CN102369223A - 分子印记聚合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于设计分子印记聚合物(MIP)的方法，上述分子印记聚合物可用于从各种生物工艺原料和废弃物中提取生物活性化合物。本发明进一步涉及通过本发明的方法设计的MIP。
Description
与相关申请的参考
本申请要求澳大利亚临时申请号2009900328的优先权，其内容以引用方式结合于本文。
技术领域
本发明涉及设计分子印记聚合物(MIP，molecularly imprinted polymer)的方法，上述聚合物可用于从各种生物工艺原料和废弃物中提取生物活性化合物。本发明进一步涉及通过本发明的方法设计的MIP。
背景技术
可以将分子印记聚合物(MIP)设计成具有可变水平的交联以产生具有受控刚性或柔性的聚合物(取决于功能要求)，其包含可以设计成对任何目标分析物具有特异性的空腔(结合位点)。利用模板的纯样品，可以制备MIP，其对于模板化合物是特异的或对于具有类似化学结构的其它分子是选择性的。MIP是具有高选择性和特异性的聚合物网络，上述选择性和特异性可以被比喻为抗体对其抗原的选择性和特异性。MIP提供了如下优点，MIP可以增强对温度、极端pH条件、溶剂、蛋白酶、以及降解或变性过程的抗性，其使它们可以成为用于从复杂原料中预浓缩、提取以及分离潜在附加价值生物分子的可再利用材料。
强有力的流行病学证据表明水果和蔬菜对心血管病、胃肠道癌、白内障以及其它疾病的健康益处。植物化学物质是对这种效应的主要部分作出贡献的候选物。虽然关于摄取机制、代谢以及在体内这些分子如何施加它们的生物效应的知识是不明确的，但由这些生物活性化合物提供的健康益处是广泛承认和接受的。
具有相当大兴趣的一类植物化学物质是多酚，其中白藜芦醇是一个实例。其它有兴趣的类是查耳酮类、吲哚类、香豆素类、黄烷酮类和黄烷醇类、花色素苷类以及植物甾醇类和植物甾烷醇类。
关于白藜芦醇和它的类似物或植物甾醇和它们的类似物，几乎没有发表的文献来检查产生具有所需要的特异性的MIP的方式。存在的文献仅主要强调分离的分析模式。在一种制备分离范围内试图使用所产生的MIP的情况下，并没有试图最优化MIP性能或解决较大规模使用所面临的一些关键挑战。例如，Xiang等1的工作是基于以下想法，非共价分子印记技术不适合于溶解在极性溶剂中的模板，如白藜芦醇，因此必要的是，丙烯酰胺用作单体，而在Ma等2的工作中并没有注意控制衍生MIP的选择性，其结果是，白藜芦醇衍生物、反式虎杖苷以及大黄素更加有力地结合于MIP，尽管它们的葡糖苷化结构或修饰结构。Cao等3的工作在很大程度上简单地重新叙述Xiang等1或Ma等2的相同结论，考虑到使用非常类似的方法和相同的一组测试化合物，出现上述情况并不奇怪。因此需要开发特异性MIP，其已针对特定模板或模板类型进行修改(tailor)和最优化，具有适用于工业型应用的衍生的分子印记聚合物。具体来说，需要制备适宜的MIP，其相容于目前由制造业采用的系统，允许分离在食品及同类行业中具有商业价值的目标化合物。
发明内容
本发明的发明人利用白藜芦醇作为模板已设计了白藜芦醇选择性MIP(在此文件中描述为MIP 8)。利用白藜芦醇类似物模板，包括白藜芦醇的亚胺类似物(本发明的发明人称作“绿色白藜芦醇”)、以及酰胺类似物，他们还设计了若干其它分子印记聚合物。他们已证明了他们的MIP 8在固相提取技术中的应用，其允许从葡萄籽和花生饼粉提取物选择性富集白藜芦醇。此结果可与借助于现有技术的MIP系统获得的低纯化系数形成对比，如由Ma等2、Xiang等1或Cao等3描述的那些系统。此外，他们已证明了按比例增加分子印记固相技术的能力，从而说明上述过程的可扩展性。
在第一方面，本发明提供了用于制备分子印记聚合物(MIP)的方法，其中分子印记聚合物对于化合物具有所期望水平的特异性，上述方法包括以下步骤：在有模板分子和致孔剂(porogen)存在的情况下聚合包含一个或多个非共价键合位点的单体和交联剂，随后除去模板，其中模板在结构上类似于化合物或包含结构上类似于化合物的部分，以及其中模板包含一个或多个非共价键合位点，其中所述非共价键合位点互补于单体的非共价键合位点，以及进一步其中模板具有比化合物更多或更少的非共价键合位点，从而与如果将化合物本身用作模板相比，MIP对于化合物具有不同水平的特异性。
在一种实施方式中，本发明提供了用于制备分子印记聚合物(MIP)的方法，其中分子印记聚合物对于化合物具有所期望水平的特异性，上述方法包括以下步骤：在有模板和致孔剂存在的情况下聚合包含一个或多个氢键合位点的单体和交联剂，随后除去模板，其中模板在结构上类似于化合物或包含结构上类似于化合物的部分，以及其中模板包含互补于单体的一个或多个氢键合位点的一个或多个氢键合位点，以及进一步其中模板具有比化合物更多或更少的氢键合位点，从而与如果将化合物本身用作模板相比MIP对于化合物具有不同水平的特异性。
在第二方面，本发明提供了用于引导用于分子印记聚合物(MIP)的单体的选择的方法，其中分子印记聚合物将印记有(imprinted with)包含一个或多个非共价键合位点的模板，其中MIP是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合所选单体和交联剂以及随后除去模板来制备，所述方法包括以下步骤：提供一组具有一个或多个非共价键合位点的单体，其中非共价键合位点互补于模板的非共价键合位点，评估在单体组的每种单体和模板之间形成的复合物的生成能，以及利用复合物的生成能作为选择因素以从若干单体来选择所选单体。
在一种实施方式中，本发明提供了用于引导用于分子印记聚合物(MIP)的单体的选择的方法，其中分子印记聚合物将印记有包含一个或多个氢键合位点的模板，其中MIP是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合所选单体和交联剂以及随后除去模板来制备，所述方法包括以下步骤：提供一组具有一个或多个氢键合位点的单体，其中氢键合位点互补于模板的氢键合位点，评估在单体组的每种单体和模板之间形成的氢键合复合物的生成能，以及利用氢键合复合物的生成能作为选择因素以从若干单体选择所选单体。
在第三方面，本发明提供了用于在分子印记聚合物(MIP)的制备中选择单体与模板的比率的方法，其中分子印记聚合物将印记有模板，其中MIP是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂以及随后除去模板来制备，所述方法包括以下步骤：评估在模板和不同数目的单体之间形成的复合物的生成能，以及利用复合物的生成能作为选择因素来选择单体与模板的比率。
在第四方面，提供了一种用于制备MIP的预聚合复合物，其包含一种或多种单体以及一种模板，该些单体各自包含一个或多个非共价键合位点，其中模板包含互补于单体的一个或多个非共价键合位点的一个或多个非共价键合位点。
在一种实施方式中，提供了一种用于制备MIP的预聚合氢键合复合物，其包含一种或多种单体以及一种模板，该些单体各自包含一个或多个氢键合位点，其中模板包含互补于单体的一个或多个氢键合位点的一个或多个氢键合位点。
在第五方面，提供了按照第一方面的方法制备的MIP。
在一种实施方式中，通过第二方面的方法来选择包含一个或多个非共价键合位点的单体。
在第六方面，提供了通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂以及随后除去模板而制备的MIP，其中通过第二方面的方法来引导单体的选择或通过第三方面的方法来选择单体与模板的比率。
在第七方面，提供了用于设计包含反式乙烯接头的化合物的类似物的方法，该方法包括用亚胺、酰胺或仲胺接头替代反式乙烯接头。
优选地，用亚胺接头替代反式乙烯接头。亚胺接头结构上等效于乙烯接头，但合成要简单得多。
在第八方面，提供了用于制备MIP的方法，其中MIP对于具有反式乙烯接头的化合物具有特异性，上述方法包括以下步骤：在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂以及随后除去模板，其中模板是化合物的类似物。
在第九方面，本发明提供了印记有多酚或其类似物的分子印记聚合物(MIP)，其中MIP包含聚合的4-乙烯基吡啶以及聚合的交联剂。
在第十方面，本发明提供了用于制备按照第九方面的MIP的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在有多酚或其类似物以及致孔剂存在的情况下聚合MIP；以及
(ii)从MIP除去多酚或其类似物。
在第十一方面，本发明提供了用于从样品提取一种或多种多酚的方法，其中通过将样品暴露于按照第一方面的MIP。
在一种优选形式中，样品是基于植物，以及源自食物如葡萄和它们的种子、外皮、以及果汁(和葡萄酒)，苹果、梨、浆果、以及其它水果，茶叶、花生(或花生饼粉)，以及谷物如小麦、玉米、稻米和它们的油，以及它们的副产物。
在一种实施方式中，MIP被包封(encase，包围)在可渗透网(mesh)中。
在第十二方面，本发明提供了用于通过层析法至少部分分离样品成分的方法，该方法包括以下步骤：(i)制备包含按照第一方面的MIP的层析柱；(ii)使样品通过上述柱；以及(iii)从上述柱收集样品的流分。
在第十三方面，本发明提供了印记有一种或多种化合物的MIP，上述化合物选自由甾醇和甾烷醇、以及它们的类似物或衍生物组成的组，其中所述MIP包含聚合单体。
优选地，衍生物是多酚酯如阿魏酸酯或没食子酸酯。多酚提供氢键合和π-π键合位点。
在第十四方面，本发明提供了用于制备按照第十三方面的MIP的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在有甾醇或甾烷醇、或它们的类似物或衍生物存在的情况下聚合MIP和致孔剂；以及
(ii)从MIP中除去甾醇或甾烷醇、或它们的类似物或衍生物。
在第十五方面，本发明提供了用于从样品提取一种或多种甾醇或甾烷醇、或它们的类似物或衍生物的方法，其中通过将样品暴露于按照第十三方面的MIP。
在一种实施方式中，MIP被包住在可渗透网中。
在第十六方面，本发明提供了通过层析法来至少部分分离样品成分的方法，该方法包括以下步骤：(i)制备包含按照第十三方面的MIP的层析柱；(ii)使样品通过上述柱；以及(iii)从上述柱收集样品的流分。
在研究本发明的功能聚合物的过程中，本发明的发明人已制备了若干新颖和创造性的化合物。本发明的第十七方面涉及这些新颖化合物。
在第十八方面，提供了用于至少部分分离样品的成分的方法，其中上述样品包含两种或更多种所述成分，所述方法包括将样品顺序地暴露于至少两种MIP，其中每种MIP已印记有不同的模板。
在第十九方面，提供了包封在可渗透网中的MIP。
在第二十方面，提供了用于从样品提取成分的方法，该方法包括将样品暴露于按照第十九方面的MIP。
在第二十一方面，提供了一种印记有(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇或3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺的MIP。
在第二十二方面，提供了用于从样品提取白藜芦醇的方法，所述方法包括将样品暴露于按照第二十一方面的MIP。
附图说明
图1.白藜芦醇-3-O-β-D-葡糖苷酸的结构。
图2.生产用于形成“共价”MIP的(E)-5-(4-(甲基丙烯酰氧基)苯乙烯基)-1，3-亚苯基二(2-甲基丙烯酸脂)。
图3.白藜芦醇的结构(3A)以及利用PM3计算显示电子特性和可能的相互作用位点获得的白藜芦醇表面的计算机生成的模型(3B)。
图4.分子模拟滴定结果，其示出在白藜芦醇和4VP簇之间的估计的相互作用能，其中使用PM3几何形状优化计算，其示出在三当量(eq)4VP处的一个不同的最低值。
图5.白藜芦醇复合物的空间填充图像，其中三个4VP单元通过每个芪羟基和吡啶基氮首基相互作用。计算并没有考虑到溶剂，所以应当仅用作引导。
图6.对于在白藜芦醇和功能单体丙烯酰胺(AAM)(图6A)以及4-乙烯基苯甲酸(4VBA)(图6B)之间的复合物的估计的净相互作用能(ΔEf)的模拟滴定数据，其中采用半经验计算并利用PM3力场。除此以外，还示出50mg聚合物在0.5mM白藜芦醇乙腈溶液中的静态结合数据(图6C和6D)。
图7.在添加增加的摩尔当量(equivalents)的功能单体4VP以后，白藜芦醇的芳族-OH移动的低磁场移动。表明，正形成预聚合复合物，其可能通过与吡啶基N基团的H键合相互作用。
图8.聚合物MIP 1、MIP 2、MIP 3和MIP 4以及相应NIP的重新结合数据，其示出来自白藜芦醇乙腈溶液(0.05mM)的白藜芦醇亲和力。
图9.在使用0.5mM白藜芦醇乙腈溶液的结合测定中，与聚合物MIP 1、MIP 2、MIP 3、MIP 4、NIP 1以及NIP 2的白藜芦醇结合亲和力。
图10.用以下T∶FM∶XL比率：1∶3∶15(MIP 8)、1∶3∶17(MIP 10)、1∶3∶20(MIP 9)、1∶3∶30(MIP 2)以及1∶3∶40(MIP 5)制备的MIP以及它们的各自的NIP对照材料的静态重新结合数据。
图11.多个MIP 8批次A-J(LS3-37p84-17-4-08a-j)、K(LS3-26p62-1-4-08a)、L(LS3-26p62-1-4-08b)以及M(ls2-6p10-7-2-07)的静态结合数据，其示出在乙腈中MIP生产和结合性能的再现性。重复进行所有测量。
图12.在静态条件下在CAN中高达5mM的白藜芦醇浓度范围内，与MIP 8(30mg)的白藜芦醇结合能力。利用悬浮混合器并以大约40rpm，混合样品过夜(18小时)。然后离心样品，并通过HPLC来分析等份的上层清液以确定游离白藜芦醇浓度。
图13.在静态条件下并在没有竞争的情况下，MIP 8对于在乙腈中的各种白藜芦醇类似物(0.5mM)的交叉反应性结合数据。
图14.静态结合数据，其比较在白藜芦醇印记聚合物(MIP 8)和用白藜芦醇类似物模板化MIP之间的白藜芦醇亲和力。
图15.来自MISPE结合测定的结果，其比较了在借助于用乙腈充分洗涤来除去非特异性结合以后并在动态SPE条件下交联量的影响以及在致孔剂(MIPE)中乙醇的影响。
图16.在用A)装载溶液以及B)水中的2×20％(v/v)乙醇洗涤以后，在水性条件下，白藜芦醇(0.5mM)与结合的白藜芦醇(μmole/g聚合物)的MISPE结合。
图17.在水性条件下，乙醇和水含量对白藜芦醇的保留/结合的影响。利用分别在20、50以及80％乙醇(v/v)中的白藜芦醇溶液(0.5mM)，评估了与MIP 8的结合。所示数据是指在A)装载和B)洗涤物，其包含1mL装载溶液(即，20、50以及80％乙醇)，以及三个50％含水乙醇(v/v)的连续洗涤物以后，结合的初始白藜芦醇溶液的百分比。
图18.说明，MIP 8能够从复杂原料浓缩白藜芦醇，其中复杂原料包含相对于可获得的结合位点的多种潜在竞争物。示意图A)示出锥形(spiked)葡萄籽提取物的HPLC示踪，其中提取物包含遮蔽白藜芦醇的大量未知物质；B)示出在施加白藜芦醇标准溶液(0.5mM)以后洗脱的白藜芦醇(RT 2.735分钟)；C)示出在施加尖刺葡萄籽提取物以后洗脱自MISPE柱的白藜芦醇(RT 2.735分钟)以及D)示出在尖刺葡萄籽施加于各自的NISPE柱以后的结果导致在2.735分钟处没有可观测峰，这表明没有保留白藜芦醇。
图19.在利用非印记对照聚合物(NIP)作为固定相进行SPE处理以后，(A)未处理花生饼粉、(B)MISPE处理花生饼粉以及(C)花生饼粉提取物的色谱图。
图20.在利用非印记对照聚合物(NIP)作为固定相进行SPE处理以后的色谱图：A)未处理花生饼粉，其中白藜芦醇浓度为大约0.98μg/mL花生饼粉提取物，B)MISPE处理花生饼粉，其导致白藜芦醇浓度为大约19.5μg/mL，以及C)花生饼粉提取物。
图21.胆固醇和常见的植物甾醇β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜子甾醇以及植物甾烷醇β-谷甾烷醇和菜油甾烷醇的化学结构。
图22.存在于γ-谷维素(oryzanol)中的主要成分的化学结构。
图23.MIP19(黑色)和NIP19(灰色)(Ch:4-VP：交联剂)的性能。
图24.MIP20(黑色)和NIP20(灰色)(Ch:MMA：交联剂)的性能。
图25.MIP20(黑色)和NIP20(灰色)的性能，其中使用豆甾醇作为再结合分子。
图26.MIP19(黑色)和NIP19(灰色)的性能，其中使用豆甾醇作为再结合分子。
图27.MIP22(黑色)和NIP22(灰色)的性能，其中使用豆甾醇作为再结合分子。
图28.MIP21(黑色)和NIP21(灰色)的性能，其中使用豆甾醇作为再结合分子。
图29.MIP21(黑色)和NIP21(灰色)的性能，其中使用胆固醇作为再结合分子。
图30.MIP20(黑色)和NIP20(灰色)的性能，其中使用胆固醇作为再结合模板以及2个循环的再结合。
图31.植物甾醇转化成相应的阿魏酸酯。
图32.MIP23(黑色)和NIP23(灰色)的性能，其中使用胆固醇阿魏酸酯作为再结合模板(4-VP作为功能单体)。
图33.MIP24(黑色)和NIP24(灰色)的性能，其中使用胆固醇阿魏酸酯作为再结合模板(甲基丙烯酸作为功能单体)。
图34.共价聚合物(1∶10(FM∶EDGMA)：MIP7)(黑色)和NIP7(灰色)的性能。
图35.混杂聚合物MIP 26(黑色)和NIP 26(灰色)的性能，其中使用胆固醇作为再结个底物(先前描述的)。
图36.相对于功能单体的(E)-白藜芦醇的模拟滴定数据：4-乙烯基吡啶(4VP，●)、丙烯酰胺(AAM，◆)、甲基丙烯酸(MAA，■)、甲基丙烯酸甲酯(MMA，+)以及苯乙烯(Sty，Δ)，其示出对于1-6当量的单体的预测Ei值。
图37.(A)静态结合等温线，多批次，(E)-白藜芦醇和多批次P1的结合。测量结果是基于重复测量，最少重复3次。误差条线表示标准平均误差(SEM)。(B)MIP对于(E)-白藜芦醇的选择性能力：插图示出在Scatchard(34)方式中的结合数据。
图38.在静态条件下，印记和非印记聚合物与(E)-白藜芦醇的结合性能。
图39.来自单一分析物测定的静态结合，其示出MIP P1(黑色)和NIP对照N1(灰色)对于(E)-白藜芦醇1和7种多羟基二苯乙烯结构类似物的结合分析物的量/克聚合物。
图40.烯烃1、酰胺2、以及亚胺3，与MIPRES的单一分析物选择基结合。
图41.通过MIPRES、MIP酰胺以及MIP亚胺来识别(E)-白藜芦醇。
图42.MIPRES与(E)-白藜芦醇的相对结合能力。将(E)-白藜芦醇标准溶液(0.5μmol)加载到MIPRES(100mg)，分别在乙腈(黑色)或EtOH/H2O(1∶1，v/v)(灰色)中。随后利用装载溶剂洗涤每个柱并依据5点校正曲线确定留在柱上的(E)-白藜芦醇量。
图43.花生饼粉提取物和MISPE洗脱液的RP-HPLC色谱图：未处理花生饼粉提取物(前线)、来自MIPRES MISPE柱的洗脱液(中线)以及来自NISPE柱的洗脱液(背线)。在321nm处获得色谱图。在Rt＝12.2分钟处洗脱(E)-白藜芦醇。
图44.(A)(E)-白藜芦醇结合于MIP酰胺(▲)和NIP酰胺(▲)的静态结合等温线；(B)MIP酰胺(▲)和MIPRES(◆)对于(E)-白藜芦醇的选择性亲和力的比较，表示为选择性(MIP-NIP)。
图45.MIPRES、MIP酰胺以及它们的各自的NIP对照聚合物对于(E)-白藜芦醇1、3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺2、儿茶素3以及(E)-云杉新甙4的交叉反应性研究。
图46.使用EtOH/H2O(8∶2v/v)作为流动相溶剂B的RP-HPLC色谱图，其中UV-Vis检测是在321nm处：(A)花生饼粉提取物以及来自(B)MIPRES、(C)MIP酰胺以及(D)NIPRES对照柱的洗脱液。在Rt＝12.2分钟处洗脱(E)-白藜芦醇。通过LC-ESI-MS来证实(E)-白藜芦醇的鉴别。
图47.示意性示出对获自复杂食物来源的提取物进行相继MISPE处理的构想，从而多种生物活性成分可以分离自单一来源。
图48.RP-HPLC色谱图：(A)在EtOH/H2O(1∶1v/v)中的花生饼粉提取物(10g/500mL)以及由(B)MIPRES然后由(C)MIP酰胺捕获的分子的酸洗脱。通过在λ＝321nm处的UV-Vis检测来获得色谱图。在Rt＝17分钟处洗脱(E)-白藜芦醇。
图49.RP-HPLC色谱图：(A)白藜芦醇耗尽的花生饼粉提取物，获自第一轮MISPE处理以及由(B)MIPRES然后由(C)MIP酰胺捕获的分子的酸洗脱。通过在λ＝321nm处的UV-Vis检测来获得色谱图。在Rt＝15分钟处进行A型原花青素洗脱。
图50.示意性示出用于从供料提取物分离多种目标化合物的相继SPE方式MIP柱的构造。所有不想要的物质通过每个MIP柱并留下结合于它们的相自的MISPE柱的多种目标物质，然后可以对其洗脱以各自产生高纯度的各自的目标化合物。
具体实施方式
MIP的形成通常包括以下步骤：将模板和单体(通常过量)混合在一起以形成预聚合复合物，其包含伴随有若干单体分子的单模板；然后通过借助于交联剂来聚合单体以将预聚合复合物交联成聚合物；以及随后从交联复合物除去模板。复合物的交联单体包含表面和空腔，其互补于模板的形状。通常在有致孔剂存在的情况下进行交联反应，其中致孔剂确保MIP具有包含若干孔的开放式结构。这些孔便于溶液的分子移动通过MIP以致分子能够相互作用于表面和空腔。具有和模板相同或类似形状的分析物将比溶液中的其它分子更加有力地相互作用于MIP，以致MIP可以用来捕获、浓缩和/或分离分析物。
可以采用各种不同类型的制备方法，例如，(a)整体型制备、(b)通过研磨和筛分制备的颗粒、(c)沉淀聚合过程。
本发明的发明人已合成了一系列基于白藜芦醇的化合物以产生化合物库，其可以存在于粗生物工艺原料中，以及其已用作模板来产生和研究MIP，其作为源自植物和其它生物来源的生物活性物质的特制的亲和吸附剂。可以合成所有这些分子以加入可变的功能特性(基于疏水性、亲水性以及其它物理化学参数)，从而产生具有限定物质组成的分子。可以设计、合成以及衍生这些化合物，使其具有各种不同的功能，从而包括(除了别的以外)分布在各自的脚手架上的各种点的氨基、羧基、羟基、烷基或芳基取代基，进而产生化合物类似物的子集，其可以用作用于MIP的设计和表征的模板。可以基于立体效应和电子方面的考虑来选择这些功能。具有增加数目的极性官能团或“点”的化合物更有可能有益于探测和限定所产生的MIP空腔。在MIP模板化过程中，增加可用于相互作用于功能单体分子的点的数目会潜在地增加为任何限定模板形成的空腔的特异性。
作为本发明的方法的一般性的说明，本发明的发明人还已说明了，当和甾醇或甾烷醇本身相比时，用多酚酸，如没食子酸和阿魏酸，酯化的甾醇和甾烷醇可以用作具有另外“点”的模板。
如本领域技术人员将明了的，所使用的技术适用于不同于白藜芦醇(甾醇和甾烷醇)的分子。
因此，在第一方面，本发明提供了用于制备对于化合物具有所期望水平的特异性的分子印记聚合物(MIP)的方法，该方法包括以下步骤：在有模板和致孔剂存在的情况下聚合包含一个或多个非共价键合位点的单体和交联剂，以及随后除去模板，其中模板结构上类似于上述化合物或包括结构上类似于上述化合物的部分，以及其中模板包含一个或多个非共价键合位点，其中所述非共价键合位点互补于单体的非共价键合位点，以及进一步其中模板具有比上述化合物更多或更少的非共价键合位点，从而与如果将化合物本身用作模板相比，对于上述化合物，MIP具有不同水平的特异性。
术语‘非共价键合位点’是指能够非共价键合相互作用的分子的基团或区域。非共价键合相互作用的实例包括氢键合相互作用、π-π键合相互作用、李斯特(Lifshitz)力相互作用以及范德华相互作用。
优选地，非共价键合位点是氢键合位点或π-π键合相互作用位点。更优选地，非共价键合位点是氢键合位点。
术语“互补的”是指在模板上的位点能够经由非共价键合相互作用结合于在单体上的位点，以及反过来也一样。
在模板包含结构上类似于化合物的一部分的情况下，非共价键合位点可以位于(i)上述部分上，(ii)模板的其余部分上，或(iii)如果存在两个或更多非共价键合位点，则位于上述部分上和模板的其余部分上。
例如，如将在实施例中看到的，本发明的发明人已使用甾醇和甾烷醇的阿魏酸酯来制备根据本发明的MIP。这些化合物包含结构上类似于甾醇或甾烷醇的部分(即甾醇或甾烷醇本身)，并且分子的其余部分提供非共价键合位点。阿魏酸部分提供两个氢键合位点和π-π键合相互作用位点。
在一种实施方式中，本发明提供了用于制备对于化合物具有所期望水平的特异性的分子印记聚合物(MIP)的方法，该方法包括以下步骤：在有模板和致孔剂存在的情况下聚合包含一个或多个氢键合位点的单体和交联剂，以及随后除去模板，其中模板结构上类似于上述化合物或包含结构上类似于上述化合物的一部分，以及其中模板包含互补于单体的一个或多个氢键合位点的一个或多个氢键合位点，以及进一步其中模板具有比上述化合物更多或更少的氢键合位点，从而与如果将化合物本身用作模板相比，对于上述化合物，MIP具有不同水平的特异性。
在一种实施方式中，模板的氢键合位点是酚式羟基基团。
在另一种实施方式中，单体的氢键合位点是吡啶氮。
在一种优选形式中，模板进一步包含一个或多个π-π键合相互作用位点以及单体进一步包含一个或多个互补的π-π键合相互作用位点。
在一种实施方式中，模板的π-π键合相互作用位点是酚的芳环。在另一种实施方式中，单体的π-π键合相互作用位点是吡啶的芳环。
本发明的发明人已发现，利用模板形成的MIP，其中上述模板结构上类似于化合物或包含结构上类似于化合物的部分以及进一步其中模板包含比化合物更多的氢键合位点，与如果将化合物本身用作模板相比，将倾向于对化合物(以及对具有非常密切相关结构的化合物)更具特异性。这是由于在模板上的另外的氢键合位点将会将更多单体单元吸引到预聚合复合物，以致通过模板形成的空腔将更紧密地符合模板，因而也更紧密地符合化合物，并在偶然空腔的打开使得模板的一个结合位点在聚合物中没有互补的结合位点的情况下补偿潜在结合位点的缺失。
因此，在一种实施方式中，模板具有比化合物更多的氢键合位点，从而与如果化合物本身用作模板相比，对于化合物，MIP具有更高水平的特异性。
另外，如果利用模板来形成MIP，其中模板结构上类似于化合物或包含结构上类似于化合物的一部分，以及模板包含比化合物更少的氢键合位点，那么与如果将化合物本身用作模板相比，MIP将倾向于对于化合物是较少特异的。虽然MIP对于化合物本身是较少特异的，但它对于化合物将仍然具有一定程度的特异性，从而同样用于具有一些结构相似性的化合物。这提供了一种方式，用于从复杂原料提取可能有用的化合物的类。必要时，包含上述化合物类的提取混合物可以经受进一步的纯化技术，如用更具选择性的MIP进行提取，以分离子类或单独的分子。
因此，在另一种实施方式中，模板具有比化合物更少的氢键合位点，从而与如果将化合物本身用作模板相比，对于化合物，MIP具有更低水平的特异性。
如本领域技术人员将明了的，本发明的方法便于形成MIP，其对于没有或具有很少氢键合位点的化合物显示改善水平的特异性，其中通过使用适当选择的确实具有更多氢键合位点的结构类似化合物作为模板。这提供了一种有用的方式来分离否则难以从复杂混合物提取的化合物。
就相对丰度而言，在食物、精细化工和制药行业内的大多数作为高价值产物的感兴趣的化合物有可能包含至少一个氢键合位点。一些污染物，尤其是有毒或有害化合物，如多环芳族化合物，有可能属于那些缺乏氢键合位点的家族，因此在有些情况下必须开发分子间相互作用的其它方式。如本领域技术人员将明了的，氢键合的方式同样适用于其它类型的非共价键合并可以用来设计对于化合物如多环烃具有选择性的MIP。
在第二方面，本发明提供了用于引导用于分子印记聚合物(MIP)(其将印记有包含一个或多个非共价键合位点的模板)的单体的选择的方法，其中MIP是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合所选单体和交联剂并随后除去模板来制备，所述方法包括以下步骤：提供一组具有一个或多个非共价键合位点的单体，其中非共价键合位点互补于模板的非共价键合位点；评估在单体组的每种单体和模板之间形成的复合物的生成能；以及利用复合物的生成能作为选择因素来从若干单体选择所选单体。
分子印记聚合物(MIP)的设计需要选择将有利地相互作用于所期望的模板物质的单体物质，以致在模板和单体之间形成预聚合复合物。工具的使用，如预聚合复合物的分子模拟和NMR光谱，便于选择适当的单体，其中通过进行′虚拟屏幕′，其可以减少为实现最优化MIP开发所需要的实际聚合物制备的数目。
在一种实施方式中，本发明提供了用于引导用于分子印记聚合物(MIP)的单体的选择的方法，上述分子印记聚合物将印记有包含一个或多个氢键合位点的模板，其中MIP是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合所选单体和交联剂以及随后除去模板来制备，所述方法包括以下步骤：提供一组具有一个或多个氢键合位点的单体，其中上述氢键合位点互补于模板的氢键合位点；评估在单体组的每种单体和模板之间形成的氢键合复合物的生成能；以及利用氢键合复合物的生成能作为选择因素以从若干单体来选择所选单体。
在第三方面，本发明提供了用于在将印记有模板的分子印记聚合物(MIP)的制备中选择单体与模板的比率的方法，其中MIP是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂以及随后除去模板来制备，所述方法包括以下步骤：评估在模板和不同数目的单体之间形成的复合物的生成能；以及利用复合物的生成能作为选择因素来选择单体与模板的比率。
在第二和第三方面的一种优选形式中，通过分子模拟技术来评估复合物的生成能。
例如，PM3几何优化可以用来产生复合物的理论生成能值。
在第二和第三方面的另一种优选形式中，通过NMR光谱技术来评估生成能。例如，在酚式羟基基团的情况下，上述基团的1H NMR信号的低磁场移动的大小反映了氢键合相互作用的强度。通常，低磁场移动将是约0.5至约1.5ppm，虽然，如本领域技术人员将明了的，NMR溶剂的选择将是确定移动大小的重要因素。
在第四方面，提供了用于制备MIP的预聚合复合物，其包含一种或多种单体，各自包含一个或多个非共价键合位点，以及模板，其中模板包含互补于单体的一个或多个非共价键合位点的一个或多个非共价键合位点。
在一种优选形式中，通过按照第二方面的方法来选择单体。
在另一种优选形式中，通过第三方面的方法来选择单体与模板的比率。
在一种实施方式中，提供了用于制备MIP的预聚合氢键合复合物，其包含一种或多种单体，各自包含一个或多个氢键合位点，以及模板，其中模板包含互补于单体的一个或多个氢键合位点的一个或多个氢键合位点。
在第五方面，提供了按照第一方面的方法制备的MIP。
在一种实施方式中，通过第二方面的方法来选择包含一个或多个非共价键合位点的单体。
在第六方面，提供了一种MIP，其是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂以及随后除去模板来制备，其中通过第二方面的方法来引导单体的选择或通过第三方面的方法来选择单体与模板的比率。
在本发明的方法和MIP中所使用的单体包括那些促进或便于氢键合相互作用和/或π-π键合相互作用的单体并且包括：
其中R选自由C1-4烷基、酰胺、腈、羧酸、伯胺或仲胺、CO2C1-4烷基、C1-4OH、丙烯酸羟烷基酯、苯、苄胺、萘、蒽、吡啶、嘧啶、嘌呤、N-咪唑组成的组；以及
其中R’选自由H和CH3组成的组；
以及R”选自由C1-4烷基、酰胺、腈、羧酸、伯胺或仲胺、CO2C1-4烷基、C1-4OH、以及甲基丙烯酸羟烷基酯组成的组。
在一种优选形式中，单体选自由下述组成的组：
4-乙烯基吡啶
2-乙烯基嘧啶
N-乙烯基咪唑
甲基丙烯酸
对乙烯基苯甲酸
丙烯酰胺
5-乙烯基嘧啶
2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸
乙烯基三联吡啶
N，N’-(吡啶-2，6-二基)-丙烯酰胺
N，N’-(吡啶-2，6-二基)-二(2-甲基丙烯酰胺)
4-乙烯基-1H-咪唑
(E)-N，N’-二乙基-4-乙烯基苯甲脒，以及
1，2，3，4，5-五氯-6-(4-乙烯基苯氧基)苯。
本领域技术人员将明了适用于本发明的方法和MIP的各种各样的交联剂。在一种优选实施方式中，交联剂选自由下述组成的组：
乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，EDMA)
二乙烯基苯
N，O-二丙烯酰基苯基丙氨醇
三甲基丙烯酰丙烷三甲基丙烯酸酯
季戊四醇三丙烯酸酯
季戊四醇四丙烯酸酯
N，N’-二丙烯酰-1，4-二氨基苯
N，N’-亚甲基二丙烯酰胺
二甲基丙烯酰胺，其中R是烷基链，优选长度为1至4个碳原子
在某些实施方式中，单体和交联剂可以是相同化合物。适用于本发明的方法和MIP的致孔剂包括那些促进或便于氢键合相互作用的致孔剂以及那些促进或便于疏水性相互作用或两者组合的致孔剂。
促进氢键形成的致孔剂包括乙腈、丙酮、乙酸乙酯以及二甲基甲酰胺(DMF)或它们的混合物，还包括上述与适量乙醇、甲醇或二甲亚砜(DMSO)的混合物。
促进疏水性相互作用的致孔剂包括乙腈、丙酮、乙酸乙酯、DMF、乙醇、甲醇、DMSO或它们的组合的含水混合物。
关于植物甾醇(或化合物的其它类或家族)，可以扩展以下清单，以包括水，优选混合与三氟乙酸。还可以使用有机溶剂如氯仿、二氯甲烷、己烷、甲苯，以及更具极性的有机溶剂如异丙醇、叔丁醇以及环己醇。
在第七方面，提供了用于设计包含反式乙烯接头的化合物的类似物的方法，该方法包括用亚胺、酰胺或仲胺接头替代反式乙烯接头。
优选地，化合物是白藜芦醇。
在第八方面，提供了用于制备对于具有反式乙烯接头的化合物具有特异性的MIP的方法，该方法包括以下步骤：在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂，以及随后除去模板，其中模板是化合物的类似物，以及进一步其中按照第七方面的方法来设计类似物。
在第九方面，本发明提供了印记有多酚或其类似物的分子印记聚合物(MIP)，其中MIP包含聚合4-乙烯基吡啶以及聚合交联剂。
优选地，多酚或其类似物是白藜芦醇或其类似物。更优选地，多酚或其类似物是白藜芦醇的类似物，其中反式乙烯接头被亚胺、酰胺或仲胺接头取代。在某些实施方式中，类似物具有比白藜芦醇更多或更少的羟基基团。在一种更优选的形式中，白藜芦醇的类似物是亚胺(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇或酰胺3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺。
就合成而言，与白藜芦醇本身相比，白藜芦醇类似物的亚胺和酰胺类似物是更简单和更清洁的。和利用白藜芦醇作为模板制备的MIP相比，对于白藜芦醇，利用这些模板制备的MIP已显示出具有可比的结合亲和力。
在一种优选形式中，MIP用于分离白藜芦醇。
优选地，当白藜芦醇用作模板时，白藜芦醇与4-乙烯基吡啶的比率是1∶3。通过建模研究和通过实证结果，已表明此比率是白藜芦醇结合MIP的最佳比率。类似地，亚胺(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇和酰胺3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺与4-乙烯基吡啶的比率优选为1∶3。
各种类型的化合物可以用作用于白藜芦醇的模板。这些化合物包括：
(a)查耳酮
(b)通过-NH-C(O)-连接的酰胺类似物；
(c)环状体系如黄烷醇和香豆素，即
(d)生物碱如含氮吲哚，被R基团取代的吲哚的环；
(e)其它环状类似物也是适当的，如来自以下模型反应的产物
产生苯并咪唑，其是白藜芦醇的类似物。苯并咪唑的每个苯环可以另外携带R取代基。
在这些化合物中，每个R可以是0至3个取代基，其各自独立地选自由H、OH、CH3、NH2、SH、NO2、COOH、C(O)NH2、CHO、CN、NC、OCH3、OC1-4烷基、SC1-4烷基、O-糖、N-糖、P(O)(OH)2、S(O)2(OH)、Oar、NHAr、SAr、C1-4烷基Ar、NHC1-4烷基Ar、OC(O)Ar、C(O)Oar、C(O)Ar、C(O)Nar、CF3、OCF3、卤素、NHC1-4烷基、N(C1-4烷基)2、SC1-4烷基、C(O)C1-4烷基、OC(O)C1-4烷基、C(O)OC1-4烷基、C(O)NHC1-4烷基、C(O)N(C1-4烷基)2、C1-4烷氧基、C1-4亚烷基二氧基、P(O)(OH)2、P(O)(OC1-4烷基)2、S(O)(OC1-4烷基)2、C(NH2)＝C(NH2)2、C(NH2)＝C(CN)2、C(CN)＝C(CN)2、C(CN)＝C(NH2)2、C(NH2)＝C(C1-4烷基)2、C(C1-4烷基)＝C(NH2)2、C(CN)＝C(C1-4烷基)2、C(C1-4烷基)＝C(CN)2、以及OR1组成的组
其中R1可以选自由H、Ac、葡萄糖、半乳糖、五倍子酸酯、阿魏酸酯组成的组。
X和Y表示适当的取代基。通常，H或C1-6烷基。在香豆素的情况下，X或Y可以是O并且含氧环可以包含另外的双键。
利用会聚方法，已建立和优化条件，用于合成多官能化(E)-芪(白藜芦醇)类似物的小库。合成程序已将各种官能团引入核心脚手架，其已导致产生具有独特的物质组成的低分子量化合物库。到目前为止产生的分子的概要列在表1中。这些化合物、以及它们的饱和二苯乙基类似物已用作模板来产生分子印记聚合物以及用作探针来研究这些MIP的结合特性。
表1.在MIP形成期间，借助于与单体相互作用的0-4‘点’，已合成的白藜芦醇类似物的结构。
以下示出评估和模板化的另外的化合物。实例已用作MIP模板和用作MIP测试化合物。
在一种进一步优选形式中，白藜芦醇的类似物是化学式I或化学式II的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4、R5以及R6各自独立地选自：H、OH、CH3、NH2、SH、NO2、COOH、C(O)NH2、CHO、CN、NC、OCH3、OC1-4烷基、SC1-4烷基、O-糖、N-糖、P(O)(OH)2、S(O)2(OH)、Oar、NHAr、Sar、C1-4烷基Ar、NHC1-4烷基Ar、OC(O)Ar、C(O)Oar、C(O)Ar、C(O)Nar、CF3、OCF3、卤素、NHC1-4烷基、N(C1-4烷基)2、SC1-4烷基、C(O)C1-4烷基、OC(O)C1-4烷基、C(O)OC1-4烷基、C(O)NHC1-4烷基、C(O)N(C1-4烷基)2、C1-4烷氧基、C1-4亚烷基二氧基、P(O)(OH)2、P(O)(OC1-4烷基)2、S(O)(OC1-4烷基)2、C(NH2)＝C(NH2)2、C(NH2)＝C(CN)2、C(CN)＝C(CN)2、C(CN)＝C(NH2)2、C(NH2)＝C(C1-4烷基)2、C(C1-4烷基)＝C(NH2)2、C(CN)＝C(C1-4烷基)2、C(C1-4烷基)＝C(CN)2；以及OR1
其中R1可以选自由H、Ac、葡萄糖、半乳糖、五倍子酸酯、以及阿魏酸酯组成的组。
X选自CH和N；
只要至少R1、R2、R3、R4、R5以及R6之一是OH。
甚至更优选地，化合物是化学式I的化合物以及X是N。
上文描述了适宜的交联剂。优选地，交联剂是EDGA。
在另一种优选形式中，聚合4-乙烯基吡啶与聚合交联剂的比率为3至15，更优选为5。
用于MIP制备的模板的扩大清单可以赋予潜力来形成化合物类别选择性MIP而不是分子选择性MIP。
因此，在一种实施方式中，MIP印记有的两种或更多种不同多酚或它们的类似物的混合物。
在第十方面，本发明提供了用于制备按照第九方面的MIP的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在有多酚或其类似物以及致孔剂存在的情况下聚合MIP；以及
(ii)从MIP除去多酚或其类似物。
在一种优选形式中，多酚或其类似物：4-乙烯基吡啶：交联剂的比率为1∶3∶15。
聚合的温度和时间可能是重要的。本发明的发明人已发现，用于制备本发明的MIP的优选温度范围为50-55℃，而在引用文献中制备的印记聚合物则是45℃的单一温度(Xiang等1)以及过长时间，如24小时，或60℃的单一温度(Ma等2以及Cao等3)。在一种优选形式中，致孔剂选自促进或便于氢键合相互作用的致孔剂。
更优选地，致孔剂包含一种或多种溶剂，其选自由乙腈、丙酮、乙酸乙酯、以及二甲基甲酰胺组成的组。甚至更优选地，致孔剂进一步包含一种或多种溶剂，其选自由乙醇、甲醇以及二甲亚砜组成的组。
在一种优选形式中，致孔剂包含乙腈和乙醇的混合物。在一种甚至更优选的形式中，乙腈与乙醇的比率为约5至1。
在第十一方面，本发明提供了用于从样品提取一种或多种多酚的方法，其中通过将样品暴露于按照本发明的或按照本发明的方法设计或制备的MIP。
样品可以包括但不限于农业废弃物、农产品、化学反应混合物、或制备的化合物的混合物。
可以利用任何适宜方式来进行提取，包括但不限于层析柱系统、分批吸附(罐)系统、流化床/膨胀床系统、膜相关系统以及″茶叶袋″型分离装置。
在一种优选形式中，样品是食物如葡萄籽、葡萄皮、花生或花生饼粉。
在一种优选形式中，多酚是白藜芦醇。
在第十二方面，本发明提供了用于通过层析法至少部分分离样品成分的方法，该方法包括以下步骤：(i)制备包含按照第一方面的MIP的层析柱；(ii)使样品通过柱；以及(iii)从柱收集样品的流分。
在第十三方面，本发明提供了印记有一种或多种化合物的MIP，上述化合物选自由甾醇和甾烷醇、以及它们的类似物或衍生物组成的组，其中所述MIP包含聚合单体。
优选地，单体具有一个或多个氢键合位点和/或π-π键合相互作用位点。上文描述了适宜的单体。
在一种实施方式中，单体选自由4-乙烯基吡啶、甲基甲基丙烯酸以及其它类型的功能单体组成的组，上文给出了其实例。
在另一种实施方式中，单体是乙二醇二甲基丙烯酸酯。虽然经常用作交联剂，但乙二醇二甲基丙烯酸酯还由本发明的发明人用作在某些MIP中的唯一单体。
在一种优选形式中，MIP进一步包含聚合交联剂。
上文描述了适宜的交联剂。特别优选的交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯。
优选地，甾醇和甾烷醇是植物甾醇和植物甾烷醇。
适宜的甾醇和甾烷醇包括：胆固醇、菜子甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾烷醇、以及菜油甾烷醇。
优选地，衍生物是甾醇或甾烷醇的阿魏酸酯如γ-谷维素的成分。适宜的衍生物包括：阿魏酸菜油甾醇酯、β-谷甾醇阿魏酸酯、环木菠萝烷醇阿魏酸酯、菜油甾烷基阿魏酸酯、环木菠萝烯醇阿魏酸酯以及24-亚甲基-环木菠萝烷醇阿魏酸酯。
在第十四方面，本发明提供了用于制备按照第十三方面的MIP的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在有甾醇或甾烷醇、或它们的类似物或衍生物、以及致孔剂存在的情况下聚合MIP；以及
(ii)从MIP除去甾醇或甾烷醇、或它们的类似物或衍生物。
上文描述了适宜的致孔剂。在一种优选形式中，致孔剂选自由氯仿、三氟乙酸、水、以及三氟乙酸和水的混合物组成的组。
在第十五方面，本发明提供了用于从样品提取一种或多种甾醇或甾烷醇、或其类似物或衍生物的方法，其中通过将样品暴露于按照本发明的、或按照本发明的方法制备或设计的MIP。
样品可以包括但不限于农业废弃物、农产品、化学反应混合物、或制备的化合物的混合物。
可以利用任何适宜装置来进行提取，包括但不限于层析柱系统、分批吸附(罐)系统、流化床/膨胀床系统、膜相关系统以及″茶叶袋″型分离装置。
在一种优选形式中，样品是食物如鳄梨油、芝麻籽油、麦油、或葡萄子油。
在第十六方面，本发明提供了用于通过层析法至少部分分离样品成分的方法，该方法包括以下步骤：(i)制备包含按照第十三方面的MIP的层析柱；(ii)使样品通过柱；以及(iii)从柱收集样品的流分。
在本发明的方法和MIP中，可以通过非共价方式，例如通过氢键合、π-π相互作用、给体-受体相互作用以及范德华相互作用，或通过共价方式如通过共价结合于MIP的单体，将模板加入聚合物。
可以通过本领域技术人员已知的任何方式来从共价MIP除去模板。上述方式包括但不限于酸解、碱水解、还原(使用NaBH4或LiAIH4)、用弱酸洗涤(以除去金属配位键)以及热裂解(以除去可逆的氨基甲酸酯键)。后种方式采用在高温，如60℃并在DMSO中解离氨基甲酸酯键的方法，虽然180℃并在DMSO中的非常苛刻的条件(如由Ki和合作者4所描述的，用于制备分子印记二氧化硅球体)，将不适合于如上文详述的完全基于有机的单体的类型。另外，可以认为酶裂解是可能的，其中使用例如酯酶。
在研究本发明的功能聚合物的过程中，本发明的发明人已制备了若干新颖和创造性的化合物。本发明的第十七方面涉及这些新颖化合物。
在本发明的方法和组合物中使用的各种化合物的清单列在以下表2和表3中。表中的新颖化合物还形成本发明的一部分。
表2
表3：另外的商业来源的化合物。
在一种优选形式中，本发明提供了化学式I和化学式II的新颖化合物，其中：
R1、R2、R3、R4、R5以及R6各自独立地选自：H、OH、CH3、NH2、SH、NO2、COOH、C(O)NH2、CHO、CN、NC、OCH3、OC1-4烷基、SC1-4烷基、O-糖、N-糖、P(O)(OH)2、S(O)2(OH)、Oar、NHAr、Sar、C1-4烷基Ar、NHC1-4烷基Ar、OC(O)Ar、C(O)Oar、C(O)Ar、C(O)NAr、CF3、OCF3、卤素、NHC1-4烷基、N(C1-4烷基)2、SC1-4烷基、C(O)C1-4烷基、OC(O)C1-4烷基、C(O)OC1-4烷基、C(O)NHC1-4烷基、C(O)N(C1-4烷基)2、C1-4烷氧基、C1-4亚烷基二氧基、P(O)(OH)2、P(O)(OC1-4烷基)2、S(O)(OC1-4烷基)2、C(NH2)＝C(NH2)2、C(NH2)＝C(CN)2、C(CN)＝C(CN)2、C(CN)＝C(NH2)2、C(NH2)＝C(C1-4烷基)2、C(C1-4烷基)＝C(NH2)2、C(CN)＝C(C1-4烷基)2、C(C1-4烷基)＝C(CN)2；以及OR1
其中R1可以选自由H、Ac、葡萄糖、半乳糖、五倍子酸酯、阿魏酸酯组成的组。
X选自CH和N；
只要R1、R2、R3、R4、R5以及R6的至少之一是OH。
甚至更优选地，化合物是化学式I的化合物以及X是N。
在第十八方面，提供了用于至少部分分离样品的成分的方法，其中样品包含两种或更多种所述成分，所述方法包括将样品顺序地暴露于至少两种MIP，其中每种MIP已印记有不同模板。
本发明的发明人已进一步表明，MIP可以用来从样品中提取成分，其中通过使用的包住在“茶叶袋”也就是可渗透网中的MIP，其便于容易将MIP插入或“浸入”样品，然后除去。适宜的网(mesh，网状物)包括基于棉的材料、
63μm网以及Sigma Aldrich渗析管纤维素膜(12 kDaMWCO)。
因此，在第十九方面，提供了包住在可渗透网中的MIP。MIP可以包括但不必限于本发明的或按照本发明的方法制备或设计的MIP。
在第二十方面，提供了用于从样品提取成分的方法，该方法包括将样品暴露于按照第十九方面的MIP。
在第二十一方面，提供了印记有(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇或3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺的MIP，其中所述MIP包含聚合单体。
在一种实施方式中，MIP包含交联剂。
优选地，MIP用于白藜芦醇的提取。
在MIP的制备中使用的单体、交联剂以及致孔剂可以选自那些相对于本发明的其它方面所描述的单体、交联剂以及致孔剂。
优选地，单体是4-乙烯基吡啶以及交联剂是EDGA。更优选地，用于制备MIP的模板与4-乙烯基吡啶的比率为1∶3。
优选地，MIP包含本发明的一个或多个其它方面的一种或多种特点。
在第二十二方面，提供了用于从样品提取白藜芦醇的方法，所述方法包括将样品暴露于按照第二十一方面的MIP。
优选地，随后从MIP洗涤或洗脱白藜芦醇。
本领域技术人员应当明了，本发明的方面是密切相关的，因而本发明的一个方面的特点还可以有关于本发明的另一方面。
为了可以更清楚地了解本发明的特性，现将参照以下非限制性实施例来描述其优选形式。
实施例
A白藜芦醇以及白藜芦醇类似物的合成
已合成了若干多官能化(E)-芪类似物1作为模板，借此可以产生新的分子印记聚合物(MIP)。这些化合物，连同它们的“饱和”二苯乙基类似物2一起，还用作探针来研究这些MIP的特性。利用会聚方法来合成这些化合物，其中关键步骤是官能化苯甲酰氯3与官能化苯乙烯的钯催化耦合。当酰基氯新鲜产生自母体苯甲酸5，其然后立即反应时，获得最好结果。这种合成方法描述在图解1中。
图解1：用于生产基于芪和苯乙基的化合物的合成方法
用于产生氮等排物(isostere)的关键耦合步骤示在以下图解2中。
图解2.用于产生白藜芦醇的氮等排物的耦合步骤。
除二甲基甲酰胺(DMF)，其经
分子筛加以干燥，以及甲苯，其经钠线加以干燥，之外，所使用的大多数AR溶剂购买自制造商。Milli-Q蒸馏水用于含水操作。试剂的饱和水溶液例如写成sat.NaHCO3。水溶液的溶剂提取物经无水硫酸钠干燥，过滤，然后在低压(10-400毫巴)和30-35℃下并在温度受控水浴中旋转蒸发至干燥。
利用涂布有硅胶60F254的铝片(Merck)进行分析薄层层析法(TLC)。通过(i)在254nm处的荧光以及(ii)暴露于碘蒸气或浸入乙醇磷钼酸溶液并加热直到炭化来显现成分。
利用硅胶60(Merck)，0.040-0.063mm(230-400网)，进行柱层析法：洗脱液混合物表示为容积/容积。
利用Büchi B-545熔点仪来确定熔点。
在(i)200MHz处用Bruker AC-200分光计、(ii)300MHz处用BrukerDPX-300分光计、或(iii)400MHz处用Bruker DRX-400分光计，来记录质子核磁共振(1H NMR)谱。如指出的，1H NMR谱涉及在氘代溶剂中的溶液。残留溶剂峰已用作内部参比。根据下列约定来指定共振：相对于残留溶剂峰、多重性、质子数、偶合常数(J Hz)、以及赋值以百万分之几(ppm)来测量化学位移(δ)。多重性记为(s)单线、(d)双重线、(dd)双重线的双重线、(ddd)双重线的双重线的双重线、(t)三重线、(dt)三重线的双重线、(td)双重线的三重线、(q)四重线、或(m)多重线以及前缀(b)宽(在适当情况下)。
在(i)50MHz处用Bruker AC-200分光计、(ii)75MHz处用BrukerDPX-300分光计、或(iii)100MHz处用Bruker DRX-400分光计，来记录碳核磁共振(13C NMR)谱，其中谱涉及在指定溶剂中的氘化溶液。
用Micromass Platform II API QMS电雾化质谱仪来记录低分辨率电雾化离子化质谱(ESI)。以正(ESI+)和负(ESI-)极性进行分析。报道主离子峰(m/z)，其中它们的强度表示为基峰的百分比(在括号中)。用BruckerBioApex 47e傅里叶变换质谱计来记录高分辨率电雾化质谱(HRMS)。
以下实施例用来说明这些合成方法。
合成的化合物
实施例1
1，2-二苯基乙烷(1)。在甲醇中并在95psi下氢化反式芪和10％Pd/C过夜。然后通过塞里(Celite)塑料垫过滤反应并通过旋转蒸发来浓缩滤液。用柱层析法纯化获得的产物(用己烷等度洗脱)以产生绝对(absolute，纯粹)产量的1，2-二苯基乙烷，作为清油。在室温下静置以后其会固化。Rf 0.95(4∶1己烷/EtOAc)、0.30(己烷)；mp 49.5-50.0℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.95(s，4H，2x CH2)，7.18-7.23(m，6H，H-2，H-4，H-6，H-2′，H-4′，H-6′)，7.28-7.33((m，4H，H-3，H-5，H-3′，H-5′)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ37.18(2x CH2)，125.18(4，4′)，127.59(2，6，2′，6′)，127.71(3，5，3′，5′)，141.01(1，1′)；LREI质谱；m/z 182(M·，100％)，183(16％)，91(51％)。
实施例2
(E)-4-乙酰氧基芪，[(E)-4-乙酰氧基苯乙烯基苯](2)。将新蒸苯甲酰氯、4-乙酰氧基苯乙烯、N-乙基吗啉以及二乙酸钯(2.00摩尔％)加入甲苯并在120℃下加热此混合物过夜。在冷却至室温以后，添加乙酸乙酯并各自用0.1M HCl和水洗涤溶液两次。然后干燥有机层，过滤并旋转蒸发，以产生棕色固体。自EtOAc/己烷的再结晶作用产生(E)4-乙酰氧基苯乙烯苯，作为米色细针状体。Rf 0.53(2∶1己烷/EtOAc)；mp 150-151℃；1HNMR(CDCl3)：δ2.28(s，3H，OAc)，6.99-7.10(m，4H)，7.21-7.26(m，1H)，7.30-7.36(m，2H)，7.46-7.50(m，4H)；1H NMR(CD3OD)：δ2.24(s，3H，OAc)，7.03-7.23(m，5H，J＝13.5Hz，H反式)，7.28-7.34(m，2H)，7.49-7.57(m，4H)；13CJMOD NMR(CDCl3)：δ20.13(OCOCH3)，120.81(3，5)，125.55(2′，6′)，126.44(3′，5′)，126.72(2x C反式)，127.72(2，6)，127.99(4′)，134.18(1)，136.22(1′)，149.13(4′)，168.390(OCOCH3)；LRESI正离子质谱；m/z 261(MNa+，100％)，293(MNa++MeOH，95％)。
实施例3
(E)-4-羟基芪，[(E)-4-羟基苯乙烯苯](3)。将氢氧化钾的甲醇溶液加入溶解在甲醇中的4-乙酰氧基苯乙烯苯。在氩气氛下加热此反应至65℃，时间为60分钟。将溶液注入水中，然后用稀HCl酸化至pH 4。添加氯化钠并用EtOAc提取溶液。然后分离有机层，用水洗涤三次，接着干燥，过滤并旋转蒸发，以回到淡粉色固体。用柱层析法(用2∶1的己烷/EtOAc等度洗脱)进行纯化以产生4-羟基苯乙烯苯，作为白色固体。Rf 0.42(2∶1己烷/EtOAc)；mp：189.6-190.0℃；1H NMR(CDCl3)：δ4.71(s，1H，OH)，6.79-6.82(m，2H，J邻＝8.7Hz，H2，H6)，6.93(d，1H，J反式＝16.4Hz，H烯烃)，7.02(d，1H，J反式＝16.4Hz，H烯烃)，7.18-7.23(m，1H，H4′)，7.29-7.32(m，2H，H3′，H5′)，7.37-7.40(m，2H，H3，H5)，7.44-7.47(m，2H，H2′，H6′)；LRESI负离子质谱；m/z 195([M-H]-，100％)，196(16％)。
实施例4
4-苯乙基-乙酰氧基苯(4)。在甲醇中并在95psi下氢化(E)4-乙酰氧基苯乙烯苯和10％Pd/C过夜。通过塞里塑料垫的过滤产生滤液，其被旋转蒸发至粘性油。梯度洗脱柱层析(4∶1己烷/EtOAc至2∶1己烷/EtOAc)产生4-苯乙基-乙酰氧基苯，作为透明粘性油。Rf 0.53(2∶1己烷/EtOAc)；1HNMR(CDCl3)：δ2.26(s，3H，OAc)，2.89(s，4H，2x CH2)，6.95-6.99(m，2H)，7.13-7.20(m，5H)，7.23-7.29(m，2H)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ20.15(CH3)，36.35，36.93(2 x CH2)，120.45(2，6)，125.11(4′)，127.48(2′，6′)，127.56(3′，5′)，128.46(3，5)，138.37(4)，140.64(1′)，148.04(1)，168.56(C＝O)；LRESI正离子质谱；m/z 263(MNa+，100％)，264(18％)。
实施例5
4-苯乙基-酚(5)。将氢氧化钾的甲醇溶液加入溶解在甲醇中的4-苯乙基-乙酰氧基苯。在氩气氛下加热此反应至65℃，时间为2小时。然后将清液注入水中，用1M HCl酸化至pH 2，然后用EtOAc提取。分离有机层并用水洗涤三次，然后干燥，过滤并旋转蒸发，以产生淡粉色固体。用柱层析法并通过使用2∶1EtOAc/己烷的等度洗脱进行纯化，以产生4-苯乙基-酚，作为白色固体。Rf 0.55(2∶1EtOAc/己烷)；1H NMR(CDCl3)：δ2.84(s，4H，2x CH2)，6.69-6.74(m，2H，J＝8.6Hz，ArH邻)，6.99-7.04(m，2H，J＝8.6Hz，ArH邻)，7.12-7.19(m，3H)，7.22-7.28(m，2H)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ36.09，37.24(2x CH2)，114.29(2，6)，124.99(4′)，127.42(2′，6′)，127.59(3′，5′)，128.67(3，5)，133.20(4)，140.90(1′)，152.55(1)；LRESI负离子质谱；m/z197([M-H]-，100％)，198(16％)。
实施例6
3-乙酰氧基苯甲酸(6)。在冰浴中冷却3-羟基苯甲酸在乙酸乙酯中的悬浮液。添加乙酸酐和吡啶，并使反应进行60分钟。然后在室温下搅拌获得的均匀溶液过夜。然后添加甲酸和另外的乙酸乙酯并将反应倾倒在冰水上。分离有机相并用水洗涤六次，然后干燥，过滤并旋转蒸发，以产生白色固体。此固体再结晶自EtOAc/己烷(1∶1)以产生3-乙酰氧基苯甲酸，作为白色粉末。Rf 0.46(2∶1EtOAc/己烷)；mp 133.0-133.5℃；1H NMR(CDCl3)：δ2.33(s，3H，OAc)，7.34-7.38(m，1H，H-4)，7.49(t，1H，J邻＝7.8Hz，H-4)，7.84(t，1H，J间＝2.0Hz，H-2)，8.00(dt，1H，H-6)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ20.00(OC(O)CH3)，122.42(2)，126.21(4)，126.60(6)，128.56(5)，129.84(1)，149.70(3)，168.19(COCH3)，170.27(COOH)；LRESI正离子质谱；m/z 203(MNa+，100％)，204(11％)。
实施例7
(E)-4-乙酰氧基芪，[(E)-3-乙酰氧基苯乙烯苯](7)。在100℃和氩气氛下加热3-乙酰氧基苯甲酸在无水甲苯、N，N-DMF以及亚硫酰氯中的悬浮液3小时。通过真空蒸馏除去溶剂以产生黄色油。将此材料溶解于无水甲苯中并在真空条件下声处理溶液30分钟以除去溶解气体。添加苯乙烯、N-乙基吗啉以及二乙酸钯(2摩尔％)并在120℃和氩气气氛下加热混合物22小时。将溶液冷却至室温并添加乙酸乙酯。然后用0.1M HCl洗涤溶液三次并用水洗涤溶液两次，然后干燥，过滤并旋转蒸发，以产生棕色固体。梯度洗脱柱层析(9∶1己烷/EtOAc至4∶1己烷/EtOAc)产生白色固体。该固体再结晶自2∶3EtOAc/己烷(50mL)以回到(E)-3-乙酰氧基芪，作为白色细针状体。Rf 0.45(己烷/EtOAc 9∶1)，0.75(己烷/EtOAc 4∶1)；mp 106.5-107.0℃；1H NMR(CDCl3)：δ2.30(s，3H，OAc)，6.94-7.00(m，1H，H-4)，7.04(d，1H，J反式，＝16.4Hz，H烯烃)，7.08(d，1H，H烯烃)，7.23-7.28(m，2H)，7.30-7.37(m，4)，7.45-7.50(m，2H，H-2′，H-6′)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ20.16(OC(O)CH3)，118.30(4)，119.68(2)，123.21(6)，125.67(2′，6′)，126.76，126.92(2x C烯烃)，127.75(3′，5′)，128.61(4′)，128.84(5)，136.05(1)，138.11(1′)，150.17(3)，168.41(C＝O)；LRESI正离子质谱；m/z 261(MNa+，100％)，293((MNa++MeOH，74％)；HRESI正离子质谱；C16H14O2Na+；；计算值为239.1072。
实施例8
(E)-3-羟基芪，[(E)-3-羟基苯乙烯苯](8)。将氢氧化钾在甲醇中的溶液加入3-乙酰氧基芪在甲醇中的悬浮液。在氩气氛下加热溶液至70℃，时间为2小时。然后用稀盐酸将清液酸化至pH 4。添加水，并通过旋转蒸发来减小容积直到首次出现沉淀物。添加另外的水，然后用EtOAc提取溶液四次。干燥合并的有机提取物，过滤并旋转蒸发，以产生淡黄色固体。通过梯度洗脱柱层析(4∶1己烷/EtOAc至2∶1己烷/EtOAc)来纯化上述固体以产生(E)-3-羟基芪，作为白色固体。Rf 0.36(4∶1己烷/EtOAc)，0.74(2∶1己烷/EtOAc)；mp：125.0-125.5℃，1H NMR(CD3OD)：δ6.70-6.74(m，1H，H-4)，7.00-7.05(m，2H)，7.12(s，2H)，7.16-7.28(m，2H)，7.33-7.39(m，2H)，7.53-7.56(m，2H，H-2′，H-6′)；13C JMOD NMR(CD3OD)：δ114.77(2)，116.60(4)，120.17(6)，128.34(2′，6′)，129.37，130.45，130.59(2x C烯烃，4′)，130.50(3′，5′)，131.49(5)，139.61(1′)，141.05(1)，159.54(3)；LRESI负离子质谱；m/z 195([M-H]-，100％)，196(16％)，391([2M-H]-)；HRESI负离子质谱；[M-H]-计算为195.0810。
实施例9a和9b
3-苯乙基-乙酰氧基苯(9a)和3-苯乙基酚(9b)。在90psi下氢化(E)-3-乙酰氧基芪和10％Pd/C在甲醇中的混合物过夜。通过塞里塑料垫的过滤产生溶液，旋转蒸发该溶液以回到灰色油。通过梯度洗脱柱层析(9∶1EtOAc/己烷至4∶1EtOAc/己烷)来纯化上述灰色油以回到两种主要产物：3-苯乙基-乙酰氧基苯作为白色粉末以及3-苯乙基酚作为白色固体。
3-苯乙基-乙酰氧基苯；Rf 0.32(9∶1己烷/EtOAc)；1H NMR(CDCl3)：δ2.30(s，3H，OAc)，2.96(s，4H，2x CH2)，6.94-6.98(m，2H)，7.05-7.08(m，1H)，7.19-7.25(m，3H)，7.27-7.34(m，3H)。
3-苯乙基酚；Rf 0.16(9∶1己烷/EtOAc)；1H NMR(CDCl3)：δ2.83-2.95(m，4H，2x CH2)，4.84(bs，1H，OH)，6.64-6.68(m，2H)，6.75-6.78(m，1H)，7.12-7.31(m，6H)。
实施例10
3，5-二乙酰氧基苯甲酸(10)。在冰浴中冷却3，5-二羟基苯甲酸在乙酸乙酯中的悬浮液。添加乙酸酐和吡啶并使反应进行60分钟。在室温下搅拌均匀溶液过夜。添加甲酸，然后将溶液倾倒在冰水上。添加另外的乙酸乙酯并分离有机相，然后依次用饱和NaHCO3和水各自洗涤两次，接着干燥，过滤并旋转蒸发，以产生白色固体。从EtOAc/己烷再结晶以产生3，5-二乙酰氧基苯甲酸，作为白色粉末。Rf 0.20(1∶1己烷/EtOAc)，0.39(3∶1己烷/EtOAc)；mp 161-162℃，熔点(lit mp)：157-159℃Turner et al，Macromolecules，1993，26，4617-4623；1H NMR(CDCl3)：δ2.29(s，6H，2xOAc)，7.18(假t，1H，J＝2.1Hz，H4)，7.70(假d，2H，J＝2.1Hz，H2，H6)；13CJMOD NMR(CD3OD)：δ18.43(2x CH3)，118.94(C4)，119.02(C2，6)，131.70(C1)，150.19(C5)，165.46(COOH)，168.17(2x OCOCH3)；LRESI正离子质谱；m/z 261(MNa+，100％)。
实施例11
(E)-3，5-二乙酰氧基芪，[(E)-5-苯乙烯基-1，3-亚苯基双乙酸酯](11)。将3，5-二乙酰氧基苯甲酸悬浮在无水甲苯中。添加N，N-DMF和亚硫酰氯，并在氩气氛下加热反应至100℃，时间为3小时。通过真空蒸馏除去溶剂以产生淡黄色固体，将其悬浮在无水甲苯中并在真空条件下声处理15分钟。添加苯乙烯、N-乙基吗啉和二乙酸钯(2摩尔％)并在120℃和氩气气氛下加热反应混合物过夜。在冷却到室温以后，添加乙酸乙酯并依次用0.1MHCl洗涤溶液三次，用水洗涤两次，然后干燥，过滤并旋转蒸发，以产生棕色固体。用柱层析法(梯度洗脱开始于6∶1己烷/EtOAc并以2∶1己烷/EtOAc完成)进行纯化以产生(E)-5-苯乙烯基-1，3-亚苯基双乙酸酯，作为白色粉末。进一步再结晶自EtOAc/己烷以产生作为白色细针状体的化合物。Rf 0.44(4∶1己烷/EtOAc)；mp 90.0-90.5℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.31(s，6H，2x OAc)，6.83(假t，1H，J＝2.1Hz，H-4)，7.04(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，7.09(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，7.12-7.14(m，2H，H-2，H-6)，7.25-7.30(m，1H，H-4′)，7.34-7.39(m，2H，H-3′，H-5′)，7.47-7.50(m，2H，H-2′，H-6′)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ20.09(3x CH3)，113.32(4)，115.89(2，6)，125.73(2′，6′)，125.98，127.13(2x C反式)，127.75(3′，5′)，129.72(4′)，135.69(1′)，138.72(1)，150.35(3，5)，167.93(2x C＝O)；LRESI正离子质谱；m/z 319(MNa+，100％)；HRESI正离子质谱；C18H16O4Na+；计算为319.0946，测得为319.0943。
实施例12
(E)-3，5-二羟基芪，[(E)-5-苯乙烯基苯-1，3-二醇](12)。将在氢氧化钾在甲醇中的溶液加入悬浮在甲醇中的(E)-5-苯乙烯基-1，3-亚苯基双乙酸酯。在氮气气氛下加热溶液至70℃，时间为100分钟。在冷却到室温以后，通过添加1M HCl，将溶液酸化至pH 3。添加水，通过旋转蒸发来减小容积，并在首次出现沉淀物时停止。添加乙酸乙酯，分离有机层，并用水洗涤四次，直到含水洗液为中性。然后干燥有机材料，过滤并旋转蒸发，以产生橙色油。通过梯度洗脱柱层析法(2∶1己烷/EtOAc至1∶1己烷/EtOAc)进行纯化以产生(E)-5-苯乙烯基苯-1，3-二醇，作为白色固体。Rf 0.17(己烷/EtOAc 4∶1)，0.62(己烷/EtOAc 1∶1)；mp 157.0-157.5℃，1H NMR(CD3OD)：δ6.18(假t，1H，J＝2.2Hz，H-4)，6.46(d，2H，J＝2.2Hz，H-2，H-6)，6.95(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，7.01(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，7.15-7.21(m，1H，H-4′)，7.26-7.32(m，2H，H-3′，H-5′)，7.44-7.48(m，2H，2′，6′)；13C JMOD NMR(CD3OD)：δ100.91(4)，103.92(2，6)，125.13(2′，6′)，126.19，127.27，127.48(2xC反式，4′)，127.31(3′，5′)，136.32(1′)，138.52(1)，157.28(3，5)；LRESI正离子质谱；m/z 213(MH+，100％)，214(18％)；HRESI正离子质谱；C14H12O2Na+；计算为235.0735，测得为235.0729。
实施例13a和13b
5-苯乙基-1，3-亚苯基双乙酸酯(13a)和3-羟基-5-苯乙基乙酸苯酯(13b)。在90psi下，氢化(E)-5-苯乙烯基-1，3-亚苯基双乙酸酯和10％Pd/C在甲醇中的混合物过夜。通过塞里塑料垫的过滤产生清液，旋转蒸发上述清液以回到透明胶质物，其随后经受梯度洗脱柱层析法(4∶1EtOAc/己烷至2∶1EtOAc/己烷)。此步骤导致两种主要产物(i)作为清油的5-苯乙基-1，3-亚苯基双乙酸酯，其在静置时固化以及(ii)作为透明粘性油的3-羟基-5-苯乙基乙酸苯酯。
5-苯乙基-1，3-亚苯基双乙酸酯；Rf 0.61(2∶1己烷/EtOAc)；mp48.0-48.5℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.25(s，6H，2x OAc)，2.90(s，4H，2x CH2)，6.75(假t，1H，J＝2.1Hz，H-4)，6.80(假d，2H，J＝2.1Hz，H-2，H-6)，7.13-7.30(m，5H，H-2′，H-3′，H-4′，H-5′，H-6′)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ20.07(OCOCH3)，36.26，36.59(2x CH2)，112.04(4)，118.01(2，6)，125.13(4′)，127.43，127.47(2′，3′，5′，6′)，140.16(1′)，143.21(1)，150.04(3，5)，167.99(OCOCH3)；LRESI正离子质谱；m/z 321(MNa+，100％)，322(20％)；HRESI正离子质谱；C18H18O4Na+；计算为321.1103，测得为321.1095。
3-羟基-5-苯乙基乙酸苯酯；Rf 0.42(2∶1己烷/EtOAc)；1H NMR(CDCl3)：δ2.25(s，3H，OAc)，2.79-2.91(m，4H，2x CH2)，6.41(假t，1H，J＝2.2Hz，H-4)，6.48(假d，2H，J＝2.3Hz，H-2，H-6)，7.13-7.20(m，3H，H-2′，H-4′，H-6′)，7.23-7.29(m，2H，H-3′，H-5′)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ20.19(OCOCH3)，36.26，36.59(2x CH2)，105.82(2)，112.47(4)，112.50(6)，125.04(4′)，127.42，127.45(2′，3′，5′，6′)，140.48(1′)，143.61(5)，150.32(1)，155.66(3)，169.43(OCOCH3)；LRESI正离子质谱；m/z 279(MNa+，100％)，280(20％)。
实施例14
5-苯乙基苯-1，3-二醇(14)。将溶解在甲醇中的氢氧化钾加入5-苯乙基-1，3-亚苯基双乙酸酯在甲醇中的溶液，并在氩气氛下加热至70℃，时间为150分钟。在回到室温以后，通过添加1M HCl来酸化溶液至pH 3。然后添加水并通过旋转蒸发来减少容积。然后用乙酸乙酯提取溶液四次，干燥合并提取液，过滤并旋转蒸发，以产生棕色油。经由柱层析法(梯度洗脱开始于4∶1己烷/EtOAc并以2∶1己烷/EtOAc完成)的纯化产生作为清油的5-苯乙基苯-1，3-二醇。Rf 0.36(2∶1己烷/EtOAc)；1H NMR(CDCl3)：δ2.75-2.81(m，2H，CH2)，2.84-2.90(m，2H，CH2)，4.70(bs，2H，2x OH))，6.17(假t，1H，J＝2.2Hz，H-4)，6.22(d，2H，J＝2.2Hz，H-2，H-6)，7.13-7.19(m，3H，H-2′，H-4′，H-6′)，7.23-7.29(m，2H，H-3′，H-5′)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ36.25，36.61(2x CH2)，99.85(4)，107.41(2，6)，125.00(4′)，127.41(2′，6′)，127.49(3′，5′)，140.72(1′)，144.16(1)，155.47(3，5)；LRESI负离子质谱m/z213([M-H]-，100％)，214(14％)，427([2M-H]-，13％)。
实施例15
(E)-3，4′-二乙酰氧基芪，[(E)-3-(4-乙酰氧基苯乙烯基)乙酸苯酯](15)。在氩气氛下加热3-乙酰氧基苯甲酸在无水甲苯、N，N-DMF和亚硫酰氯中的悬浮液至100℃并保持3小时。通过真空蒸馏除去溶剂并且获得的固体再溶解于无水甲苯中，然后在真空条件下声处理溶液20分钟。添加4-乙酰氧基苯乙烯、N-乙基吗啉和二乙酸钯(2摩尔％)并在120℃和氩气气氛下加热混合物过夜。在冷却到室温以后，添加乙酸乙酯，随后用0.1M HCl洗涤三次并用水洗涤两次，然后干燥，过滤并旋转蒸发，以产生棕色液体。通过柱层析法(梯度洗脱开始于4∶1己烷/EtOAc并以2∶1己烷/EtOAc完成)进行纯化以产生白色固体。1H NMR表明，大部分是(E)-3，4′-二乙酰氧基芪以及少量是未反应4-乙酰氧基苯乙烯。自EtOAc/己烷的再结晶产生(E)-3-(4-乙酰氧基苯乙烯基)乙酸苯酯，仅作为白色云母片。Rf 0.32(4∶1己烷/EtOAc)，0.59(2∶1己烷/EtOAc)；mp 124.5-125.0℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.28(s，3H，OAc)，2.29(s，3H，OAc)，6.93-7.09(m，5H，H-4，2x H反式，H-3′，H-5′)，7.21-7.22(m，1H，H-2)，7.30-7.34(m，2H，H-5，H-6)，7.45-7.50(m，2H，H-2′，H-6′)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ20.11(2x OC(O)CH3)，118.27(4)，119.74(2)，120.86(3′，5′)，123.19(6)，126.55(2′，6′)，126.96，127.76(2x C反式)，128.61(5)，133.79(1′)，137.92(1)，149.32(4′)，150.15(3)，168.35(2x C＝O)。
实施例16
(E)-3，4′-二羟基芪，[(E)-3，4′-(乙烯-1，2-二基)二酚](16)。将氢氧化钾在甲醇中的溶液加入悬浮在甲醇中的(E)-3-(4-乙酰氧基苯乙烯基)乙酸苯酯并在氩气氛下加热至70℃，时间为100分钟。在冷却到室温以后，通过添加1M HCl将溶液酸化至pH 3。然后添加水并通过旋转蒸发来减小容积直到首次出现沉淀物。添加另外的水和乙酸乙酯并分离两相。用水洗涤有机相三次直到含水洗液为中性，然后干燥，过滤并旋转蒸发，以回到米黄色固体。通过柱层析法(梯度洗脱开始于2∶1己烷/EtOAc并以1∶1己烷/EtOAc完成)的纯化产生作为米黄色粉末的(E)-3，4′-(乙烯-1，2-二基)联苯酚。Rf 0.35(2∶1己烷/EtOAc)；mp 213.0-213.5℃，1H NMR(CD3OD)：δ6.60-6.63(m，1H，H-2)，6.74(d，2H，J邻＝8.7Hz，H-3′，H-3′)，6.85(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，6.89-6.94(m，2H，H-4，H-6)，6.98(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，7.09(假t，1H，J邻＝7.9Hz，H-5)，7.33(d，2H，H-2′，H-6′)；13C JMOD NMR(CD3OD)：δ111.21(2)，112.79(4)，114.15(3′，5′)，116.68(6)，124.51(5)，126.49(2′，6′)，127.14(C反式)，128.12(1′)，128.22(C反式)，138.35(1)，155.90(4′)，156.20(3)；LRESI负离子质谱；m/z 211([M-H]-，100％)，212(13％)；HRESI正离子质谱；C14H12O2Na+；计算为235.0735，测得为235.0730。
实施例17
3-(4-乙酰氧基苯乙基)乙酸苯酯(17)。在85psi下氢化(E)-3，4′-(乙烯-1，2-二基)联苯酚和10％Pd/C在甲醇中的混合物过夜。通过Celite塞的过滤产生清液，对上述清液进行旋转蒸发以回到透明粘性油。借助柱层析法并通过等度洗脱(2∶1己烷/EtOAc)来纯化上述材料以产生作为透明粘性油的3-(4-乙酰氧基苯乙基)乙酸苯酯。此材料在室温下静置过夜以后缓慢固化。Rf 0.69(2∶1己烷/EtOAc)；mp 69.5-70.0℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.259(s，3H，OAc)，2.263(s，3H，OAc)，2.89(s，4H，2x CH2)，6.88-6.92(m，2H，H-4，H-6)，6.94-7.02(m，3H，J邻＝8.6Hz，H-2，H-3′，H-5′)，7.12-7.16(m，2H，H-2′，H-6′)，7.22-7.28(m，1H，H-5)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ20.07(2xOCOCH3)，35.91，36.55(2x CH2)，118.23(4)，120.38(3′，5′)，120，96(2)，124.99(6)，128.30(5)，128.38(2′，6′)，137.96(1′)，142.25(1)，148.03(4′)，149.85(3)，168.43，168.51(2x OCOCH3)；LRESI正离子质谱；m/z 321(MNa+，100％)，299(MH+，10％)。
实施例18
3，4′-(乙烷-1，2-二基)二酚(18)。将溶解于甲醇中的氢氧化钾加入悬浮在甲醇中的3-(4-乙酰氧基苯乙基)乙酸苯酯，然后在氩气氛下加热至80℃，时间为2小时。在冷却到室温以后，通过添加1M HCl将溶液酸化至pH 3。然后添加水并通过旋转蒸发来减小容积。然后用乙酸乙酯提取溶液四次，干燥合并提取液，过滤并旋转蒸发，以产生粘性黄色油。借助于柱层析法并通过等度洗脱(2∶1己烷/EtOAc)进行纯化以产生作为白色固体的3，4′-(乙烷-1，2-二基)联苯酚。Rf 0.41(2∶1己烷/EtOAc)；mp 108.0-108.5℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.84(s，4H，2x CH2)，4.60(s，1H，OH)，4.65(s，1H，OH)，6.63-6.78(m，5H，H-2，H-4，H-6，H-3′，H-5′)，7.00-7.07(m，2H，，H-2′，H-6′)，7.10-7.18(m，1H，H-5)；1H NMR(CD3OD)：δ2.79(s，4H，2x CH2)，6.58-6.73(m，5H，H-2，H-4，H-6，H-3′，H-5′)，6.97-7.02(m，2H，，H-2′，H-6′)，7.15-7.10(m，1H，H-5)；13C JMOD NMR(CD3OD)：δ34.19，35.45(2x CH2)，109.81(4)，112.13(3′，5′)，112.52(2)，117.17(5)，126.38(6)，126.56(2′，6′)，130.24(1′)，140.94(1)，152.24(4′)，154.13(3)；LRESI负离子质谱m/z213([M-H]-，100％)，427([2M-H]-，66％)。
实施例19
(E)-3，5-二甲基-4′-乙酰氧基芪，[(E)-4-(3，5-二甲基苯乙烯基)乙酸苯酯](19)。将3，5-二甲基苯甲酸悬浮在无水甲苯中。添加N，N-DMF和亚硫酰氯并在100℃和氩气氛下下加热反应3小时。在冷却至室温以后，通过真空蒸馏除去溶剂。将残余黄色油溶解于无水甲苯中并在真空条件下声处理溶液。添加4-乙酰氧基苯乙烯、N-乙基吗啉和二乙酸钯(2摩尔％)并在120℃和氩气氛下加热混合物过夜。在冷却到室温以后，添加乙酸乙酯并依次用0.1M HCl洗涤溶液三次，用水洗涤两次，然后干燥，过滤并旋转蒸发，以产生棕色油。通过梯度洗脱柱层析法(9∶1己烷/EtOAc至7∶1己烷/EtOAc)进行纯化以产生作为主要产物的4-乙酰氧基苯乙烯和作为副产物的米黄色固体。随后用己烷研制上述固体以产生作为白色固体的(E)-4-(3，5-二甲基苯乙烯基)乙酸苯酯。这种产物的再结晶产生半透明细针状体。Rf 0.34(9∶1己烷/EtOAc)，0.59(2∶1己烷/EtOAc)；mp 84.9-85.0℃，1HNMR(CDCl3)：δ2.28(s，3H，OAc)，2.31(s，6H，2x CH3)，6.89(bs，1H，H4)，6.97(d，1H，J＝16.4Hz，H反式)，7.02-7.07(m，3H，H3′，H5′，H反式)，7.10(bs，2H，2，6)，7.45-7.50(m，2H，J邻＝8.7Hz，H2′，H6′)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ20.12(OCOCH3)，20.32(2x CH3)，120.79(3′，5′)，123.49(2，6)，128.20，128.55(4，2x C烯烃)，134.38((1′)，136.14(1)，137.14(3，5)，149.02(4′)，168.40(3x C＝O)；LRESI正离子质谱；m/z 555(2M+Na+，14％)，321(MNa++MeOH，53％)，289(MNa+，100％)，267(MH+，12％)。
实施例20
(E)-3，5-二甲基-4′-羟基芪，[(E)-4-(3，5-二甲基苯乙烯基)酚](20)。将氢氧化钾在甲醇中的溶液加入溶解在甲醇中的(E)-4-(3，5-二甲基苯乙烯基)乙酸苯酯并在氮气气氛下加热至65℃，时间为2小时。然后将溶液倾倒在冰水上，接着用1M HCl酸化至pH 3。添加氯化钠，然后用乙酸乙酯提取溶液三次。干燥合并的提取液，过滤并旋转蒸发，以产生黄色固体。通过快速层析法(梯度洗脱开始于9∶1己烷/EtOAc并以4∶1己烷/EtOAc完成)进行纯化以产生作为白色无定形粉末的(E)-4-(3，5-二甲基苯乙烯基)酚。Rf0.29(4∶1己烷/EtOAc)；mp：142.0-142.2℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.31(s，6H，2x CH3)，4.66(s，1H，OH)，6.77-6.81(m，2H，J邻＝8.7Hz，3′，5′)，6.86(bs，1H，4)，6.88(d，1H，J反式＝16.1Hz，烯烃)，7.00(d，1H，烯烃)，7.08(s，2H，2，6)，7.34-7.39(m，2H，2′，6′)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ19.25(2x CH3)，114.22(3′，5′)，122.82(2，6)，124.88(C烯烃)，126.55(2′，6′)，126.72(C烯烃)，127.43(4)，128.39(1′)，136.58(3，5)，136.66(1)，155.74(4′)；LRESI负离子质谱；m/z223([M-H]-，100％)，224(18％)；HRESI负离子质谱；m/z[M-H]-计算为223.1123，测得为223.1126。
实施例21
4-(3，5-二甲基苯乙基)乙酸苯酯(21)。在90psi下氢化(E)-4-(3，5-二甲基苯乙烯基)乙酸苯酯和10％Pd/C在甲醇中的混合物过夜。通过塞里塑料垫的过滤产生清液，将其旋转蒸发至粘性油。通过梯度洗脱柱层析法(9∶1EtOAc/己烷至4∶1EtOAc/己烷)进行纯化以产生作为透明粘性油的4-(3，5-二甲基苯乙基)乙酸苯酯。Rf 0.64(2∶1己烷/EtOAc)，0.32(4∶1己烷/EtOAc)，0.18(9∶1己烷/EtOAc)；1H NMR(CDCl3)：δ2.267，2.270，2.271(3x s，9H，2x CH3，OAc)，2.77-2.90(m，4H，2x CH2)，6.79(bs，2H，2，6)，6.82(bs，1H，4)，6.95-7.00(m，2H，J邻＝8.6Hz，2′，6′)，7.14-7.19(m，2H，3′，5′)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ20.13(OCOCH3)，20.40(2x CH3)，36.52，36.92(2x CH2)，120.47(3′，5′)，125.44(2，6)，126.78(4)，136.89(3，5)，138.65(1′)，140.64(1)，148.06(4′)，168.57(OCOCH3)；LRESI正离子质谱；m/z 291(MNa+，100％)，292(20％)，269(MH+，5％)。
实施例22
4-(3，5-二甲基苯乙基)酚(22)。将氢氧化钾在甲醇中的溶液加入溶解在甲醇中的4-(3，5-二甲基苯乙基)乙酸苯酯，并在65℃和氩气氛下加热3小时。通过旋转蒸发来减小容积并将浓缩溶液倾倒到水中，然后用1M HCl酸化至pH 3，接着用EtOAc提取三次。然后干燥合并的提取液，过滤并旋转蒸发，以产生透明粘性油。通过柱层析法(梯度洗脱开始于9∶1己烷/EtOAc并以4∶1己烷/EtOAc完成)进行纯化以产生作为透明粘性油的4-(3，5-二甲基苯乙基)酚。Rf 0.71(2∶1EtOAc/己烷)，0.59(2∶1己烷/EtOAc)，0.39(4∶1己烷/EtOAc)；1H NMR(CD3OD)：δ2.28(s，4H，2x CH3)，2.78-2.84(m，1H，2x CH2)，4.59(bs，1H，OH)，6.71-6.76(m，2H，J邻＝8.5Hz，2，6)，6.80(bs，2H，2′，5′)，6.82(bs，1H，4′)，7.03-7.07(m，2H，3，5)；13C JMODNMR(CDCl3)：δ20.57(2x CH3)，36.42，37.36(2x C烯烃)，114.64(3，5)，125.65(2′，6′)，126.88(4′)，128.86(2，6)，133.72(1)，137.06(3′，5′)，141.14(1′)，152.67(4)；LRESI负离子质谱；m/z 225([M-H]-，100％)，226(17％)；HRESI正离子质谱；m/z MH+计算为227.1436，测得为227.1438。
实施例23
3，5-二乙酰氧基苯甲酰氯(23)。在氮气气氛和100℃下加热3，5-二乙酰氧基苯甲酸在无水甲苯、N，N-DMF和亚硫酰氯中的悬浮液3小时。通过真空蒸馏除去溶剂并用己烷处理余下的粘性液体以沉淀黄色固体。通过旋转蒸发除去己烷以产生淡黄色粉末。立即反应这种化合物。Rf 0.88(2∶1EtOAc/己烷)。Rf 0.88(2∶1EtOAc/己烷)。
实施例24
(E)-3，4′，5-三乙酰氧基芪，[(E)-5-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1，3-亚苯基双乙酸酯](24)。将3，5-二乙酰氧基苯甲酰氯、4-乙酰氧基苯乙烯、N-乙基吗啉和二乙酸钯(0.45摩尔％)溶解于无水甲苯(20mL)中并在120℃和氮气气氛下加热过夜。在冷却到室温以后，添加乙酸乙酯并用0.1M HCl和水各洗涤反应两次，然后干燥，过滤并旋转蒸发，以产生棕色固体。借助于柱层析法并通过等度洗脱(1∶1己烷/Et2O)进行纯化以产生白色固体。通过梯度洗脱层析法(4∶1己烷/EtOAc至2∶1己烷/EtOAc)对上述材料进行纯化以产生作为白色固体的E-5-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1，3-亚苯基双乙酸酯。Rf 0.29(2∶1己烷/EtOAc)；mp 112.5-113.0℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.27(s，9H，3x OAc)，6.80(假t，1H，J＝2.1Hz，4′)，6.93(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，7.03(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，7.04-7.09(m，4H，3，5，2′，6′)，7.44-7.47(m，2H，2，6)；13CJMOD NMR(CDCl3)：δ20.07(3x CH3)，113.39(4′)，115.88(2′，6′)，120.88(3，5)，126.19，126.64，128.64(2x C反式，2，6)，133.45(1)，138.53(1′)，149.46(4)，150.34(3′，5′)，167.91，168.30(3x C＝O)；LRESI正离子质谱；m/z 377(MNa+，100％)，378(21％)。
实施例25
(E)-3，4′，5-三乙酰氧基芪，(E)-5-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1，3-亚苯基双乙酸酯(25)。在氩气氛下，加热3，5-二乙酰氧基苯甲酸、N，N-DMF和亚硫酰氯在无水甲苯中的混合物至100℃，时间为3小时。通过真空蒸馏除去溶剂，随后将白色固体残余物悬浮在无水甲苯中，然后在真空条件下进行声处理。添加4-乙酰氧基苯乙烯、N-乙基吗啉和二乙酸钯(2.0摩尔％)并在120℃下加热此混合物过夜。在冷却到室温以后，添加乙酸乙酯并用0.1MHCl洗涤溶液三次，然后干燥，过滤并旋转蒸发，以产生棕色固体。通过梯度洗脱柱层析法(2∶1己烷/EtOAc至100％EtOAc)进行纯化以产生作为白色固体的(E)-5-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1，3-亚苯基双乙酸酯。Rf 0.29(2∶1己烷/EtOAc)；mp 112.5-113.0℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.27(s，9H，3x OAc)，6.80(假t，1H，J＝2.1Hz，4′)，6.93(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，7.03(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，7.04-7.09(m，4H，3，5，2′，6′)，7.44-7.47(m，2H，2，6)；13C JMODNMR(CDCl3)：δ20.07(3x CH3)，113.39(4′)，115.88(2′，6′)，120.88(3，5)，126.19，126.64，128.64(2x C反式，2，6)，133.45(1)，138.53(1′)，149.46(4)，150.34(3′，5′)，167.91，168.30(3x C＝O)；LRESI正离子质谱；m/z 377(MNa+，100％)，378(21％)。
实施例26
(E)-3，4′，5-三乙酰氧基芪，(E)-5-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1，3-亚苯基双乙酸酯(26)。将3，5-二乙酰氧基苯甲酰氯、4-乙酰氧基苯乙烯、N-乙基吗啉和二乙酸钯(0.45摩尔％)溶解在无水甲苯中并在120℃和氮气气氛下加热过夜。在冷却到室温以后，添加乙酸乙酯并用0.1M HCl洗涤反应两次，然后用水洗涤，接着干燥，过滤并旋转蒸发至棕色固体。借助于柱层析法并通过等度洗脱(1∶1己烷/Et2O)进行纯化以产生白色固体。通过梯度洗脱层析法(4∶1己烷/EtOAc至2∶1己烷/EtOAc)纯化这种材料以产生作为白色固体的(E)-5-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1，3-亚苯基双乙酸酯。Rf 0.29(2∶1己烷/EtOAc)；mp 112.5-113.0℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.27(s，9H，3x OAc)，6.80(假t，1H，J＝2.1Hz，4′)，6.93(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，7.03(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，7.04-7.09(m，4H，3，5，2′，6′)，7.44-7.47(m，2H，2，6)；13C JMODNMR(CDCl3)：δ20.07(3x CH3)，113.39(4′)，115.88(2′，6′)，120.88(3，5)，126.19，126.64，128.64(2x C反式，2，6)，133.45(1)，138.53(1′)，149.46(4)，150.34(3′，5′)，167.91，168.30(3x C＝O)；LRESI正离子质谱；m/z 377(MNa+，100％)，378(21％)。
实施例27
(E)-5-(4-羟基苯乙烯基)苯-1，3-二醇(27)。将溶解于甲醇中的氢氧化钾加入悬浮在甲醇中的(E)-5-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1，3-亚苯基双乙酸酯并在氮气气氛下加热至65℃，时间为1小时。通过旋转蒸发来减小容积，然后用1M HCl酸化溶液至pH 3。添加乙酸乙酯，然后用饱和盐水洗涤溶液三次，接着干燥，过滤并旋转蒸发，以产生暗红色固体。借助于柱层析法(0,040-0,063mm SiO2)，通过等度洗脱并使用EtOAc进行纯化以产生作为浅米色固体的(E)-5-(4-羟基苯乙烯基)苯-1，3-二醇。Rf 0.65(EtOAc)；1HNMR(CD3OD)：δ6.13(假t，1H，J＝2.2Hz，4)，6.41-6.42(m，2H，2，6)，6.71-6.79(m，3H，H反式，3′，5′)，6.93(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，7.29-7.36(m，2H，J邻＝8.6Hz，2′，6′).13C JMOD NMR(CD3OD)：δ.LRESI正离子质谱；m/z229(MH+，100％)，230(23％)。
实施例28
4-(3，5-二乙酰氧基苯乙基)-乙酰氧基苯。在95psi下，氢化(E)-4-(3，5-二乙酰氧基苯乙烯)-乙酰氧基苯和10％Pd/C在甲醇中的混合物过夜。通过塞里塑料垫的过滤产生清液，对其进行旋转蒸发以产生粘性油。借助于柱层析法(0,040-0,063mm SiO2)并通过等度洗脱(2∶1EtOAc/己烷)进行纯化以产生作为透明粘性油的4-(3，5-二乙酰氧基苯乙基)-乙酰氧基苯，在室温下静置以后，其固化成白色固体。Rf 0.68(2∶1EtOAc/己烷)，0.52(2∶1Et2O/己烷)；mp 52.0-52.5℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.25(s，6H，2x OAc)，2.26(s，3H，OAc)，2.88(s，4H，2x CH2)，6.75-6.77(m，3H)，6.95-6.98(m，2H，J邻＝8.4Hz，ArH)，7.12-7.14(m，2H，ArH)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ20.03(3x CH3)，35.57，36.47(2x CH2)，112.08(4′)，118.00(3，5)，120.46(2′，6′)，128.33(2，6)，137.64(1)，142.91(1′)，148.02(4)，150.01(3′，5′)，167.98，168.53(3x C＝O)；LRESI正离子质谱；m/z 379(MNa+，100％)，380(21％)。
实施例29
4-(3，5-二羟基苯乙基)-酚(29)。将氢氧化钾在甲醇中的溶液加入在甲醇中的4-(3，5-二乙酰氧基苯乙基)-乙酰氧基苯，然后在氩气氛下加热至65℃，时间为30分钟。然后将溶液倾倒到水中，用1M HCl酸化至pH 4。添加NaCl并用EtOAc提取溶液。分离有机层并用饱和盐水洗涤两次，然后经无水Na2SO4干燥，过滤并旋转蒸发，以产生橙色固体。借助于柱层析法(0,040-0,063mm SiO2)并通过等度洗脱(2∶1EtOAc/己烷)进行纯化以产生作为白色固体的4-(3，5-二羟基苯乙基)-酚。Rf 0.44(2∶1EtOAc/己烷)；Mp：160.5-161.0℃，1H NMR(CD3OD)：δ2.61-2.75(m，4H，2x CH2)，6.05(假t，1H，J＝2.2Hz，4′)，6.09-6.10(m，2H，2′，6′)，6.61-6.66(m，2H，J邻＝8.6Hz，3，5)，6.91-6.96(m，2H，2，6)；13C JMOD NMR(CD3OD)：δ35.56，37.08(2xCH2)，98.81(4′)，105.82(2′，6′)，113.66(3，5)，128.01(2，6)，131.82(1)，143.33(1′)，153.85(4)，156.80(3′，5′)；LRESI正离子质谱；m/z 231(MH+，100％)，232(12％)，253(MNa+，11％)；HRESI正离子质谱；MH+计算为231.1021，测得为231.1014。
实施例30
(E)-3，5-二硝基-4′-乙酰氧基芪，乙酸(E)-4-(3，5-二硝基苯乙烯基)苯酯(30)。将3，5-二硝基苯甲酰氯、4-乙酰氧基苯乙烯、N-乙基吗啉和二乙酸钯(2摩尔％)加入无水甲苯并在120℃和氩气气氛下加热过夜。在冷却到室温以后，添加乙酸乙酯并用0.1M HCl洗涤溶液四次，然后用水洗涤两次。然后经无水Na2SO4干燥有机层，过滤并旋转蒸发，以产生深棕色固体。将此材料悬浮在CH2Cl2中并在通过旋转蒸发除去溶剂以前添加硅石。然后作为窄带将剩余的粉末加载到柱上，然后通过等度洗脱层析法(0,040-0,063mm SiO2)并使用CH2Cl2进行纯化以产生作为明黄色固体的(E)-4-(3，5-二硝基苯乙烯基)乙酸苯酯。Rf0.42(CH2Cl2)；mp，217.5-218.0℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.30(s，3H，OAc)，7.08-7.17(m，3H，H3′，H5′)，7.32(d，1H，Jtran＝16.3Hz，H烯烃)，7.54-7.58(m，2H，J邻＝8.5Hz，H2′，H6′)，8.60-8.61(m，2H，J间＝2.0Hz，H2，H6)，8.87(假t，1H，H4)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ20.31(CH3)，115.92(4)；121.75(3′，5′)，124.22(C烯烃)，125.48(2，6)，127.66(2′，6′)，132.42(C烯烃)，133.15(1′)，140.39(1)，148.05(3，5)，150.28(4′)，168.55(CO)；EIMS：m/z 328(M+，6％)，286(100％)，147(30％)。
实施例31
(E)-3，5-二硝基-4′-羟基芪，(E)-4-(3，5-二硝基苯乙烯基)酚)(31)。将氢氧化钾在甲醇中的溶液加入悬浮在甲醇中的(E)-4-(3，5-二硝基苯乙烯基)乙酸苯酯并在氩气氛下加热至65℃，时间为2小时。通过旋转蒸发来减半反应溶液容积，然后倾倒到冰水上，接着用1M HCl酸化至pH 3。然后用乙酸乙酯提取获得的明黄色固体并除去有机层，接着用水洗涤三次。经无水Na2SO4干燥提取液，然后过滤并旋转蒸发，以产生明橙色固体。通过梯度洗脱层析法(无水CH2Cl2至9∶1CH2Cl2/MeOH)进行纯化以产生作为明橙色粉末的(E)-4-(3，5-二硝基苯乙烯基)酚。Rf 0.31(CH2Cl2)；1H NMR(CD3OD)：δ6.79(m，2H，J邻＝8.5Hz，H3′，H5′)，7.16(d，1H，Jtran＝16.2Hz，H烯 烃)，7.40-7.49(m，3H，H烯烃，H2′，H6′)，8.67-8.69(m，2H，H2，H6)，8.73(m，1H，H4)；13C JMOD NMR(CD3OD)：δ.ESI MS：m/z 286(100％)，147(53％)。
实施例32
(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇(32)。在室温下剧烈搅拌3，5-二羟基苯甲醛、4-氨基酚和无水硫酸钠在二氯甲烷中的混合物3小时。添加另外的无水硫酸钠并搅拌持续1小时。通过旋转蒸发除去二氯甲烷。将余下的白色粉末再悬浮在沸腾乙醇中，然后通过真空过滤除去。用另外的沸腾乙醇冲洗回收的固体滤。合并滤液并旋转蒸发至干燥以产生作为淡粉色固体的(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇。Lit(WO2006/108864A2)162℃(dec)；1H NMR(d6-DMSO)：δ6.36(假t，1H，J＝2.2Hz，H-4)，6.80-6.85(m，4H，H-2，H-6，H-3′，H-5′)，7.16-7.22(m，2H，J邻＝8.8Hz，H-2′，H-6′)，8.43(s，1H，亚胺-H)，9.47(bs，3H，3x酚式ic-OH)；13CJMOD NMR(d6-DMSO)：δ106.27(4)，107.41(2，6)，116.70(3′，5′)，123.42(2′，6′)，139.35(1)，143.61(1′)，157.16(4′)，158.38(亚胺-C)，159.62(3，5)；LRESI正离子质谱；m/z 230(MH+，100％)，231(13％)；HRESI正离子质谱；C13H11NO3Na+，计算为252.0637，测得为252.0633。
实施例33
3，4，5-三乙酰氧基苯甲酸(33)。在冰浴中冷却3，4，5-三羟基苯甲酸在乙酸乙酯中的悬浮液，然后添加乙酸酐和吡啶。使反应进行45分钟，然后加热反应以回流3小时。然后添加另外的乙酸酐并在室温下搅拌溶液过夜。添加甲酸并将溶液倾倒在冰水上。除去有机层，然后用饱和NaHCO3洗涤四次并用水洗涤两次，干燥，过滤并旋转蒸发，以产生白色固体。从1∶1EtOAc/己烷的再结晶产生作为白色粉末的3，4，5-三乙酰氧基苯甲酸。Rf0.47(EtOAc)；mp 167.5-168.0℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.279(s，6H，2x OAc)，2.284(s，3H，OAc)，7.84(s，2H，芳族)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ.LRESI正离子质谱；m/z 319(M+Na+，100％)，负离子质谱；m/z 295([M-H]-，100％)。
实施例34
(E)-3，4，5，4′-四乙酰氧基芪[(E)-5-(4-乙酰氧基苯乙烯基)苯-1，2，3-三基三乙酸酯](34)。将3，4，5-三乙酰氧基苯甲酸悬浮在无水甲苯中。添加N，N-DMF和亚硫酰氯并在氩气氛下加热反应至100℃，时间为3小时。通过真空蒸馏除去溶剂以产生淡黄色固体。将此酰基氯悬浮在无水甲苯中并在真空条件下声处理混合物30分钟。添加4-乙酰氧基苯乙烯、N-乙基吗啉和二乙酸钯(2摩尔％)并120℃和氩气氛下加热混合物过夜。在冷却到室温以后，添加乙酸乙酯并依次用水洗涤溶液一次，用0.1M HCl洗涤三次，并再次用水洗涤，然后干燥，过滤并旋转蒸发，以产生深棕色粘性油。通过梯度洗脱柱层析法(无水己烷至无水EtOAc)的纯化分离和回收4-乙酰氧基苯乙烯和(E)-3，4，5，4′-四乙酰氧基芪。从己烷∶乙酸乙酯(3∶2)的(E)-3，4，5，4′-四乙酰氧基芪的再结晶产生作为白色细针状体的(E)-3，4，5，4′-四乙酰氧基芪。Rf 0.49(1∶1己烷/EtOAc)，0.23(2∶1己烷/EtOAc)；mp162.5-163.0℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.26(s，3H，OAc)，2.27(s，6H，2x OAc)，2.28(s，3H，OAc)，6.91(d，1H，J＝16.2Hz，H反式)，6.99(d，1H，H反式)，7.04-7.08(m，2H，J邻＝8.6Hz，J间＝1.9Hz，H-3′，H-5′)，7.20(bs，2H，H-2，H-6)，7.42-7.47(m，2H，H-2′，H-6′)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ19.12，19.62，20.08(OCOCH3)，117.45(2，6)，120.87(3′，5′)，125.65(C烯烃)，126.64(2′，6′)，128.70(C烯烃)，132.76(1)，133.39(4)，134.89((1′)，142.61(3，5)，149.47(4′)，165.99，166.82，168.30(OCOCH3)；LRESI正离子质谱；m/z 435(MNa+，100％)；HRESI正离子质谱；m/z C22H20O8Na+，，计算为435.1056，测得为435.1061。
实施例35
(E)-3，4，5，4′-四羟基芪[(E)-5-(4-羟基苯乙烯基)苯-1，2，3-三醇](35)。将对甲苯磺酸一水合物(4mg，0.021毫摩尔)在甲醇(1.0mL)中的溶液加入悬浮在甲醇(9mL)中的(E)-3，4，5，4′-四乙酰氧基芪(150mg，0.3623毫摩尔)。在氩气氛下加热反应以回流4小时。通过旋转蒸发除去溶剂，然后用己烷研制余下的粉红色固体。滤出该固体并空气干燥以产生粉红色粉末。通过梯度洗脱柱层析法(2∶1EtOAc/己烷至无水EtOAc)进行纯化以产生作为淡黄色粉末的(E)-3，4，5，4′-四羟基芪。Rf 0.34(2∶1EtOAc/己烷)；1H NMR(CD3OD)：δ6.50(bs，2H，H-2，H-6)，6.70(d，1H，J反式＝16.2Hz，H烯烃)，6.69-6.76(m，2H，J邻＝8.7Hz，H-3′，H-5′)，6.77(d，1H，H烯烃)，7.25-7.30(m，2H，H-2′，H-6′)；13C JMOD NMR(CD3OD)：δ104.12(2，6)，114.07(3′，5′)，124.55，124.90(2x C烯烃)，126.01(2′，6′)，128.45(1′)，128.56(1)，131.62(4)，144.63(3，5)，155.42(4′)；LRESI负离子质谱；m/z 243([M-H]-，100％)，244(17％)。
实施例36
5-(4-乙酰氧基苯乙基)苯-1，2，3-三基三乙酸酯(36)。在90psi下氢化(E)-3，4，5，4′-四乙酰氧基芪和10％Pd/C在甲醇中的混合物过夜。通过塞里塑料垫过滤反应，然后旋转蒸发至灰色油。然后将此油溶解于乙酸乙酯中，接着在添加乙酸酐和吡啶以前在冰浴中冷却。在添加另外的乙酸酐和随后在80℃下加热3小时以前使反应进行60分钟。然后在室温下搅拌混合物过夜。然后将反应溶液倾倒在冰水上，并用乙酸乙酯提取。随后除去有机层，用水洗涤四次，然后干燥，过滤并旋转蒸发，以产生橙色油。此油通过梯度洗脱层析法(4∶1己烷/EtOAc至1∶1己烷/EtOAc)加以纯化以产生作为白色粉末的5-(4-乙酰氧基苯乙基)苯-1，2，3-三基三乙酸酯。Rf 0.36(1∶1己烷/EtOAc)；mp 121.5-122.0℃，1H NMR(CDCl3)：δ2.24(s，6H，2x OAc)，2.25(s，3H，OAc)，2.26(s，3H，OAc)，2.87(bs，4H，2x CH2)，6.89(bs，2H，H-2，H-6)，6.95-6.99(m，2H，J邻＝8.4Hz，J间＝2.0Hz，H-3′，H-5′)，7.11-7.16(m，2H，H-2′，H-6′)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ19.11，19.59，20.06(4x OCOCH3)，35.54，36.23(2x CH2)，119.56(2，6)，120.49(3′，5′)，128.32(2′，6′)，131.72(4)，137.54(1′)，139.02(1)，142.19(3，5)，148.04(4′)，166.08，166.86，168.51(4x OCOCH3)；LRESI正离子质谱；m/z 437(MNa+，100％)，438(22％)；HRESI正离子质谱；C22H22O8Na+；计算为437.1212，测得为437.1196。
实施例37
5-(4-羟基苯乙基)苯-1，2，3-三醇(37)。将对甲苯磺酸一水合物在甲醇中的溶液加入1-(3，4，5-三-O-乙酰基苯乙基)-4-O-乙酰基苯在甲醇中的悬浮液。在氩气气氛下加热反应至85℃过夜。通过旋转蒸发除去溶剂并用柱层析法(等度洗脱，2∶1EtOAc/己烷)对油进行纯化以回到作为白色固体的5-(4-羟基苯乙基)苯-1，2，3-三醇。Rf 0.55(2∶1EtOAc/己烷)；mp 180.0-188.5℃，1H NMR(CD3OD)：δ2.55-2.61(m，2H，CH2)，2.66-2.72(m，2H，CH2)，6.13(bs，2H，H-2，H-6)，6.61-6.65(m，2H，J邻＝8.5Hz，H-3′，H-5′)，6.90-6.93(m，2H，H-2′，H-6′)；13C JMOD NMR(CD3OD)：δ39.03(CH2)，39.75(CH2)，109.36(2，6)，116.74(3′，5′)，131.14(2′，6′)，132.74(4)，135.11(1′)，131.37(1)，147.43(3，5)，156.83(4′)；LRESI负离子质谱；m/z 245([M-H]-，100％)，246(18％)；HRESI负离子质谱；对于C14H14O4-H-，计算的m/z为245.0814，测得为245.0814。
实施例38
3，5-二(叔丁基二甲基甲硅氧基)苯甲醛(38)。在氩气气氛下进行反应。将二异丙基乙胺加入3，5-二羟基苯甲醛溶解在干燥N，N-DMF中的溶液。在室温下充分搅拌溶液20分钟然后经15分钟滴加溶解在干燥N，N-DMF中的叔丁基二甲基氯化甲硅烷以后，在室温下搅拌混合物过夜。然后将反应倾倒到冰水中，用二氯甲烷提取，干燥合并的提取液(无水Na2SO4)并旋转蒸发，以回到棕色油。用柱层析法(梯度洗脱，开始于己烷(100％)并以9∶1己烷/EtOAc完成)进行纯化以产生作为清油的3，5-二(叔丁基二甲基甲硅氧基)苯甲醛。Rf 0.80(4∶1己烷/EtOAc)，0.50(19∶1己烷/EtOAc)；1H NMR(CDCl3)：δ0.22(s，12H，2x Si(CH3)2)，0.99(s，18H，2x SiC(CH3)3)，6.59(假t，1H，J＝2.3Hz，H4)，6.96(假d，2H，J＝2.3Hz，H2，H6)，9.86(s，1H，CHO)；13CJMOD NMR(CDCl3)：δ-4.15(SiCH3).18.46(C(CH3)3)，25.90(C(CH3)3)，114.61(2，6)，118.59(4)，138.73(1)，157.55(3，5)，191.80(CHO)。
实施例39a
(5-乙烯基-1，3-亚苯基)二(氧)二(叔丁基二甲基硅烷(39a)。在氩气气氛下进行反应。通过加热回流亚甲基三苯基溴化膦(34.787g，97.443毫摩尔，Aldrich Chem.Co.)和叔丁醇钾(9.010g，73.856毫摩尔，Aldrich Chem.Co.)在无水THF中的混合物，首先原位产生亚甲基三苯基正膦。在回到室温以后，滴加3，5-二(叔丁基二甲基甲硅氧基)苯甲醛在无水THF中的溶液并加热反应以回流过夜。然后添加乙酸乙酯(600mL)并用水洗涤溶液，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发至棕色油。用柱层析法(梯度洗脱，开始于己烷(100％)并以7∶1己烷/EtOAc完成)进行纯化以产生作为淡黄色油的(5-乙烯基-1，3-亚苯基)二(氧)二(叔丁基二甲基硅烷)。Rf 0.44(50∶1己烷/EtOAc)，0.75(25∶1己烷/EtOAc)；1H NMR(CDCl3)：δ0.21(s，12H，2x Si(CH3)2)，0.99(s，18H，2x SiC(CH3)3)，5.02(dd，1H，J＝12.8Hz，J＝1.5Hz，Halk)，5.66(dd，1H，J＝13.2Hz，J＝0.7Hz，Halk)，6.59(假t，1H，J＝1.6Hz，H2)，6.96(假d，2H，J＝1.6Hz，H4，H6)，6.58(dd，1H，Halk)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ-8.03(SiCH3).18.56(C(CH3)3)，26.06(C(CH3)3)，111.80(4，6)，112.02(2)，114.20(＝CH2)，137.12(CH＝)，139.78(5)，156.97(1，3)；LRESI正离子质谱；m/z 365(MH+，100％)，366(37)。
实施例39b
5-乙烯基苯-1，3-二醇，[3，5-二羟基苯乙烯](39)。在氩气气氛下进行反应。经15分钟，将溶解在THF中的氟化四丁基铵加入在无水THF中的(5-乙烯基-1，3-亚苯基)二(氧)二(叔丁基二甲基硅烷)并在室温下放置反应90分钟。然后通过旋转蒸发减小容积并用乙酸乙酯代替上述容积。然后用水洗涤溶液，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发至棕色油。用柱层析法(用1∶1己烷/EtOAc进行等度洗脱)进行纯化以产生粘性淡黄色油。进一步进行柱层析法(梯度洗脱，开始于4∶1己烷/EtOAc，并以1∶1己烷/EtOAc完成)以回到作为淡黄色油的5-乙烯基苯-1，3-二醇。Rf 0.58(1∶1己烷/EtOAc)，0.76(1∶2己烷/EtOAc)；1H NMR(CD3OD)：δ5.16(dd，1H，J＝10.8Hz，J＝1.1Hz，Halk)，5.66(dd，1H，J＝17.6Hz，J＝1.2Hz，Halk)，6.22(假t，1H，J＝2.2Hz，H2)，6.40(假d，2H，J＝2.2Hz，H4，H6)，6.58(dd，1H，Halk)；13C JMOD NMR(CD3OD)：δ102.24(2)，104.92(4，6)，112.95(＝CH2)，137.11(CH＝)，140.07(5)，158.31(1，3)；LRESI负离子质谱；m/z 135([M-H]-，100％)，136(17％)。
实施例40
5-乙烯基-1，3-亚苯基双乙酸酯，[3，5-二乙酰氧基苯乙烯](40)。在氩气气氛下进行反应。将5-乙烯基苯-1，3-二醇溶解于乙酸乙酯中。添加吡啶和乙酸酐并加热反应以回流4小时，然后在室温下放置过夜。用另外的乙酸乙酯增加容积并用水洗涤溶液，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发至黄色半固体。用柱层析法(等度洗脱，使用4∶1己烷/EtOAc)进行纯化以产生作为清油的5-乙烯基-1，3-亚苯基双乙酸酯。Rf 0.29(4∶1己烷/EtOAc)；1HNMR(CDCl3)：δ2.30(s，6H，2x OAc)，5.33(d，1H，J＝10.9Hz，Halk)，5.75dd，1H，J＝17.5Hz，Halk)，6.66(dd，1H，Halk)，6.84(假t，1H，J＝2.1Hz，H2)，7.03(假d，2H，J＝2.1Hz，H4，H6)；13C JMOD NMR(CDCl3)：δ21.37(2x CH3)，114.93(2)，116.18(＝CH2)，117.04(4，6)，135.66(CH＝)，140.27(5)，151.54(1，3)，169.22(2x CO)；LRESI正离子质谱；m/z 243(MH+，100％)，244(13％)。
实施例41。(E)-3，3′，5，5′-四乙酰氧基-芪(41)
试图制备(2+2)加成物；(E)-3，5，3′，5′-四乙酰氧基芪。系统命名为(E)-5，5′-(乙烯-1，2-二基)二(苯-5，3，1-三基)四乙酸酯。
将3，5-二乙酰氧基苯甲酸(1.841g，7.735毫摩尔，批次BDp125-21-9-07)悬浮在钠线干燥甲苯(50mL)中。添加干燥N，N-DMF(0.5mL)和亚硫酰氯(5.0mL，69毫摩尔)并在氩气气氛下加热反应以回流三小时。在20分钟内溶解所有材料。通过真空蒸馏(0.1mm/60℃)除去溶剂，然后将获得的黄色固体再溶解于无水甲苯(25mL)中并在真空条件下声处理15分钟以除去溶解气体。添加3，5-二乙酰氧基苯乙烯(1.547g，7.032毫摩尔，批次BDp143-18-10-07)、N-乙基吗啉(983μL，7.735毫摩尔)和二乙酸钯(35mg，0.0155毫摩尔，2摩尔％)并在氩气气氛下加热混合物以回流过夜。在回到室温以后，添加乙酸乙酯(200mL)并依次用水(5x 50mL)洗涤溶液，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发。以产生3.269g深棕色胶质物。这种原材料的TLC表明许多产物。1H NMR(300MHz，CDCl3)表明没有明显的反式芪产物，以及苯乙烯原始材料。ESI质谱分析表明，没有五-O-乙酸乙酯或部分脱乙酰加成物。正模式(positive mode)表明与苯乙烯原始材料一致的m/z 243[MNa+]。负离子模式表明，与酸原始材料一致的m/z 237[M-H]-。
然后重新乙酰化粗产物。将全部3.269g溶解于乙酸乙酯(150mL)中并添加剂吡啶(40mL)和乙酸酐(40mL)。加热此反应以回流5小时并在室温下放置过夜。添加水(50mL)并通过旋转蒸发将溶液减少至一半容积。然后添加二氯甲烷(500mL)并用水(6x 400mL)洗涤溶液，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发，以产生5.253g深棕色粘性油(此仍然具有残余吡啶气味)。借助于柱层析法(0,040-0,063mm SiO2，梯度洗脱，开始于4∶1己烷/EtOAc并以2∶1己烷/EtOAc EtOAc完成)进行纯化以回到作为主要产物的回收的3，5-二乙酰氧基苯乙烯(1.506g)，作为清油。
1H NMR(CDCl3)：δ2.30(s，6H，2x OAc)，5.32(d，1H，J＝10.8Hz，Halk)，5.74dd，1H，J＝17.5Hz，Halk)，6.65(dd，1H，Halk)，6.77(假t，1H，J＝2.1Hz，H2)，7.03(假d，2H，J＝2.1Hz，H4，H6)。
预示实施例42。(E)-3，5-3′，5′-四羟基-芪(42)。
预示实施例43。3，5-二乙酰氧基-5-(3，5-二乙酰氧基-苯乙基)-苯-(43)。
预示实施例44。3，5-二羟基-5-(3，5-二羟基-苯乙基)-苯-(44)。
实施例45。(E)-3，4，5-3′，5′-五乙酰氧基芪(45)。
一般方法源自Spencer，A.，“Selective Preparation of Non-SymmetricallySubstituted Divinylbenzenes by Palladium Catalysed Arylations of Alkeneswith Bromobenzoic Acid Derivatives”，J.Organomet.Chem.，1984，265，323-3315。由于(2+2)制备BDp145-22-10-07失败，因此使用增加量的催化剂。
将3，4，5-三乙酰氧基苯甲酸(2.294g，7.75毫摩尔，批次BDp79-1-8-07)悬浮在钠线干燥甲苯(500mL)中并添加亚硫酰氯(10.0mL，138毫摩尔)。加热反应以在氩气气氛下回流三小时。在30分钟内溶解所有材料。通过真空蒸馏(0.1mm/60℃)除去溶剂以产生白色固体，将其再溶解在无水甲苯(20mL)中并在真空条件下声处理30分钟以除去溶解气体。添加3，5-二乙酰氧基苯乙烯(1.365g，6.205毫摩尔，批次BDp143-18-10-07)、N-乙基吗啉(985μL，7.775毫摩尔)和二乙酸钯(87mg，0.3875毫摩尔，5摩尔％，相对地酰基氯)并加热混合物以在氩气气氛下回流过夜。添加另外的二乙酸钯(87mg，0.3875毫摩尔，5摩尔％)并再持续加热4小时。在回到室温以后，添加乙酸乙酯(500mL)并依次用0.1M HCl(300mL)和水(3x 300mL)洗涤溶液，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发，以产生3.371g深棕色胶质物。这种原材料的TLC表明若干产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)表明没有明显的反式芪产物，以及苯乙烯原始材料。ESI质谱分析：正和负离子模式，表明没有五-O-乙酸乙酯或部分脱乙酰加成物。将3，4，5-三乙酰氧基苯甲酸(2.294g，7.75毫摩尔，批次BDp79-1-8-07)悬浮在钠线干燥甲苯(500mL)中并添加亚硫酰氯(10.0mL，138毫摩尔)。加热反应以在氩气气氛下回流三小时。在30分钟内溶解所有材料。通过真空蒸馏(0.1mm/60℃)除去溶剂以产生白色固体，将其再溶解在无水甲苯(20mL)中并在真空条件下声处理30分钟以除去溶解气体。添加3，5-二乙酰氧基苯乙烯(1.365g，6.205毫摩尔，批次BDp143-18-10-07)、N-乙基吗啉(985μL，7.775毫摩尔)和二乙酸钯(87mg，0.3875毫摩尔，5摩尔％，相对于酰基氯)并加热混合物以在氩气气氛下回流过夜。添加另外的二乙酸钯(87mg，0.3875毫摩尔，5摩尔％)并再持续加热4小时。
1H NMR(CDCl3)：δ2.28(s，6H，2x OAc)，5.32(d，1H，J＝10.8Hz，Halk)，5.73dd，1H，J＝17.5Hz，Halk)，6.64(dd，1H，Halk)，6.82(假t，1H，J＝2.1Hz，H2)，7.01(假d，2H，J＝2.1Hz，H4，H6)。
预示实施例46。(E)-3，4，5-3′，5′-五乙酰氧基芪(46)。
预示实施例47。1，2，3-三乙酰氧基-5-(3，5-二乙酰氧基-苯乙基)-苯-(47)。
预示实施例48。1，2，3-三羟基-5-(3，5-二羟基-苯乙基)-苯-(48)。
实施例49
4-(3，5-二氨基苯乙基)-酚(49)。在90psi下氢化(E)-3，5-二硝基-4′-乙酰氧基芪和10％Pd/C在甲醇中的混合物过夜。通过塞里塑料垫的过滤产生淡粉色溶液，对其旋转蒸发至干燥以产生淡粉色固体。
实施例50
3，4，5-三乙酰氧基苯甲酸(50)。在冰浴中冷却3，4，5-三羟基苯甲酸在乙酸乙酯中的悬浮液并添加乙酸酐和吡啶。在1小时以后，加热获得的溶液以回流3小时。添加另外的乙酸酐并在室温下搅拌溶液过夜。然后添加甲酸，并将溶液倾倒到冰水上。分离有机层并用碳酸氢钠饱和水溶液和水洗涤，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发至白色固体。从EtOAc/己烷的1∶1混合物的再结晶产生两次收获的3，4，5-三乙酰氧基苯甲酸。Rf0.47(EtOAc)；mp 167.5-168.0℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ2.279(s，6H，2xOAc)，2.284(s，3H，OAc)，7.84(s，2H，芳族)；13C JMOD NMR(75MHz，CDCl3)：δ20.48，20.87(3x OCOCH3)，123.16(2，3)，127.75(1)，139.71(4)，143.89(3，5)，166.72，167.93(3x OCOCH3)，169.96(CO2H)；LRESI正离子质谱；m/z 319(M+Na+，100％)，负离子质谱；m/z 295([M-H]-，100％)。
实施例51
(E)-3，4，5-三乙酰氧基芪(51)。将3，4，5-三乙酰氧基苯甲酸悬浮在干燥甲苯中并添加N，N-DMF和亚硫酰氯。在氮气气氛下，加热反应至100℃，时间为三小时并通过真空蒸馏除去溶剂以回到恢黄色固体。将其悬浮在无水甲苯中并在真空条件下声处理30分钟以除去溶解气体。添加苯乙烯、N-乙基吗啉、以及双乙酸钯(II)(2摩尔％，Aldrich)并在氮气气氛下加热混合物以回流过夜。在回到室温以后，添加乙酸乙酯并依次用水、0.1M HCl和水洗涤溶液，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发至深棕色粘性油。用柱层析法(梯度洗脱，开始于3∶1己烷/EtOAc并以2∶1己烷/EtOAc完成)进行纯化以回到作为米黄色固体的(E)-3，4，5-三乙酰氧基芪。Rf0.86(1∶1己烷/EtOAc)，0.34(2∶1己烷/EtOAc)；mp 119.0-119.5℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ2.30(s，3H，OAc)，2.31(s，6H，2x OAc)，7.02(d，1H，J＝16.3Hz，H反 式)，7.05(d，1H，H反式)，7.26(bs，2H，H-2，H-6)，7.26-7.32(m，1H，H-4′)，7.34-7.40(m，2H，H-3′，H-5′)，7.47-7.52(m，2H，J邻＝8.6Hz，H-2′，H-6′)；13CJMOD NMR(75MHz，CDCl3)：δ20.38，20.87(OCOCH3)，118.70(2，6)，126.68(C烯烃)，126.96(2′，6′)，128.34(C烯烃)，128.99(3′，5′)，131.02(4′)，133.97(4)，136.32(1)，136.88(1′)，143.87(3，5)，167.25(OCOCH3)，168.09(2x OCOCH3)；LRESI正离子质谱；m/z 377(MNa+，100％)，393(MK+，41％)。
实施例52
(E)-3，4，5-三羟基芪[(E)-5-苯乙烯基苯-1，2，3-三醇](52)。
将对甲苯磺酸一水合物的甲醇溶液加入悬浮在甲醇(50mL)中的(E)-3，4，5-三乙酰氧基芪，然后在正压氮气气氛下加热反应至85℃过夜。通过旋转蒸发除去溶剂以产生桔红色固体，借助于柱层析法(等度洗脱，使用2∶1EtOAc/己烷)对上述固体进行纯化以回到作为浅米色粉末的(E)-3，4，5-三羟基芪。Rf0.63(2∶1EtOAc/己烷)；mp 172.0-172.5℃，1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ6.61(bs，2H，H-2，H-6)，6.90(d，1H，J反式＝16.3Hz，H烯 烃)，6.96(d，1H，H烯烃)，7.18-7.23(m，1H，H-4′)，7.30-7.35(m，2H，H-3′，H-5′)，7.46-7.50(m，2H，H-2′，H-6′)；13C JMOD NMR(75MHz，CD3OD)：δ107.71(2，6)，127.82(C烯烃)，127.91(2′，6′)，128.78(C烯烃)，130.39(3′，5′)，130.83(4′)，131.11(1)，135.32(4)，139.95(1′)，147.82(3，5)；LRESI负离子质谱；m/z 227([M-H]-，100％)，228(15％)。
实施例53
5-苯乙基苯-1，2，3-三基三乙酸酯(53)。在90psi下氢化在甲醇中的(E)-3，4，5-三乙酰氧基芪和10％Pd/C过夜。然后通过塞里塑料垫过滤反应并旋转蒸发滤液至灰色固体。将此固体溶解在乙酸乙酯中，在冰浴中冷却，并添加乙酸酐和吡啶，然后加热反应至80℃，时间为3小时。添加另外的乙酸酐并在室温下搅拌溶液过夜。然后将反应倾倒在冰水上并用乙酸乙酯提取。用水洗涤提取液，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发，以回到黄色油。对其进行层析(等度洗脱，使用2∶1己烷/EtOAc)以产生作为米黄色固体的5-苯乙基苯-1，2，3-三基三乙酸酯。Rf 0.49(1∶1己烷/EtOAc)，0.66(1∶2己烷/EtOAc)；mp 79.5-80.0℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ2.28(s，6H，2xOAc)，2.29(s，3H，OAc)，2.93(bs，4H，2x CH2)，6.95(bs，2H，H-2，H-6)，7.16-7.24(m，3H，H-2′，H-4′，H-6′)，7.26-7.33(m，2H，H-3′，H-5′)；13C JMODNMR(75MHz，CDCl3)：δ20.23(OCOCH3)，20.70(2x OCOCH3)，37.30，37.44(2x CH2)，120.70(2，6)，126.26(4′)，128.53(2′，6′)，128.60(3′，5′)，132.83(4)，140.40(1)，141.16(1′)，143.33(3，5)，167.22(OCOCH3)，168.00(2xOCOCH3)；LRESI正离子质谱；m/z 379(MNa+，100％)。
实施例54
5-苯乙基苯-1，2，3-三醇(54)。将溶解于甲醇中的对甲苯磺酸一水合物加入5-苯乙基苯-1，2，3-三基三乙酸酯在甲醇中的溶液。在正压氮气气氛下加热反应至85℃过夜并通过旋转蒸发除去溶剂。借助于柱层析法(等度洗脱，使用1∶1EtOAc/己烷)对余下的桔红色固体进行纯化以回到作为米黄色固体的5-苯乙基苯-1，2，3-三醇。Rf 0.50(1∶1EtOAc/己烷)；mp 124.0-124.5℃；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ2.67-2.76(m，2H，CH2)，2.79-2.87(m，2H，CH2)，6.23(bs，2H，H-2，H-6)，7.12-7.17(m，3H，H-2′，H-4′，H-6′)，7.23-7.28(m，2H，H-3′，H-5′)；13C JMOD NMR(75MHz，CD3OD)：δ39.39(CH2)，39.82(CH2)，109.32(2，6)，127.44(4′)，129.93(2′，6′)，130.17(3′，5′)，132.80(4)，135.15(1)，143.95(1′)，147.46(3，5)；LRESI负离子质谱；m/z 229([M-H]-，100％)。
借助于3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺(17)的合成已产生了另外的“三点”范例。所使用的程序是由S.J.Kim等(Amorepacific Corporation；Applicant)，“Hydroxybenzamide derivatives，the method for preparing thereofand the cosmetic composition containing the same”，WO2007/021067A1描述的程序。以下图解总结了这种制备，其开始于市售3，5-二羟基苯甲酸(25)和4-氨基酚。
图解33，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺(17)的合成图解。
试剂和条件：(i)Ac2O，Et3N，EtOAc，回流，4小时，产率34％；(ii)Et3N，THF，CH3SO2Cl，30分钟；(iii)4-氨基酚，0℃，4小时，产率82％；(iv)Ac2O，吡啶，DMAP，EtOAc，回流，2小时，产率76％；(v)(a)KOH(aq)，回流，75分钟，(b)HCl(aq)。产率55％；(vi)(a)KOH(aq)，回流，2小时，(b)HCl(aq)，产率60％。
实施例55
5-(4-羟苯基氨基甲酰基)-1，3-亚苯基双乙酸酯(55)。在正压氩气下进行反应。将三乙胺加入3，5-二乙酰氧基苯甲酸在冷却至0℃的无水THF中的溶液。然后通过注射器缓慢添加甲磺酰氯并搅拌反应另外25分钟。然后添加4-氨基酚，并在-20℃下存储过夜以前，将反应保持在0℃另外4小时。然后用1M HC酸化反应(pH 2)并通过旋转蒸发除去溶剂。将残余胶质物溶解于EtOAc中并用水洗涤，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发以回到白色固体。1H NMR(CD3OD)表明这是至多75％纯的5-(4-羟苯基氨基甲酰基)-1，3-亚苯基双乙酸酯。这种棒料原样用于正在进行的反应。Rf0.56(2∶1EtOAc/己烷)。
实施例56
5-(4-乙酰氧基苯基氨基甲酰基)-1，3-亚苯基双乙酸酯(56)。将“粗”5-(4-羟苯基氨基甲酰基)-1，3-亚苯基双乙酸酯悬浮在乙酸乙酯中。然后添加4-(二甲基氨基)吡啶、吡啶和乙酸酐并加热反应以回流2小时，接着在室温下放置过夜。添加另外的乙酸乙酯并用0.1M HCl和水洗涤反应，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发，以回到白色固体。将其再溶解于乙酸乙酯中，添加硅石并旋转蒸发掉溶剂。将剩余的粉末加载到作为干塞的硅柱上并层析(梯度洗脱，开始于2∶1EtOAc/己烷并以5∶1EtOAc/己烷完成)以产生作为白色粉末的5-(4-乙酰氧基苯基氨基甲酰基)-1，3-亚苯基双乙酸酯。1H NMR (d6-DMSO)表明，这是大约80％纯。此材料原样用于正在进行的水解反应。Rf 0.63(2∶1EtOAc/己烷)。
实施例57
3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺(57)。
方法1；双乙酸酯的水解。在正压氩气下进行反应。将氢氧化钾的水溶液加入“粗”5-(4-羟苯基氨基甲酰基)-1，3-亚苯基双乙酸酯。加热反应以回流75分钟，回到室温并添加1M HCl直到形成沉淀物(pH约3)。真空滤出沉淀物并在漏斗中用水重复洗涤固体，然后在真空条件下干燥，以回到作为松散的白色小针状体的3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺。Rf 0.39(4∶1EtOAc/己烷)；mp 266.0-266.5℃；1H NMR(CD3OD)：δ6.47(假t，1H，J间＝2.2Hz，H-4)，6.77-6.82(m，4H，H-3′，H-5′，H-2，H-6)，7.43-7.46(m，2H，J邻＝8.9Hz，H-2′，H-6′)；1H NMR(d6-DMSO)：δ6.42(假t，1H，J间＝2.2Hz，H-4)，6.72-6.78(m，4H，H-3′，H-5′，H-2，H-6)，7.51-7.56(m，2H，J邻＝8.9Hz，H-2′，H-6′)，9.20(s，1H)，9.51(s，2H)，9.83(s，1H)；13C JMOD NMR(CD3OD)：δ104.41(4)，104.67(2，6)，113.92(3′，5′)，122.13(2′，6′)，129.10(1′)，136.08(1)，153.26(4′)，157.41(3，5)，166.70(C＝O)；LRESI负离子质谱；m/z 244([M-H]-，100％)，489([2M-H]-，29％)；HRESI正离子质谱；C13H11NO4的m/z，计算的[MH]+246.0766，测得为246.0764。
方法2；三乙酸酯的水解。在正压氩气下进行反应。将氢氧化钾水溶液加入“粗”5-(4-乙酰氧基苯基氨基甲酰基)-1，3-亚苯基双乙酸酯。加热反应以回流2小时并在回到室温以后，添加1M HCl直到形成沉淀物(pH约3)。将其真空滤出并用水重复洗涤。然后在真空条件下干燥白色固体以回到作为松散的白色小针状体的3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺。熔点和光谱数据相同于先前制备的材料。
实施例58
以下示出获得的/评估的/模板化的另外的化合物。实例已被用作MIP模板以及用作MIP测试分析物。
已合成和源自外部的化合物可以提供有用的模板以(i)围绕限定模板来构造MIP，(ii)利用纯化合物和化合物的复杂混合物来估计结合，以及(iii)全面表征所述MIP对于目标化合物的选择性，其中使用合成的模板作为测试化合物以及使用真实生物过程废弃物。
MIP系统的开发是围绕更加复杂的白藜芦醇类似物作为模板，如黄酮类分子、以及不同类型的多酚。
目前正研究作为MIP的潜在模板的其它分子、以及它们的类似物，除了别的以外，还包括儿茶素(cacatechin)、桑色素、鞣花酸、原花青素，其是MIP酰胺的靶。用于MIP模板化的另外可能类型的分子是自然发生的白藜芦醇衍生物如葡糖苷酸。Romero-Peréz等6已报道了在葡萄浆果皮中大量的这些葡糖苷酸，其数量通常超过白藜芦醇的数量(J.Agric.FoodChem.，Vol.49，No.1，2001，210-215)。对于上述化合物具有特异性的MIP的开发对于从用来分离白藜芦醇的相同原料浓缩、分离和提取这些生物活性分子作为二次下游产物可能具有相当大的价值。如果需要，然后这些葡糖苷酸可以化学或酶促转化成白藜芦醇。D.A.Learmonth(BioconjugateChem.，2003，14，262-267)7已报道了用于制备这些葡糖苷酸模板(图1)的合成方法。
我们还已探索了新类MIP的开发，称作“共价结合”MIP，其预期对于个别目标分子具有更大选择性和能力。试验已产生少量(E)-5-(4-(甲基丙烯酰氧基)苯乙烯基)-1，3-亚苯基二(2-甲基丙烯酸脂)，示于图2中，作为用于初步探索性MIP研究的可能的候选物。
(E)-3，4′，5-三(甲基丙烯酰)氧代芪(BDp47-5-12-2006)。系统命名为(E)-5-(4-(甲基丙烯酰氧基)苯乙烯基)-1，3-亚苯基二(2-甲基丙烯酸脂)
在氩气气氛下进行反应。将白藜芦醇溶解于干乙腈中，向其添加无水硫酸钠。剧烈搅拌溶液30分钟并滤出固体材料。然后将三乙胺加入滤液并立即在冰浴中冷却。缓慢添加溶解在乙腈中的甲基烯丙酰氯并使反应溶液冷却至室温，然后搅拌过夜。然后在冰浴中再次冷却反应并添加另外的三乙胺，接着搅拌冰水和溶液另外20分钟。添加乙酸乙酯并分离相。用水洗涤有机层四次，然后干燥，过滤并旋转蒸发，以产生褐色胶质物。通过梯度洗脱层析法(9∶1己烷/EtOAc至4∶1己烷/EtOAc)对上述胶质物进行纯化以产生作为清油的纯(E)-3，4′，5-三(甲基丙烯酰)氧代芪。Rf 0.47(4∶1己烷/EtOAc)；1H NMR(CDCl3)：δ2.04(s，9H，3x CH3)，5.72-5.76(m，3H，3x乙烯基)，6.33-6.34(m，3H，3x乙烯基)，6.88(假t，1H，J间＝2.1Hz，H-4)，6.97(d，1H，J＝16.3Hz，H反式)，7.10(d，1H，H反式)，7.10-7.15(m，4H，H-2，H-6，H-3′，H-5′)，7.47(dt，2H，J邻＝8.6Hz，H-2′，H-6′)。LRESI正离子质谱；m/z455(MNa+，100％)，456(31％)。
实施例S1
反式-4-O-乙酰基阿魏酸[(E)-3-(4-乙酰氧基-3-甲氧基苯基)丙烯酸](S1)
方法1。将阿魏酸加入在冰浴中冷却的氢氧化钠水溶液。充分搅拌悬浮液直到溶解所有固体，然后添加乙酸酐。在5分钟以后，除去冷却浴并在室温下搅拌溶液另外90分钟。使反应返回到0℃，添加2M HCl水溶液以沉淀白色固体(pH约4)，然后对其真空过滤并在漏斗中用另外的水重复洗涤。通过从己烷/乙酸乙酯的再结晶作用来收集两次收获的作为白色粉末的反式-4-O-乙酰基阿魏酸。Rf 0.52(4∶1EtOAc/己烷)；mp 197.5-198.0℃；litmp 192℃(Roberts et al，Eur.J.Med.Chem.，(1994)，29，841-8548)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ2.33(s，3H，OAc)，3.88(s，3H，OMe)，6.40(d，1H，J反式＝15.9Hz，H烯烃)，7.06-7.17(m，3H，芳族)，7.73(d，1H，J反式＝15.9Hz，H烯烃)。
方法2。将阿魏酸溶解于吡啶中。添加乙酸酐(15.0mL)并在室温下搅拌反应过夜。然后将溶液倾倒在冰上并用2M HCl(pH 2)酸化。滤出获得的白色固体，在漏斗中用另外的水洗涤，然后干燥。从沸腾二氯甲烷和乙醇的再结晶产生两次收获的作为白色粉末的反式-4-O-乙酰基阿魏酸。Mp201.0-201.5℃；lit mp 192℃(Roberts et al，Eur.J.Med.Chem.，(1994)，29，841-8548)；Rf和1H NMR(300MHz，CDCl3)相同于先前制备的材料。
实施例S2
3-O-(反式-4-O-乙酰基阿魏酰)-麦角甾醇(系统命名为(E)-((3S，10R，13R，17R)-17-((2R，5R，E)-5，6-二甲基庚-3-烯-2-基)-10，13-二甲基-2，3，4，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-1H-环戊[a]菲-3-基)3-(4-乙酰氧基-3-甲氧基苯基)丙烯酸脂)(S2)。将反式-4-O-乙酰基阿魏酸溶解于干二氯甲烷中并添加4-二甲基氨基吡啶和N，N-二环己基碳二亚胺。在室温下搅拌反应60分钟以产生活性酸，然后添加麦角甾醇并用另外的二氯甲烷洗涤。在室温下搅拌溶液过夜并通过过滤除去获得的白色固体。旋转蒸发滤液以回到白色固体，用柱层析法(梯度洗脱，开始于50∶1CHCl3/MeOH并以50∶4CHCl3/MeOH完成)对上述白色固体进行纯化以产生作为白色固体的3-O-(反式)4-O-乙酰基阿魏酰)-麦角甾醇。Rf 0.58(2∶1己烷/EtOAc)，0.90(49∶1CHCl3/MeOH)；mp 181.5-182.05℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ0.64(s，3H，CH3)，0.83(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，0.85(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，0.93(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，0.99(s，3H，CH3)，1.04(d，3H，J＝6.6Hz，CH3)，1.20-2.60(宽多重线，具有不确定质子数)，2.32(s，3H，OAc)，3.86(s，3H，OCH3)，4.80-4.90(m，1H，H-3)，5.14-5.28(m，2H，H-22，H-23)，5.38-5.42(m，1H，H-6/5)，5.59-5.61(m，1H，H-5/6)，6.40(d，1H，J反式＝15.9Hz，H烯烃)，7.03-7.14(m，3H，芳族)，7.65(d，1H，J反式＝15.9Hz，H烯烃)；13C JMOD NMR(75MHz，CDCl3)：δ12.30(18)，16.43，17.84，19.89，20.18，20.82(5x CH3)，21.28(11)，21.35(CH3)，23.24(15)，28.48，28.50(2，16)，33.33(25)，37.01，37.37，38.19，39.29(10，4，13，1，12)，40.64(20)，43.07(24)，46.31(9)，54.77，55.99，56.10(14，OCH3，17)，73.22(3)，111.47(2芳族)，116.59(7)，119.08(6)，120.55(C烯 烃)，121.41(6芳族)，123.44(5芳族)，132.23(23)，133.70(1芳族)，135.80(22)，138.72(5)，141.65(8)，141.71(4芳族)，143.97(C烯烃)，151.63(C-OCH3)，166.36(C3-OCOCH＝)，168.89(Ar-OCOCH3)。
实施例S3
3-O-(反式-阿魏酰)-麦角甾醇(系统命名为(E)-((3S，10R，13R，17R)-17-((2R，5R，E)-5，6-二甲基庚-3-烯-2-基)-10，13-二甲基-2，3，4，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-1H-环戊[a]菲-3-基)3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸脂)(S3)。将3-O-(反式-4-O-乙酰基阿魏酰)-麦角甾醇溶解于氯仿和甲醇的2∶1混合物中并添加碳酸钾，然后加热反应至65℃，时间为6小时。在回到室温以后，添加饱和氯化铵水溶液并用二氯甲烷重复提取溶液。用水洗涤合并的提取液，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发以回到白色固体。用柱层析法(梯度洗脱，开始于CH2Cl2并以98∶2CH2Cl2/MeOH完成)对上述白色固体进行纯化，以回到作为白色固体的3-O-(反式-阿魏酰)-麦角甾醇。Rf 0.31(4∶1己烷/EtOAc)，0.49(100％CH2Cl2)，0.84(98∶2CH2Cl2/MeOH)；mp 182.0-182.5℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ0.64(s，3H，CH3)，0.84-0.85(m，6H，2x CH3)，0.92(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，0.99(s，3H，CH3)，1.04(d，3H，J＝6.6Hz，CH3)，1.26-2.08(宽多重线，具有不确定质子数)，2.41-2.48(m，1H)，2.56-2.61(m，1H)，3.93(s，3H，OCH3)，4.82-4.86(m，1H，H-3)，5.15-5.26(m，2H，H-22，H-23)，5.39-5.40(m，1H，H-6/5)，5.59-5.60(m，1H，H-5/6)，5.83(s，1H，OH)，6.28(d，1H，J反式＝15.9Hz，H烯烃)，6.91(d，1H，J邻＝8.2Hz，H6芳族)，7.03-7.10(m，2H，H芳族)，7.60(d，1H，J反式＝15.9Hz，H烯烃)；13C JMOD NMR(100MHz，CDCl3)：δ12.41(18)，16.55，17.95，19.99，20.29，21.46(5x CH3)，21.40(11)，23.35(15)，28.62(2，16)，33.44(25)，37.17，37.49，38.32，39.41(10，4，13，1，12)，40.75(20)，43.17(24)，46.42(9)，54.88，56.10，56.26(14，OCH3，17)，73.09(3)，109.70(2芳族)，115.08(7)，116.36(C烯径)，116.69(6)，120.59(5芳族)，123.36(6芳族)，127.44(1芳族)，132.34(23)，135.92(22)，138.96(5)，141.83(8)，144.93(C烯烃)，147.13(4芳族)，148.28(C-OCH3)，166.99(C＝O)。
实施例S4
3-O-ergasteryl肉桂酸酯(系统命名为(3S，10R，13R，17R)-17-((2R，5R，E)-5，6-二甲基庚-3-烯-2-基)-10，13-二甲基-2，3，4，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-1H-环戊[a]菲-3-基肉桂酸酯)(S4)。
就本发明人所知，这种化合物是新颖的。
将反式-肉桂酸溶解于干二氯甲烷中。添加剂4-二甲基氨基吡啶和N，N-二环己基碳二亚胺并在室温下搅拌反应15分钟。然后添加剂麦角甾醇以及另外的干二氯甲烷并在室温下搅拌反应过夜。滤出获得的白色固体并用另外的二氯甲烷洗涤上述固体。旋转蒸发合并的滤液，然后用柱层析法(梯度洗脱，开始于CH2Cl2(100％)并以97∶3(v/v)CH2Cl2/MeOH完成)对获得的白色固体进行纯化以回到白色固体。1H NMR(300MHz，CDCl3)表明这是约95％纯的标题化合物。获得样品并再结晶自2∶1己烷和乙酸乙酯混合物，以产生作为“闪光的”白色云母片的3-O-ergasteryl肉桂酸酯。Rf 0.68(4∶1己烷/EtOAc)，0.89(99∶1CH2Cl2/MeOH)；mp 171.0-171.1℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ0.64(s，3H，CH3)，0.83(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，0.85(d，3H，J＝6.7Hz，CH3)，0.93(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，0.99(s，3H，CH3)，1.04(d，3H，J＝6.6Hz，CH3)，1.23-2.62(宽多重线，具有不确定质子数)，4.80-4.91(m，1H，H-3)，5.14-5.28(m，2H，H-22，H-23)，5.38-5.42(m，1H，H-6/5)，5.59-5.61(m，1H，H-5/6)，6.43(d，1H，J反式＝16.0Hz，H烯烃)，7.36-7.40(m，3H，3芳族，4芳族，5芳族)，7.51-7.55(m，2H，2芳族，6芳族)，7.68(d，1H，H烯烃)；13C JMODNMR(75MHz，CDCl3)：δ12.42(18)，16.56，17.97，20.01，20.31，21.48(5xCH3)，21.41(11)，23.36(15)，28.60，28.63(2，16)，33.45(25)，37.14，37.50，38.33，39.42(10，4，13，1，12)，40.76(20)，43.19(24)，46.44(9)，54.90(14)，56.11(17)，73.26(3)，116.72(7)，119.02(6)，120.64(C烯烃)，128.38(2芳族，6芳族)，129.20(3芳族，5芳族)，130.50(4芳族)，132.35(23)，134.90(1芳族)，135.93(22)，138.92(5)，141.81(8)，144.81(C烯烃)，166.68(C＝O)。
实施例S5
(E)-4-O-乙酰氧基肉桂酸(系统命名为(E)-3-(4-乙酰氧基苯基)丙烯酸)(S5)。将对香豆酸悬浮在吡啶中并添加乙酸酐和DMAP。快速溶解所有固体并在室温下搅拌溶液过夜。然后将反应倾倒在冰上并通过添加2MHCl来酸化(至pH 3)。滤出获得的白色固体，在漏斗中用另外的水洗涤，然后在真空条件下经干燥剂干燥。干物质再结晶自乙酸乙酯以产生白色针状体的(E)-4-O-乙酰氧基肉桂酸，以及第二次收获获自容积减少的滤液。Rf 0.52(4∶1EtOAc/己烷)；mp 201.1-201.2℃；lit mp 205-208℃(Roberts et al，Eur.J.Med.Chem.，(1994)，29，841-8547)；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ2.31(s，3H，OAc)，6.48(d，1H，J反式＝16.0Hz，H烯烃)，7.17-7.20(m，2H，J邻s＝8.6Hz，3芳族，5芳族)，7.64-7.73(m，3H，H烯烃2芳族，6芳族)；LRESI负离子质谱；m/z 205([M-H]-，100％)，206(12％)。
实施例S6
3-O-(反式-4-O-乙酰氧基肉桂酰)-麦角甾醇(系统命名为(E)-((3S，10R，13R，17R)-17-((2R，5R，E)-5，6-二甲基庚-3-烯-2-基)-10，13-二甲基-2，3，4，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-1H-环戊[a]菲-3-基)3-(4-乙酰氧基苯基)丙烯酸脂)(S6)。在室温下，搅拌(E)-4-O-乙酰氧基肉桂酸、4-二甲基氨基吡啶和N，N-二环己基碳二亚胺在干二氯甲烷中的混合物20分钟。然后添加麦角甾醇并用另外的干二氯甲烷洗涤，然后在室温下搅拌反应过夜。滤出获得的白色固体，在漏斗中用另外的二氯甲烷充分洗涤并旋转蒸发合并的滤液，以回到黄色固体。用柱层析法(梯度洗脱，开始于CH2Cl2并以97∶3CH2Cl2/MeOH完成)进行纯化以回到作为白色固体的3-O-(反式-4-O-乙酰氧基肉桂酰)-麦角甾醇。Rf 0.60(4∶1己烷/EtOAc)，0.56(CH2Cl2100％)；mp 181.1-181.2℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ0.64(s，3H，CH3)，0.82-0.86(m，6H，2xCH3)，0.92(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，0.99(s，3H，CH3)，1.04(d，3H，J＝6.6Hz，CH3)，1.22-2.57(宽多重线，具有不确定质子数)，2.31(s，3H，OAc)，4.79-4.90(m，1H，H-3)，5.10-5.28(m，2H，H-22，H-23)，5.38-5.41(m，1H，H-6/5)，5.58-5.61(m，1H，H-5/6)，6.38(d，1H，J反式＝16.0Hz，H烯烃)，7.10-7.14(m，2H，J邻＝8.6Hz，3芳族，5芳族)，7.51-7.56(m，2H，2芳族，6芳族)，7.67(d，1H，H烯烃)13C JMOD NMR(75MHz，CDCl3)：δ12.34(18)，16.46，17.90，19.94，20.24，21.34，21.41(5x CH3，OC(O)CH3)，21.32(11)，23.29(15)，28.52，28.55(2，16)，33.37(25)，37.05，37.40，38.23，39.34(10，4，1，12)，40.69(20)，43.09(13)，43.11(24)，46.35(9)，54.81(14)，56.03(17)，73.24(3)，116.66(7)，119.08(6)，120.59(Ccinn烯烃)，122.34(3芳族，5芳族)，129.39(2芳族，6芳族)，132.27(23)，132.49(1芳族)，135.85(22)，138.78(5)，141.69(8)，143.58(Ccinn烯烃)，152.32(4芳族)，166.42(C3-OCOCH3)，169.22(Ar-OCOCH3)。
实施例S7
3-O-(反式-香豆酰)-麦角甾醇(系统命名为(E)-((3S，10R，13R，17R)-17-((2R，5R，E)-5，6-二甲基庚-3-烯-2-基)-10，13-二甲基-2，3，4，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-1H-环戊[a]菲-3-基)3-(4-羟苯基)丙烯酸脂)(S7)。将碳酸钾加入溶解在氯仿和甲醇的2∶1混合物中的3-O-(反式-4-O-乙酰基阿魏酰)-麦角甾醇。然后加热至70℃，时间为6小时，添加另外的2∶1氯仿(10.0mL)和甲醇(5.0mL)，并在室温下搅拌反应过夜。添加饱和氯化铵水溶液和另外的二氯甲烷，并分离两相。用水重复洗涤有机材料，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发，以回到米黄色固体。自乙酸乙酯的再结晶产生作为白色固体的纯3-O-(反式-香豆酰)-麦角甾醇。减少滤液的容积以回到第二次收获。Rf 0.28(100％CH2Cl2)；mp 213.1-213.2℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ0.64(s，3H，CH3)，0.82-0.85(m，6H，2x CH3)，0.92(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，0.99(s，3H，CH3)，1.04(d，3H，J＝6.6Hz，CH3)，1.24-2.09(宽多重线，具有不确定质子数)，2.41-2.47(m，1H)，2.56-2.60(m，1H)，4.81-4.85(m，1H，H-3)，5.15-5.26(m，3H，H-22，H-23，OH)，5.39-5.41(m，1H，H-6/7)，5.59-5.60(m，1H，H-7/6)，6.29(d，1H，J反式＝15.9Hz，H烯烃)，6.80-6.86(d，2H，J邻＝8.6Hz，H3芳族，H5芳族)，7.41-7.45(m，2H，H2芳族，H6芳族)，7.62(d，1H，H烯烃)；13C JMOD NMR(75MHz，CDCl3)：δ12.43(18)，16.58，17.96，20.01，20.30，21.47(5x CH3)，21.42(11)，23.34(15)，28.62(2，16)，33.46(25)，37.17，37.51，38.33，39.43(10，4，1，12)，40.76(20)，43.19(24)，43.21(13)，46.45(9)，54.91(14)，56.12(17)，73.23(3)，116.24，116.44，116.69，(7，Ccinn烯烃，3芳族，5芳族)，120.61(6)，127.73(1芳族)，130.29(2芳族，6芳族)，132.37(23)，135.94(22)，138.98(5)，141.89(8)，144.62(Ccinn烯烃)，158.02(4芳族)，167.28(C3-OCOCH3)；LRESI负离子质谱；m/z 541([M-H]-，100％)，542(51％)；HR EI负离子质谱；针对[C37H49O3-H]-的计算为541.36817，测得为541.36801。
实施例S8
麦角甾醇苯甲酸酯(系统命名为3S，10R，13R，17R)-17-((2R，5R，E)-5，6-二甲基庚-3-烯-2-基)-10，13-二甲基-2，3，4，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-1H-环戊[a]菲-3-基苯甲酸酯)(S8)。在正压氮气气氛下进行反应。将麦角甾醇溶解于干吡啶中并在冰浴中冷却此溶液。添加新蒸苯甲酰氯并使反应返回到室温，然后搅拌过夜。然后将反应倾倒在冰水上并用二氯甲烷提取白色固体。然后依次用水和饱和NaHCO3水溶液洗涤有机提取物，干燥(无水Na2SO4)，过滤并旋转蒸发，以回到浅棕色固体。用柱层析法(等度洗脱，使用CH2Cl2，100％)进行纯化以产生作为白色固体的麦角甾醇苯甲酸酯。Rf 0.69(100％CH2Cl2)；mp 157.1-157.2℃；lit mp 169-171℃[Dolle，R.E.；Kruse，L.I.J.Org.Chem.1985，51，4047-40539]；1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ0.65(s，3H，CH3)，0.83(d，3H，J＝6.6Hz，CH3)，0.85(d，3H，J＝6.6Hz，CH3)，0.93(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，1.01(s，3H，CH3)，1.05(d，3H，J＝6.6Hz，CH3)，1.26-2.67(宽多重线，具有不确定质子数)，4.92-5.01(m，1H，H-3)，5.16-5.27(m，2H，H-22，H-23)，5.40-5.42(m，1H，H-6/5)，5.60-5.62(m，1H，H-5/6)，7.39-7.45(m，2H，3芳族，5芳族)，7.53-7.57(m，1H，4芳族)，8.01-8.06(m，2H，2芳族，6芳族)；13C JMOD NMR(100MHz，CDCl3)：δ12.43(18)，16.59，17.96，20.01，20.30，21.47(5x CH3)，21.42(11)，23.36(15)，28.59，28.63(2，16)，33.45(25)，37.13，37.27，37.52，38.32(10，4，12)，40.76(20)，43.19(24)，43.20(13)，46.44(9)，54.91(14)，56.11(17)，73.74(3)，116.72(7)，120.68(6)，128.61(2芳族，6芳族)，129.89(3芳族，5芳族)，131.17(1芳族)，132.36(23)，133.07(4芳族)，135.92(22)，138.88(5)，141.87(8)，166.31(C＝O)。
实施例S9
麦角甾醇-3，4-二甲氧基肉桂酸酯(BDp 145-19-6-2008；5.478g粗产物，其仍然需要最终纯化)
系统命名为(E)-((3S，10R，13R，17R)-17-((2R，5R，E)-5，6-二甲基庚-3-烯-2-基)-10，13-二甲基-2，3，4，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-1H-环戊[a]菲-3-基)3-(3，4-二甲氧基苯基)丙烯酸脂。
所使用的程序是由Condo Jr，A.M.；Baker，D.C.；Moreau，R.A.；andHicks，K.B.，J.Agric.Food Chem.，(2001)，49，4961-4964，“Improved Methodfor the Synthesis of trans-Feruloyl-β-sitostanol.”10描述的针对β-谷甾烷醇所报道的程序。
将3，4-二甲氧基肉桂酸(1.765g，8.475毫摩尔，Aldrich Chem.Co.)溶解于二氯甲烷(30.0mL，借助于通过矾土加以干燥)中并添加4-二甲基氨基吡啶(105mg，0.861毫摩尔，Sigma)和N，N-二环己基碳二亚胺(1.925g，9.345毫摩尔，Aldrich)。在室温下搅拌反应20分钟以产生活性酸。然后连同另外的干二氯甲烷(10.0mL)一起添加麦角甾醇(3.360g，8.470毫摩尔，Aldrich)并在室温下搅拌溶液过夜。滤出获得的白色固体并用另外的二氯甲烷洗涤(3x 30mL)。合并滤液并旋转蒸发以回到5.478g的淡黄色固体。
TLC表明，这主要是更高Rf新产物和麦角甾醇原始材料的混合物。
Rf 0.45(4∶1己烷/EtOAc)，0.58(CH2Cl2100％)。
B分子印记聚合物：白藜芦醇
分子印记聚合物的设计
分子印记聚合物(MIP)的设计需要选择将有利地相互作用于所期望的模板物质的单体物质，以致在模板和单体之间形成预聚合复合物。工具如分子模拟和NMR光谱的使用有助于通过进行‘虚拟屏幕’来选择适当的单体，其可以减少在MIP开发中所需要的多聚体制备的数目。
分子模拟
利用PM3结构优化而不考虑溶剂来进行模拟计算以产生理论生成能值，ΔHf。产生白藜芦醇的结构优化和表面电子势(图3)，从而部分洞察白藜芦醇如何可以相互作用于潜在功能单体。
模型化单体簇，其中簇的大小为1至6个单体单元。这些计算产生在这些簇大小下单体与本身的相互作用的预测ΔHf值(表4)。为白藜芦醇参数引入理论结构优化和表面电子参数可以允许估计利用以下方程确定的复合物的平均生成能(图4)：
ΔEi＝(ΔHf_Complex-(ΔHf_Template+ΔHf_Monomer))
交联单体的存在没有包括在这些模拟计算中。
基于4-乙烯基吡啶的复合物
4VP预期会通过氢键合和芳族π-π相互作用进行相互作用(图5)。
表4.白藜芦醇的ΔEi和ΔHf的PM3计算-4VP建模滴定
表4表明，在MIP的形成中，白藜芦醇与4VP的最佳比率理论上应为1∶3。亚胺(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇或酰胺3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺的类似结果也表明1∶3比率。
Ma等和Zhuang等(J.Chromatographic Sci.(2008)，46(8)，pp 739-742)已报道了从白藜芦醇和4-乙烯基吡啶来制备MIP。然而，他们并没有通过经验或建模技术来确定最佳1∶3的白藜芦醇∶4-VP比率。
丙烯酰胺和4-乙烯基苯甲酸复合物
利用各种其它功能单体进行建模滴定实验，包括丙烯酰胺(AAM)和4-乙烯基苯甲酸(4VBA)(以下示出其数据)，以及4-乙烯基吡啶(4VPyr)。由于在基于比率为1∶6∶30的白藜芦醇∶AAM∶EGDMA的无系统性实验中Xiang等1已采用AAM，所以出于比较的目的我们重复此制备，尽管事实是，我们的建模研究表明，对于最佳MIP建造，仅需要3当量的AAM。基于AAM的MIP(源自1∶6∶30比率)的静态结合评价数据证实了我们获自建模研究的结论，其中结果表明，虽然观测到对于白藜芦醇的稍微低亲和力，但选择性性能显著差于对于采用4-乙烯基吡啶的MIP的选择性性能。还基于用来制备MIP 8(最成功的基于4VP的MIP)的制备并利用4VBA作为功能单体来制备分子印记聚合物。在该情况下，建模数据未能显示单体比率的任何可靠的最低限度以及大多数情况下预测的不利的相互作用(对于2、3和4当量的4VBA)。静态结合评价数据支持这种预测，其中观测到没有白藜芦醇的识别和可忽略的亲和力(图6)。此结果可以解释为在白藜芦醇的缺电子芳族基团和4VBA之间缺乏适宜的给体-受体相互作用，从而防止发生任何有利的相互作用。
1H NMR光谱滴定
将白藜芦醇溶解于CD3CN中，并用增加摩尔当量的4VP加以滴定。在每次添加以后，记录1H NMR谱，并跟随芳族-OH移动的变化。芳族-OH移动的一致的低磁场移动(表5和图7)证实了H键合相互作用的存在。在8当量以后，OH峰变得不可观测。
表5相对于增加量的4VP，白藜芦醇的1H NMR滴定。
在各种致孔混合物中使用4VP和EGDMA分别作为功能和交联单体来制备白藜芦醇印记单块(表6)。在磨碎聚合单块以后，过筛成60-90μm的粒径，接着在包含乙酸(10％v/v)的甲醇中重复洗涤以除去模板。
用白藜芦醇模板化的分子印记聚合物(MIP)
如在表6中所描述的并利用以下程序来制备第一和第二代分子印记聚合物(MIP)。在配备有suba密封件的玻璃试管中，在添加交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯，EGDMA)和自由基引发剂(AIBN)以前声处理模板(白藜芦醇)和功能单体(4VP)10分钟，接着氮气清洗10分钟。在45℃下进行用于第一代MIP的热聚合12小时，然后在50℃下进行24小时，以及对于第二代MIP，在50℃下进行热聚合16小时，然后在55℃下进行5小时并在60℃下进行4小时，从而产生本体单块聚合物。以完全相同的方式但在没有模板存在的条件下制备非印记对照聚合物(NIP)。从反应管除去单块聚合物并利用Reutsh 200球磨机进行磨碎，然后过筛成大小(60-90μm)。通过多聚体颗粒重复悬浮在丙酮中并过滤通过20μm玻璃粉来除去细微粉末。通过在在甲醇/乙酸(10％)中重复洗涤来除去白藜芦醇模板直到不存在模板，如通过UV-VIS分光光度测定法在235nm、307nm和321nm处的ν最大所观测到的。洗涤提取液的UV-Vis分析表明，已除去＞99％的模板。
表6
下面描述典型的MIP制备的一个实施例：
MIP 8(LS3-54p118-1-7-08)的制备
将228.2mg白藜芦醇(1毫摩尔)和321μL的4VP(3毫摩尔)溶解于在15mL试管中的1mL的EtOH和5mL的CAN中并用suba密封件密封。溶液用氮气清洗2分钟，然后声处理20分钟。向溶液添加2.83mL的EGDMA(15毫摩尔)和51mg的AIBN(0.31毫摩尔)自由基引发剂。然后在被浸入50℃水浴18小时以前，反应混合物用氮气清洗另外2分钟。然后增加水温至60℃，时间为24小时。因为聚合引发会释放氮气，所以试管配备有针和带有柱塞的注射器筒以作为压力阀。这重复用于NIP对照多聚体而没有添加白藜芦醇模板。
然后从试管除去本体聚合物单块，并利用Restch 200球磨机压碎和磨碎成60-90μm的粒径。在MeOH/AcOH(10％)(v/v)中重复洗涤获得的多聚体颗粒以除去模板和任何未反应单体物质。然后用MeOH洗涤MIP和NIP材料以除去任何微量的AcOH并在减压下干燥。
MIP结合评价
利用适合于Mettler Toledo MiniBlockTM系统的4.5mL烧结聚丙烯反应管进行初始MIP结合研究。利用此装置，在短期温育以后，快速评估第一代MIP的白藜芦醇亲和力，接着真空辅助过滤到流分收集管中。设计这些评价以确定最适宜的模板与功能单体比。再结合研究进行如下：
(1)将50mg的MIP(或各自的NIP对照)放入配备有25μm聚丙烯多孔熔块的反应管中；
(2)添加白藜芦醇(0.05mM)在乙腈中的再结合溶液并在室温下温育反应混合物30分钟，同时连续摇动；
(3)收集滤液，用乙腈稀释5倍-通过UV-VIS光谱法，在νmax 235nm、307nm和321nm处，并使用光程长度为1cm的石英比色杯，对3mL等份进行分析，并且游离白藜芦醇的浓度计算自实验测定的五点校正曲线。于是结合于MIP(或各自的NIP)的白藜芦醇的浓度确定为最初白藜芦醇浓度和最终游离白藜芦醇浓度之间的差异。这表示为结合的量，B，单位为μ摩尔/g多聚体。
(4)顺序地用乙腈、甲醇和包含乙酸(10％v/v)的甲醇以及再次用甲醇洗涤MIP以除去结合白藜芦醇。
相同于上述程序，进行白藜芦醇结合的MIP阴性对照实验，不同之处在于，再结合溶液并不包含白藜芦醇。
图8示出白藜芦醇与使用模板白藜芦醇和使用4VP作为功能单体制备的MIP的结合。利用1mL在乙腈中的白藜芦醇溶液(0.05mM)进行多个快速筛选检测以说明MIP对模板白藜芦醇的亲和力以及结合的再现性。对于每种制备和测试的白藜芦醇印记聚合物，印记效应的证据是明显的。
为了进一步确定最适当的模板与功能单体比，采用了一种测定，其使用10倍增加的白藜芦醇浓度(0.5mM)。结果示在图9中。
按照以下方程，确定每种MIP的相对印记系数(IF)，其涉及相对于NIP对照的MIP的性能：
IF＝BMIP/BNIP，
式中BMIP和BNIP分别是结合于MIP和NIP的白藜芦醇的量。
表7。对于在0.05和0.5mM白藜芦醇浓度下的测定，具有相应印记系数(IF)的相对结合性能。
因此，为了利用4VP作为功能单体(表7)来制备白藜芦醇印记聚合物，按照建模数据，最适宜的模板∶单体比确定为1∶3。用这种方式制备的MIP表明，在低和中等白藜芦醇浓度(分别为0.05和0.5mM)下的连续重复的结合研究以后，可以保持高性能水平(最高能力和IF值)。
致孔剂和交联量的影响
随后用不同量的EGDMA来制备基于上述配方的MIP，以估计交联对结合亲和力的影响。典型的MIP是MIP 2、MIP 5、MIP 7、MIP 8、MIP9和MIP 10)。
然而，观测到，MIP 7导致伪沉淀聚合，该伪沉淀聚合产生类滑石多聚体，其是物理上软或弱的并被减小到粒径＜20μm的细微粉末或珠。这是由于为溶解白藜芦醇模板所需要的低量交联和较大致孔剂容积。虽然上述尺寸有利于分析技术，但认为这种多聚体不适合于未来大规模或产业规模分离技术，因为小粒径将导致不可接受的高反压而不管结合性能(数据未示出)。
因此，少量EtOH包括在ACN致孔剂(MIP 8)中，其会增加模板白藜芦醇的溶解度，从而提供更小的致孔剂容积以及单块多聚体的制备，上述单块多聚体可以被磨碎和过筛成适宜粒径。
以下针对MIP 8(LS2-6p10-7-2-07)，描述包含ACN/EtOH(5∶1v/v)致孔剂混合物的多聚体的典型制备：
静态结合测定用来评估交联的影响。以下详细描述测定的实施例：
在1.7mL埃彭道夫管中放入30mg的MIP、1.5mL在乙腈中的白藜芦醇(0.5mM)，然后在28℃下利用旋转悬浮混合器混合获得的样品混合物18小时。每种样品制备双份并对NIP对照样品同样如此。除此之外，利用30mg各自的多聚体以及1.5mL空白乙腈溶液制备空白对照样品。然后在13000rpm下离心样品15分钟并在等度条件下除去200μL等份，供反相HPLC分析，其中在波长γ＝321nm处进行UV-Vis检测。确定曲线下面积并利用实验五点校正曲线来确定游离白藜芦醇的浓度。通过从结合溶液的浓度减去游离白藜芦醇浓度来计算结合于MIP的白藜芦醇的浓度。结果示在图10中。
本发明的一个重要方面是重复MIP制备和随后结合亲和力的能力。作为其一个实施例，以多个批次制备了MIP 8(图11)，并经由静态结合研究观测了结合性能(如上所述)。结果清楚地表明良好的再现性以及大约10-11μ摩尔/g多聚体的一致的白藜芦醇结合性能。
本发明描述的MIP的结合特性的进一步研究包括静态能力和静态交叉反应性研究，对其下面描述利用MIP 8的实施例。静态能力结合测定：在1.7mL埃彭道夫管中放入30mg多聚体(MIP和NIP)，向其添加在乙腈中的定容(1.5mL)的增加浓度的白藜芦醇溶液。温育获得的混合物同时在约40rpm下混合18小时(除非另有说明)，其后，在13000rpm下离心混合物15分钟。除去200μL等份的上层清液并通过反相HPLC分析和UV检测加以分析，然后借助于5点校正曲线来确定在上层清液中白藜芦醇的浓度。将其从最初结合溶液减去以产生结合的白藜芦醇的量。结合(B)表示为结合的分析物，B，单位为μmol/g多聚体。
初步数据显示没有明确能力(如通过曲线中的稳定状态所证实的)，同时观测到对NIP对照多聚体的非特异性结合在重复结合实验中变化很大(图12)并且高得惊人。
静态交叉反应性结合测定
对于静态交叉反应性研究，结合程序和上述相同，不同之处在于，分析物结合溶液的浓度保持为0.5mM。
用零、一、二、三和四点化合物进行对MIPE(LS 2-6p10-7-1-07)的交叉反应性研究。在研究中包括的化合物是：白藜芦醇(1)、3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺(BDp105-21-8-07)(2)、‘绿色’白藜芦醇(BDp55-11-12-2006)(3)、(E)-5-(4-羟基苯乙烯基)苯-1，2，3-三醇(BDp75-23-7-2007)(4)、(E)-4-(3，5-二硝基苯乙烯基)酚(BDp15-2-11-06)(5)、(E)-4-(3，5-二甲基苯乙烯基)酚(BDp127-22-9-06)(6)、(E)-5-苯乙烯基苯-1，3-二醇(BDp123-8-3-07)(7)、咖啡酸(8)、(E)-3，4′-(乙烯-1，2-二基)联苯酚(BDp35-23-5-07)(9)、(E)-4-苯乙烯基酚(BDp81-5-10-2007)(10)、(E)-3-苯乙烯基酚(BDp47-15-6-07)(11)、(E)-芪(12)、5-(4-羟基苯乙基)苯-1，3-二醇(BDp55-12-7-2006)(13)、5-(4-羟基苯乙基)苯-1，2，3-三醇(BDp67-16-7-2007)(14)、3-(4-羟基苯乙基)酚(BDp35-23-5-07)(15)、双酚A(16)、3-苯乙基酚(BDp55-27-6-07)(17)、4-苯乙基酚(BDp89-9-8-06)(18)。
在此部分中所使用的编号方案对应于在图13中的编号方案。
交叉反应性结合数据(图13)突出了与对MIP 8的结合亲和力有关的一些结构要求。很明显，结合亲和力受到多个氢键合单元和C＝C、C＝N或NH-C＝O接头基团的联合存在的强烈影响。酰胺和亚胺类似物(分别为2和3)的亲和力和选择性类似于白藜芦醇，其中大约55％的应用分析物保留在MIP 8上。有趣的是，C＝C双键(14)的除去同时保留额外的-OH基团，会导致对MIP 8和NIP 8的吸附降低大约65％。对于所有物质，观测到这种相同的趋势，虽然程度较轻，这表明，由C＝C键提供的增加的电子密度或刚性导致更大亲和力以及在许多情况下MIP 8的选择性。
其它显著的观察结果是在除去两个或更多-OH单元以后亲和力的丧失，如随同硝基(5)、二甲基(6)和芪(12)类似物，对其观测到最小亲和力。
采用白藜芦醇类似物作为模板的MIP
还将对MIP 8显示亲和力的一些白藜芦醇类似物，如酰胺和亚胺类似物(图13)，加入MIP材料作为模板，以产生能够结合白藜芦醇和/或其它多酚的空腔，从而不需要白藜芦醇作为模板。如总结在表8中的，利用上文针对MIP 8所描述的程序来制备这些MIP材料。
表8MIP制备的一些实施例的概要，其中采用白藜芦醇类似物作为模板物质。
用白藜芦醇类似物模板化的分子印记聚合物的实例示于图14，其显示在静态条件下它们各自结合来自乙腈溶液的白藜芦醇的能力。印记有酰胺和亚胺类似物的聚合物呈现良好的白藜芦醇亲和力，其中酰胺印记聚合物结合性能接近MIP 8的结合性能。
分子印记固相提取(MISPE)研究
为了将MIP技术成功应用于在产业规模上分离和富集生物活性物质如多酚，需要能够提供良好分离和高流量的方式。就这点而论，可以预测，用于此技术的适当方式的一个实例将是可扩展的液体层析技术如固相提取。
MISPE柱制备的一个实施例
在覆盖有20μm玻璃粉的3.5mL注射器筒中制备初始MISPE和非印记固相提取(NISPE)柱。100mg干MIP是装入注射器筒中的淤浆，从而便于沉降过夜。将第二玻璃粉盖放置在湿法填装柱的顶部，然后利用柱塞轻轻地压缩上述湿法填装柱，其中小心保持柱湿润，从而在柱填充中防止形成空隙和裂纹。对各自的NIP对照材料重复上述过程。依次用甲醇、包含乙酸(10％v/v)的甲醇、甲醇和乙腈洗涤柱。
一般MISPE测定协议
依次用包含乙酸(10％v/v)的甲醇、甲醇和乙腈)预调节MIP柱。在MISPE柱上装载1mL白藜芦醇(或分析物)溶液(0.5mM)以后，将来自随后洗涤步骤的洗脱液和溶剂收集在单流分管中。通过用包含乙酸(10％v/v)的甲醇洗涤若干次来洗脱结合分子。通过离心法来澄清样品并通过反相HPLC来分析等份的上层清液。在30℃和真空条件下蒸发包含不同于乙腈或乙腈/H2O的溶剂的样品，然后在分析以前再组成在乙腈中。借助于在乙腈/H2O(7∶3)作为流动相中的等度洗脱来层析所有样品，其中流速为0.5mL/分钟，并在321nm处进行UV-VIS检测，以检测和量化白藜芦醇。
利用改进的程序和设备，已进一步改善了MISPE材料的制备，其已导致这样的MIP，其在多个可重复MISPE测定中对白藜芦醇具有增强的吸附选择性。此程序已用于利用各种模板∶功能单体∶交联剂(T∶FM∶XL)比和可替换的致孔剂制备的若干种不同MIP。白藜芦醇在这些MISPE柱上的保留示于图15，其说明，利用乙腈/乙醇(5∶1v/v)以及1∶3∶15T∶FM∶XL比制备的MIP显然优于其它MIP制备，其中在用乙腈充分洗涤以后印记系数接近10∶1。在致孔溶剂中乙醇的存在具有有益影响，其可以源自模板的增加的溶解度，更大的结构刚性(由于减小的致孔剂容积)或通过影响分子间相互作用，如π-π堆集(在制备的预聚合阶段中)。
随后在半水性条件(在水中的乙醇(20％v/v))下以MISPE方式并借助于清洗步骤，检查MIP 8的性能，其中上述清洗步骤包括用水中的20％(v/v)乙醇洗涤两次，接着用在甲醇中的1％(v/v)乙腈、和乙腈连续洗涤。图16示出在MIP 8上的高吸附，其中保留有大约80％的初始白藜芦醇溶液并且在用含水乙醇冲洗以后印记系数接近2。然而，大大提高了在MIP和NIP之间的选择性，同时在用乙腈洗涤以除去非特异性结合以后保持良好水平的吸附。
通过在含水结合条件下增加乙醇含量，检查了乙醇和水含量对白藜芦醇对于MIP 8的亲和力的影响。为便于比较，结合的白藜芦醇的量表示为初始装载溶液的百分比(图17)。除此之外，图17说明，使用作为乙腈的环保替代物的含水乙醇作为清洗溶液以除去非特异性结合。基于此数据，似乎是，当在水性条件下时，20-50％的EtOH含量导致优先白藜芦醇识别。
来自农业原料的复杂样品的应用
为了估计MIP 8从复杂原料如葡萄压榨废弃物浓缩白藜芦醇并因而成为澳大利亚食品行业的一种有效的增值过程的能力，将葡萄籽样品施加于填装有MIP 8的100mg的MISPE柱。
原料葡萄籽由CSIRO，Food Science Australia Werribee提供(批号02VIN03)。量出2×10g样品，其一掺加200μg白藜芦醇，并基于由Romero-Perez等6报道的程序，借助于索氏抽提法，在丙酮中连续提取，从而产生对照BDp119-14-9-2006和掺加的BDp119-14-9-2006提取物。将1g每种提取物分别悬浮在80％(v/v)乙醇中，然后声处理30分钟并在3000rpm下离心30分钟。将1mL等份的各自的可溶性提取物施加于填装有100mg的MIP 8的离线MISPE柱，用80％(v/v)乙醇洗涤，接着用乙腈连续洗涤以及用在甲醇中的10％(v/v)AcOH进行最后洗脱。将在水中的80％(v/v)乙醇中的白藜芦醇标准溶液施加于填装有MIP 8的分开的MISPE柱，并相同于葡萄籽提取物进行处理。非印记对照柱(NISPE)的处理完全相同于它们各自的MIP对应物。通过HPLC来分析回收自MIPSE柱的等份的结合材料(参见图18)。
图18B)和图18C)说明，填装有MIP 8的MISPE柱能够浓缩来自复杂原料如葡萄籽提取物的白藜芦醇，如通过与在洗脱自MISPE柱以后在2.735分钟处所观测到的白藜芦醇一致的峰所证实的，而对于NISPE柱则没有观测到这样的峰。
在1g的MIP材料上花生饼粉提取物的分子印记固相提取(MISPE)的证明
将10g花生饼粉提取物(BDp63-9-7-07)加入500mL EtOH/H2O(50/50v/v)。离心和过滤混合物，其后通过分子印记固相提取(MISPE)并利用1g的MIP 8材料(ls3-26p62-1-4-08)来处理100mL等份。然后用4个柱容积(4×10mL)的含水乙醇(EtOH/H2O 50/50v/v)洗涤MIP柱，接着利用3个柱容积的含水丙酮(丙酮/H2O 50/50v/v)进行选择性洗涤。经由5×5mL 10％AcOH(在MeOH中)和2×5mL丙酮，洗脱剩余结合分析物。使用填装有1g非印记对照聚合物(NIP)的柱重复上述程序。合并洗脱流分，蒸发至干燥并构成在50％含水EtOH中的1mL，对其200μL等份进行反相HPLC分析，其中采用流速为0.5mL/分钟的等度洗脱(表9)。
表9。为未处理和MISPE处理的花生饼粉提取物的RP-HPLC分析所采用的梯度剖面。溶剂A＝H2O以及0.1％AcOH，溶剂B＝EtOH/H2O(80∶20v/v)以及0.1％AcOH。
| 时间(分钟) | ％溶剂B |
| 0 | 25％ |
| 2 | 25％ |
| 6 | 37.5％ |
| 9 | 37.5％ |
| 12 | 62.5％ |
| 15 | 62.5％ |
| 18 | 100.0％ |
| 22 | 100.0％ |
| 25 | 25.0％ |
| 29 | 25.0％ |
结果概要
反相HPLC产生的未处理和MISPE处理的花生饼粉提取物的色谱图(图19)证明了白藜芦醇的选择性富集(浓度大约增加20倍)和未识别分析物(RT＝9.6分钟)的保留(没有观测到富集)。应当指出，必须最优化MISPE处理程序，并且就这点而论，可以改善白藜芦醇和其它分析物的富集。
在1g的MIP材料上，花生饼粉提取物的分子印记固相提取(MISPE)的证明(40倍富集)
实验概要
将花生饼粉提取物(10g)加入500mL EtOH/H2O(50/50v/v)。离心和过滤混合物，其后通过分子印记固相提取(MISPE)并使用1g分子印记聚合物(MIP)材料来处理100mL等份。然后用4个柱容积(4x 10mL)的含水乙醇(EtOH/H2O 50/50v/v)洗涤MIP柱，接着利用3个柱容积的含水丙酮(丙酮/H2O 50/50v/v)进行选择性洗涤。经由5x 5mL 10％AcOH(在MeOH中)和2x 5mL丙酮，洗脱剩余结合分析物。利用填装有1g非印记对照聚合物(NIP)的柱重复上述程序。将洗脱流分合并，蒸发至干燥并构成在50％含水EtOH中的1mL，对其200μL等份进行反相HPLC分析，其中采用流速为0.5mL/分钟的梯度洗脱(表10)。
表10。为未处理和MISPE处理的花生饼粉提取物的RP-HPLC分析所采用的梯度剖面。溶剂A＝H2O以及0.1％AcOH，溶剂B＝EtOH/H2O(80∶20v/v)以及0.1％AcOH。
结果概要
反相HPLC产生的未处理和MISPE处理的花生饼粉提取物的色谱图(图20)说明了白藜芦醇的选择性富集，其中印记系数(I)为66。还可以注意到，具有正m/z为577amu的未识别分析物(RT＝9.6分钟)也被捕获，但没有观测到显著的富集。应当指出，必须充分最优化这种MISPE处理程序，并且就这点而论，可以进一步改善白藜芦醇和其它分析物的富集。
C分子印记聚合物：植物甾醇
已知植物甾醇和植物甾烷醇在人类中可以降低低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)水平达15％，并且市场上现存在若干种产品，其是植物甾烷醇的自然衍生的脂肪酸酯(甾烷醇酯)和植物甾醇。植物甾醇是结构类似于动物脂肪胆固醇的植物脂肪。所有植物，其除了别的以外还包括水果、蔬菜、谷物、香料、种子和坚果，包含这些甾醇化合物或固醇素。一些最常见的植物甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇。植物油是植物甾醇的特别丰富的来源，然而认为所有来源均可有效地治疗或预防高胆固醇或高胆固醇血症。图21示出胆固醇和常见的植物甾醇(β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜子甾醇)以及植物甾烷醇(β-谷甾烷醇和菜油甾烷醇)的化学结构。
γ-谷维素。γ-谷维素是三萜烯醇(如环阿屯醇和24-亚甲基环木菠萝烷醇)的阿魏酸酯的混合物。已提出，γ-谷维素具有潜在功能如抗氧化活性、减少血清胆固醇、减少胆固醇吸收和减少早期动脉粥样硬化、抑制血小板聚集、抑制肿瘤诱发、绝经期综合征治疗和抗溃疡活性。图22示出在γ-谷维素中的6种主要成分：菜油甾醇阿魏酸酯、菜油甾烷基阿魏酸酯、β-谷甾醇阿魏酸酯、环木菠萝烯醇阿魏酸酯、环木菠萝烷醇阿魏酸酯和24-亚甲基-环木菠萝烷醇阿魏酸酯。
因为γ-谷维素的功能是有前途的，所以米糠或γ-谷维素可以具有很大的市场潜力并可以用于各种各样的产品和功能食品，其可以提供降低胆固醇和抗氧化效应。
分子印记聚合物的制备
已制备的不同非共价和共价MIP的各种配方总结在表11中。
表11：为估计甾醇结合所制备的非共价MIP的组成。
MMA-甲基丙烯酸甲酯
M＝(单体)
C＝(交联剂，即EDGMA)
TFA＝三氟乙酸
聚合：非共价方式(模板胆固醇，致孔剂氯仿)
已使用胆固醇和豆甾醇分别作为模板化分子制备了分子印记聚合物(MIP)。按照以下程序制备MIP和它们各自的非印记对照聚合物(NIP)。将模板(胆固醇或豆甾醇：1eq)、功能单体(4VP或甲基丙烯酸：3eq)溶解于致孔剂(CHCl3)中，然后声处理10分钟。随后添加交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯，EGDMA：30eq)和自由基引发剂(AIBN：0.25eq)并在60℃下进行热聚合24小时。以相同方式并在没有模板存在的条件下制备NIP。
聚合：非共价方式(模板胆固醇，致孔剂H2O∶TFA(9∶1)
已使用胆固醇作为模板化分子制备了分子印记聚合物(MIP)。按照以下程序制备MIP和它们的各自的NIP：将模板(胆固醇1eq)、功能单体(MMA：3eq)溶解于致孔剂(H2O∶TFA，9∶1)中，然后声处理10分钟。随后添加交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯，EGDMA：30eq)和自由基引发剂(AIBN：0.25eq)并在65℃下进行热聚合24小时。以相同方式并在没有模板存在的条件下制备NIP。
分子印记聚合物的性能：
图23和24示出分别使用胆固醇作为模板化分子制备的MIP的两种“非共价模型”的性能。利用在白藜芦醇部分中描述的再结合实验评估了胆固醇溶液(0.5mM)的结合：通过测量在208nm处的吸光率来量化在洗脱液中胆固醇的存在。示出在这些MISPE柱上胆固醇的保留并且说明利用这些方法制备的MIP特异性地吸附胆固醇，其中印记系数为至少10∶1。
如图25和26所示，类似的再结合实验说明这些MIP均能够结合豆甾醇。
利用豆甾醇作为模板来制备第二系列的MIP和NIP，以确定豆甾醇和胆固醇之间的化学结构差异是否影响MIP的整体识别。如上述利用1∶3∶30的T∶MMA∶EDGMA来制备MIP。再结合实验的结果示于图27中。
相比于MIP19和MIP20，估计使用致孔剂9∶1H2O∶TFA以及胆固醇和豆甾醇的“绿色多聚体”(MIP21和NIP21)。
可以得出的初步结论是，对于豆甾醇和胆固醇，“绿色多聚体”具有一定程度的识别(参见图28和29)，因而是用于未来研究和应用的最适宜的模型系统，以试图区分不同类型的植物甾醇和植物甾烷醇(作为生物活性目标)。
回收利用多聚体的尝试是有前途的并且总结在图30中(氯仿作为致孔剂)。结果是令人鼓舞的，这是由于可重复使用形式的MIP/NIP技术的适用性和适应性，并且没有明显改变多聚体的功能。
使用胆固醇阿魏酸酯作为模板的非共价聚合
1.作为用于MIP的非共价聚合的模板的固醇阿魏酸酯的合成。
利用容易获得的阿魏酸，将包含豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇的植物甾醇的混合物衍生为相应的阿魏酸酯酯(图31)。
反式-4-O-乙酰基阿魏酸的合成
利用在水中的Ac2O/NaOH来乙酰化阿魏酸以产生反式-4-O-乙酰基阿魏酸。通过用1M HCl调节溶液pH至4-5以形成白色沉淀物来纯化产物，随后用H2O洗涤上述白色沉淀物，干燥并收集为结晶固体。
1H(300MHz，CDCl3)7.0-7.5(m，3H，Ar)，6.2(m，1H)，3.70(s，3H，OCH3)，2.0(s，3H，CH3)。
3-O-(反式-4-O-乙酰基阿魏酰)胆固醇的合成
将反式-4-O-乙酰基阿魏酸和胆固醇溶解在干CH2Cl2中。添加在CH2Cl2中的DCC以及DMAP并在室温下搅拌混合物18小时。通过过滤除去固体副产物并且溶液依次用H2O提取一次，然后用10％HOAc提取两次，接着用H2O提取两次。合并有机提取物，经无水MgSO4干燥并蒸发，以产生白色固体。将该固体溶解于最少的THF并在0℃下冷却过夜以沉淀任何残余副产物。过滤溶液并蒸发溶剂以形成固体，借助于柱层析法并通过等度洗脱(25％EtOAc/己烷)来纯化上述固体以产生作为灰白色结晶固体的最终产物。
1H(300MHz，CDCl3)7.62(d，1H，J＝16Hz，Ar)，7.10(m，2H，Ar)，6.37(d，1H)，4.83(m，1H)，3.86(s，3H)，2.33(s，3H)，0.6-2.0(m，50H)。
3-O-(反式-4-O-乙酰基阿魏酰)β-谷甾醇的合成
将反式-4-O-乙酰基阿魏酸和β-谷甾醇溶解于干CH2Cl2中。添加在CH2Cl2中的DCC以及DMAP并在室温下搅拌混合物18小时。通过过滤除去固体副产物并且溶液依次用H2O提取一次，用10％HOAc提取两次，然后用H2O提取两次。合并有机提取物，经无水MgSO4干燥并蒸发，以产生白色固体。将该固体溶解于最少的THF并在0℃下冷却过夜以沉淀任何残余副产物。过滤溶液并蒸发溶剂以形成固体，借助于柱层析法并通过等度洗脱(25％EtOAc/己烷)来纯化上述固体以产生作为灰白色结晶固体的最终产物。
1H(300MHz，CDCl3)7.62(d，1H，J＝16Hz，Ar)，7.10(m，2H，Ar)，6.37(d，1H)，4.83(m，1H)，3.86(s，3H)，2.33(s，3H)，0.6-2.0(m，50H)。
3-O-(反式-4-阿魏酰)-胆固醇的合成：
将3-O-(反式-4-O-乙酰基阿魏酰)胆固醇溶解于2∶1CHCl3∶MeOH中并添加K2CO3(0.2eq)，然后回流混合物6小时。随后通过添加饱和NH4Cl水溶液来骤冷反应并分离有机层，接着用H2O洗涤两次，然后经MgSO4干燥。在自3∶1CHCl3∶MeOH的再结晶作用以后获得作为灰白色结晶固体的最终产物。
1H(300MHz，CDCl3)7.62(d，1H，J＝16Hz，Ar)，7.10(m，2H，Ar)，6.91(d，1H)，6.2(d，1H)，5.96(s，1H)，4.83(m，1H)，3.86(s，3H)，0.6-2.0(m，50H)。
聚合：非共价方式(模板胆甾醇阿魏酸酯(2a)，致孔剂氯仿)
已利用胆固醇阿魏酸酯作为模板化分子制备了分子印记聚合物(MIP)。按照以下程序制备MIP和它们各自的NIP。将模板(胆固醇阿魏酸酯：1eq)、功能单体(4VP或甲基丙烯酸：3eq)溶解于致孔剂(CHCl3)中，然后声处理10分钟。随后添加交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯，EGDMA：30eq)和自由基引发剂(AIBN：0.25eq)并在60℃下进行热聚合24小时。以相同方式并在没有模板存在的条件下制备NIP。
初步再结合研究进行如下：
MIP NIP
将50mg的MIP放入2mL离心管中并 将50mg的MIP放入2mL离心管中并
添加氯仿(1.5mL)。 添加氯仿(1.5mL)。
将0.5mM模板溶解于0.5mL的CHCl3 将0.5mM模板溶解于0.5mL的CHCl3
中 中
摇动30分钟 摇动30分钟
离心20分钟 离心20分钟
收集等份的上层清液 收集等份的上层清液
HPLC分析 HPLC分析
以相同方式处理MIP对照，不同之处在于，再结合溶液不包含模板。
结合数据分析为结合于多聚体的所施加的胆固醇阿魏酸酯、胆固醇或豆甾醇的百分比。依据4点校正曲线，确定自由胆甾醇阿魏酸酯、胆固醇或豆甾醇的浓度。于是结合的胆甾醇阿魏酸酯的百分比(图32和33)可以计算为结合％＝100-((Cf/Ci)×100)，其中Cf是自由胆甾醇阿魏酸酯的浓度以及Ci是初始胆甾醇阿魏酸酯的浓度。
“柱体”再结合一般研究
将100mg的MIP放入过滤管并添加甲 将100mg的NIP放入过滤管并添加甲
醇 醇
添加在氯仿(0.05mM)中的模板并允许 添加在氯仿(0.05mM)中的模板并允许
通过“MIP”柱缓慢吸收 通过“NIP”柱缓慢吸收
在不同阶段评估MIP的性能：在洗脱以 在不同阶段评估NIP的性能：在洗脱以
前(空白)、1mL甲醇、2mLMeOH、3mL 前(空白)、1mL甲醇、2mLMeOH、3mL
MeOH、4ml MeOH. MeOH、4mL MeOH.
利用“共价方式”进行聚合，其中使用胆固醇阿魏酸酯作为用于印记的模板：
分子印记聚合物和它们各自的非印记对照聚合物(NIP)的制备如下：在CHCl3中的(4VP∶交联剂(1∶10)，其中交联剂是EGDMA)作为致孔剂并使用AIBN作为自由基引发剂。
共价印记聚合物的性能以及它的非印记当量。
图34详细示出性能。
未来的研究将涉及致孔剂(如乙醇、H2O/TFA)的影响以优化聚合物的性能和选择性。
利用“混合方式”进行聚合：
基于一致性，使用比率为1∶3∶30的T∶M∶C来制备“混杂聚合物”，其中T是胆固醇、M是(E)-3-(4-(甲基丙烯酰氧基)-3-甲氧基苯基)丙烯酸以及C是EDGMA。
多聚体的性能：
多聚体的性能表明，“混合方式”可以在感兴趣的基质中添加增加的柔性和选择性。
混杂聚合物显示对于酯样基质的良好的选择性以及低中等水平的非特异性结合(图35)。多聚体组成适用于所提供的废弃物的粗混合物。
D.用于生物活性多酚(E)-白藜芦醇的选择性识别的分子印记聚合物的制备
在此实施例中，描述了借助于非共价自组装的(E)-白藜芦醇印记聚合物的设计和制备以及相对于结构相似类似物它对于(E)-白藜芦醇的选择性的估计。
材料与方法
试剂。白藜芦醇-3-β-D-吡喃葡萄糖苷(3，4′，5-三羟基芪-3-β-D-吡喃葡萄糖苷)5、(E)-芪8、4-乙烯基吡啶(4VP)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和2，2′-偶氮二(2-甲基丙腈)(AIBN)购买自Sigma-Aldrich。用于MIP制备和评价的所有溶剂为HPLC级。
装置。由带有真空脱气器的二元泵、带有900μL进样环管的自动采样器、恒温柱室和二极管阵列检测器构成的Agilent Technologies 1100 LC系统(Waldbronn，德国)用于样品的HPLC分离。用Zorbax Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm，5μm粒径)并通过RP-HPLC来分析注射样品。
化合物。选择所选化合物以能够比较研究潜在结合位点的数目和它们的相对位置(围绕中心E-芪核心)。一般合成工艺总结在以下图解4中。
图解4.(E)-白藜芦醇和其它多酚的制备。
试剂和条件：示于括号中的产率是通常用于(E)-白藜芦醇。(i)Ac2O，pyr，DMAP，EtOAc，0℃-40℃，2h，(72％)，或Ac2O，Et3N，EtOAc，回流，4h，(34％)；(ii)SOCl2，DMF，甲苯，100℃，3h，(100％)；(iii)2％Pd(OAc)2，NEM，甲苯，回流，过夜，(51％)；(iv)(a)KOH，MeOH，回流，60分钟，然后(b)HCl(aq)，(79％)，或TsOH，MeOH，85℃，过夜，(95％)。
上文报道了用于制备(E)-白藜芦醇1和羟基化芪类似物(E)-5-(4-羟基苯乙烯基)苯-1，2，3-三醇2、(E)-5-苯乙烯基苯-1，3-二醇3、(E)-3-(4-羟基苯乙烯基)酚4、(E)-4-苯乙烯基酚6、(E)-3-苯乙烯基酚7、(以及另外的多酚)的详细描述。过程需要将官能化苯甲酸转化成它的更加活性的酰基氯，其在蒸馏以除去溶剂以后立即和适当的苯乙烯反应。借助于催化量的乙酸钯来满意地促进偶联反应。据报道，借助于查耳酮中间体，进行上述偶联反应。然而，在这些条件下，仅分离芪加成物，这表明在反应期间已同时发生完全脱羰作用。通过在1H NMR中的特征性J反式＝16Hz偶合常数可以容易地证实产物的E立体化学，并且没有检测到Z异构体(预期Jcis＝≤12Hz)。
分子模拟。基于Pentium IV 2.0GHz并利用用于Windows V100软件包的Spartan’08进行所有模拟计算。模拟程序是基于先前描述的方法，由此利用PM3力场来应用半经验的平衡几何级理论以计算模板、单体簇和单体-模板簇在气相中的生成能值(ΔHf)而不考虑溶剂效应。模型化1至6个单体单元的单体簇大小并确定在这些簇大小下单体与本身的相互作用的ΔHf值。然后将(E)-白藜芦醇结构文件插入每个簇文件并且没有预定方向强加于模板或单体簇。利用迭代方法来确定平衡几何形状。最少三次迭代产生复合物的平均生成能(ΔEi)的理论估计，其是利用以下方程加以确定：
ΔEi＝ΔHf_Complex-(ΔHf_Template+ΔHf_Monomer)
1H NMR光谱滴定。用增加摩尔当量的4-乙烯基吡啶(4VP)滴定溶解在CD3CN中的(E)-白藜芦醇(23mg，0.1mM)。在每次添加后记录1H NMR谱，并跟随芳族-OH移动的变化，直到通过随着增加的添加芳族-OH信号的一致的低磁场移动证实H键合相互作用的存在。持续此过程直到芳族-OH信号不再可检测(由于峰加宽)。
MIP制备。通过将模板(E)-白藜芦醇(228mg，1毫摩尔)溶解在玻璃试管的CH3CN/EtOH(6mL，5∶1v/v)中并中其添加功能单体4VP(322μL，3毫摩尔)来制备MIP。声处理混合物10分钟并添加交联剂EGDMA(2.314mL，15毫摩尔)和自由基引发剂AIBN(51mg，0.31毫摩尔)。用氮气冲洗这种预聚合混合物5分钟并放置在50℃的恒温水浴中24小时。通过在60℃下再加热24小时来退火若干种多聚体产物。然后从反应管除去聚合物，接着利用Retsch 200球磨机压碎和磨碎。随后过筛磨碎颗粒并保留63-100μm尺寸颗粒。通过多聚体颗粒悬浮在丙酮中并滗析上层清液的重复循环来除去细微粉末。通过在按容积计包含10％AcOH的MeOH(50mL)中重复并轻轻搅拌，来从MIP树脂除去(E)-白藜芦醇模板。通过UV-Vis光谱法并在321nm处监测洗液，然后重复至少3次或直到不再能检测到模板。然后用MeOH洗涤MIP以除去痕量AcOH，过滤并真空干燥。以完全相同的方式但在没有模板分子存在的条件下制备非印记对照聚合物(NIP)。MIP和NIP制备的概要概述在表12中。
MIP评价。利用恒重多聚体的MIP和NIP在CH3CN中的0-4mM的浓度范围内进行(E)-白藜芦醇饱和度研究。针对MIP和NIP参比材料所观测到的结合事件的比较揭示了印记影响(E)-白藜芦醇的吸附的程度。将多聚体(30mg)称量到1.7mL埃彭道夫管中并借助于旋转混合器(40rpm)和分析物溶液(1.5mL，0-4mM)一起温育18小时。然后在13000rpm下离心混合物15分钟以沉淀配体结合多聚体：除去等份(200μL)的上层清液，通过RP-HPLC并借肋于在321nm处的UV检测加以分析，然后按照线性5点校正曲线确定未结合(E)-白藜芦醇的浓度。此浓度是从初始总分析物浓度减去此值以产生结合的分析物的量(B)，表示为μmol/g多聚体。
为了进一步研究来自与交联剂和随机分散功能单体的相互作用的非特异性表面结合，并行对MIP和NIP进行静态结合测定。将多聚体(30mg)称量到1.7mL埃彭道夫管中并添加(E)-白藜芦醇溶液(1.5mL，0.5mM，在CH3CN中)。然后如上述处理和分析获得的混合物。
表12。MIP制备的概要
在50℃下用AIBN引发所有聚合24小时。
*借助于在60℃下另外24小时的加温退火来制备
结果与讨论
分子印记聚合物设计。若干技术用来协助(E)-白藜芦醇印记聚合物的合理设计。分子模拟技术用来估计在(E)-白藜芦醇和广泛的潜在功能单体簇之间的分子间相互作用的强度。这种方式确定了4-乙烯基吡啶(4VP)作为适宜的功能单体(FM)，并且预测，为了形成最稳定的预聚合复合物，4VP∶(E)-白藜芦醇的3∶1摩尔比率是最佳的(图36)。通过1H NMR光谱滴定分析证实了这些相互作用，其中用4VP进行的滴定导致酚式OH基团低磁场移动的化学位移总共大约0.8ppm。已报道了自组装相互作用如那些涉及吡啶和酚分子的自组装相互作用，由此经由芳族分子间O-H…N氢键合相互作用来形成层簇。
分子印记聚合物制备。固体印记嵌段共聚物单块的制备如下：将少量EtOH加入致孔剂溶液(CH3CN∶EtOH，5∶1v/v)以增加(E)-白藜芦醇的溶解度而没有损害氢键合能力。这种极性质子溶剂可以有助于增强在已经靠近聚集的芳族基团之间的芳族π-π相互作用，其还会稳定在酚式吡啶基簇体系内存在的相互作用。
分子印记聚合物评价。图37示出聚合物P1和N1与(E)-白藜芦醇的静态结合等温线。选择性能力(BMIP-BNIP＝14μmol/g)可以证实印记效应，其来自在印记聚合物内(E)-白藜芦醇结合空腔或区域的成功形成。由非印记对照聚合物N1结合的更少量的(E)-白藜芦醇最可能起因于与随机分散功能单体的非特异性表面相互作用。基于自组装的MIP可以因制备而不同，因此，因为利用多个批次的P1进行这些评价，所以上述差异很可能促成较大的误差条线。然而，虽然观测到制备之间的不同能力，但选择性能力保持基本不变，这表明类似MIP的不同批次并没有很大程度上影响印记效应。
斯卡查德分析揭示了非线性凹面向上曲线，该曲线具有两个不同的线性区，其通常说明：(i)结合位点的异质性，(ii)结合的协同性，或(iii)多价配体结合，其中通常认为(i)描述了分子与非共价制备印记聚合物的结合。
为了证实与随机分散4VP的非特异性表面相互作用是造成非印记聚合物N1的结合反应的原因，制备了聚合物P2((E)-白藜芦醇印记聚EGDMA，没有FM)、N2(非印记聚EGDMA，没有FM)和N3(非印记聚4VP，没有交联剂)。在相同条件下，这些聚合物结合(E)-白藜芦醇的各自的亲和力示于图38中。聚合物P2和N2呈现可忽略的(E)-白藜芦醇吸附，这表明交联剂EGDMA并没有显著促成多聚体结合反应。另外，P2未能识别(E)-白藜芦醇表明，具有(E)-白藜芦醇的尺寸和形状的结合空腔的存在并不足以主动螯合来自溶液的这种分子。此发现突出说明了除空腔的适当尺寸以外在空腔部位中适当拓扑定位的互补的官能团的重要性。(E)-白藜芦醇与N3的中等结合进一步证实了，功能单体4VP在整个多聚体基质中的随机分散是造成非特异性分子结合的原因。
单一分析物(非竞争性)交叉反应性研究用来检查在目标分子上存在的氢键合OH基团的位置和数目对分子识别的影响。利用平衡结合测定来确定(E)-白藜芦醇和广泛的结构类似物与(E)-白藜芦醇印记聚合物P1的静态结合亲和力。通过在初始分析物浓度和在溶液中的剩余分析物浓度之间的差异来确定结合分析物的浓度(图39，表13)。此分析表明，酚式OH基团的数目会明确影响特异性结合于P1和非特异性结合于N1的量，其中四醇2对于P1和N1均呈现高水平的亲和力。少于三个酚式OH基团的分析物对于N1呈现最小亲和力(≤2.21μmol/g)。此观测结果类似于针对氨基酸印记体系所报道的观测结果(38)，其中具有更大数目的官能团的非模板分析物呈现与多聚体基质内的随机分散官能团的更高非特异性结合。通过具有良好结合能力(12.36μmol/g)和2.35的印记系数(IF)(其中IF＝BMIP/BNIP)的模板(E)-白藜芦醇观测到最好的结合。少一个酚式OH基团的(E)-白藜芦醇的类似物(分析物3和4)显示，和针对(E)-白藜芦醇所观测到的相比，分析物结合的程度减少大约50％，然而导致相对更高的识别(分别为IF＝4.02和2.89)，因为这些分子的非特异性结合被显著降低。少两个酚式OH基团的(E)-白藜芦醇类似物(分析物6和7)显示进一步减少的与P1的特异性结合，并且OH基团的相对位置基本上没有赋予区别。由于不存在酚式OH基团，会有效地废除(E)-芪8与PI的结合。有趣的是，自然发生的单糖基化衍生物(E)-白藜芦醇-3-β-D-吡喃葡萄糖苷5与P1的结合类似于针对一元酚(E)-白藜芦醇类似物6和7所观测到的结合。膨松葡萄糖基团的存在可能会防止在结合空腔内间位OH基团的相互作用，从而留下对位OH基团作为能够氢键合的仅有的官能团。
表13。在静态平衡结合条件和没有竞争的情况下，广泛的结构相关多酚(0.5mM，在CH3CN中)对于P1和N1的亲和力。
在竞争条件下研究多酚类似物与多聚体P1的结合。来自(E)-白藜芦醇1和类似物2、3、4、6以及8(各自0.5mM)的等克分子混合物的竞争性静态交叉反应性测定的结果示在表14中。为了降低混合物的复杂性，类似物5和7没有包括在此混合物中，这是由于上文说明的这些类似物对于P1的可忽略的亲和力。多聚体P1对于(E)-白藜芦醇保留良好的识别，并具有印记系数(IF 2.26)和选择性(α1.26)(其中α＝BMIP-BNIP)/BNIP)参数，其几乎相同于单一分析物实验(IF 2.35，α1.36)。此结果明确说明，P1优先结合(E)-白藜芦醇(相对于它的结构相似类似物)。虽然P1对于来自混合物的(E)-白藜芦醇的结合能力降低了(7.78μmol/g)，但这可以是四醇类似物对于可获得的结合位点的竞争的结果。四醇类似物显示与P1的有效不变结合(19.84μmol/g)，并且和非竞争性研究(19.37μmol/g，IF 1.17，α0.17)相比，具有改善的识别(IF 1.41)和选择性(α0.41)。增加的IF可以起因于(E)-白藜芦醇与在整个多聚体中随机分布的4VP的降低的非特异性结合，其产生于在混合物中存在的其它分析物的非特异性结合。在单一分析物测定中显示良好识别(分别为IF 4.02和2.89)的(E)-白藜芦醇类似物3和4不能与(E)-白藜芦醇1和化合物2竞争在P1上的可获得的结合位点，如两种类似物的减小的IF和α所表明的。按照以上单一分析物的静态结合结果，化合物6和8显示基本上可忽略的结合。化合物8持续显示与最少量的识别一致的最低值。按照单一分析物测定获得的那些结果，这些结果强调了相对于在核心分子中的数目和位置，-OH基团的重要性。在芳环上在间位和对位具有至少两个-OH基团的(E)-白藜芦醇的类似物(化合物1、2、3、4)明确显示中等至良好亲和力，并在结合亲和力和存在的芳族连接的OH基团的数目之间具有良好的相关性。
表14。相对于白藜芦醇MIP的竞争性交叉反应性，其中利用包含若干种密切相关多酚的溶液。
结论
(E)-白藜芦醇-印记聚合物已经由非共价自组装加以制备，并显示相对于类似的多酚类似物，单一和混合分析物样品均对于模板具有高度特异性分子识别。化合物的识别受到芳族OH基团的存在的影响并且需要在间位和/或对位的至少两个上述基团。具有三个以上芳族OH基团的化合物对于(E)-白藜芦醇印记聚合物呈现强亲和力，但它们的分子识别受到高水平非特异性结合的抑制。对于能够通过与3维结合空腔具有互补性的三个间位和对位芳族OH基团相互作用于结合空腔的白藜芦醇，观测到优越的识别。
E.用于分子印记聚合物的多酚模板选择基
这里报道的是(E)-白藜芦醇的亚胺和酰胺选择基的合成。这些选择基比(E)-白藜芦醇更容易和有效地制备，因为两者可以通过“单容器”制备加以合成。还报道了新多酚选择基印记聚合物相对于(E)-白藜芦醇印记聚合物的性能。
结果与讨论
选择基制备
(E)-白藜芦醇1可以可视化作为具有烯烃约束的多酚化合物。然后在此约束处具有变化的类似物选择用于合成，即亚胺，(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇2和酰胺，3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺3。所有三种化合物具有能够占据相同的3维空间的两个间苯二酚羟基，其中第三个酚式羟基可能采取非常类似但不相同的位置。
在此实验室中的早先的研究使用(E)-白藜芦醇作为用于制备MIP的起初模板。存在许多报道的用于合成(E)-白藜芦醇的方法，但大多数这些合成方法违反绿色化学的原则和现代工业实用性。所有这些方法总是需要多步合成(从而显著丧失材料)、相应的纯化过程、有毒试剂的多次处理、保护和脱保护过程以及用来驱动化学反应的能量。
用于合成(E)-白藜芦醇的方法总结在图解5中并用来将3，5-二羟基苯甲酸4转化成(E)-白藜芦醇1。
图解5烯烃(E)-白藜芦醇1的制备。
这种多步方法产生总产率为29％的所期望的产物，但通常需要5天以上来完成，并且需要腐蚀性和有毒材料的生成和处理，以及层析纯化。
如图解6所示，亚胺选择基(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇2制备自市售4-氨基酚5和3，5-二羟基苯甲醛6。
图解6亚胺(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇2的制备。
我们已发现这种方法是十分有利的，因为该方法在简单过滤操作以后快速给出清洁产物的定量产率。这种亚胺产物的稳定性是通过在d6-DMSO和CD3CN中的1H NMR研究加以证实，其表明在6天期间在这些溶液中这种化合物保持不变。当在用于MIP制备的条件下用作模板分子时，以及当用作分析物来评估这些MIP的结合性能时，这种亚胺选择基也保持完整。
第三选择基实例是酰胺3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺3。通过图解7所示多步程序，初始制备真实样品。
图解7酰胺3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺3的制备。
用于这种多步制备的完整的实验细节已包括在附加的电子补充资料中。酰胺3的这种多步制备明显面临在(E)-白藜芦醇1的合成中所遇到的相同“非绿色”问题。我们对大量酰胺3的持续的要求激发我们开发一种可替换的改善方法，其总结在图解8中。
图解8。酰胺3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺3的可替换制备。
除去溶剂，接着用水研制和洗涤，从而快速产生产率为76％的纯酰胺3。这种碳二亚胺激活耦合的‘绿色’优点在于，相同的起始试剂用于所报道的多步合成，但现在利用单容器程序可以产生提高的总产率的酰胺，并且不需要补充能量、官能团保护和脱保护、或层析纯化。
分子印记聚合物(MIP)
三种合成的选择基用作用于制备MIP的模板，以及用作分析物来查询新聚合物的结合特性。分子印记聚合物(MIP)的制备简要地涉及选择基模板、功能单体和交联剂在致孔剂中的混合物的热引发自由基聚合。然后磨碎获得的固体材料，筛出适当尺寸的颗粒并用酸洗涤以解吸模板。在没有模板分子存在的条件下相同地制备非印记聚合物(NIP)。利用(E)-白藜芦醇印记聚合物(MIPRES)和相应的NIP进行单一分析物结合研究。在这些研究中，用新鲜配制的分析物溶液温育聚合物过夜，然后除去上层清液，并通过RP-HPLC来确定其浓度。从初始浓度减去则给出由多聚体结合的分析物的量(B)，并且这些结果总结在图40中。
在此实验设计中，对于烯烃、酰胺和亚胺分子，MIPRES显示类似的结合能力和类似的选择性亲和力(BMIP-BNIP)。这些结合参数的相似性表明，对于这些这些聚酚式选择基的每一种，MIPRES显示一般的交叉反应性。此结果是一致于所有这些分子在溶液中采用的类似的空间构象。这些选择基还可能具有类似的电子特性，因为与这些三种不同键有关的诱导变化有可能被离芳族羟基基团的距离和芳族π云减轻。因此，在这些MIP空腔内，这些选择基类似地结合于识别表面。
然后评估了酰胺和亚胺选择基作为(E)-白藜芦醇模板模拟物的适合性。这些化合物的每一种用作用于制备新MIP(即分别为MIP酰胺和MIP亚胺)的模板，其中使用与用于制备MIPRES的类似协议。如前所述，进行静态结合测定，并且这些MIP识别(E)-白藜芦醇的能力报道在图41中。
选择基印记MIP酰胺和MIP亚胺对于(E)-白藜芦醇均显示选择性亲和力，但和MIPRES相比具有降低的能力。尽管这些分子可以在溶液中具有类似构象，但由4-乙烯基吡啶的吡啶基氮占据的立体拓扑空间，其在印记期间是互补的官能结合基团，对于所有三种MIP来说，必须是不同的。针对MIP酰胺和MIP亚胺所观测到的减小的结合能力和更低的选择性亲和力也可能反映了这些印记聚合物具有结合和保持烯烃(E)-白藜芦醇的受欢迎构象的降低的能力，此发现可能是起因于烯烃约束的增加的相对结构刚性。
结论
已开发了用来合成多酚(E)-白藜芦醇的具有空间限定官能、或选择基的结构类似物的方法。利用“更环保”单容器程序，可以更容易和方便地制备这些化合物。然后选择基用作用于制备MIP的模板模拟物，并且发现，对于此典型的多酚化合物，这些新聚合物显示可比较的、但不相同的结合。
该方式是可以用来探索和表征新MIP的技术，并且我们的发现表明，适当的选择基可以是适宜的模板以能够更方便地制备一般的MIP，其能够提取结构相似化合物。
实验
使用的AR溶剂购买自制造商，除了经
分子筛干燥的二甲基甲酰胺(DMF)、经钠金属丝干燥的甲苯、以及经KOH颗粒干燥的吡啶和三乙胺。Milli-Q超纯蒸馏水用于含水操作。溶剂混合物表示为容积/容积。溶剂提取物经无水硫酸钠干燥，过滤，然后在低压(≥10毫巴)和30-35℃下旋转蒸发至干燥。在硅胶上并利用
1.05554.001平板进行分析薄层层析法(TLC)。通过(i)在254nm处的荧光和(ii)乙醇磷钼酸溶液浸渍和焦化来显现成分。利用
1.09385.1000进行硅胶柱层析法。通过开口玻璃毛细管法来确定熔点并且未校正。用Bruker DPX-300、在300MHz的的1H和在75MHz处的13C JMOD来记录NMR谱。如指出的，使用氘代溶剂，以及残留溶剂峰用于内部参比。以Hz为单位给出J值。使用具有正(ESI+)和负(ESI-)极性的Micromass Platform II API QMS电雾化质谱仪来记录低分辨率电雾化离子化质谱(ESI)。用Bruker BioApex 47e傅里叶变换质谱计来记录高分辨率电雾化质谱(HRMS)。在37kHz/150W ElmasonicS100超声波清洗装置中声处理混合物。利用Retsch PM 200行星式球磨机来磨碎聚合物并用Retsch AS 200摇筛机来确定尺寸。
多酚选择基的合成
3，5-二乙酰氧基苯甲酸
在冰浴中冷却3，5-二羟基苯甲酸(15.40g，0.100mol)在乙酸乙酯(220mL)中的悬浮液。添加乙酸酐(24.52mL，0.2421mol)、吡啶(16.16mL，0.1998mol)和4-(二甲基氨基)吡啶(100mg，0.81855毫摩尔)并在0℃下搅拌反应60分钟，然后在室温下过夜。添加甲酸(5.12mL，0.1357毫摩尔)并将反应倾倒在冰(约500g)上。添加另外的乙酸乙酯(300mL)，分离有机相，并用水(2x 200mL)、饱和NaHCO3水溶液(100mL)、另外的水(2x 200mL)洗涤，然后蒸发至白色固体。从5∶1EtOAc/己烷(120mL)的再结晶作用产生两次收获的3，5-二乙酰氧基苯甲酸(合并重量17.07g，72％)，作为白色粉末。Rf 0.20(1∶1EtOAc/己烷)，0.39(3∶1EtOAc/己烷)；mp161-162℃(来自EtOAc/己烷)(lit.mp：157-159℃)；δH(CDCl3)2.29(s，6H，2x OAc)，7.18(假t，1H，J 2.1，4-H)和7.70(假d，2H，J 2.1，2-H，6-H)；δC(CD3OD)18.43，118.94，119.02，131.70，150.19，165.46和168.17；m/z(ESI)261(MNa+，100％)。
(E)-3，4′，5-三乙酰氧基芪
在氩气气氛和100℃下加热悬浮在甲苯(130mL)、DMF(500μL)和亚硫酰氯(16.00mL，220.6毫摩尔)的混合物中的3，5-二乙酰氧基苯甲酸(8.022g，33.706毫摩尔)三小时。通过真空蒸馏除去溶剂并将残余物再悬浮在甲苯(85mL)中，然后在真空条件下声处理以除去溶解气体。添加4-乙酰氧基苯乙烯(5.74mL，37.5毫摩尔)、N-乙基吗啉(4.31mL，33.9毫摩尔)和二乙酸钯(35mg，0.16毫摩尔，0.46摩尔％)并加热反应以回流2小时。添加另外的二乙酸钯(116mg，0.52毫摩尔，1.54摩尔％)并使反应回流过夜。在回到室温以后，添加乙酸乙酯(500mL)，用0.1M HCl(2x 300mL)和水(300mL)洗涤溶液，然后干燥并蒸发，以产生恢复棕色固体。借助于柱层析法(等度洗脱，使用2∶1Et2O/己烷)进行纯化以产生7.888g白色固体，1HNMR表明主要是所期望的加成物。进一步的层析(梯度洗脱，开始于4∶1己烷/EtOAc并以2∶1己烷/EtOAc完成)产生作为白色固体的纯(E)-3，4′，5-三乙酰氧基芪(6.071g，51％)。Rf 0.29(2∶1己烷/EtOAc)；mp 112.5-113.0℃(lit mp 116℃)；δH(CDCl3)2.27(s，9H，3x OAc)，6.80(假t，1H，J 2.1，4′-H)，6.93(d，1H，J 16.3，H反式)，7.03(d，1H，J 16.3，H反式)，7.04-7.09(m，4H，3-H，5-H，2′-H，6′-H)和7.44-7.47(m，2H，2-H，6-H)；δC(CDCl3)20.07，113.39，115.88，120.88，126.19，126.64，128.64，133.45，138.53，149.46，150.34，167.91和168.30；m/z(ESI)377(MNa+，100％)，378(21)。
烯烃1；(E)-白藜芦醇
在氩气气氛下进行反应。将溶解在甲醇(3.0mL)中的氢氧化钾(22mg，0.3922毫摩尔)加入(E)-3，4′，5-三乙酰氧基芪(113mg，0.319毫摩尔)在甲醇(10mL)中的悬浮液。立即溶解固体并温和加热清液以回流60分钟并注意到颜色显着变暗。然后借助于旋转蒸发将容积减小到一半并用1M HCl水溶液酸化剩余溶液(pH 2)。添加乙酸乙酯(150mL)并用饱和盐水(3x 20mL)洗涤反应，干燥并蒸发，以产生暗红色固体。借助于柱层析法(等度洗脱，使用100％EtOAc)进行纯化以产生作为浅米色固体的(E)-白藜芦醇(58mg，79％)。Rf 0.65(EtOAc)；mp 261.0-263.0℃(lit mp 255-260℃)；δH(CD3OD)6.13(假t，1H，J2.2，4-H)，6.41-6.42(m，2H，2-H，6-H)，6.71-6.79(m，3H，H反 式，3′-H，5′-H)，6.93(d，1H，J 16.3，H反式)和7.29-7.36(m，2H，J邻8.6，2′-H，6′-H)；δC(CD3OD)100.30，103.47，114.12，124.64，126.43，127.06，128.07，138.97，155.89和157.20；m/z(ESI)229(MH+，100％)，230(23)。
亚胺2；(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇
在室温下剧烈搅拌3，5-二羟基苯甲醛(300mg，2.174毫摩尔)、4-氨基酚(237mg，2.174毫摩尔)和无水硫酸钠(309mg，2.176毫摩尔)在二氯甲烷(15mL)中的混合物3小时。添加另外的无水硫酸钠(309mg，2.176毫摩尔)并再持续搅拌1小时。通过旋转蒸发除去二氯甲烷并将白色残余物再悬浮在沸腾乙醇(10mL)中，并在热的情况下过滤。在漏斗中用另外的热乙醇(10mL)洗涤固体。合并滤液并旋转蒸发至干燥，以产生作为淡粉色固体的(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇(501mg，100％)。Rf0.48(2∶1EtOAc/己烷)；随着在mp＞340℃下加热会变暗；δH(d6-DMSO)6.36(假t，1H，J 2.2，4-H)，6.80-6.85(m，4H，2-H，6-H，3′-H，5′-H)，7.16-7.22(m，2H，J邻8.8，2′-H，6′-H)，8.43(s，1H，亚胺-H)，9.47(bs，3H，3x酚式-OH)；δC(d6-DMSO)106.27，107.41，116.70，123.42，139.35，143.61，157.16，158.38和159.62；m/z(ESI)230(MH+，100％)，231(13)；m/z(HRESI)252.0633([M+Na]+C13H11NO3Na+要求252.0637)。
酰胺3；3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺
在正压氩气下进行反应。将3，5-二羟基苯甲酸(2.310g，15.000毫摩尔)和4-氨基酚(1.962g，18.000毫摩尔)溶解在DMF(90.0mL)中。添加N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(3.450g，17.997毫摩尔)并在室温下搅拌反应过夜。在高真空下通过旋转蒸发除去溶剂并用水共馏油性残留物直到形成固体。用冷0.01M HCl(50mL)研制固体，过滤，然后在漏斗中用冷水(4x 20mL)洗涤淡紫色产物。在真空条件下用干燥剂干燥固体以产生纯3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺(2.791g，76％)；Rf 0.39(4∶1EtOAc/己烷)；mp 266.0-266.5℃；δH(CD3OD)6.47(假t，1H，J间2.2，4-H)，6.77-6.82(m，4H，3′-H，5′-H，2-H，6-H)，7.43-7.46(m，2H，J邻8.9，2′-H，6′-H)；δH(d6-DMSO)6.42(假t，1H，J间2.2，4-H)，6.72-6.78(m，4H，3′-H，5′-H，2-H，6-H)，7.51-7.56(m，2H，J邻8.9，2′-H，6′-H)，9.20(s，1H)，9.51(s，2H)和9.83(s，1H)；δC(CD3OD)104.41，104.67，113.92，122.13，129.10，136.08，153.26，157.41和166.70；m/z(ESI)244([M-H]-，100％)，489([2M-H]-，29)；m/z(HRESI)246.0764([M+H]+C13H12N1O4 +要求246.0766)。
分子印记聚合物的制备
通过将选择基模板(1毫摩尔)溶解在一次性玻璃试管中的致孔剂(5∶1乙腈/EtOH，6ml)中来制备分子印记聚合物(MIP)。对于酰胺3，丙酮(6mL)是优选的致孔剂，这是由于它不完全溶解于最初混合物容积。10添加功能单体4乙烯基吡啶(322μL，3毫摩尔)并声处理混合物10分钟。然后添加作为交联剂的乙二醇二甲基丙烯酸酯(2.314mL，15毫摩尔)并添加作为自由基引发剂的2，2-偶氮二(异丁酸)腈(51mg，0.31毫摩尔)。在50℃的恒温水浴中加热24小时以前，用氮气冲洗这种预聚合混合物5分钟。从反应管除去固体聚合物，用研钵和研杵压碎并利用Retsch 200球磨机精细磨碎。过筛磨碎物并保留63-100μm尺寸颗粒。将此尺寸范围颗粒重复悬浮在丙酮中并倒掉上层清液以除去细微粉末。然后通过用甲醇的10％乙酸溶液重复洗涤来从多聚体除去结合模板，直到洗液没有模板(通过UV-Vis光谱法在321nm处加以监测)。利用相同程序并在没有模板分子存在的条件下制备非印记对照聚合物(NIP)。
分子印记聚合物的评价
在相同条件下，对MIP和NIP并行进行实验。
将分析物溶液(1.5mL，0.5mM，在乙腈中)加入在埃彭道夫管中的多聚体(30mg)。在40rpm下混合此多聚体18小时并在13000rpm下通过离心法沉降多聚体15分钟。除去200μL等份的上层清液，然后通过RP-HPLC并借助于在321nm处的UV检测加以分析。通过和线性5点校正曲线的比较来确定浓度。结合分析物(B)的量确定为此值和初始值之间的差异并以μmol/g多聚体为单位加以报道。
E.经由分子印记从花生副产物富集生物活性多酚(E)-白藜芦醇
报道了一种快速技术，该技术用于利用分子印记技术从花生压榨废弃物分离和富集(E)-白藜芦醇并确定有关多酚。
材料与方法
化合物
4-乙烯基吡啶(4VP)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和2，2′-偶氮二(2-甲基丙腈)(AIBN)、(+)-儿茶素水合物(在使用前，冷冻干燥)、咖啡酸和(E)-云杉新甙获自Sigma-Aldrich(Sydney，NSW，澳大利亚)。在使用前，分别借助于真空蒸馏和矾土柱层析法来纯化4-VP和EGDMA。所使用的所有溶剂均为HPLC级。
利用以上报道的方法来合成(E)-白藜芦醇1。
MIP制备
通过将(E)-白藜芦醇和4-VP(以比率1∶3摩尔当量)溶解在乙腈/EtOH(5∶1v/v)中来制备(E)-白藜芦醇印记聚合物(MIPRES)。在添加EGDMA(15摩尔当量)和自由基引发剂AIBN以前，用氮气清洗获得的混合物2分钟并声处理20分钟。然后密封混合物并用氮气清洗2分钟，然后放置在50℃水浴中(18小时)，接着在60℃下加温退火处理(24小时)。以相同方式但不包括(E)-白藜芦醇模板，来制备非印记聚合物(NIP)作为对照。利用Retsch 200球磨机磨碎获得的硬块整料(monoliths)以产生60-100μm的粒径分布，通过过筛对其加以分离。通过用MeOH/AcOH(9∶1v/v)重复洗涤来提取模板分子，直到通过在321nm处的吸光率在提取介质中不再看到模板。然后用MeOH洗涤MIP颗粒以除去痕量的AcOH并通过在丙酮中的重复沉降来除去细微粉末。随后在40℃下真空干燥剩余MIP颗粒过夜。
静态选择性研究
使用30mg的固定量的多聚体对MIP和NIP进行选择性研究。NIP用来确定起因于与交联剂和随机分散功能单体的相互作用的非特异性结合的程度。在乙腈中的1.5mL分析物溶液(0.5mM)中温育多聚体。在40rpm下混合获得的混合物18小时，然后在13000rpm下离心15分钟。除去等份(200μL)的上层清液，借助于RP-HPLC并通过在321nm处的UV光谱法加以分析，并且按照线性5点校正曲线来确定自由分析物的浓度。通过从初始总分析物溶液浓度减去自由分析物浓度来计算结合分析物(B)的量，其表示为μmol/g多聚体。
MISPE确认研究
用包含100mg的MIP或NIP固定相的SPE柱进行小规模MISPE研究。多聚合固定相(100mg)是在3mL注射器筒中的MeOH中的淤浆，其中上述注射器筒装有聚丙烯熔块(20μm孔径大小)。随后用1.5mL(3柱容积)的乙腈或EtOH/H2O(1∶1，v/v)调节获得的SPE柱，以分别用于有机和含水研究，其后将在在乙腈或EtOH/H2O(1∶1，v/v)中的1mL的(E)-白藜芦醇(0.5mM)溶液加载到柱上。然后对每个柱进行多个选择性清洗步骤(各自1mL)，其中使用乙腈或在EtOH/H2O(1∶1，v/v)中的1％AcOH，其后利用在MeOH中的10％AcOH(2mL)洗脱每个柱。将收集自清洗和洗脱步骤的流分蒸发至干燥，再组成为在EtOH/H2O(1∶1，v/v)中的1mL并通过RP-HPLC加以分析。利用5点校正曲线来确定(E)-白藜芦醇浓度。
反相层析法(RP-HPLC)
用Agilent Technologies 1100LC系统(Waldbronn，德国)进行RP-HPLC分离，上述系统包括带有真空脱气器的二元泵、带有900μL进样环管的自动采样器、恒温柱室和二极管阵列检测器。在40℃下用Zorbax EclipseXDB-C18柱(4.6×150mm，5μm粒径)来分析注射样品。流动相包括在H2O中的0.1％AcOH(溶剂A)和在EtOH/H2O中的0.1％AcOH，并采用以下梯度：0-2分钟：25％B等度，2-6分钟：25-37.5％B，6-9分钟：37.5％B等度，9-12分钟：37.5-62.5％B，12-15分钟：62.5％B等度，15-18分钟：62.5-100％B，18-22分钟：100％B等度，22-25分钟：100-25％B，25-29分钟：25％B等度。流速是0.5mL分钟-1。注射量是5μL，其中UV-Vis二极管阵列检测器(80Hz)设置为λ＝280、321和370nm的吸光波长。
LC-ESI-MS
利用的耦合于离子阱MS系统(Agilent 1100Series LC/MSD-SL)的Agilent 1100毛细管LC系统(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)进行所有层析分离。利用填装有3.5μm颗粒的Zorbax 300SB-C18(150mm×0.3mm I.D)毛细管柱来分离MIP洗脱液。桩的出口直接连接于离子阱质谱仪的电雾化源，并且旁通有UV检测器。利用由在H2O中的0.1％FA(溶剂A)和在乙腈中的0.1％FA构成的流动相来分离在乙腈/H2O(60∶40，v/v)(包含0.1％FA)中的0.3mg/mLMIP洗脱液样品，并采用以下梯度：0-15分钟：10％B，15-65分钟：10-65％B，65-70分钟：60-95％B。流速为4μL分钟-1。注射量是0.2μL。以正离子模式进行ESI-MS/MS分析。以数据依赖模式操作质谱仪，其中在母离子扫描中的两种最强离子经受随后的自动化的MS/MS。借助于Agilent ChemStation和MSD Trap Control软件进行所有系统控制和数据获取。
花生压榨废弃物提取物的制备
声处理在EtOH∶H2O(1000mL，4∶1v/v)中的花生压榨废弃物(200g)60分钟，其后过滤混合物并蒸发溶剂以产生17.9g提取物。将A 10.0g这种花生压榨废弃物提取物再组成为在容量瓶中的在EtOH/H2O(1∶1v/v)中的500mL并存储于4℃直到需要。在使用之前，在室温下平衡花生压榨废弃物提取物并声处理以澄清溶液。
花生压榨废弃物提取物的MISPE
利用1.0g的MIPRES或相应的NIP作为对照固定相来进行MISPE研究，以检查其从上述花生压榨废弃物提取物选择性地保留和富集(E)-白藜芦醇的能力。使用各自3柱容积的MeOH、EtOH和最后EtOH/H2O(1∶1，v/v)(包含0.1％AcOH)来调节柱。将花生压榨废弃物提取物(2×50mL)施加于每个柱。在真空条件下收集穿透流分并通过柱反向循环以最大化在固定相和花生压榨废弃物提取物内的多酚成分之间的相互作用。然后每个柱用EtOH/H2O(1∶1v/v)(20mL)洗涤，接着连续选择性清洗步骤，包括包含1％AcOH的EtOH/H2O(1∶1v/v)(20mL)，然后丙酮/H2O(1∶1v/v)(30mL)以扰乱非特异性结合。然后使用在MeOH中的10％AcOH(25mL)进行酸性洗脱步骤，以从每个柱解吸和除去感兴趣的化合物。合并洗脱流分，蒸发至干燥并构成在EtOH/H2O(1∶1v/v)中的1.0mL，然后通过RP-HPLC加以分析。
结果与讨论
分子印记聚合物
借助于在(E)-白藜芦醇的酸性酚式羟基基团和4VP功能单体的富电子吡啶基氮之间的初始自缔合来产生(E)-白藜芦醇印记聚合物空腔。所获得的主要形成自自组装氢键合相互作用的预聚合复合物可以通过另外的芳族π-π相互作用(由于紧密靠近酚式和吡啶基芳族基团)的参与来稳定。然后通过在有交联剂EGDMA存在的情况下聚合苯乙烯基官能来‘冻结’自组装复合物。模板分子的除去导致产生互补于(E)-白藜芦醇的MIP空腔。
利用若干种结构相关的、自然发生的多酚：E-白藜芦醇、咖啡酸、(＝)-儿茶素和(E)-云杉新甙，来评估MIPRES的交叉反应性。对于MIPRES，识别(MIP-NIP)的次序是(E)-白藜芦醇1＞咖啡酸2＞儿茶素3＞(E)-云杉新甙4(表15)。虽然MIPRES对于咖啡酸和(+)-儿茶素的结合能力类似于针对模板分子所观测到的，但NIP对这些化合物的增加的非特异性结合会偏移它。可以得出结论，和(E)-白藜芦醇相比，在咖啡酸和(+)-儿茶素上更大数目的能够与NIP形成氢键的基团会造成更强非选择性结合，因而对NIP对照多聚体更大的亲和力，从而导致减少的识别。观测到葡糖基化白藜芦醇分子(E)-云杉新甙的可忽略的识别，其可能是由于存在庞大的葡萄糖取代基，从而阻止进入MIPRES结合空腔。另外，和(E)-白藜芦醇相比，NIP对于(+)-儿茶素的减小的结合能力可以对以下看法提供另外的支持：在与MIP和NIP的非特异性结合中涉及H键相互作用。基于MIPRES对(E)-白藜芦醇(相对于其它结构相关的分子，在富多酚源中发现的那些典型分子)呈现的选择性，可以预测，基于MIPRES的SPE提取将选择性地从复杂农业副产物基质分离目标(E)-白藜芦醇。
表15.关于MIPRES和各自的NIP对照多聚体与(E)-白藜芦醇1、咖啡酸2、(+)-儿茶素3和(E)-云杉新甙4的交叉反应性研究。
为了证实，MIPRES作为MISPE吸附剂用于精炼(E)-白藜芦醇是可行的，在有机和水环境中，借助于MIPRES固定相进行了初步小规模实验。以这种方式确定MIPRES对于(E)-白藜芦醇的结合能力，正如，和有机清洗步骤相比，水清洗步骤扰乱弱或非特异性结合的影响(图42)。通常，有机溶剂如乙腈或二氯甲烷用于清洗步骤以最小化非特异性疏水性相互作用和扰乱非特异性或弱结合相互作用。在有机条件下MIPRES呈现对于(E)-白藜芦醇的优越的结合能力。然而，MIPRES从水溶液提取(E)-白藜芦醇的能力，尽管具有降低的效率，明确说明了在加工或制造环境中通常会遇到的条件下MIP用于提取和洗脱这种化合物的适用性(图42)。因此，包含MIPRES或相应NIP对照的更大克规模柱用作MISPE固定相来从含水花生压榨废弃物提取物提取(E)-白藜芦醇，其中上述含水花生压榨废弃物提取物包含生物活性多酚的复杂混合物，其中包括基于(E)-白藜芦醇和儿茶素的低聚体。
花生压榨提取物的MISPE
花生压榨废弃物是花生油制备的副产物，构成花生和外壳在压榨以后的剩余物，其包含广泛的生物活性成分，包括植物甾醇、黄烷醇和其它多酚。然而，因为这种副产物通常处置为填埋物或牲畜饲料，所以这些生物活性物质经常是未充分利用的。因为全球大量消费花生和花生衍生物，所以获得的花生饼粉副产物是生物活性成分的重要来源，如生物活性多酚(E)-白藜芦醇，在各种花生市场类型其中，其存在量为0.02-1.79μg/g。因此，我们已经以MISPE方式采用MIPRES来从花生饼粉提取液选择性地分离和富集(E)-白藜芦醇。花生饼粉提取物和随后MIP洗脱液的RP-HPLC色谱图示在图43中。MIPRES显然导致花生饼粉提取物的显著的样品清洗以及(E)-白藜芦醇(Rt＝12.2分钟)和若干种未知化合物的富集。在来自MIPRES的洗脱液中存在的(E)-白藜芦醇的量(39.5μg/mL)意味着大约60倍富集来自粗原料的这种重要生物活性物。这种富集可以完全归因于(E)-白藜芦醇印记效应，因为NIP洗脱液的色谱图并没有显示(E)-白藜芦醇的显著富集，其存在量类似于在未处理花生饼粉提取物中测得的量。
通过串联液体层析法-ESI-质谱法(LC-ESI-MS)并以正离子模式分析了MIPRES洗脱液，通过和(E)-白藜芦醇标准比较，其证实了(E)-白藜芦醇的存在(Rt＝12.2分钟，229m/z[M+H]+)。
除(E)-白藜芦醇以外，MIPRES空腔还显示对二次分子的亲和力，如在Rt＝9.9分钟处的峰所证实的。此峰涉及并不由NIP对照多聚体保留的更具极性的化合物。LC-ESI-MS揭示了对应于在577m/z和865m/z处的[M+H]+离子的质量峰的存在，两者分别符合于A型原花青素二聚物和三聚体的预期质量。
结论
已说明了分子印记固相提取技术可用于从花生副产物分离和富集生物活性多酚。(E)-白藜芦醇印记聚合物用作固定相柱可以提供显着的样品清洗和从含水花生压榨废弃物提取物60倍富集(E)-白藜芦醇(借助于最小样品制备)。
G.白藜芦醇和相关多酚的串联分子印记固相提取
在此实施例中，报道了一种快速串联MISPE方法，该方法用于以高纯度从花生饼粉分离和浓缩(E)-白藜芦醇和相关多酚。
材料与方法
化合物
4-乙烯基吡啶(4VP)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和2，2′-偶氮二(2-甲基丙腈)(AIBN)、儿茶素和云杉新甙获自Sigma-Aldrich(Sydney，NSW，澳大利亚)。紧接着在使用之前，分别借助于真空蒸馏和矾土柱层析法来纯化4-VP和EGDMA。所使用的所有溶剂是HPLC级。
如上所述，合成(E)-白藜芦醇1和结构相关的多酚类似物3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺2。
MIP制备
制备了若干种MIP和它们的非模板化对应物(NIP)，如总结在表16中。在50℃下制备MIPRES(18小时)，接着在60℃下加温退火处理(24小时)。在55℃下借助于不同的致孔剂来产生MIP酰胺(40小时)。两种制备均产生具有可比较的结合性能的MIP。
表16.所使用的MIP的合成条件。
+在50℃下制备，以及在60℃下在6mL致孔剂中加温退火处理。
*在55℃并在5mL致孔剂中制备。
反相层析法(RP-HPLC)
用Agilent Technologies 1100LC系统(Waldbronn，德国)进行RP-HPLC分离，其中上述系统由带有真空脱气器的二元泵、带有900μL进样环管的自动采样器、恒温柱室和二极管阵列检测器构成。在40℃下用ZorbaxEclipse XDB-C18柱(4.6×150mm，5μm粒径)分析注射样品。流动相由在H2O中的0.1％AcOH(溶剂A)和在EtOH/H2O或MeOH/H2O(8∶2v/v)中的0.1％AcOH(溶剂B)构成，并采用以下梯度：0-2分钟：25％B等度，2-6分钟：25-37.5％B，6-9分钟：37.5％B等度，9-12分钟：37.5-62.5％B，12-15分钟：62.5％B等度，15-18分钟：62.5-100％B，18-22分钟：100％B等度，22-25分钟：100-25％B，25-29分钟：25％B等度。流速为0.5mL分钟-1。注射量为5μL，并且UV-Vis二极管阵列检测器(80Hz)设置为λ＝280、321和370nm的吸光波长。
花生饼粉提取物的制备
声处理在EtOH∶H2O(1000.0mL，4∶1v/v)中的花生饼粉(200g)60分钟，其后过滤混合物并蒸发溶剂以产生17.9g提取物。用于随后实验的花生饼粉提取物的制备如下：将10.0g这种材料加入EtOH/H2O(1∶1v/v)的溶液并在容量瓶中稀释至500mL，然后存储于4℃直到需要。在使用之前，使花生饼粉提取物回到室温并声处理以澄清溶液。
白藜芦醇饱和度研究
利用定量的多聚体(30mg)，对MIP和它们的NIP对应物，在0-2mM的浓度范围内，进行(E)-白藜芦醇饱和度研究。NIP反应用来确定起因于与交联剂和随机分散功能单体的相互作用的非特异性结合的程度。在1.5mL包含白藜芦醇的乙腈中借助于在40rpm下的混合温育聚合物18小时，然后在13000rpm下离心15分钟，以沉淀多聚体。除去等份(200μL)的上层清液并通过RP-HPLC以及借助于在321nm处的UV检测加以分析，然后依据线性5点校正曲线来确定未结合(E)-白藜芦醇的浓度。从总分析物溶液浓度减去上述浓度以得到结合分析物(B)的量，其表示为μmol/g多聚体。
静态选择性研究
利用定量的多聚体(30mg)，对MIP和NIP进行选择性研究。用白藜芦醇或结构相似类似物3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺2、儿茶素3和(E)-云杉新甙4分别地温育聚合物。如上所述，评估这些化合物的每一种的结合。
花生饼粉提取物的MISPE
利用MIPRES或MIP酰胺(250mg)进行初步MISPE研究以研究它们从花生饼粉提取物选择性地保留和富集白藜芦醇和其它多酚的能力。将花生饼粉提取物的溶液(25mL)施加于每个柱并在真空条件下收集穿透流分，然后反向循环通过柱，以最大化在固定相和花生饼粉提取物中的多酚成分之间的相互作用。用EtOH/H2O(1∶1v/v，3柱容积，6mL)、然后用H2O(10mL)洗涤每个柱，以除去提取物的未结合和/或弱结合水溶性成分。使用含水丙酮(丙酮/H2O，1∶1v/v，2mL)的选择性清洗步骤用来扰乱非特异性结合。然后使用在MeOH中的10％AcOH(10×1mL)的酸性洗脱步骤用来从每种多聚体解吸和除去特异性地结合的感兴趣的化合物。合并洗脱流分，然后蒸发至干燥并再组成在EtOH/H2O(1∶1v/v)中的1.0mL。通过离心法来澄清这些浓缩洗脱液并除去上层清液供RP-HPLC分析。
花生饼粉提取物的串联(tandem)MISPE
用包含1％AcOH的EtOH/H2O(1∶1v/v)(15mL)来预调节分开的MIPRES和MIP酰胺柱(各自1000mg)。将花生饼粉提取物(100mL)加载到两个串联MIP柱(MIPRES)的第一个柱上，如图44A所示。然后将来自MIPRES柱的流通物加载到MIP酰胺柱上，并收集来自MIP酰胺的流通物，供进一步研究。然后用100mL的包含1％AcOH的EtOH/H2O(1∶1v/v)洗涤MIPRES柱并将洗涤流分加载到MIP酰胺上。最后，利用3×10mL的在MeOH中的10％AcOH分别洗脱两个MIP柱并将洗脱液收集在2mL流分中(图44B)。保留每种流通物和洗涤流分的样品，供分析。
在第二个循环以前(图44C)，用包含0.1％AcOH的EtOH/H2O(1∶1v/v)重调节MIPRES和MIP酰胺柱，然后将合并的白藜芦醇耗尽提取物和洗涤流分再加载到这些串联柱上(如上所述)，以分离任何剩余的多酚化合物。然后用25mL的包含1％AcOH的EtOH/H2O(1∶1v/v)洗涤MIPRES柱并将洗涤流分加载到MIP酰胺柱上，接着利用包含1％AcOH的EtOH/H2O(1∶1v/v)进行洗脱。
随后将来自串联MISPE的两个循环的处理提取物再加载到MIPRES(5g)的较大柱上，从而以尽可能的最大量提取任何剩余多酚化合物。用包含10％AcOH的MeOH(3柱容积)、MeOH(3柱容积)和在EtOH/H2O(1∶1，v/v)中的1％AcOH(3柱容积)预调节上述柱。施加剩余的经处理的花生饼粉提取物(包含来自上述第一次MISPE应用的流通物和洗涤物)(100mL)并收集随后的流通物。然后用在EtOH/H2O(1∶1，v/v)中的1％AcOH(50mL)洗脱柱。
结果与讨论
分子印记聚合物
使用功能单体4VP来制备用白藜芦醇1或3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺2模板化的分子印记聚合物。4VP的使用提供了在富电子吡啶氮和这些模板化合物中的酸性酚式基团之间氢键合或离子相互作用的机会。芳族π-π相互作用还可以参与稳定预聚合复合物，其随后在有交联剂EGDMA存在的情况下在聚合期间被‘冻结’。以上报道了MIPRES的结合特性和性能，其描述了(E)-白藜芦醇选择性MIP的制备，其中(E)-白藜芦醇选择性MIP能够特性性地识别在复杂混合物中存在的(E)-白藜芦醇，上述复杂混合物包含多种结构相关的类似物和其它多酚。
3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺2合成为模板，用于制备MIP酰胺，其将产生在印记聚合物中的“假”(E)-白藜芦醇空腔，该空腔不仅能够结合模板分子，而且能够结合(E)-白藜芦醇和可能地其它存在于复杂食物废弃物基质中的结构相关化合物。
进行(E)-白藜芦醇饱和度研究以确定MIP酰胺的(E)-白藜芦醇结合亲和力(图44)。包含高于2mM(其超过这种化合物的自然发生范围)的(E)-白藜芦醇的溶液的结合结果不是可重现的，因而未示出。MIP酰胺显示大约15μmol/g的(E)-白藜芦醇结合能力，如依据静态结合等温线的渐近线(图44A)所确定的，其约20％低于使用相应的(E)-白藜芦醇印记聚合物所获得的。(E)-白藜芦醇与NIP酰胺的非特异性结合的程度清楚地表明，3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺印记空腔是造成MIP酰胺的增加的结合能力的原因。然而，对于MIP酰胺的选择性结合能力(表示为MIP-NIP)(5-7μmol/g，图44B)大大低于针对MIPRES所观测到的选择性结合能力(9-11μmol/g)。这种观测结果可以归因于在各自的MIP空腔之间的三维结构差异。利用不同模板分子来产生这些MIP，因而确定在各自的MIP空腔内单体的固定官能团的互补的空间定向，从而最大化在模板再结合以后与它们的结合配偶体的相互作用的机会。因此，借助地结构相似白藜芦醇类似物3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺2作为模板化分子来制备MIP酰胺会产生关于功能单体的相对取向在构象方面具有细微差异的分子空腔，其会降低它们与目标分子，(E)-白藜芦醇，形成强相互作用的能力。
经由结合位点探询并利用若干种结构相关的多酚(图45)评估了MIPRES和MIP酰胺的交叉反应性。MIPRES的选择性识别(MIP-NIP)的次序是(E)-白藜芦醇1＞酰胺2＞儿茶素3＞(E)-云杉新甙4，而MIP酰胺的选择性识别则是酰胺2≥(E)-白藜芦醇1＞儿茶素3＞(E)-云杉新甙4。MIP酰胺对于(E)-白藜芦醇显示高交叉反应性，并对于这种化合物和模板化分子3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺2显示可比较的选择性结合。MIPRES和MIP酰胺显示对于儿茶素的类似的结合能力，尽管具有降低的选择性，其类似于各自的模板分子的结合。在分子上增加数目的可能的氢键合基团的存在导致更大数目的非选择性缔合，因而导致NIP的更大亲和力，从而和各自的模板分子相比，降低儿茶素的特异性识别。对于葡糖基化(E)-白藜芦醇分子(E)-云杉新甙，MIPRES和MIP酰胺基本上不显示识别，该结果可能起因于防止进入MIP结合空腔的庞大的葡萄糖取代基。
花生饼粉提取物的MISPE
花生饼粉或花生压榨物是在花生油制备期间产生并构成在压榨后花生和外壳的剩余物。花生包含可变量的(E)-白藜芦醇(0.02-1.79μg/g)(11)，该量超过我们在葡萄皮渣中所观测到的量。因此，利用MIPRES和MIP酰胺评估了在花生饼粉提取物，生物活性多酚的复杂混合物(包括(E)-白藜芦醇和基于儿茶素的低聚体)中存在的成分的结合。制备液体花生饼粉提取物并分别地施加于MIPRES或MIP酰胺柱或各自的NIP对照。花生饼粉提取物和随后MIP洗脱液的RP-HPLC色谱图示于图46。MIPRES显然显着清洗花生饼粉提取物和富集(E)-白藜芦醇(其是在Rt＝12.2分钟处洗脱)，以及若干种未鉴别化合物(图46B)。相比之下，MIP酰胺显示对于未鉴别化合物(其在Rt＝9.7分钟处被洗脱)的优先选择性，同时显示(E)-白藜芦醇的可忽略的保留，其以和花生饼粉提取物大约类似的水平存在于洗脱液中(图46C)。虽然MIP酰胺显示对于(E)-白藜芦醇的亲和力(如上所述)，但对于来自复杂混合物的这种分子明显缺乏亲和力可能起因于对于存在于混合物中的其它分子的更高亲和力或起因于质量作用定律效应，其产生于对于MIP空腔具有可变亲和力的高丰分子。NIP对照柱对(E)-白藜芦醇的非特异性结合的水平(图46D)仅最低限度地高于在提取物中存在的水平以及由MIP酰胺结合的水平，虽然在后一种情况下，未知物的存在可能有效地饱和结合表面。
利用串联液体层析法-ESI-质谱法(LC-ESI-MS)并以正离子模式分析了来自MIPRES的(图46B)，通过和(E)-白藜芦醇标准(其具有229m/z的分子质量，作为单电荷离子([M+H]+))比较，其证实了在Rt＝12.2分钟处的峰仅包括(E)-白藜芦醇。LC-ESI-MS还用来检查在MIP酰胺洗脱液(在Rt＝9.7分钟处)中存在的未知化合物，其揭示了此峰包括分子质量为577m/z([M+H]+)的化合物，上述分子质量是与A型原花青素的分子质量一致的。低分子量儿茶素低聚体，其中A型原花青素占优势，是已知的存在于花生皮中的抗氧化剂，按质量计其量接近9.5％(12)。
如概述在图47中，探索了在串联分离和分离策略中采用多种MIP的构想，由此可以从单一来源捕获和分离多种生物活性成分。将花生饼粉提取物依次加载到两个MIP、MIPRES、接着MIP酰胺，以分离对其MIP呈现最大选择性的主要分子。耗尽花生饼粉提取物在这些相同洗脱和洗涤的串联MIP上的再装载用来分离其它剩余的、但同样有价值的多酚化合物。
来自花生饼粉提取物的串联MISPE处理的典型的RP-HPLC色谱图示在图48中。花生饼粉提取物的色谱图(图48A)显示(E)-白藜芦醇在Rt＝17分钟处的小峰，其对应于64μg总(E)-白藜芦醇。在来自MIPRES(图48B)和来自MIP酰胺(图48C)的洗脱液中类似地观测到对应于(E)-白藜芦醇的峰。这些结果清楚地说明MIP酰胺的精炼潜力：特异性地捕获(E)-白藜芦醇，同时排除保留在来自MIPRES的流通物中的许多非结合化合物。
MIPRES和MIP酰胺的串联组合使得能够几乎定量(96％)回收白藜芦醇，如总结在表17中。此结果显然意味着，两种MIP柱均能够选择性地保留和富集(E)-白藜芦醇，并且从粗原料几乎完全回收。
表17.在洗脱液的不同流分(fraction)中，通过串联MISPE，从花生饼粉提取物回收(E)-白藜芦醇。
1针对1mL再组成样品确定的回收
2ND＝不可检测的
出人意料地，相对于可能的A型原花青素(Rt＝15分钟，577m/z[M+H]+)，MIP酰胺柱还显示对(E)-白藜芦醇的优先选择性，该结果相反于以下观测结果：和(E)-白藜芦醇相比，MIP酰胺优先结合未知化合物(图46C)。然而，以比在小规模实验中使用的显著更大的花生饼粉提取物容积进行串联MISPE实验。因而，很明显，MIP酰胺已选择性地保留大量的存在于此花生饼粉提取物中的(E)-白藜芦醇，从而排除原花青素，以及(E)-白藜芦醇有效地饱和MIP酰胺结合位点，从而排除可以竞争这些MIP酰胺结合位点的其它化合物。在小规模实验中，MIP酰胺能够结合(E)-白藜芦醇和原花青素的我们的观测结果清楚地反映了以下事实：小量的可获得的(E)-白藜芦醇并未饱和可获得的MIP酰胺结合位点，从而使原花青素可以结合于剩余的未占据的MIP酰胺结合位点。另外，在大规模实验中原花青素根本不结合意味着，和对于(E)-白藜芦醇相比，MIP酰胺对于原花青素呈现更低的亲和力、特异性和选择性。
因为串联MISPE柱已从初始原料选择性地除去大多数的(E)-白藜芦醇(96％)，所以可以预测，随着对可获得的MIP结合位点的减少的竞争，MIPRES和MIP酰胺均将选择性地结合剩余在白藜芦醇耗尽的花生饼粉提取物中的原花青素。因此，合并来自经处理的花生饼粉提取物的流通物和洗涤流分，并再施加于重调节的串联MIPRES和MIP酰胺柱。利用和上述相同条件获得的回收自MIPRES和MIP酰胺柱的提取物的RP-HPLC色谱图表明，(E)-白藜芦醇并不结合或洗脱自任何柱(图49)。然而，如预期的，对应于原花青素的峰(Rt＝15分钟)明显存在来自两种MIP柱的色谱图中。MIPRES和MIP酰胺均保留类似量的原花青素(图49B和49C)。这些结果证实了(i)通过花生饼粉提取物的第一轮的串联MISPE处理，已从提取物成功除去所有可测量的(E)-白藜芦醇和(ii)在从此提取物耗尽(E)-白藜芦醇以后，MIPRES和MIP酰胺均可以成功地浓缩A型原花青素。
结论
这里报道的发现说明了分子印记聚合物(MIP)的能力：从花生饼粉提取物选择性地分馏包含多酚如白藜芦醇和A型原花青素的混合物，而不需要广泛的样品预处理。还可以以这样的方式来应用这些MIP，以致借助于快速串联MISPE(即，MIP串联)方式可以从相同原料分别地分离或富集一种以上的多酚。
H.“茶袋”MIP用于分离复杂原料的成分
这种技术是MIP的实际应用的新方式。来自处理废弃物流(例如，花生副产物、酒厂的葡萄籽和外皮、苹果汁生产废弃物)的生物活性物质的提取可以是相当大的物流处理，这是由于来自地理上不同位置的大量材料要分离并产生少得多的目标生物活性物质。因此，可能会更有利的是，考虑在废弃物发生位置进行批量规模材料的初步分离或预浓缩，其将导致更容易处理材料并在单一专用处理设施中合并最后分离和纯化。可替换地，可以在、或靠近废弃物发生位置进行提取，其中利用低技术应用，其用于从废弃物流提取有价值材料的初始过程。一种典型的方法可以基于使用“茶叶袋”，其装满用于从原料中分离目标分子的MIP。
用于这些研究的“茶叶袋”已制造自基于棉的材料，
63μm网和Sigma Aldrich渗析管纤维素膜(12kDa MWCO)。将茶叶袋保持在电镀金属泡茶器中以在搅拌期间保护它们免受物理性损坏。它们可以耐用若干天并容许浸泡在乙醇、水和乙酸的混合物中。
利用在茶叶袋中的MIP进行结合实验。在白藜芦醇结合实验中所使用的MIP是MIP8(如在本专利申请中所编号的)、MIPE、MIP酰胺、和MIP亚胺(如在以上实施例中陈述的)。在植物甾醇结合实验中所使用的MIP是利用比率为1∶3∶30的模板∶4-VP∶EDGMA来制备。
在用于植物甾醇的静态结合系统中”茶袋”MIP的使用：用麦角甾醇、菜油甾醇、胆固醇、豆甾醇、胆固醇阿魏酸酯、阿魏酸和香豆素来模板化MIP(如上所述)。将MIP包装在茶叶袋多聚体袋中，然后放置在天然植物提取物中18小时。随后从混合物除去茶叶袋并转移到在MeOH中的10％乙酸溶液4小时。除去茶叶袋并蒸发溶液至干燥；将获得的固体再组成为在20％ACN/MeOH中的大约0.5mM，然后通过HPLC和ESI/MS加以分析。利用来自鳄梨油、芝麻籽油、麦油、葡萄籽葡萄子油、β-谷甾醇维生素辅助料的提取物、和绿茶提取物，其来自Lipton Green TeaTM，评估了MIP的性能。鉴定了提取的个别成分。可以单独或各自地将若干种不同的聚合物放置在个别袋中以同时从提取液提取最大量和数目的感兴趣的化合物。还确立了个别MIP的回收利用并且结果说明了这些MIP的可重用性而没有性能的显著恶化。在13C NMR谱中的峰便于分析各种捕获和分离的植物甾醇。例如，借助于洗脱自加载的菜油甾醇模板化MIP的结合流分，在13C NMR谱中的峰揭示了仅纯的菜油甾醇，这证实了这种MIP仅特异性地和选择性地吸收菜油甾醇。在另一方面，借助于胆固醇模板化MIP，存在于粗提取物中的豆甾醇被显著结合，这提示，胆固醇可以用作仿生模板(以类似于绿色白藜芦醇，白藜芦醇的亚胺类似物，的方式)，用于更加昂贵的和难以制备的多聚体的分子印记。
在用于白藜芦醇的静态结合系统中”茶袋”MIP的应用
对于白藜芦醇与“茶叶袋”MIP的结合进行相应实验，其中使用MIP8(如在本专利申请中所编号的)、MIPE、MIP酰胺、和MIP亚胺，并使用以下原料实例：花生皮和麦芽汁副产物、酒厂的葡萄籽和外皮、苹果汁生产废弃物和绿茶提取物(来自Lipton Green TeaTM)。
I MIP的相继应用
图50提供了MIP相继用于从供料提取物分离多种目标化合物的实施例。
在本说明书中，单词″包含″、或变体是指包括所陈述的要素、整数或步骤、或要素、整数或步骤的组，但并不排除任何其它要素、整数或步骤、或要素、整数或步骤的组。
在本说明书中提及的所有出版物以引用方式结合于本文。已包括在本说明书中的文件、法令、材料、装置、论文等的任何讨论仅用于提供本发明的范围。并不承认，任何或所有这些事项形成现有技术基础的一部分或是在与本发明有关的领域中的常见的一般知识，因为在本申请的每项权利要求的优先权日以前它存在于澳大利亚或其它地方。
本领域技术人员应当明了，如在具体实施方式中所说明的，可以对本发明进行许多变化和/或改进而不偏离如大致描述的本发明的精神或范围。因此，本发明的实施方式是说明性的而不是限制性的。
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Claims (22)
1.一种用于制备对于化合物具有所期望水平的特异性的分子印记聚合物(MIP)的方法，所述方法包括以下步骤：在有模板和致孔剂存在的条件下聚合包含一个或多个非共价键合位点的单体和交联剂，以及随后除去所述模板，其中所述模板结构上类似于所述化合物或包含结构上类似于所述化合物的部分，以及其中所述模板包含一个或多个非共价键合位点，其中所述非共价键合位点互补于所述单体的非共价键合位点，以及进一步其中所述模板具有比所述化合物更多或更少的非共价键合位点，从而与如果将所述化合物本身用作所述模板相比，所述MIP对于所述化合物具有不同水平的特异性。
2.一种引导用在分子印记聚合物(MIP)中的单体的选择的方法，所述分子印记聚合物将印记有包含一个或多个非共价键合位点的模板，其中所述MIP将如下制备：通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合所选单体和交联剂，并随后除去所述模板，所述方法包括以下步骤：提供一组具有一个或非共价键合位点的单体，所述非共价键合位点互补于所述模板的非共价键合位点，评估在所述单体组的每种单体和所述模板之间形成的复合物的生成能，以及利用所述复合物的所述生成能作为在所述选择中的一个因素来从若干所述单体中选择所选单体。
3.一种用于在分子印记聚合物(MIP)的制备中选择单体与模板的比率的方法，其中所述分子印记聚合物将印记有所述模板，其中所述MIP将如下制备：通过在有所述模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂，以及随后除去所述模板，所述方法包括以下步骤：评估在所述模板和不同数目的所述单体之间形成的复合物的生成能，以及利用所述复合物的所述生成能作为在所述选择中的一个因素来选择单体与模板的比率。
4.一种用于制备MIP的预聚合复合物，包含各自包含一个或多个非共价键合位点的一种或多种单体以及模板，其中所述模板包含与所述单体的一个或多个非共价键合位点互补的一个或多个非共价键合位点。
5.一种根据权利要求1所述的方法制备的MIP。
6.一种通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂以及随后除去所述模板来制备的MIP，其中所述单体的选择是通过权利要求2所述的方法来引导的。
7.一种用于设计包含反式乙烯接头的化合物的类似物的方法，所述方法包括用亚胺、酰胺或仲胺接头替代所述反式乙烯接头。
8.一种用于制备对于具有反式乙烯接头的化合物具有特异性的MIP的方法，所述方法包括以下步骤：在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂，并随后除去所述模板，其中所述模板是所述化合物的类似物，以及进一步其中所述类似物是根据权利要求7所述的方法进行设计的。
9.一种印记有多酚或其类似物的分子印记聚合物(MIP)，其中，所述MIP包含聚合的4-乙烯基吡啶以及聚合的交联剂。
10.一种用于制备根据权利要求9所述的MIP的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在有所述多酚或其类似物以及致孔剂存在的情况下聚合所述MIP；以及
(ii)从所述MIP中除去所述多酚或其类似物。
11.一种用于通过将样品暴露于根据权利要求1所述的MIP以从所述样品中提取一种或多种多酚的方法。
12.一种用于通过层析法至少部分地分离样品的成分的方法，所述方法包括以下步骤：(i)制备包含根据权利要求1所述的MIP的层析柱；(ii)使所述样品通过所述柱；以及(iii)从所述柱中收集所述样品的流分。
13.一种用一种或多种化合物印记的MIP，所述化合物选自由甾醇和甾烷醇、以及它们的类似物或衍生物组成的组，其中所述MIP包含聚合的单体。
14.一种用于制备根据权利要求13所述的MIP的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在有所述甾醇或甾烷醇、或它们的类似物或衍生物、以及致孔剂存在的情况下，聚合所述MIP；以及
(ii)从所述MIP中除去所述甾醇或甾烷醇、或它们的类似物或衍生物。
15.一种通过将样品暴露于根据权利要求13所述的MIP而从所述样品中提取一种或多种甾醇或甾烷醇、或它们的类似物或衍生物的方法。
16.一种通过层析法至少部分地分离样品的成分的方法，所述方法包括以下步骤：(i)制备包含根据权利要求13所述的MIP的层析柱；(ii)使所述样品通过所述柱；以及(iii)从所述柱中收集所述样品的流分。
17.一种如本文描述的新型化合物。
18.一种至少部分地分离包含两种或更多种成分的样品中的所述成分的方法，所述方法包括将所述样品顺序地暴露于至少两种MIP，其中每种MIP已印记有不同的模板。
19.一种包封在可渗透网中的MIP。
20.一种用于从样品中提取成分的方法，包括将所述样品暴露于根据权利要求19所述的MIP。
21.一种印记有(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇或3，5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺的MIP，其中所述MIP包含聚合的单体。
22.一种用于从样品中提取白藜芦醇的方法，所述方法包括将所述样品暴露于根据权利要求21所述的MIP。
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