CN102421788A - 用于制备植物甾醇阿魏酸酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于制备植物甾醇阿魏酸酯的合成方法，所述合成方法使用阿魏酸和植物甾醇(分离自大豆油脱臭器馏出物)，该合成方法包括：(a)将阿魏酸乙酰化为阿魏酸乙酸酯；(b)将阿魏酸乙酸酯与植物甾醇进行酯化以获得植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯；(c)将植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯脱保护为植物甾醇阿魏酸酯。与分离自米糠油皂料的天然谷维素对仓鼠的降血胆固醇活性相比较，评价植物甾醇阿魏酸酯对仓鼠的降血胆固醇活性。本研究证实了植物甾醇阿魏酸酯显著地将提高的胆固醇水平降低，并且也干扰胆固醇的吸收，并且其效果可以与天然谷维素相比拟，并且可用于营养品/食品增补剂。因此，对于多个应用而言，植物甾醇阿魏酸酯是天然谷维素的潜在替代品。

Description

用于制备植物甾醇阿魏酸酯的方法

发明领域

本发明涉及一种用于制备作为营养品/食品增补剂的植物甾醇阿魏酸酯(phytosteryl ferulate)的方法，所述方法使用阿魏酸和分离自大豆油脱臭器馏出物(deodorizer distillate)的植物甾醇，所述植物甾醇阿魏酸酯与分离自米糠油皂料(rice bran oil soap stock)的谷维素中存在的一些分子等价。更具体地，本发明还涉及：与分离自米糠油皂料的天然谷维素对仓鼠的降血胆固醇活性(hypocholesteremic activity)相比较，评价作为营养品/食品增补剂的植物甾醇阿魏酸酯对仓鼠的降血胆固醇活性。

发明背景

米糠油是天然谷维素的唯一来源。谷维素最初分离自米糠油[Kaneko，R.和T.Tsuchiya；J.Chem Soc.Jpn.57，526(1954)]；[Tsuchya，T.等；JP 4895(1957)]并被假定为单一组分。谷维素是阿魏酸(4-羟基3-甲氧基肉桂酸)与环木菠萝烯醇、24-亚甲基环木菠萝烯醇、菜油甾醇和β-谷甾醇的酯的混合物(图1)[Rogers，E.J；Rice，S.M.；Nicolosi，R.J，；Carpenter，D.R.；McClelland，C.A.；Romanczyk，L.J.，Jr.J.Am.Oil.Chem Soc.70，301-307(1993)；Diack，M.；Saska，M.J.Am.Oil.Chem Soc.71，1211-1217(1994)；Norton，R.A.Lipids，30，269-274(1995)；Xu，Z.；Godrej，J.S.J.Agric.Food Chem.47，2724-2728(1999)]。在几十年中，从植物油分离谷维素的方法得到了提高。这样的方法包括：使用用于谷维素萃取的选择性有机溶剂从植物油中分离环木菠萝烯醇阿魏酸酯，之后进行层析法纯化[Kimura，Goro，日本专利6314796(1988)和日本专利6314797(1988)]，用硫酸铝使硬脂酸精沉淀，之后使来自上层清液的谷维素结晶，以从米糠深色油中分离谷维素[Beso oils & fats Co.Ltd.，日本专利8295942(1982)]，通过两步碱处理从米糠和米胚芽油高度浓缩分离谷维素[Shimuzu，Hisashi；日本专利76123811(1976)]。用乙醚在pH 9.5下从米糠皂料萃取谷维素，之后在中性氧化铝柱上将其层析纯化[G.S.Seetharamaiah和J.V.Prabhakar；食品科学技术杂志(J.Food Science Technology)，23，270(1986)]。在用HCl将米糠皂料酸化后，用醚从皂料萃取谷维素[Tomotaro，tsuchiya等；日本专利4895(1957)]。如果是米糠深色油，用甲醇和硫酸通过酯交换分离谷维素，之后使用混合溶剂甲醇和醚作为洗脱剂在预处理过的Amberlite IRA-401上进行柱层析[Tomaro，Tsuchiya和Osamu，Okubo；日本专利13649(1961)]。使用水饱和的糠醛作为萃取剂通过谷维素的20.2％浓缩溶液的己烷溶液的液-液萃取以总共约35％的收率分离98.3％纯度的谷维素[Watanabe，Vasuo等；日本专利7812730(1968)]，以及在相对低的温度下对米糠及发酵物、玉米和大麦的原料油进行蒸馏，之后用含羟基(hydrox123yl)溶剂萃取残余物以萃取来自这些油的谷维素[Yamamoto，Takeshi，德国专利1301002(1969)]。从未加工深色酸性油(米糠)分离谷维素的方法[Das；P.K，Chaudary；A，Kaimal；T.N.B，Bhalerao；U.T，美国专利5,869,708(1999)]。从米糠油皂料分离谷维素的方法[Rao；K.V.S.A，Rao；B.V.S.K.Kaimal；T.N.B，美国专利6,410,762(2002)]。已经证明米糠油的降血胆固醇活性是归功于其谷维素成分和一些其它不皂化物组分[Seetharamaiah，G.S.和Chandrasekhara，N.Atherasclerosis：78.219(1989)]。

谷维素的重要生物活性在于其降低胆固醇的特性。已经证明在视网膜中用γ-谷维素因其抗氧化性而预防了脂质过氧化[Heramitsu，Tadahisa和Armstrong Donald，Opthalmic Res：23，196(1991)]。已经证明含有谷维素的药物制剂成功减少了老年女性酒井(Sakai)的皱纹[Tatsu等(Eisai Co Ltd.)JP 05.30.526(1993)]。含有谷维素的指甲油防止指甲变色[Ito，Nobumasa(Polo Chemical Industries Inc.)，JP 02.290.806(1990)]。含有谷维素的除臭剂制剂对控制来自汗液和腋下的气味特别有效[Kumasaka，Sadao(Humanindustry Corp.)JP 633322(1988)]。含有谷维素的药物制剂被用于预防晕动病[Sakada，Hideharu；JP 82.32.229(1982)]和神经系统疾病的治疗中[Sun.Zhide和Cong Yizi；CN 87,101,519(1998)]。已经制备了大量含有谷维素的经皮吸收药物和保湿化妆品制剂用于皮肤病的治疗[Courtin，Olivier(Clarins S.A.)，FR 2,688,137(1993)；Tokuda，Yasuaki等(Nisei Marine KogyoK.K.).JP 01,290,613(1998)；Ichimaru Co.Ltd.16，JP 81,161,315(1981)；Toyo Chemical Corp.JP 82,149,212(1982)；Zenyaku Kogyo Co Ltd.，82,42,621(1982)；Nitto Electric industrial Co.Ltd.，JP 59,53,415(1984)，JP59,184,120(1984)]。谷维素乳液被用作用于化妆品和食物的抗氧化剂和防腐剂，并且该类乳液在防止产品变色上也有效[Orita Yuka Co.Ltd.，JP58,45,728(1983)]。带有或不带有核黄素丁酸盐的含有谷维素的软胶囊被用于预防动脉硬化[Nishin Kogaku K.K.JP 58,103,315(1983)]。含有3-20％(以重量计)谷维素的浴用制剂被用于特应性皮炎和老年干皮病的治疗[Inoe，Toshio和Nunokawa Senzo(Otsuka Pharm Co.Ltd.，JP 05,279,272(1993)]。已经证明谷维素在具有天然脂类代谢异常的自发性高血压大鼠中抗脂肪性肝硬化高度有效[Ito，Masahiro等；J.Clin Biochem.Nutr.12，193(1992)]。针对谷维素的安全评价研究清楚地表明谷维素不具有遗传毒性和致癌变活性[Tsushimoto Gen等，J.Toxicol.Sci.16，191(1991)].[Tamagawa，M等，Food.Chem.Toxicol.30.49.(1992)]。

谷维素被作为用于人，特别是运动员和动物如马和狗的健身剂出售。据称谷维素作为天然类固醇替代物对体重训练和有氧运动项目的个体有帮助，有助于增加瘦肉肌肉量和改善体形。据认为谷维素的抗氧化性质形成该有益作用的原因。由于谷维素对皮脂腺的作用，它的主要应用是用于化妆品。γ-谷维素也因其在紫外线诱导的脂类过氧化中的防护作用而被知晓，并且被用于防晒制剂(form16ulation)中。阿魏酸及其酯刺激头发生长并防止皮肤老化[日本专利08,81,352(1996)]。已经证实可用于头发和皮肤的含有1重量％谷维素的局部用制剂可将灰色头发转变为自然的黑色[Sakai Tatsu等(Eisai Co Ltd.)JP 05 225.037(1993)]。对于阿魏酸和γ-谷维素在化妆品中的多活性作用已有综述[日本专利06,48,940(1994)]。通过使用蔗糖脂肪酸酯和乙氧化的HCO可将γ-谷维素溶于药用饮品中[日本专利05,255,037(1993)]。通过添加谷维素可防止食用油中生育酚类在180℃下的早期加热过程中的分解[日本专利82,136,509(1982)]。阿魏酸作为原材料可用于医药、农药、化妆品、颜料和食品添加剂等，并且可以由谷维素制备阿魏酸[欧洲专利503,650(1992)]。通过用硝基苯将获得的阿魏酸的皂化和氧化，也可以将谷维素用于香草醛的制造。谷维素的其它各种用途包括抗菌剂、UV隔离织物、防霉聚丙烯、杀生物纤维、尼龙6、羊毛、棉布。据称含有肌醇和/或γ-谷维素的米糠油可用于提高煮熟的米饭的品质。

在常用的植物油中唯独米糠油含有γ-谷维素。可以从以成本效率高的方式碱精制油的工艺中制备的廉价酸性油分离这一高价值化合物。目前，大部分米糠油生产单元转变为物理精炼，以便防止化学精炼过程中的较大量的油损失。与碱精制过程中获得酸性油比较，通过对高FFA米糠油采用物理精制，精制机不仅能防止化学过程中的中性油损失，而且还能以更纯的形式作为有价值的副产物回收脂肪酸。在物理精炼过程中将不会产生作为谷维素分离的潜在来源的皂料。鉴于谷维素具有显著降低血中胆固醇和其它一些益处，寻找具有相似活性的替代化合物是适当的，以便可以将它作为添加剂加入到植物油中以提高植物油的营养价值。本发明中，使用植物甾醇制备植物甾醇阿魏酸酯，作为分离自米糠油皂料的谷维素中存在的一些分子的等价物。大豆和向日葵脱臭器馏出物是植物甾醇的好的来源，并且基于植物甾醇的植物甾醇阿魏酸酯制备当然提高了精炼副产物如脱臭器馏出物的价值。

发明目的

本发明的主要目的是提供一种用于制备作为营养品/食品增补剂的植物甾醇阿魏酸酯的新合成方法，所述方法使用阿魏酸和分离自大豆油脱臭器馏出物的植物甾醇，所述植物甾醇阿魏酸酯等价于分离自米糠油皂料的谷维素中一些分子。

本发明的另一个目的是提供一种用于在室温(25-30℃)，在多相催化剂即12-钨磷酸的单铵盐上，在没有吡啶的情况下使用乙酸酐将阿魏酸乙酰化的方法。

本发明的再另一个目的是提供一种用于使用多相催化剂即12-钨磷酸的单铵盐和乙酸酐在微波辅助的条件下将阿魏酸乙酰化的方法，以将反应时间从3小时显著地缩短为10-20分钟。

本发明的再另一个目的是与分离自米糠油皂料的天然谷维素对仓鼠的降血胆固醇活性相比，评价作为营养品/食品增补剂的植物甾醇阿魏酸酯对仓鼠的降血胆固醇活性。

发明概述

因此，本发明提供一种制备通式1的植物甾醇阿魏酸酯的方法

所述方法包括以下步骤：

(a)将阿魏酸乙酰化为阿魏酸乙酸酯；

(b)通过在二氯甲烷、N，N’-二环己基-碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的存在下在室温下搅拌45-48小时，将步骤(a)中所获得的阿魏酸乙酸酯与植物甾醇进行酯化，以获得植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯以及副产物二环己基脲(DCU)；

(c)将步骤(b)中所形成的反应产物过滤以从植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯移除副产物二环己基脲(DCU)；

(d)将步骤(c)中所获得的植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯通过柱层析纯化；

(e)将步骤(d)中所获得的纯化的植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯脱保护以获得植物甾醇阿魏酸酯；

(f)将步骤(e)中所获得植物甾醇阿魏酸酯通过柱层析纯化。

在本发明的一个实施方案中，通过以下方法合成阿魏酸乙酸酯：使用乙酸酐与吡啶将阿魏酸乙酰化，或者，使用乙酸酐与多相固体催化剂12-钨磷酸的单铵盐[(NH₄)H₂PW₁₂O₄₀]通过搅拌或备选地通过微波辐照而将阿魏酸乙酰化。

在本发明的其它实施方案中，在步骤(a)中使用乙酸酐和吡啶的阿魏酸的乙酰化在85-90摄氏度进行6-8小时。

在本发明的另一个实施方案中，步骤(a)中的使用12-钨磷酸的单铵盐的阿魏酸的乙酰化在环境温度(25-30℃)下进行3-5小时。

在本发明的另一个实施方案中，将在用于阿魏酸的乙酰化的步骤(a)中所使用的多相催化剂通过简单过滤而从反应混合物分离，并且将所述催化剂在没有任何预处理的情况下再使用。

在本发明的另一个实施方案中，步骤(a)中的使用乙酸酐和多相催化剂的阿魏酸的乙酰化也在处于300-800W和100-120℃的微波辐照条件进行10-20分钟。

在本发明的另一个实施方案中，多相催化方法简单、无毒，并且催化剂的分离包括简单过滤，并且该催化剂可以重复使用。

在本发明的另一个实施方案中，其中阿魏酸乙酸酯的收率在80-95％的范围内。

在本发明的另一个实施方案中，其中所用的植物甾醇分离自植物油脱臭器馏出物，所述植物油脱臭器馏出物选自由大豆和向日葵组成的组。

在本发明的另一个实施方案中，其中分离自大豆油脱臭器馏出物的植物甾醇主要含有菜油甾醇(18-23％)、豆甾醇(25-35％)和β-谷甾醇(41-56％)。

在本发明的另一个实施方案中，在步骤(d)中使用己烷、乙酸乙酯和氯仿(以体积计80∶5∶15)的溶剂体系将植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯选择性地从硅胶柱中洗脱。

在本发明的另一个实施方案中，柱层析之后的所述植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯的收率在75-80％的范围内。

在本发明的另一个实施方案中，在步骤(e)中通过使所述植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯与溶解在体积比为2∶1的氯仿∶甲醇中的1至3重量％的无水碳酸钾反应，将所述植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯脱保护，以从植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯移除乙酸酯基团(acetate group)。

在本发明的另一个实施方案中，植物甾醇阿魏酸酯的收率和纯度分别为85-90％和85-100％。

在本发明的再另一个实施方案中，在步骤(f)中使用己烷、乙酸乙酯和氯仿(以体积计80∶5∶15)作为洗脱溶剂通过硅胶柱层析将植物甾醇阿魏酸酯纯化。

在本发明的再另一个实施方案中，其中将作为营养品/食品增补剂的由阿魏酸与大豆植物甾醇制备的所述植物甾醇阿魏酸酯对仓鼠进行降血胆固醇活性评价，所述植物甾醇阿魏酸酯表现出与分离自米糠油皂料的天然谷维素相比等价的降血胆固醇活性。

在本发明的再另一个实施方案中，所述植物甾醇阿魏酸酯即使仅包含三种化合物，即，菜油甾醇阿魏酸酯、豆甾醇阿魏酸酯和β-谷甾醇阿魏酸酯，也表现出与天然谷维素的降血胆固醇活性相似的降血胆固醇活性，所述天然谷维素包含五种化合物，即，环木菠萝烷醇阿魏酸酯(cycloartanylferulate)、环木菠萝烯醇阿魏酸酯、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯。

附图说明

为更好理解本发明，下面参考附图一起对其示例性实施方案进行描述，其中：

图1.分离自米糠油的γ-谷维素中存在的分子

图2.方案-1：植物甾醇阿魏酸酯的制备

发明详述

本发明涉及一种用于制备植物甾醇的阿魏酸酯，即植物甾醇阿魏酸酯(方案1/图2)的新合成方法，所述方法使用阿魏酸和植物甾醇(分离自大豆脱臭器馏出物)，所述植物甾醇阿魏酸酯作为营养品/食品增补剂，与分离自米糠皂料的天然谷维素(图1)等价。大豆甾醇主要含有菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇，而米糠油甾醇还含有三萜烯醇。

在本发明中，最初，通过用乙酸酐和吡啶(方案1/图2)在85-90℃下处理阿魏酸(1)6小时，从而以80％的收率制备阿魏酸乙酸酯(2)。在反应完成后，用HCl水溶液骤冷吡啶，并且将产物用醚萃取。本方法被发现是繁琐的，并且处理吡啶也很复杂。为了在反应中避免吡啶，可使用备选的简单的多相催化剂。在乙酰化中使用多相催化剂是优选的，因为可以通过过滤将它们简单地从反应产物分离，并且这有助于使用连续操作反应器如固定床反应器。

由我们组制备的多相催化剂即12-钨磷酸的单铵盐[B.Y.Giri，K.Narasimha Rao，B.L.A.Prabhavathi Devi，N.Lingaiah，I.Suryanarayana，R.B.N.Prasad和P.S.Sai Prasad，催化剂通讯(Catalysis Communications)，6，(2005)第788-792页]被用于阿魏酸乙酸酯的制备。通过用所需量的碳酸铵在水性介质中与12-钨磷酸的简单离子交换制备12-钨磷酸的单铵盐。在该过程中，水溶性的12-钨磷酸转化为其不溶性单铵盐。在离子交换之后，将该催化剂在空气中于350℃下煅烧4小时。

在5重量％的多相催化剂即12-钨磷酸的单铵盐的存在下，用乙酸酐在室温(25-30℃)下处理阿魏酸(1)3小时。通过TLC监控该反应，并且在反应完成后在真空下除去过量的乙酸酐。将反应混合物放于乙酸乙酯中并且滤去催化剂。减压除去溶剂，从而以92-95％的收率得到阿魏酸乙酸酯(2)(方案1/图2)。

已经通过在微波辐照下使用12-钨磷酸的单铵盐进行阿魏酸乙酸酯的制备以在10分钟内以92-95％的收率获得阿魏酸乙酸酯。在微波加速的反应中在100℃下辐照4-羟基-3-甲氧基肉桂酸(1)、乙酸酐和12-钨磷酸的单铵盐的混合物10分钟。通过TLC监控反应混合物，并且在反应完成后，将氯仿加入到反应混合物中。将反应混合物过滤以分离催化剂。在减压下除去溶剂。在加热下加入甲醇以溶解化合物，并且之后冷却至25-30摄氏度以使产物沉淀。将产物过滤，干燥从而以92％的收率获得4-乙酰氧基-3-甲氧基肉桂酸(2，阿魏酸乙酸酯)的白色固体。通过光谱法如NMR、IR和GC-MS表征该产物。在微波反应条件下12-钨磷酸的单铵盐催化的反应在相对非常短的反应时间内给出出色的收率。

在二环己基碳二亚胺(DCC)和二甲氨基吡啶(DMAP)存在下，在二氯甲烷中将阿魏酸乙酸酯(2)与分离自大豆油脱臭器馏出物中的植物甾醇的混合物偶联，从而以75-80％的收率得到植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯(3)。在该阶段通过使用己烷、乙酸乙酯和氯仿(80∶5∶15，v/v/v)作为洗脱剂的硅胶柱层析以最优化植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯的纯化。在回流温度(60-65摄氏度)下用氯仿/甲醇(2∶1)混合物中的K₂CO₃处理纯植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯(3)，以脱保护去除乙酸酯基团从而以90-95％的收率获得植物甾醇阿魏酸酯(4)。

与分离自米糠油皂料的天然谷维素比较，进行由大豆植物甾醇与阿魏酸制备的作为营养品/食品增补剂的植物甾醇阿魏酸酯的胆固醇降低研究。在两个研究设计中(方法A和方法B)，植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)显著降低了胆固醇、LDL胆固醇和甘油三酯，并升高了HDL胆固醇，这表明植物甾醇阿魏酸酯使升高的胆固醇水平降低，并且还影响胆固醇的吸收。该效果与分离自米糠油皂料的天然谷维素的效果可以相比拟，并且可以将植物甾醇阿魏酸酯用作合成谷维素。所述植物甾醇阿魏酸酯即使仅包含三种化合物，即，菜油甾醇阿魏酸酯、豆甾醇阿魏酸酯和β-谷甾醇阿魏酸酯，也表现出与天然谷维素的降血胆固醇活性相似的降血胆固醇活性，所述天然谷维素包含五种化合物，即，环木菠萝烷醇阿魏酸酯、环木菠萝烯醇阿魏酸酯、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯。

下面通过例证的方式给出实施例，并且因此不应将其解释为对于本发明的范围的限制。

实施例1

通过在吡啶(40ml)的存在下用乙酸酐(40ml)处理阿魏酸(1，10g)进行4-羟基-3-甲氧基-肉桂酸(阿魏酸)的乙酰化(方案-1)。将内含物在85摄氏度下加热6小时。将反应混合物冷却至30摄氏度，并且将其用HCl水溶液中和，并将产物用醚萃取。将醚层浓缩，并且在减压下将其干燥，从而以80％的收率作为粉末得到4-乙酰氧基-3-甲氧基-肉桂酸(阿魏酸乙酸酯，2)。通过光谱法如¹H和¹³C NMR、IR和GC-MS表征产物。

光谱数据：

M.P.：162-165℃。

IR(KBr)：3448，1764，1702，1627，1598和1512Cm^-1。

¹H NMR(CDCl₃，δ)：2.3(3H，s，OAc)，3.9(3H，s，O-CH₃)，6.5(1H，d，J＝15.9Hz，CH)，7.1(1H，m Ar-H)，7.3(2H，m，Ar-H)和7.7(1H，d，J＝15.9Hz，CH)。

¹³C NMR(CDCl₃，δ)：20.4(C＝O)，55.9(OCH₃)，111.7，119.5，121.5，123.5，133.3，140.8，143.3，151.2，167.6和168.4。

Mass(GC-MS)：236，194，179，133和77。

实施例2

通过12-钨磷酸与计算量的碳酸铵在水性介质中的简单离子交换以使该酸的一个质子被一个铵离子替代，制备多相酸催化剂，即12-钨磷酸的单铵盐[B.Y.Giri，K.Narasimha Rao，B.L.A.Prabhavathi Devi，N.Lingaiah，I.Suryanarayana，R.B.N.Prasad和P.S.Sai Prasad，催化剂通讯(CatalysisCommunications)，6，(2005)第788-792页]。在交换之后，将催化剂在空气中于350℃下煅烧4小时。在离子交换之后，通过XRD和FT-IR确认Keggin结构的保留。在全玻璃高真空装置中在液氮温度下吸收氮气测定催化剂的BET表面积。用于阿魏酸乙酸酯的制备，在Siemens D-5000衍射仪上使用Cu Kα射线获得X-射线衍射图。

实施例3

将4-羟基-3-甲氧基-肉桂酸(1，阿魏酸，20g)、乙酸酐(40ml)和12-钨磷酸的单铵盐(1g，5重量％)的混合物在30摄氏度下搅拌3小时。通过TLC监控反应混合物，并且在反应完成之后，将反应混合物过滤以分离催化剂。在减压下除去过量的乙酸酐以得到固体残留物。将甲醇(50ml)加入至残留物并将其加热以将其溶解，并且之后将其冷却至25摄氏度，从而以92％的收率使4-乙酰氧基-3-甲氧基-肉桂酸(2，阿魏酸乙酸酯)结晶。通过光谱法如¹H和¹³C NMR、IR和GC-MS表征产物，并且所获得的数据与实施例1中给出的相同。

实施例4

使用USA的CEM公司的微波反应器(MARS5)将4-羟基-3-甲氧基-肉桂酸(5g)(1)、乙酸酐(10ml)和12-钨磷酸的单铵盐(250mg)的混合物在微波加速的反应中于100℃下在300W下辐照10分钟。通过TLC监控反应混合物，并且在反应完成之后，加入氯仿(25ml)并将其过滤以分离催化剂。在减压下除去溶剂，并将其溶解于热甲醇中(10ml)并且使产物在30摄氏度结晶。以92％的收率获得产物4-乙酰氧基-3-甲氧基-肉桂酸(2，阿魏酸乙酸酯)。通过光谱法如¹H和¹³C NMR、IR和GC-MS表征产物，并且所获得的数据与实施例1中给出的相同。

实施例5

从大豆油脱臭器馏出物(DOD)分离植物甾醇：使用短程蒸馏单元(short path distillation unit)将含有约8％植物甾醇类和6％生育酚类的大豆油DOD(2kg)在减压(0.01mm)下于170℃下蒸馏出脂肪酸，以富集植物甾醇。将含有的约10％游离脂肪酸以及50％甘油三酯的残留物同时酯化和酯交换成脂肪酸甲酯，并且在减压(0.01mm)下在120℃下使用短程蒸馏单元蒸馏所述甲酯。残留物中含有约26％的生育酚和46％的植物甾醇。使用甲醇水溶液(5％)作为溶剂从残留物中结晶植物甾醇。通过HPLC分析发现植物甾醇混合物的组成为菜油甾醇(19.6％)、豆甾醇(27.1％)和β-谷甾醇(53.4％)。该植物甾醇混合物被直接用于制备作为γ-谷维素替代物的植物甾醇阿魏酸酯。

实施例6

将实施例3中获得的4-乙酰氧基-3-甲氧基-肉桂酸(2，阿魏酸乙酸酯，20g)和具有如实施例5中所给出的组成的大豆植物甾醇(3，38.6g)溶解在干燥的二氯甲烷(30ml)中，并且加入二环己基碳二亚胺(15.0g)和4-二甲氨基吡啶(1.0g)。将反应混合物在25℃下搅拌48小时。在反应结束后，将副产物二环己基脲从反应混合物移除。将滤液浓缩，并且在真空下干燥。使用己烷、乙酸乙酯和氯仿(80∶5∶15，v/v/v)的混合物做为洗脱剂通过硅胶(100-200目)柱层析纯化粗产品，从而以80％的收率获得纯的甾基-4-乙酰氧基-3-甲氧基-肉桂酸酯(4，植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯)。通过光谱法如¹H和¹³C NMR、IR和质谱分析表征产物。

光谱数据：

M.P：197-203℃。

IR(KBr)：2957，2868，1758，1716，1636，1601，1513，1155和1031 Cm^-1。

¹H NMR(CDCl₃，δ)：0.65-2.05(甾醇部分～48H)，2.30(s，OAc)，3.85(3H，s，OCH₃)，4.70(1H，m)，5.4(1H，t)，6.27-6.35(1H，d，J＝16.10Hz，CH)，7.60(1H，d，J＝16.10Hz，CH)和7.10(3H，m ArH)。

¹³C NMR(CDCl₃，δ)：11.85，11.98，12.21，18.78，19.05，19.32，20.59，21.05，23.09，24.29，26.15，27.9，28.22，29.2，31.9，33.97，36.63，37.03，38.23，39.75，42.33，45.87，50.08，55.88，56.71，74.18，76.58，77.0，77.42，111.2，118.95，121.17，122.73，123.2，133.5，139.64，141.38，143.64，151.38，166.15和168.68。

Mass(EI)：632，590，395。

实施例7

将从如实施例6中从大豆植物甾醇所获得的甾基-4-乙酰氧基-3-甲氧基-肉桂酸酯(4，植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯，25.0g)溶解于氯仿∶甲醇的2∶1比例混合物(100ml)中，并加入碳酸钾(2.0g)，在65摄氏度下加热6小时。用50ml的氯化铵水溶液中和反应混合物，并且用氯仿(3x150ml)萃取。在减压下浓缩并干燥有机层以得到残余物，并且将其通过柱层析纯化，从而以95-97％的收率获得纯的植物甾醇阿魏酸酯(5)。通过¹H和¹³C NMR、IR和质谱分析表征产物。通过HPLC测定植物甾醇阿魏酸酯组成，并发现为菜油甾醇阿魏酸酯(18.9％)、豆甾醇阿魏酸酯(29.1％)和β-谷甾醇阿魏酸酯(52.0％)。

光谱数据：

M.P.：196-204℃。

IR(KBr)：3421，2954，2868，1705，1633，1598，1515，1268，1165和1029Cm^-1。

¹H NMR(CDCl₃，δ)：0.7-2.0(β-谷甾醇部分～48H)，3.95(3H，s，O-CH₃)，4.73(1H，m)，5.4(1H，t)，6.22(1H，d，J＝15.90Hz，CH)，6.95-7.10(3H，mArH)和7.60(1H，d，J＝15.90，Hz，CH)。

¹³C NMR(CDCl₃，δ)：11.85，11.98，12.21，18.78，19.05，19.33，21.04，23.09，24.29，26.16，27.9，28.22，29.2，31.9，33.97，36.63，37.05，38.28，39.75，42.33，45.87，δ50.08，55.91，56.71，73.92，76.57，77.0，77.42，109.33，114.72，116.1，122.65，122.99，127.12，129.31，139.72，144.47，146.77，147.89和166.63。

Mass(EI)：590(M+)，396，193。

实施例8

在本研究中使用体重在90g至110g的范围内的叙利亚雄性仓鼠作为试验动物。将它们分为3组，每组由6只动物组成。基础膳食为根据AIN93推荐的纯化膳食，(参考)并将所述基础膳食用1％胆固醇和10％椰子油增强(在本发明中，在下文中称作高胆固醇饲料，HCD)。通过将天然谷维素和植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)各1％与对照组的饲料HCD混合以制备用于测试组的膳食。在整个饲养过程中，将每只仓鼠饲养在22±1℃的恒温和55±5％的相对湿度下的笼中。将所有组中的全部动物用HCD喂养5周的期间，直至实现高胆固醇血症的诱发。在这个阶段，将两个治疗组中的仓鼠分别用含有1.0％的分离自米糠油皂料的天然谷维素和1.0％的由阿魏酸和大豆植物甾醇制备的植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)的HCD喂养，而对照组仅得到HCD。再继续喂养11周。在第77天时，使仓鼠禁食过夜，在麻醉下由降腹主动脉(descending abdominal arota)对每只仓鼠取血。使用自动血液分析仪(Express Plus，Bayer Diagnostics，USA)测量每只仓鼠的血清中的总脂分布，如总胆固醇(TC)、LDL(低密度脂蛋白)-胆固醇(LDL-C)、HDL(高密度脂蛋白)-胆固醇(HDL-C)和三酰基甘油(TG)。基于每周一次的间隔测定所有动物的体重。并且还每日评估总的笼观察结果。

该降血胆固醇活性测试的目的是评价由阿魏酸和大豆植物甾醇制备的植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)以及分离自米糠油皂料的天然谷维素作为营养品/食品增补剂对降低仓鼠的升高胆固醇水平的降低血中胆固醇的效果。表1和2中显示了根据方法A的降血胆固醇活性测试的结果。与喂养HCD的对照组相比，喂养在HCD中含有植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)和分离自米糠油皂料的天然谷维素的两个治疗组中都存在LDL胆固醇的显著降低(p＜0.01)。对TG的情况获得类似的结果(p＜0.05)。与对照组比较，治疗组在TC水平上的降低相当显著(p＜0.05)。这些结果表明植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)在降低LDL胆固醇上与分离自米糠油皂料的天然谷维素的活性可以相比拟。然而，与对照组相比，在治疗组中在HDL-C的水平上存在有限的增加。在两个治疗组中在所有参数中观察到基本上相同的观察结果，这表明作为营养品/食品增补剂，植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)与天然谷维素的降血胆固醇活性可以相比拟。当比较治疗组中LDL-C、TC和TG降低百分比时，观察到相似的趋势。在以含有植物甾醇阿魏酸酯膳食喂养的治疗组中的LDL-C(50.2％)、TC(22.1％)和TG(25.2％)的降低百分比与喂养含有天然谷维素饲料的另一个治疗组中获得的那些降低百分比(对于LDL-C、TC和TG分别为55.9％，23.6％和31.2％)可以相比拟。这些结果表明植物甾醇阿魏酸酯的降血胆固醇活性可以与天然谷维素相比拟。表3中显示了方法A中在所有组中用于降血胆固醇活性测试所取的仓鼠的平均体重增加值。在所有研究组中观察到相同的体重增加。

表1

NO：天然谷维素；SO：植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)

*显著性水平(p＜0.05)；**显著性水平(p＜0.01)

表2

^a“％减少”意指(L-L_c)X100/Lc，这里L是实验组中在研究的最后的脂类组分的浓度，L_c是对照组中在研究的最后的脂类组分的浓度

表3

实施例9

在本研究中使用体重在90g至110g的范围内的叙利亚雄性仓鼠作为试验动物。将它们分为3组，每组由6只动物组成。在整个饲养过程中，将每只仓鼠饲养在22±1℃的恒温和55±5％的相对湿度下的笼中。用HCD膳食喂养对照组，而分别用含有1％的分离自米糠油皂料的天然谷维素和由阿魏酸和大豆植物甾醇(合成谷维素)制备的植物甾醇阿魏酸酯喂养两个治疗组。继续喂养11周。在第77天时，使仓鼠禁食过夜(16小时)，在麻醉下由降腹主动脉对每只仓鼠取血。使用自动血液分析仪(ExpressPlus，Bayer Diagnostics，USA)测量每只仓鼠的血清中的总脂分布，如总胆固醇(TC)、LDL-胆固醇(LDL-C)、HDL-胆固醇(HDL-C)和三酰基甘油(TG)。基于每周一次的间隔测定所有动物的体重。并且每日评估总的笼观察结果。

该降血胆固醇活性测试的目的是评价天然谷维素以及由阿魏酸和大豆植物甾醇制备的植物甾醇阿魏酸酯在抑制胆固醇的吸收比例上的效果。表4和5中显示了根据方法B的降血胆固醇活性测试的结果。与喂养HCD的对照组比较，在喂养在HCD中含有由阿魏酸和大豆植物甾醇制备的阿魏酸酯(合成谷维素)和分离自米糠油皂料的天然谷维素的饲料的两个治疗组中都存在LDL胆固醇的显著降低(p＜0.001)。然而，从第6周开始在两个治疗组中都观察到脂分布(profile)的明显变化。最初的延缓期可能归因于本设计中的仓鼠是正常的而非高胆固醇的事实。因此，开始时天然谷维素或植物甾醇阿魏酸脂(合成谷维素)的效果不像方法A那么显著。然而，在6周的滞后期之后，清楚地观察到天然谷维素和植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)的效果。虽然在治疗组中在TC和TG的水平上观察到些许降低的趋势，在植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)的情况下降低不足够显著(p＞0.05)。与对照组比较，在两个治疗组中HDL-C的水平显著增加(p＜0.05)。喂养含有植物甾醇阿魏酸酯的膳食的治疗组的LDL-C(25.6％)、TC(22.7％)和TG(15.1％)的降低百分比可以与喂养含有天然谷维素饲料的另一个治疗组的(LDL-C、TC和TG分别为26.8％，24.7％和18.7％)相比拟。在这些治疗组中，即使HDL-C水平的增加百分比也相当可比拟(25.6％对比26.8％)。这些结果表明植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)的降血胆固醇活性可以与天然谷维素相比拟。表3中显示了方法B中在所有组中用于降血胆固醇活性测试的仓鼠的平均体重增加值。在所有研究组中观察到相同的体重增加。

表4

NO：天然谷维素；SO：植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)

*显著性水平(p＜0.05)；***显著性水平(p＜0.001)

表5

^a“％减少”意指(L-L_c)X100/L_c，此处L是实验组中在研究的最后的脂类组分的浓度，L_c是对照组中在研究的最后的脂类组分的浓度

表6

总之，在两个研究设计中，由阿魏酸和大豆植物甾醇制备的植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)显著地降低了胆固醇、LDL胆固醇和甘油三酯，升高了HDL胆固醇，这表明由阿魏酸和大豆植物甾醇制备的植物甾醇阿魏酸酯(合成谷维素)使升高的胆固醇水平降低(治疗作用)，并且还影响胆固醇的吸收(预防作用)。作为营养品/食品增补剂，该效果与分离自米糠油皂料的天然谷维素可以相比拟。

发明益处

1.本发明提供一种用于制备作为营养品/食品增补剂的植物甾醇阿魏酸酯的新合成方法，所述方法使用阿魏酸和分离自大豆油脱臭器馏出物的植物甾醇，所述植物甾醇阿魏酸酯与分离自米糠油皂料的谷维素中存在的一些分子等价。

2.本发明中所制备的植物甾醇阿魏酸酯与分离自米糠油皂料的天然谷维素比较显示出等价的对仓鼠的降血胆固醇活性。

Claims (16)

1.一种用于制备通式1的植物甾醇阿魏酸酯的方法，

所述方法包括以下步骤：

a.将阿魏酸乙酰化为阿魏酸乙酸酯；

b.通过在二氯甲烷、N，N’-二环己基-碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的存在下在室温下搅拌45-48小时，将步骤(a)中所获得的阿魏酸乙酸酯与植物甾醇进行酯化，以获得植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯以及副产物二环己基脲(DCU)；

c.将步骤(b)中所形成的反应产物过滤以从植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯移除副产物二环己基脲(DCU)；

d.将步骤(c)中所获得的植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯通过柱层析纯化；

e.将步骤(d)中所获得的纯化的植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯脱保护以获得植物甾醇阿魏酸酯；

f.将步骤(e)中所获得植物甾醇阿魏酸酯通过柱层析纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中通过以下方式合成所述阿魏酸乙酸酯：(i)用乙酸酐与吡啶将阿魏酸乙酰化；或(ii)用乙酸酐和多相固体催化剂12-钨磷酸的单铵盐[(NH₄)H₂PW₁₂O₄₀]通过搅拌将阿魏酸乙酰化；或(iii)用乙酸酐和多相固体催化剂12-钨磷酸的单铵盐[(NH₄)H₂PW₁₂O₄₀]通过微波辐照将阿魏酸乙酰化。

3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(a)中的使用乙酸酐和吡啶的阿魏酸的乙酰化在85-90℃的乙酸酐中进行6-8小时范围内的时期。

4.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(a)中的使用12-钨磷酸的单铵盐的阿魏酸的乙酰化在环境温度(25-30℃)下进行3-5小时。

5.根据权利要求2所述的方法，其中将在用于阿魏酸的乙酰化的步骤(a)中所使用的多相催化剂通过简单过滤而从反应混合物分离，并且将所述催化剂在没有任何预处理的情况下再使用。

6.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(a)中的使用乙酸酐和多相催化剂的阿魏酸的乙酰化在处于300-800W的微波辐照条件和100-120℃进行10-20分钟。

7.根据权利要求3，4和6所述的方法，其中所获得的阿魏酸乙酸酯的收率在80-95％的范围内。

8.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中使用的植物甾醇分离自植物油脱臭器馏出物，所述植物油脱臭器馏出物选自由大豆和向日葵组成的组。

9.根据权利要求1所述的方法，其中分离自大豆油脱臭器馏出物的植物甾醇主要含有菜油甾醇(18-23％)、豆甾醇(25-35％)和β-谷甾醇(41-56％)。

10.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(d)中使用己烷、乙酸乙酯和氯仿(以体积计80∶5∶15)的溶剂体系，将植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯选择性地从硅胶柱中洗脱。

11.根据权利要求1所述的方法，其中柱层析之后的所述植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯的收率在75-80％的范围内。

12.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(e)中通过使所述植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯与溶解在体积比为2∶1的氯仿∶甲醇中的1至3重量％的无水碳酸钾反应，将所述植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯脱保护，以从植物甾醇阿魏酸酯乙酸酯移除乙酸酯基团。

13.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(f)中使用己烷、乙酸乙酯和氯仿(以体积计80∶5∶15)作为洗脱溶剂通过硅胶柱层析，将所述植物甾醇阿魏酸酯纯化。

14.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(f)中所述植物甾醇阿魏酸酯的收率和纯度分别在85-90％和85-100％的范围内。

15.根据权利要求1所述的方法，其中制备并对仓鼠进行了降血胆固醇活性评价的植物甾醇阿魏酸酯展现出与分离自米糠油皂料的天然谷维素相比等价的降血胆固醇活性。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物甾醇阿魏酸酯即使仅包含三种化合物，即，菜油甾醇阿魏酸酯、豆甾醇阿魏酸酯和β-谷甾醇阿魏酸酯，也表现出与天然谷维素的降血胆固醇活性相似的降血胆固醇活性，所述天然谷维素包含五种化合物，即，环木菠萝烷醇阿魏酸酯、环木菠萝烯醇阿魏酸酯、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯。

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