成。 收率 56%。
'H-NMR (500 MHz, D20) δ 8.06-8.03 (m, 2Η)， 7.58-7.53 (m, 1H), 7.45-7.41 (m, 2H), 5.94-5.85 (m, 2H) , 5.49-5.41 (m, 2H) , 5. 35-5.21 (m， 4H)， 5.05—4.97 (m, 1H), 4.92 (d， 1H, 7 = 4.0Hz, anomeric H on GlcNAc), 4.45 (ddd, 1H, J, = 4. 0 Hz, J2= 10.0 Hz, J3= 11.0 Hz), 4.29-4.22 (m, 2H) , 4.25 (ddt, 1H, /, = J2= 1.5 Hz, J3= 5.5 Hz, J4= 12.5 Hz), 4.14 (dd, 1H， /；= 1.5 Hz, Λ= 10.5 Hz), 4.10-3.96 (m, 4H) , 3.81 (s, 3H, COOMe) , 3.83-3.78 (1H， overlapped), 3.76 (dd, 1H, = 1.5 Hz, J2- 11.2 Hz), 3.44 (br. , 1H, OH) , 2.66 (dd, 1H, = 5.0 Hz, = 13.5 Hz, sialH— 3eg)， 2.11 (s, 3H, OAc), 1.90-1.80 (1H, sial Η-33Λ-, overlapped), 2.06 (s， 3H, OAc), 2.00 (s， 3H, OAc), 1.90 (s, 3H, OAc), 1.86 (s, 3H, NAc), 1.84 (s， 3H， NAc); 13C-N R (125 MHz, CDC13) δ 170.99, 170.60， 170.34, 170.05, 169.98， 169.56， 168.24, 167.34， 133.34, 133.22, 129.80, 129.58, 128.36, 118.00, 97.86, 96.74, 73.80, 72.22, 71.16， 68.85, 68.49, 68.37, 68.01， 67.11, 62.76， 62.18, 52.87， 51.86， 49.59, 37.77, 23.13, 23.09, 21.02， 20.87, 20.65, 20.27; HRMS (m/z) [M+Na] + calcd. for C38H5具 Na019, 861.2900; found, 861.2872 实施例 49 制备半抗原 2-14， 16-24, 29-34, 42 与载体蛋白质 （多肽） 的 缀合物
将半抗原 （化合物 2, 10毫克）溶解于 2毫升无水甲醇中， - 72°C下通入含有 臭氧的空气， 当体系变成蓝色（约需 10-30分钟）后， 停止通臭氧， 10分钟后体系 仍然为蓝色。 向反应体系通入氮气约 10分钟， 以便除去过量的臭氧。 滴加二曱石克 醚 0.5毫升， 之后让反应体系温度自然升至室温， 2小时后将反应体系在真空下除 去溶剂， 即得到了含有醛基的半抗原。 后者与蛋白质（多肽）如 BSA (牛血清蛋白） 或 KLH ( 10毫克）共同溶解于 pH 7.2的緩冲液中， 加入氰基硼氢化钠 3毫克， 室 温下在摇床上反应 24小时。 透析后即得到所需的糖蛋白缀合物 STn- KLH。
按照上述制备方法，将本发明实施例 3-47所制备的化合物 3-14, 16-24, 29-34, 42 与载体蛋白质（多肽）相偶联分别得到各自的蛋白 （多肽）缀合物， 即： 3-KLH, 4-KLH, 5-KLH, 6- LH, 7-KLH, 8- LH, 9- LH, 10- LH, 11- LH, 12-KLH, 14-KLH, 16-KLH, 17-KLH, 18-KLH, 19-KLH, 20-KLH, 21-KLH, 22-KLH, 23-KLH, 24-KLH, 29-KLH, 30-KLH, 31-KLH, 32-KLH, 33-KLH, 34- LH, 42- LH.
需要指出的是本发明合成路线对 STn和糖蛋白（多肽）缀合物进行结构衍生时， 选用了比较典型 R2、 R3、 R4、 R5和 16取代基。 本领域的普通技术人员在阅读了本 说明书后， 按照本实施例的操作方法很容易获得其它 (如任意酰胺、 - NH2、 _N3、 -OH )、 R2 (如任意酰胺、 - NH2、 - N3、 -OH)、 R3 (如- C02H、 - CH20H、 - C02M、 - C(0)NH0H、 - H,M为任意烷基、芳基或杂环或者正离子， R3的空间取向为平伏键或直立键）、 R4 (各 种连接臂） 、 R5 (不同空间取向的 OH )和 R6(H或 半乳糖基)取代的化合物； 这 些都是本领域的技术人员无需付出任何创造性的劳动都可实现的， 所以本发明的保 护范围绝不囿于本实施例所公开的范围。 试验例 1 本发明化合物免疫学活性试验 一、 试验材料及来源
1、 供试化合物： 本发明实施例 49所制备的糖蛋白 （多肽）缀合物; 二、 试验方法
(一） 小鼠免疫
每组 6只 Ba l b/c雌性小鼠， 6— 8周龄（Number: SCX j ing2007-0001, SPF/VAF ), 购自北京大学医学部动物科学部并于动物部饲养。用 STn-KLH以及^ "生的 STn与 KLH 的缀合物免疫小鼠， 每次免疫的糖蛋白 （多肽） 中含有 2 μ β的糖（溶解于 PBS ) ， 每 2周免疫一次， 免疫途径为腹腔注射， 共免疫 4次。 分别于免疫前、 第 2次免 疫后 13天、 第 3次免疫后 13天及第 4次免疫后 14天取血， 分离血清， -80度冰箱 冻存待测。
(二） 小鼠免疫前后血清中抗体滴度的测定
各组小鼠混合血清的滴度， 以及 20、 31和 21的缀合物免疫组每只小鼠血清的 滴度均采用 ELISA方法检测
1 包被抗原 ： 酶标板上包被 100 的 STn- BSA (包含 0. 02 g 的 STn )
4 0C过夜 。
2 洗涤与封闭： 每孔加入 200 ul洗涤缓冲液 PBS- Tween20 ( 0. 05% ) 洗板， 洗 3次 ， 然后每孔加入 200 ul封闭液（3% BSA-PBS ) , 37 °C , 1小时。
3 加一抗（即免疫血清）： 洗涤 3次（具体方法同上）。 血清用抗体稀释液（ 1% BSA- PBS )从某一稀释度开始倍比稀释， 每孔加 100 ul， 37 °C , 1小时。
4 加酶标二抗： 洗涤 3次， 每孔加入用抗体稀释液 5000倍稀释的 100 ul的二 抗（为辣 过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG ( γ -cha in 特异）或 IgM ( μ -cha in 特 异）， 37 °C , 1小时。
5 显色： 洗涤 3次， 每孔加入现配的显色底物邻苯二胺（0PD ) 100 u l , 室温 避光显色 15分钟， 每孔加入 2 M H2S04终止显色。
6 结果判断： 用酶标仪于 490 nm波长读取 0D值。 把减去空白血清孔读数后 的 0D值为 0. 1时的血清稀释倍数作为抗体滴度 三、 试验结果
1. 表 1. 第二次免疫之后 13天测定小鼠血清中识别 STn的抗体滴度 表 1
组别 IgG I M immunized with STn-KLH 910 <1000 immunized with 3-KLH <1000 <1000 immunized with 4-KLH <1000 <1000 immunized with 5-KLH <1000 <1000 immunized with 6- LH <1000 <1000 immunized with 7- LH <1000 <1000 immunized with 8-KLH 7734 〈1000 immunized with 9-KLH <1000 <1000 immunized withlO-KLH 7933 <1000 immunized with 11-KLH <1000 〈1000 immunized with 12-KLH <1000 <1000 immunized with 13-KLH <1000 <1000 immunized with 14-KLH <1000 <1000 immunized with 16-KLH <1000 <1000 immunized with 17-KLH <1000 <1000 immunized with 18-KLH 1381 <1000 immunized with 19-KLH <1000 <1000 immunized with 20-KLH 11000 <1000 immunized with 21-KLH 1266 <1000 immunized with 22-KLH <1000 <1000 immunized with 23-KLH <1000 <1000 immunized with 24-KLH 6618 <1000 immunized with 29-KLH <1000 <1000 immunized with 30- LH <1000 <1000 immunized with 31-KLH 20000 <1000 immunized with 32-KLH <1000 <1000 immunized with 33-KLH <1000 <1000 immunized with 34-KLH <1000 <1000 immunized with 42-KLH <1000 <1000
第三次免疫之后 13天测定小鼠血清中识别 STn的抗体滴度 组别 IgG IgM immunized with STn-KLH 50, 144 5763 immunized with 3-KLH <2500 <1000 immunized with 4-KLH 17, 040 1604 immunized with 5-KLH 38, 878 1872 immunized with 6-KLH <2500 <1000 immunized with 7-KLH 23, 279 4706 immunized with 8-KLH 43, 201 4963 immunized with 9-KLH 4714 2897 immunized with 10-KLH 55， 004 <1000 immunized with 11- LH 4054 <1000 immunized with 12-KLH 11, 783 <1000 immunized with 13-KLH 24, 12 <1000 immunized with 14-KLH <2500 <1000 immunized with 16-KLH <2500 2571 immunized with 17-KLH 11, 329 2047 immunized with 18-KLH 56, 276 1842 immunized wi th 19-KLH <2500 <1000 immunized wi th 20-KLH 185, 354 2581 immunized wi th 21-KLH 150, 504 9236 immunized wi th 22-KLH 24, 154 1586 immunized wi th 23-KLH 38, 173 2880 immunized wi th 24-KLH 93, 488 <1000 immunized wi th 29-KLH <2500 1979 immunized wi th 30-KLH <2500 <1000 immunized wi th 31-KLH 276, 162 1804 immunized wi th 32-KLH <2500 <1000 immunized wi th 33-KLH <2500 <1000 immunized wi th 34- LH 6108 <1000 immunized wi th 42-KLH <2500 <1000 表 3 第三次免疫后血清这几组每只小鼠血清的滴度。
STn-KLH 20-KLH 31-KLH 21-KLH
Mouse 1 5, 170 296, 647 179, 666 24, 235
Mouse 2 6, 385 79, 799 356, 282 182, 259
Mouse 3 65, 524 283, 403 291, 807 71 , 044
Mouse 4 96, 812 63, 561 83, 396 85, 645
Mouse 5 6, 187 69, 508 104, 519 89, 172
Mouse 6 18, 663 68, 401 351, 977 472, 834
4、 第三次免疫之后 13天测定小鼠血清与肿瘤细胞的结合。
试验结果见图 5。 5、 结果分析 实验结果采用 SAS软件（version 9.1)来进行统计分析。 对原始数据取以 10为 底的对数， 变换后的数据符合方差分析的条件， 方差分析的结果： F = 7.55, (p = 0.0014) , 表明组间有显著性差异； 组间比较釆用 Dunnett' s t Tests, 在 α取 0.05 时， 20- KLH、 31- KLH、 21- KLH各组与 STn_KLH组有显著性差异。 这说明本发明合成 的糖缀合物得到的抗体滴度高于 STn- KLH的抗体滴度。 本发明并未进行杀伤动物肿瘤细胞的在体实验， 但已有文献（British J.
Cancer 2009, 100, 1746-1754. ) 证明 STn抗体（用 Theratope即 STn- KLH免疫得到） 确实可以抑制肿瘤的生长。 而在本发明的实验中， 得到了高于 STn-KLH的抗体滴度， 因此可以合理预测本发明化合物抑制肿瘤生长的活性要好于 STn- KLH本身。

Claims

权利要求
1、 唾液酸（α - (2— 6) ) - D-氨基吡喃糖衍生物或其盐， 其结构式为式（ I ) 所
Figure imgf000039_0001
式（ I )
其中， ^选自酰胺基、 -冊2、-^或- 0H;优选的，所述的酰胺基选自 -NH C (0) CHxCly、
- NHC (0) CHxFy、 -NHC (0) CHxBry、 - NHC (0) H、 -NHC (0) CaH2a+1、 -NHC (0) CaH2a0H、 -NHC (0) CbH2b -!. - NHC (0) CbH2b— 3; 其中， x或 y选自 0、 1、 2或 3， 且 x+y等于 3; a 选自 1至 20中的任一整数； b选自 2至 20中的任一整数；
R2选自酰胺基、 - NH2、 - N3或 - OH; 优选的， 所述酰胺基选自- NH C (0) CHpClq、 -NHC (0) CHpFq 、 - NHC (0) CHpBr¾、 - NHC (0) H、 -NHC (0) CaH2a+1、 -NHC (0) CaH2a0H、 -NHC (0) CbH2b -!, - NHC (0) CbH2b—3; 其中， p或 q选自 0、 1、 2或 3 , 且 p+q等于 3; a 选自 1至 20中的任一整数； b选自 2至 20中的任一整数；
R3选自- C02H、 - CH具 - C02M、 -C (0) NH0H或氢， 其中， M为烷基、 芳基或杂环； R3的空间取向为平伏键或直立键；
R4选自带有双键、 块键、 叠氮、 酸基、 保护缩醛、 马来酰亚胺基、 琉基、 保护 巯基、 硒基、 保护硒基、 -NH2或- 0NH2的取代基； 优选的， R4是婦丙基；
R5为 0H; 其空间取向为直立键或者平伏键；
1 6选自氢或 β -半乳糖基。
2、 一种糖缀合物， 其特征在于： 由权利要求 1所述的唾液酸（a - U— S -D- 氨基吡喃糖衍生物或其盐与多肽或蛋白质相缀合而得到。
3、 按照权利要求 1所述的唾液酸（ α - (2→ 6) ) -D-氨基吡喃糖衍生物或其盐 , 其特征在于： 所述的盐是碱加成的盐。
4、 一种合成权利要求 1 所述唾液酸（α - (2→ 6) ) -D-氨基吡喃糖衍生物或其盐 的方法， 包括： 以唾液酸 5-位氨基棵露和 /或氨基半乳糖（葡萄糖） 的 2-位氨基裸 露的化合物为原料，在反应助剂作用下，在溶剂中使用酸犴、羧酸或羧酸酯进行酰化反应， 即得。
5、 按照权利要求 4 所述的方法， 其特征在于： 所述原料包括浠丙基 4- 0~ (5 - 氨基 -3, 5-二去氧- a -Z "吡喃神经氨酸基） -2-乙酰氨基 -2-去氧- α -/) "吡喃半乳糖 苷， 烯丙基 4-(?~ (5-乙酰氨基 -3， 5-二去氧 - a - 吡喃神经氨酸基）- 2-氨基- 2-去氧 - α -ΰ~吡喃半乳糖苷或烯丙基 4-0~ (5-氨基- 3， 5-二去氧 - α -Ζ>"吡喃神经氨酸 基） -2-氨基- 2-去氧 - α - 吡喃半乳糖苷； 所述酸酐包括脂肪酸的酸酐， 其脂肪链 上含有氟原子、 氯原子或溴原子的取代基； 所述羧酸包括脂肪酸的羧酸， 其脂肪链 上含有氟原子、 氯原子或溴原子的取代基； 所述羧酸酯包括脂肪酸的羧酸酯， 其脂 肪链上含有氟原子、氯原子和溴原子的取代基；所述反应助剂采用有机减或无机碱； 所述溶剂是水或是有机溶剂。
6、 按照权利要求 5 所述的方法， 其特征在于： 所述的酸酐包括乙酸酐、 丙酸 酐、 正丁酸酐、 异丁酸酐或正己酸酐； 所述的羧酸包括单氟乙酸、 二氟乙酸、 三氟 乙酸、 单氯乙酸或二氯乙酸； 所述羧酸酯包括单氟乙酸曱酯、 二氟乙酸曱酯、 三氟 乙酸曱酯或二氯乙酸曱酯。
7、 一种合成权利要求 2所述糖缀合物的方法， 包括：
( 1 )将权利要求 1 所述的唾液酸（ct - (2→ 6) ) - D-氨基吡喃糖衍生物或其盐经 臭氧氧化得到含有醛基的二糖； （ 2 )将步骤（ 1 ) 所得到的产物在还原胺化的条件 下与载体蛋白质或多肽进行偶联，即得。
8、 权利要求 1 所述的唾液酸（α - (2→ 6) ) -D-氨基吡喃糖衍生物或其盐在制备 抗肿瘤药物中的用途。
9、 权利要求 1所述糖缀合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
10、 一种治疗肿瘤的疫苗， 由有效量的权利要求 2所述的糖缀合物和药学上可 接受的载体或辅料组成。
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