JP2012516361A

JP2012516361A - 分子インプリントポリマー

Info

Publication number: JP2012516361A
Application number: JP2011546534A
Authority: JP
Inventors: ミルトン・ティー・ダブリュー・ハーン; スティーヴン・ラングフォード; ケリー・ルイーズ・タック; サイモン・ハリス; ラインハルト・インゲマー・ボイセン; ヴィクトリア・タマラ・パーチヨーノック; バジル・ダニーレック; ラックラン・シュワルツ; ジャミール・チョウダリー
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2009-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2012-07-19
Also published as: AU2010207887A1; US20160288090A1; EP2391658A4; AU2010207887B2; CN102369223A; EP2391658B1; US20200188878A1; NZ594298A; US20120052757A1; WO2010085851A1; CA2750591A1; EP2391658A1

Abstract

本発明は、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）を設計する方法に関する。この方法は、生物活性化合物をさまざまなバイオプロセスの供給原料および廃棄物から抽出することに応用することができる。本発明はさらに、本発明の方法によって設計されるＭＩＰを対象とする。

Description

本出願は、その内容を参照により本明細書に組み込む豪州特許仮出願第2009900328号に基づく優先権を主張する。

本発明は、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）の設計方法を対象とする。この方法は、広範なバイオプロセスの供給原料および廃棄物から生物活性化合物を抽出することにおける用途を有する。本発明はさらに、本発明の方法によって設計されるＭＩＰを対象とする。

分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）を、さまざまなレベルの架橋を考慮して設計することによって、制御された剛性または柔軟性を有するポリマーであって、任意の標的被験物質に特異的となるようにオーダーメードすることができる空洞（cavities）（結合部位）を有するポリマーを製造することができる。純粋なテンプレート試料を用いて、このテンプレート化合物に特異的であるかまたは類似の化学構造を有する他の分子に特異的であるＭＩＰを製造することができる。ＭＩＰは、抗原に対する抗体に例えることができる高い選択性および特異性を有する高分子網目である。ＭＩＰは、温度、極端なｐＨ、溶媒、プロテアーゼ、ならびに分解および変性に対して高められた抵抗性を有するという利点を有し、この利点はＭＩＰを、付加価値を有する可能性のある生物分子を予備濃縮、抽出、および分離するための再利用可能な材料にする。

心疾患、消化器癌、白内障、および他の疾病もしくは病気に対する果物および野菜の健康効果については、有力な疫学的証拠が存在する。植物化学物質は、この効果の大部分に寄与すると考えられる候補である。生体内における吸収、代謝、これらの分子がどのようにその生物効果を発揮するかについては不確かであるが、これらの生物活性化合物によって得られる健康効果については広く理解され、受け入れられている。

非常に興味が持たれている植物化学物質の部類には、ポリフェノール類があり、レスベラトロールがその例である。他の興味深い部類は、カルコン類、インドール類、クマリン類、フラバノン類およびフラバノール類、アントシアニン類、ならびに植物ステロール類および植物スタノール類である。

レスベラトロールおよびその類似体、ならびに植物ステロール類およびその類似体については、求められる特異性を有するＭＩＰの製造方法を研究する既刊文献がほとんどない。存在する文献の大部分は、分析的な分離方法だけに重点が置かれている。予備分離において製造したＭＩＰを用いるためになされた試みについてみると、ＭＩＰの性能を利用するための試み、または大規模スケールに利用するための主要な課題の一部に対処する試みは全くなされていない。例えば、Xiangら¹の研究は、非共有結合分子インプリンティング技術は、極性溶媒に溶解されたテンプレート（例えばレスベラトロール等）には適しておらず、モノマーとしてはアクリルアミドを使用する必要があるという考えに基づいている。一方、Maら²の研究では、誘導されたＭＩＰの選択性の制御については全く注目されておらず、レスベラトロール誘導体、trans-ポリダチン、およびエモジンが、それらのグルコシル化または修飾された構造にもかかわらずＭＩＰに強く結合するという結果が得られている。Caoら³の研究は、大体において、Xiangら¹およびMaら²のものと同じ結論を単に再び述べており、非常に類似した方法および同じ試験化合物群を使用している点において驚くべきことがない。したがって、工業的利用に適した誘導体化分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）を用いて、特定のテンプレートまたはテンプレート群に対してオーダーメードされ最適化された、特異的なＭＩＰを開発することが求められている。とりわけ、食品業界などにおいて商業的な重要性を有する標的化合物の単離を可能にする、現在製造業者によって採用されているシステムとの互換性がある、好適なＭＩＰを創り出す必要がある。

Yingyong Huaxue 2005, 22, (7), 739-743 Analytical Letters 2007, 40, 321-333 Polygonum cuspidatum. Macromolecular Research 2006, 14, (3), 324- 330

本発明者らは、レスベラトロール選択的ＭＩＰ（本明細書において「ＭＩＰ８」と記述する）を、レスベラトロールをテンプレートとして用いて設計した。本発明者らは、レスベラトロールのイミン類似体（発明者らは、「グリーンレスベラトロール」と称している）およびアミン類似体を含むレスベラトロール類似体を用いて、多くの他の分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）も設計した。本発明者らは、固相抽出技術におけるこれらのＭＩＰ８の適用によって、グレープシードおよびピーナッツミールの抽出物からレスベラトロールを選択的に濃縮することが可能になることを実証した。この成果は、従来技術のＭＩＰシステムによって得られた低い精製ファクター（例えば、Maら²、Xiangら¹、およびCaoら³のもの）とは対照的である。加えて、本発明者らは、分子インプリンティングされた固相技術のスケールアップの可能性を実証し、これによって本方法の拡大可能性が例証された。

第１の態様では、本発明は、化合物に対して所望のレベルの特異性を有する分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）の製造方法であって、１種以上の非共有結合部位を含むモノマーと架橋剤とをテンプレート分子およびポロゲンの存在下で重合させる工程と、その後前記テンプレートを除去する工程とを含み；前記テンプレートが、前記化合物に構造的に類似しているかまたは前記化合物に構造的に類似する部分を含み；前記テンプレートが、前記モノマーの非共有結合部位と相補的である１種以上の非共有結合部位を含み；かつ、前記テンプレートが、前記化合物より多いかまたは少ない非共有結合部位を有し、これによって前記ＭＩＰが、前記化合物自体をテンプレートとして用いる場合と比較して前記化合物に対して異なるレベルの特異性を有する製造方法を提供する。

１つの実施態様では、本発明は、化合物に対して所望のレベルの特異性を有する分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）の製造方法であって、１種以上の水素結合部位を含むモノマーと架橋剤とをテンプレートおよびポロゲンの存在下で重合させる工程と、その後前記テンプレートを除去する工程とを含み；前記テンプレートが、前記化合物に構造的に類似しているかまたは前記化合物に構造的に類似する部分を含み；前記テンプレートが、前記モノマーの水素結合部位と相補的である１種以上の水素結合部位を含み；かつ、前記テンプレートが、前記化合物より多いかまたは少ない水素結合部位を有し、これによって前記ＭＩＰが、前記化合物自体をテンプレートとして用いる場合と比較して前記化合物に対して異なるレベルの特異性を有する製造方法を提供する。

第２の態様では、本発明は、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）に用いるためのモノマーであって１種以上の非共有結合部位を含むテンプレートと共にインプリンティングされることとなるものの選択を案内する方法であって、前記ＭＩＰが、前記選択されたモノマーと架橋剤とのテンプレートおよびポロゲンの存在下での重合、ならびにその後の前記テンプレートの除去によって製造されることとなるものであり；前記方法が、前記テンプレートの非共有結合部位と相補的である１種以上の非共有結合部位を有する一群のモノマーを準備する工程と、前記一群のモノマーの各モノマーと前記テンプレートとの間で形成される複合体の生成エネルギーを評価する工程と、前記選択におけるファクターとして前記複合体の生成エネルギーを用いて、前記一群のモノマーから前記選択されたモノマーを選択する工程とを含む方法を提供する。

１つの実施態様では、本発明は、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）に用いるためのモノマーであって１種以上の水素結合部位を含むテンプレートと共にインプリンティングされることとなるものの選択を案内する方法であって、前記ＭＩＰが、前記選択されたモノマーと架橋剤とのテンプレートおよびポロゲンの存在下での重合、ならびにその後の前記テンプレートの除去によって製造されることとなるものであり；前記方法が、前記テンプレートの水素結合部位と相補的である１種以上の水素結合部位を有する一群のモノマーを準備する工程と、前記一群のモノマーの各モノマーと前記テンプレートとの間で形成される複合体の生成エネルギーを評価する工程と、前記選択におけるファクターとして前記複合体の生成エネルギーを用いて、前記一群のモノマーから前記選択されたモノマーを選択する工程とを含む方法を提供する。

第３の態様では、本発明は、テンプレートを用いてインプリンティングされることとなる分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）の製造におけるテンプレートに対するモノマーの比を選択する方法であって、前記ＭＩＰが、モノマーを、架橋剤と共に、テンプレートおよびポロゲンの存在下で重合させる工程と、その後前記テンプレートを除去する工程によって製造されることとなるものであり；前記方法が、前記テンプレートとさまざまな数の前記モノマーとの間で形成される前記複合体の生成エネルギーを評価する工程と、前記選択におけるファクターとして前記複合体の生成エネルギーを用いて、テンプレートに対するモノマーの比を選択する工程とを含む方法を提供する。

第４の態様では、ＭＩＰの製造に用いるためのポリマー化前複合体であって、前記ポリマー化前複合体が、それぞれ１種以上の非共有結合部位を含む１種以上のモノマーと、テンプレートとを含み；前記テンプレートが、前記モノマーの前記１種以上の非共有結合部位と相補的である１種以上の非共有結合部位を含む、ポリマー化前複合体を提供する。

１つの実施態様では、ＭＩＰの製造に用いるためのポリマー化前の水素結合した複合体であって、前記ポリマー化前複合体が、それぞれ１種以上の水素結合部位を含む１種以上のモノマーと、テンプレートとを含み；前記テンプレートが、前記モノマーの前記１種以上の水素結合部位と相補的である１種以上の水素結合部位を含む、ポリマー化前複合体を提供する。

第５の態様では、第１の態様の方法によって製造されるＭＩＰを提供する。

１つの実施態様では、１種以上の非共有結合部位を含むモノマーは、第２の態様の方法によって選択される。

第６の態様では、モノマーを、架橋剤と共に、テンプレートおよびポロゲンの存在下で重合させる工程と、その後前記テンプレートを除去する工程とによって製造されるＭＩＰであって、前記モノマーの選択が、第２の態様の方法によって案内されるか、テンプレートに対するモノマーの比が第３の態様の方法によって選択されるＭＩＰを提供する。

第７の態様では、トランス-エチレン連結基を含む化合物の類似体を設計する方法であって、前記トランス-エチレン連結基を、イミン連結基、アミド連結基、または二級アミン連結基で置き換えることを含む方法を提供する。
好ましくは、前記トランス-エチレン連結基を、イミン連結基で置き換える。このイミン連結基は、エチレン連結基と構造的に等価であるが、合成法については全く類似していない。

第８の態様では、トランス-エチレン連結基を有する化合物に対して特異的であるＭＩＰを製造する方法であって、モノマーと架橋剤とをテンプレートおよびポロゲンの存在下で重合させる工程と、その後前記テンプレートを除去する工程とを含む方法を提供する。

第９の態様では、本発明は、ポリフェノールまたはその類似体を用いてインプリンティングされた分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）であって、前記ＭＩＰが、重合した4-ビニルピリジンを、重合した架橋剤と共に含む、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）を提供する。

第１０の態様では、本発明は、第９の態様のＭＩＰの製造方法であって、
(i)前記ＭＩＰを、ポリフェノールまたはその類似体、およびポロゲンの存在下で重合させる工程と、
(ii)前記ポリフェノールまたはその類似体を、前記ＭＩＰから除去する工程と
を含む、方法を提供する。

第１１の態様では、本発明は、１種以上のポリフェノールを試料から抽出する方法であって、前記試料を第１の態様のＭＩＰに曝すことによる方法を提供する。

好ましい形態では、前記試料は、植物をベースとする試料であり、食料品、例えば、ブドウおよびその種子、果皮、および果汁（およびワイン）、リンゴ、ナシ、ベリー、ならびに他の果物、茶、ピーナッツ（またはピーナッツミール（peanut meal））、ならびに、シリアル、例えば、小麦、コーン、米、およびこれらのオイル、ならびにこれらの副産物から供給される。
１つの態様では、ＭＩＰは、透過性メッシュに入っている。

第１２の態様では、本発明は、クロマトグラフィーによって試料の構成成分を少なくとも部分的に分離する方法であって、
(i)第１の態様のＭＩＰを含むクロマトグラフィー用カラムを準備する工程と、
(ii)前記試料を、前記クロマトグラフィー用カラムに通す工程と、
(iii)前記クロマトグラフィー用カラムから前記試料のフラクションを集める工程と
を含む方法を提供する。

第１３の態様では、本発明は、ステロール類およびスタノール類、ならびにこれらの類似体または誘導体からなる群から選択される１種以上の化合物を用いてインプリンティングされたＭＩＰであって、重合したモノマーを含む、ＭＩＰを提供する。
好ましくは、誘導体は、ポリフェノールエステル、例えば、フェルラ酸エステルまたは没食子酸エステルなどである。ポリフェノールは、水素結合部位またはπ-π結合部位を提供する。

第１４の態様では、本発明は、第１３の態様のＭＩＰの製造方法であって、
(i)ステロールもしくはスタノールまたはこれらの類似体もしくは誘導体と、ポロゲンとの存在下で前記ＭＩＰを重合させる工程と、
(ii)ステロールもしくはスタノールまたはこれらの類似体もしくは誘導体を、前記ＭＩＰから除去する工程と
を含む方法を提供する。

第１５の態様では、本発明は、１種以上のステロールもしくはスタノールまたはこれらの類似体もしくは誘導体を、試料から抽出する方法であって、前記試料を第１３の態様のＭＩＰに曝すことによる方法を提供する。

１つの態様では、ＭＩＰは、透過性メッシュに入っている。

第１６の態様では、本発明は、クロマトグラフィーによって試料の構成成分を少なくとも部分的に分離する方法であって、
(i)第１３の態様のＭＩＰを含むクロマトグラフィー用カラムを準備する工程と、
(ii)前記試料を前記クロマトグラフィー用カラムに通す工程と、
(iii)前記クロマトグラフィー用カラムから前記試料のフラクションを集める工程と
を含む方法を提供する。

本発明の官能性ポリマーの研究の過程で、本発明者らは、新規かつ進歩性を有する多数の化合物を合成した。第１７の態様は、これらの新規な化合物を対象とする。

第１８の態様では、本発明は、２種以上の成分を含む試料の前記成分を、少なくとも部分的に分離する方法であって、前記試料を、少なくとも２種のＭＩＰに順次曝す工程を含み、各ＭＩＰが異なるテンプレートを用いてインプリンティングされたものである方法を提供する。

第１９の態様では、本発明は、透過性メッシュに入ったＭＩＰを提供する。

第２０の態様では、試料から成分を抽出する方法であって、前記試料を第１９の態様のＭＩＰに曝す工程を含む方法を提供する。

第２１の態様では、(E)-5-[(4-ヒドロキシ-フェニルイミノ)-メチル]-ベンゼン-1,3-ジオールまたは3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミドを用いてインプリンティングされたＭＩＰを提供する。

第２２の態様では、試料からレスベラトロールを抽出する方法であって、前記試料を、第２１の態様のＭＩＰに曝す工程を含む方法を提供する。

図１は、レスベラトロール-3-O-β-D-グルクロニドの構造を示す。図２は、「共有結合性」MIPSを形成するための(E)-5-(4-(メタクリロイルオキシ)スチリル)-1,3-フェニレンビス(2-メチルアクリレート)の製造を示す。図３Ａは、レスベラトロール(3A)の構造を示す。図３Ｂは、電子特性と可能な相互作用部位とを示す、PM3計算を用いてコンピュータによって作ったレスベラトロール表面のモデルを示す。図４は、3当量4VPにて明確な最小値を示す、PM3構造最適化計算を用いてレスベラトロールと4VPクラスターとの間に見積もった相互作用エネルギーを示す分子モデリング滴定結果を示す。図５は、スチルベンヒドロキシ基およびピリジニル窒素頭部基のそれぞれによって相互作用する３つの4VP単位とのレスベラトロール複合体の空間充填像を示す。図６Ａは、PM3力場を用いた半経験的計算を使って、レスベラトロールと官能性モノマーであるアクリルアミド(AAM)との間の複合体に対して見積もった総相互作用エネルギー(ΔE_f)に対するモデリング滴定データを示す。図６Ｂは、PM3力場を用いた半経験的計算を使って、レスベラトロールと官能性モノマーである4-ビニル安息香酸(4VBA)との間の複合体に対して見積もった総相互作用エネルギー(ΔE_f)に対するモデリング滴定データを示す。図６Ｃは、アセトニトリル中0.5mMのレスベラトロールの溶液中の50mgのポリマーに対する静電的結合データを示す。図６Ｄは、アセトニトリル中0.5mMのレスベラトロールの溶液中の50mgのポリマーに対する静電的結合データを示す。図７は、官能性モノマー4VPの漸増するモル当量を添加したときのレスベラトロールの芳香族-OHのシフトの低磁場側への移動を示す。図７は、ポリマー化前複合体が形成され、これはピリジニルN基との水素結合相互作用を通じてのようであることを示唆している。図８は、アセトニトリル中のレスベラトロール溶液(0.05mM)からのレスベラトロール親和性を示す、ポリマーMIP1、MIP2、MIP3、及びMIP4、並びに対応するNIPの再結合データを示す。図９は、アセトニトリル中0.5mMのレスベラトロール溶液を用いた結合アッセイにおける、ポリマーMIP1、MIP2、MIP3、NIP1、及びNIP2に対するレスベラトロール結合親和性を示す。図１０は、MIPと、以下のT:FM:XL比＝1:3:15(MIP 8)、1:3:17(MIP 10)、1:3:20(MIP 9)、1:3:30(MIP 2)、及び1:3:40(MIP 5)で調製したそれらそれぞれのNIP対照物質に対する静電的再結合データを示す。図１１は、複数のMIP 8のバッチA〜J(LS3-37p84-17-4-08a-j)、K(LS3-26p62-1-4-08a)、L(LS3-26p62-1-4-08b)、及びM(ls2-6p10-7-2-07)に対する静電的結合データを示し、これはMIP生産の再現性と、アセトニトリル中での結合性能を示している。全ての測定は２回繰り返した。図１２は、アセトニトリル中最高で5mMまでレスベラトロール濃度範囲にわたる、静電的条件下でのMIP8（30 mg）に対するレスベラトロールの結合能を示す。サンプルは懸濁混合機を使用して約40rpmで夜通し混合した。次にサンプルを遠心分離にかけ、上清の一部をHPLCで分析し、フリーのレスベラトロール濃度を測定した。図１３Ａは、競合なしでアセトニトリル中のレスベラトロール類似体のある範囲(0.5mM)に対する、静電的条件下でのMIP 8に対する交差反応性結合データを示す。図１３Ｂは、競合なしでアセトニトリル中のレスベラトロール類似体のある範囲(0.5mM)に対する、静電的条件下でのMIP 8に対する交差反応性結合データを示す。図１３Ｃは、競合なしでアセトニトリル中のレスベラトロール類似体のある範囲(0.5mM)に対する、静電的条件下でのMIP 8に対する交差反応性結合データを示す。図１４は、レスベラトロールでインプリントしたポリマー(MIP 8)とレスベラトロール類似体でテンプレートしたMIP類との間でのレスベラトロール親和性を比較した静電的結合データを示す。図１５は、アセトニトリルでの試験的洗浄によって非特異的結合を除去した後で、動的SPE条件下にて、ポロゲン（MIP_E）中のエタノールの影響及び架橋量の影響の両方を比較するMISPE結合試験の結果を示す。図１６Ａは、A)負荷溶液、及びB)2×20%(v/v)エタノール-水で洗浄した後で束縛(μmole/gポリマー)されているレスベラトロールによる、水性条件下でのレスベラトロール(0.5mM)のMISPE結合を示す。図１６Ｂは、A)負荷溶液、及びB)2×20%(v/v)エタノール-水で洗浄した後で束縛(μmole/gポリマー)されているレスベラトロールによる、水性条件下でのレスベラトロール(0.5mM)のMISPE結合を示す。図１７Ａは、水性条件下でのレスベラトロールの保持／結合への、エタノール及び水の含有量の影響を示す。結合は、それぞれ、20、50、及び80%エタノール(v/v)中のレスベラトロール溶液(0.5mM)を用い、MIP 8に対して評価した。示したデータは、A)負荷、及びB)1mL負荷溶液（すなわち、20、50、及び80%エタノール）を含む洗浄並びに50%水性エタノール (v/v)での3回の連続洗浄の後で結合している、初期レスベラトロール溶液に対するパーセント割合である。図１７Ｂは、水性条件下でのレスベラトロールの保持／結合への、エタノール及び水の含有量の影響を示す。結合は、それぞれ、20、50、及び80%エタノール(v/v)中のレスベラトロール溶液(0.5mM)を用い、MIP 8に対して評価した。示したデータは、A)負荷、及びB)1mL負荷溶液（すなわち、20、50、及び80%エタノール）を含む洗浄並びに50%水性エタノール(v/v)での3回の連続洗浄の後で結合している、初期レスベラトロール溶液に対するパーセント割合である。図１８は、MIP 8が、利用可能な結合部位に対する複数の潜在的競合物を含む複合原液からレスベラトロールを濃縮することができることを実証している図である。図１８Ａは、レスベラトロールを隠している多量の未知のものを含む強化グレープシード抽出物のHPLCチャートを示す。図１８は、MIP 8が、利用可能な結合部位に対する複数の潜在的競合物を含む複合原液からレスベラトロールを濃縮することができることを実証している図である。図１８Ｂは、レスベラトロール溶液(0.5mM)を適用した後に溶離されたレスベラトロール(RT 2.735分)を示す。図１８は、MIP 8が、利用可能な結合部位に対する複数の潜在的競合物を含む複合原液からレスベラトロールを濃縮することができることを実証している図である。図１８Ｃは、強化グレープシード抽出物を適用した後でMISPEカラムから溶離されたレスベラトロール(RT 2.735分)を示す。図１８は、MIP 8が、利用可能な結合部位に対する複数の潜在的競合物を含む複合原液からレスベラトロールを濃縮することができることを実証している図である。図１８Ｄは、NISPEカラムに強化グレープシード抽出物を適用した後にそのNISPEカラムから溶離されたレスベラトロール(RT 2.735分)を示すが、2.735分に観察可能なピークがなく、これはレスベラトロールが保持されていなかったことを示している。図１９Ａは、未処理のピーナッツミールのクロマトグラムを示す。図１９Ｂは、MISPE処理したピーナッツミールのクロマトグラムを示す。図１９Ｃは、非インプリント対照ポリマー(NIP)を固定相として用いるSPE処理後のピーナッツミール抽出物のクロマトグラムを示す。図２０Ａは、ピーナッツミール抽出物の約0.98μg/mLのレスベラトロール濃度を有する未処理ピーナッツミールのクロマトグラムを示す。図２０Ｂは、約19.5μg/mLのレスベラトロール濃度であるMISPE処理したピーナッツミールのクロマトグラムを示す。図２０Ｃは、非インプリント対照ポリマー(NIP)を固定相として用いるSPE処理後のピーナッツミール抽出物のクロマトグラムを示す。図２１は、コレステロール、及び一般的に見出されるフィトステロール類であるβ-シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、及びブラシカステロール、並びにフィトスタノール類であるβ-シトスタノール及びカンペスタノールの化学構造を示す。図２２は、γ-オリザノール中に存在する主成分の化学構造を示す。図２３は、MIP19（黒）及びNIP19（灰色）の性能を示す（Ch:4-VP:架橋剤）。図２４は、MIP20（黒）及びNIP20（灰色）の性能を示す（Ch:MMA:架橋剤）。図２５は、再結合分子としてスチグマステロールを用いたMIP20（黒）及びNIP20（灰色）の性能を示す。図２６は、再結合分子としてスチグマステロールを用いたMIP19（黒）及びNIP19（灰色）の性能を示す。図２７は、再結合分子としてスチグマステロールを用いたMIP22（黒）及びNIP22（灰色）の性能を示す。図２８は、再結合分子としてスチグマステロールを用いたMIP21（黒）及びNIP21（灰色）の性能を示す。図２９は、再結合分子としてコレステロールを用いたMIP21（黒）及びNIP21（灰色）の性能を示す。図３０は、再結合テンプレートとしてコレステロールを用い、再結合を２回したMIP20（黒）及びNIP20（灰色）の性能を示す。図３１は、対応するフェルラ酸エステルへのフィトステロール類の変換を示す。図３２は、再結合テンプレートとしてコレステリルフェルラートを用いるMIP23（黒）及びNIP23（灰色）の性能を示す（官能性モノマーとして4-VP）。図３３は、再結合テンプレートとしてコレステリルフェルラートを用いるMIP24（黒）及びNIP24（灰色）の性能を示す（官能性モノマーとしてメタクリル酸）。図３４は、共有結合性ポリマー（1:10 (FM:EDGMA): MIP7（黒）及びNIP7（灰色））の性能を示す。図３５は、上述した再結合基剤としてコレステロールを用いるハイブリッドポリマーMIP26（黒）及びNIP26（灰色）の性能を示す。図３６は、官能性モノマー類である4-ビニルピリジン（4VP、黒丸）、アクリルアミド（AAM、黒ひし形）、メタクリル酸（MMA、黒四角）、メタクリル酸メチル（MMA、十字）、及びスチレン（Sty、白抜き三角）に対する(E)-レスベラトロールのモデリング滴定データであり、1〜6の範囲のモノマー等価体に対して予測されるΔE_i値を示す。図３７Ａは、(E)-レスベラトロールと複数バッチのP1との結合についての複数バッチの静電的結合等温線を示す。測定値は、3つの繰り返しのうち最小値を示す二重のサンプルについて行なった。誤差を示す線は標準誤差を示す（SEM）。図３７Ｂは、(E)-レスベラトロールに対するMIPの選択能を示し、組み込み図は、スキャッチャード(Scatchard)(34)フォーマットでの結合データを示す。図３８は、静電的条件下での(E)-レスベラトロールに対するインプリントポリマー及び非インプリントポリマーの結合能を示す。図３９は、MIP P1（黒）及びそのNIP対照N1（灰色）による、(E)-レスベラトロール1及び７種のポリヒドロキシスチルベン構造同族体についてポリマー1 g当りに結合した被験物質の量を示す単一検体アッセイによる静電的結合を示す。図４０は、アルケン1、アミド2、及びイミン3と、MIP_RESとの単一被験物質セレクトフォア結合を示す。図４１は、MIP_RES、MIP_AMIDE、及びMIP_IMINEによる(E)-レスベラトロールの認識を示す。図４２は、(E)-レスベラトロールに対するMIP_RESの相対的結合能を示す。(E)-レスベラトロール基準物(0.5μモル)を、アセトニトリル（黒）又はEtOH/H₂O(1:1, v/v)（灰色）中のそれぞれいずれかでMIP_RES（100mg）に負荷した。次にそれぞれのカラムをその負荷溶媒を用いて洗浄し、カラム上に残っている(E)-レスベラトロールの量を5点校正曲線から決定した。図４３は、ピーナッツミール抽出物及びMISPE溶出液のRP-HPLCクロマトグラムを示す。未処理ピーナッツミール抽出物（一番前の線）、MIP_RESMISPEカラムからの溶出液（真ん中の線）、及びNISPEカラムからの溶出液（一番後ろの線）。クロマトグラムは321nmで得た。(E)-レスベラトロールはR_t=12.2分で溶出する。図４４Ａは、MIP_AMIDE（黒三角）及びNIP_AMIDE（灰色三角）に対する(E)-レスベラトロールの結合に対する静電的結合等温線を示す。図４４Ｂは、選択性（MIP-NIP）として表した、(E)-レスベラトロールに対するMIP_AMIDE（黒三角）及びMIP_RES（黒ひし形）の双方の選択的親和性の比較を示す。図４５は、(E)-レスベラトロール1、3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド2、カテキン3、及び(E)-ピセイド(piceid)4に対するMIP_RES、MIP_AMIDE、及びそれらの各NIP対照ポリマーについての交差反応性試験を示す。図４６Ａは、(A)ピーナッツミール抽出物についての、移動相溶媒BとしてEtOH/H₂O(8:2 v/v)を用いて321nmでのUV-可視検出を用いたRP-HPLCクロマトグラムを示す。(E)-レスベラトロールはR_t=12.2分で溶出する。(E)-レスベラトロールの同定はLC-ESI-MSで確かめた。図４６Ｂは、(B)MIP_RESカラムからのピーナッツミール溶出液についての、移動相溶媒BとしてEtOH/H₂O(8:2 v/v)を用いて321nmでのUV-可視検出を用いたRP-HPLCクロマトグラムを示す。(E)-レスベラトロールはR_t=12.2分で溶出する。(E)-レスベラトロールの同定はLC-ESI-MSで確かめた。図４６Ｃは、(C)MIP_AMIDEカラムからのピーナッツミール溶出液についての、移動相溶媒BとしてEtOH/H₂O(8:2 v/v)を用いて321nmでのUV-可視検出を用いたRP-HPLCクロマトグラムを示す。(E)-レスベラトロールはR_t=12.2分で溶出する。(E)-レスベラトロールの同定はLC-ESI-MSで確かめた。図４６Ｄは、(D)NIP_RES対照カラムからのピーナッツミール溶出液についての、移動相溶媒BとしてEtOH/H₂O(8:2 v/v)を用いて321nmでのUV-可視検出を用いたRP-HPLCクロマトグラムを示す。(E)-レスベラトロールはR_t=12.2分で溶出する。(E)-レスベラトロールの同定はLC-ESI-MSで確かめた。図４７は、複雑な食品原料から得られた抽出物の順次MISPE処理の概念を示す略図であり、これによって複数の生物活性成分が単一原料から分離できる。図４８Ａは、(A)EtOH/H₂O(1:1 v/v)中のピーナッツミール抽出物、及び(B)MIP_RES次に(C)MIP_AMIDEによって捕捉された分子の酸溶出のRP-HPLCクロマトグラムのうち(A)のクロマトグラムを示す。クロマトグラムはλ=321nmでのUV-可視検出によって得られた。(E)-レスベラトロールはR_t=17分で溶出する。図４８Ｂは、(A)EtOH/H₂O(1:1 v/v)中のピーナッツミール抽出物、及び(B)MIP_RES次に(C)MIP_AMIDEによって捕捉された分子の酸溶出のRP-HPLCクロマトグラムのうち(B)のクロマトグラムを示す。クロマトグラムはλ=321nmでのUV-可視検出によって得られた。(E)-レスベラトロールはR_t=17分で溶出する。図４８Ｃは、(A)EtOH/H₂O(1:1 v/v)中のピーナッツミール抽出物、及び(B)MIP_RES次に(C)MIP_AMIDEによって捕捉された分子の酸溶出のRP-HPLCクロマトグラムのうち(C)のクロマトグラムを示す。クロマトグラムはλ=321nmでのUV-可視検出によって得られた。(E)-レスベラトロールはR_t=17分で溶出する。図４９Ａは、(A)MISPE処理の第一回目で得られるレスベラトロールが低減されたピーナッツミール抽出物と(B)MIP_RES次に(C)MIP_AMIDEによって捕捉された分子の酸溶出のRP-HPLCクロマトグラムのうち(A)のクロマトグラムを示す。クロマトグラムはλ=321nmでのUV-可視検出によって得られた。A-型プロシアニジンはR_t=15分で溶出する。図４９Ｂは、(A)MISPE処理の第一回目で得られるレスベラトロールが低減されたピーナッツミール抽出物と(B)MIP_RES次に(C)MIP_AMIDEによって捕捉された分子の酸溶出のRP-HPLCクロマトグラムのうち(B)のクロマトグラムを示す。クロマトグラムはλ=321nmでのUV-可視検出によって得られた。A-型プロシアニジンはR_t=15分で溶出する。図４９Ｃは、(A)MISPE処理の第一回目で得られるレスベラトロールが低減されたピーナッツミール抽出物と(B)MIP_RES次に(C)MIP_AMIDEによって捕捉された分子の酸溶出のRP-HPLCクロマトグラムのうち(C)のクロマトグラムを示す。クロマトグラムはλ=321nmでのUV-可視検出によって得られた。A-型プロシアニジンはR_t=15分で溶出する。図５０は、食品抽出物からの複数標的化合物の単離のための順次SPEフォーマットMPIカラム構成の略図を示す。全ての所望しない化学種は各MIPカラムを通過して、それら各MISPEカラムに結合した複数の標的種が残り、これを次に溶出させてそれぞれの標的化合物を高純度で得ることができる。

ＭＩＰの形成は、典型的には、以下の工程を含む：テンプレートをモノマー（典型的には過剰量）と一緒に混合して、１個のテンプレートが多数のモノマー分子に結びついたポリマー化複合体を形成させる工程；次いで、これらのポリマー化複合体が、モノマーを架橋剤と共に重合させることによって、架橋されてポリマーとなる工程；その後、テンプレートを架橋した複合体から除去する工程。複合体の架橋したモノマーは、テンプレートの形状に相補的な表面および空洞を含んでいる。架橋反応は、一般に、ＭＩＰが多くの細孔（pore）を含む開放的な構造を有することを確実にするポロゲンの存在下で実施する。これらの細孔は、溶液の分子がＭＩＰを通して移動することを可能にし、分子がＭＩＰの表面および空洞と相互作用するようにする。テンプレートと類似した形状を有する被験物質は、他の分子よりも強くＭＩＰと相互作用するであろう。その結果、ＭＩＰを、被験物質の捕捉、濃縮、および／または分離のために用いることができる。

さまざまな異なる種類の製造法を採用することができる。例えば、(a)モノリス（monolith）タイプの製造、(b)粒子の研削およびサイジングによる作製、(c)沈殿重合法。

本発明者らは、レスベラトロールをベースとする一連の化合物を合成して、粗バイオプロセス供給原料に存在するであろう化合物ライブラリーを作成した。そして、これらの化合物を、植物および他の生物資源から誘導される生物活性物質のためのオーダーメードの親和性吸着剤としてのＭＩＰを創出および研究するためのテンプレートとして用いた。これらの分子はいずれも、疎水性、親水性、および他の物理化学的パラメータに基づいて、さまざまな官能特性を合成によって組み込むことができ、求められる構成を有する分子の創出に用いることができる。これらの化学種を、例えばアミノ、カルボキシル、ヒドロキシル、アルキル、またはアリールの置換基を含むバラエティに富んだ官能基と共に設計、合成、および誘導体化することによって、個々の足場の上にさまざまな点が分布していて、ＭＩＰの設計および特徴付けのためのテンプレートとして用いることができる、化合物類似体の部分集合体を創出することができる。これらの官能性は、立体的考慮および電子的考慮の両方に基づいて選択することができる。極性官能基すなわち「点」の数が増加した化合物は、ＭＩＰの空洞のプローブ化および規定においてより有益でありそうである。ＭＩＰテンプレート化プロセスの際に官能化モノマー分子との相互作用に利用可能な点の数を増加させると、任意の規定されたテンプレートに対して形成された空洞の特異性が潜在的に増加する。

本発明の方法の一般性を説明するために、本発明者らは、ポリフェノール酸（例えば、没食子酸およびフェルラ酸など）でエステル化されたステロール類およびスタノール類を、ステロール類およびスタノール類をそのまま用いる場合と比較して追加的な「点」を有するテンプレートとして用いることができることを実証した。

当業者には明らかなとおり、用いたこれらの技術は、レスベラトロール、ステロール類、およびスタノール類以外の分子に応用することができる。

したがって、第１の態様では、本発明は、化合物に対して所望のレベルの特異性を有する分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）の製造方法であって、１種以上の非共有結合部位を含むモノマーと架橋剤とをテンプレートおよびポロゲンの存在下で重合させる工程と、その後前記テンプレートを除去する工程とを含み；前記テンプレートが、前記化合物に構造的に類似しているかまたは前記化合物に構造的に類似する部分を含み；前記テンプレートが、前記モノマーの非共有結合結合部位と相補的である１種以上の非共有結合結合部位を含み；かつ、前記テンプレートが、前記化合物より多いかまたは少ない非共有結合部位を有し、これによって前記ＭＩＰが、前記化合物自体をテンプレートとして用いる場合と比較して前記化合物に対して異なるレベルの特異性を有する製造方法を提供する。

用語「非共有結合部位」は、非共有結合相互作用することができる分子の基または領域を意味する。非共有結合相互作用の例には、水素結合相互作用、π-π結合相互作用、リフシッツ力（Lifshitz force）相互作用、およびファン・デル・ワールス相互作用が含まれる。

好ましくは、非共有結合部位は、水素結合部位またはπ-π結合部位である。より好ましくは、非共有結合部位は水素結合部位である。

用語「相補的」は、テンプレート上の部位が非共有結合相互作用を介してモノマー上の部位に結合可能であること、あるいは、モノマー上の部位が非共有結合相互作用を介してテンプレート上の部位に結合可能であること意味する。

テンプレートが化合物と構造的に類似した部位を含む場合、このテンプレートの非共有結合部位は、(i)前記部位、(ii)テンプレートの残りの部分、または(iii)２個以上の非共有結合部位を有する場合には、前記部位と前記テンプレートの残りの部分の両方に位置している可能性がある。

例えば、実施例に見られるように、本発明者らは、ステロール類およびスタノール類のフェルラ酸エステルを、本発明のＭＩＰの製造に用いている。これらの化合物は、ステロールまたはスタノールに構造的に類似した部分（すなわちステロールまたはスタノール自体）を、非共有結合部位を備えた残りの分子部分と共に含む。フェルラ酸部分は２つの水素結合部位と１つのπ-π結合相互作用部位とを備えている。

１つの実施態様では、テンプレートの水素結合部位は、フェノール性ヒドロキシル基である。

別の実施態様では、モノマーの水素結合部位は、ピリジンの窒素である。

好ましい形態では、テンプレートは、１つ以上の相補的なπ-π結合相互作用部位をさらに含む。

１つの実施態様では、テンプレートのπ-π結合相互作用部位は、フェノールの芳香族環である。別の実施態様では、モノマーのπ-π結合相互作用部位は、ピリジンの芳香族環である。

本発明者らは、化合物に構造的に類似しているかまたは化合物に構造的に類似する部分を含むテンプレートであって、化合物より多い水素結合部位を含むテンプレートを用いて形成されたＭＩＰが、化合物自体をテンプレートとして用いた場合と比較して、この化合物（および非常に近い関連構造を有する化合物類）に対してより特異的となる傾向があることを見出した。これは、テンプレート上の追加的な水素結合部位が、ポリマー化前の複合体により多いモノマー単位を引きつけて、テンプレートによって形成された空洞がテンプレートにより親密に適合することによって、空洞の開口部がテンプレートの１つの結合部位がポリマー中に相補的な結合部位を全く有さないように偶然位置している場合に、可能な結合部位の損失を補うようにするからである。

したがって、１つの実施態様では、テンプレートは、化合物より多い水素結合部位を有し、これによって、ＭＩＰは、化合物自体をテンプレートとして用いた場合より高いレベルの特異性を化合物に対して有する。

さらに、ＭＩＰが、化合物に構造的に類似しているかまたは化合物に構造的に類似する部分を含むテンプレートであって、化合物より少ない水素結合部位を含むテンプレートを用いて形成された場合、このＭＩＰは、化合物自体をテンプレートとして用いた場合と比較して、この化合物に対して特異性がより低くなる傾向があることを見出した。このＭＩＰは、この化合物自体にたいして特異性がより低いが、化合物に対して、また構造的に類似した化合物類に対して、依然としてある程度の特異性を有している。これにより、複雑な供給原料から有用である可能性のある化合物の部類を抽出する手段が提供される。必要であれば、このような部類の化合物類を含む抽出混合物を、その後、さらなる精製技術（例えば、より選択的なＭＩＰを用いる抽出など）を施して、サブクラスまたは個別の分子を単離することができる。

したがって、別の実施態様では、テンプレートは、化合物より少ない水素結合部位を有し、これによって、そのＭＩＰは、化合物自体をテンプレートとして用いた場合と比較して、化合物に対して特異性がより低い。

当業者には明らかなとおり、本発明の方法によって、テンプレートとして、構造的に類似した化合物であって、水素結合部位の数がより多くなく、適切に選択された化合物を用いることによって、水素結合部位を全く有さないかまたはより少ない数有する化合物類に対して高められたレベルの特異性を示すＭＩＰを形成させることが可能になる。これによって、複雑な混合物から抽出することが他の方法では困難であった化合物を単離する有用な手段が提供される。

相対的な存在量の観点からみると、食品、精密化学、および医薬の産業における高価値製品として興味が持たれる化合物の大部分は、少なくとも１個の水素結合部位を有している可能性が高い。一部の汚染物質、とりわけ毒性化合物または有害化合物（例えば、多環芳香族類）は、水素結合部位を欠くファミリーに属する可能性が高く、したがって、これらの場合には、他のモードの分子相互作用を利用することが必要となる。当業者には明らかなとおり、水素結合を用いて採ったアプローチは、他の非共有結合のタイプに同様に適用することができ、多環芳香族類などの化合物に対して選択的なＭＩＰを設計するために用いることができる。

分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）の設計は、意図したテンプレート種と良好に相互作用して、ポリマー化前複合体がテンプレートとモノマーとの間に形成されるようにするモノマー種を選択することを必要とする。ポリマー化前複合体の分子モデリングおよびＮＭＲ分光学などのツールを試用して「仮想スクリーニング」を実施することによって、適切なモノマーを選択し、最適化されたＭＩＰの開発を達成するために必要とされる実際のポリマー合成の数を減らすことが可能になる。

第２および第３の態様の好ましい形態では、複合体の生成エネルギーを、分子モデリング技術によって評価する。
例えば、ＰＭ３構造最適化を用いて複合体の理論的な生成エネルギー値を得ることができる。

第２および第３の態様の好ましい別の形態では、生成エネルギーを、ＮＭＲ分光学技術によって評価する。例えば、フェノール性ヒドロキシル基の場合、この基の¹H NMRのシグナルの低磁場シフトのマグニチュードが、水素結合相互作用の強さの指標となる。典型的には、低磁場シフトは、約0.5 ppm〜約1.5 ppmのオーダーとなるであろうが、当業者には明らかなとおり、ＮＭＲ溶媒の選択が、このシフトのマグニチュードにおける重要なファクターとなるであろう。

好ましい形態では、モノマーは、第２の態様の方法によって選択される。

別の好ましい形態では、テンプレートに対するモノマーの比は、第３の態様の方法によって選択される。

１つの態様では、ＭＩＰの製造に用いるためのポリマー化前の水素結合した複合体であって、前記ポリマー化前複合体が、それぞれ１種以上の非共有結合部位を含む１種以上のモノマーと、テンプレートとを含み；前記テンプレートが、前記モノマーの前記１種以上の非共有結合部位と相補的である１種以上の非共有結合部位を含む、ポリマー化前複合体を提供する。

第６の態様では、モノマーを、架橋剤と共に、テンプレートおよびポロゲンの存在下で重合させる工程と、その後前記テンプレートを除去する工程とによって製造されるＭＩＰであって、前記モノマーの選択が、第２の態様の方法によって案内されるか、前記テンプレートに対する前記モノマーの比が第３の態様の方法によって選択されるＭＩＰを提供する。

本方法で用いるモノマーおよび本発明のＭＰＩには、水素結合相互作用および／またはπ-π結合相互作用を促進または容易にするものが含まれ、下記式のモノマーが含まれる：
式中、Ｒは、C_1〜4アルキル、アミド、ニトリル、カルボン酸、第一級および第二級アミン、CO₂C_1〜4アルキル、C_1〜4OH、ヒドロキシアルキルアクリレート、ベンゼン、ベンジルアミン、ナフタレン、アントラセン、ピリジン、ピリミジン、プリン、N-イミダゾールからなる群から選択され；および
式中、Ｒ’は、HおよびCH₃からなる群から選択され；
Ｒ’’は、C_1〜4アルキル、アミド、ニトリル、カルボン酸、第一級および第二級アミン、CO₂C_1〜4アルキル、C_1〜4OH、ヒドロキシアルキルメタクリレートからなる群から選択される。

好ましい形態では、モノマーは、下記からなる群から選択される：

当業者であれば、本方法における使用に好適な広範な架橋剤および本発明のＭＩＰを知っているであろう。好ましい実施態様では、架橋剤は、下記からなる群から選択される：
式中、Ｒは、アルキル鎖、好ましくは１〜４の炭素数のものである。

特定の実施態様では、モノマーおよび架橋剤は、同じ化合物であってよい。本本方法における使用に好適なポロゲンおよび本発明のＭＩＰには、水素結合相互作用を促進または容易にするもの、疎水性相互作用を促進または容易にするもの、および両者の組合せが含まれる。

水素結合の形成を促進または容易にするポロゲンには、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはこれらの組合せ、加えて、上述のものと、適切な量のエタノール、メタノール、もしくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）との混合物が含まれる。

疎水性相互作用を促進または容易にするポロゲンには、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、ＤＭＦ、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、またはこれらの組合せの水性混合物が含まれる。

フィトステロール（すなわち他の部類もしくはファミリーの化合物）については、上述したリストを拡張して、水（場合によりトリフルオロ酢酸と混合した水）をさらに含めることができる。有機溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、トルエンなど）、およびより極性の有機溶媒（例えば、イソプロパノール、第三ブチルアルコール、およびシクロヘキサノールなど）を使用することもできる。

第７の態様では、トランス-エチレン連結基を含む化合物の類似体を設計する方法であって、前記トランス-エチレン連結基を、イミン連結基、アミド連結基、または第二級アミン連結基で置き換えることを含む方法を提供する。

好ましくは、前記化合物は、レスベラトロールである。

第８の態様では、トランス-エチレン連結基を有する化合物に対して特異的であるＭＩＰを製造する方法であって、モノマーと架橋剤とをテンプレートおよびポロゲンの存在下で重合させる工程と、その後前記テンプレートを除去する工程とを含む方法を提供する。この場合において、前記テンプレートは前記化合物の類似体であり、かつ、前記類似体が、第７の態様の方法によって設計される

好ましくは、ポリフェノールまたはその類似体は、レスベラトロールまたはその類似体である。より好ましくは、ポリフェノールまたはその類似体は、レスベラトロールの類似体であって、トランス-エチレン連結基が、イミン、アミド、または第二級アミンの連結基で置き換えられたものである。特定の実施態様では、この類似体は、レスベラトロールより多いかまたは少ないヒドロキシル基を有する。より好ましい形態では、レスベラトロールの類似体は、(E)-5-[(4-ヒドロキシ-フェニルイミノ)-メチル]-ベンゼン-1,3-ジオールまたは3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミドである。

レスベラトロールのイミンおよびアミドの類似体は、レスベラトロール自体より、合成がより簡単であり、不純物が少ない。これらのテンプレートを用いて製造したＭＩＰは、レスベラトロールをテンプレートとして製造したＭＩＰと同程度の結合親和性を有することが明らかとなっている。

好ましい形態では、ＭＩＰは、レスベラトロールの単離用である。

好ましくは、レスベラトロールをテンプレートとして用いる場合、レスベラトロールと、4-ビニルピリジンとの比は、１：３である。この比は、モデリング研究によって、および経験則によって、レスベラトロールが結合しているＭＩＰに対する最適比であることが明らかとなった。同様に、イミン：(E)-5-[(4-ヒドロキシ-フェニルイミノ)-メチル]-ベンゼン-1,3-ジオールおよびアミド：3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミドと、4-ビニルピリジンとの比は、好ましくは１：３である。

さまざまな部類の化合物を、レスベラトロールのためのテンプレートとして用いることができる。これらには、
(a)カルコン：
(b) -NH-C(O)-によって結合したアミド類似体：
(c)環状システム、例えば、フラバノール類およびクマリン類など：
(d)アルカロイド類、例えば、Ｒ基で置換されている窒素含有インドールなど；
(e)他の環状類似体（例えば、下記のモデル反応からの生成物など）も適切である。
この反応は、レスベラトロールの類似体であるベンズイミダゾールを生じる。ベンズイミダゾールの各フェニル基は、さらにＲ基を有していてよい。

これらの化合物において、各Ｒは、ゼロ（０）個〜３個の置換基であってよく、それぞれ独立に、H、OH、CH₃、NH₂、SH、NO₂、COOH、C(O)NH₂、CHO、CN、NC、OCH₃、OC_1〜4アルキル、SC_1〜4アルキル、O-糖、N-糖、P(O)(OH)₂、S(O)₂(OH)、OAr、NHAr、SAr、C_1〜4アルキルAr、NHC_1〜4アルキルAr、OC(O)Ar、C(O)OAr、C(O)Ar、C(O)NAr、CF₃、OCF₃、ハロゲン、NHC_1〜4アルキル、N(C_1〜4アルキル)₂、SC_1〜4アルキル、C(O)C_1〜4アルキル、OC(O)C_1〜4アルキル、C(O)OC_1〜4アルキル、C(O)NHC_1〜4アルキル、C(O)N(C_1〜4アルキル)₂、C_1〜4アルコキシ、C_1〜4アルキレンジオキシ、P(O)(OH)₂、P(O)(OC_1〜4アルキル)₂、S(O)(OC_1〜4アルキル)₂、C(NH₂)=C(NH₂)₂、C(NH₂)=C(CN)₂、C(CN)=C(CN)₂、C(CN)=C(NH₂)₂、C(NH₂)=C(C_1〜4アルキル)₂、C(C_1〜4アルキル)=C(NH₂)₂、C(CN)=C(C_1〜4アルキル)₂、C(C_1〜4アルキル)=C(CN)₂、およびOR₁からなる群から選択される。

Ｒ_１は、H、Ac、グルコース、ガラクトース、ガレート（gallate）、フェルレート（ferulate）からなる群から選択することができる。

ＸおよびＹは、適切な置換基を指す。典型的には、HまたはC_1〜6アルキルである。クマリンの場合、ＸおよびＹは=Oであってよく、酸素を有する環は、さらなる二重結合を有していてもよい。

収束的合成法を用いて、多官能化(E)-スチルベン（レスベラトロール）類似体の小さなライブラリーの合成を確立し、最適化した。この合成手順により、コアとなる骨組みにさまざまな官能基が導入され、特異な物質組成を有する低分子量化合物のライブラリーが得られた。これまでに製造した分子のまとめを表１に示す。これらの化合物を、その飽和時フェネチル類似体と共に、分子インプリントポリマーを作製するためのテンプレートとして、およびそれらのＭＩＰの結合特性を研究するためのプローブとして用いた。

（表１）ＮＩＰ形成の際にモノマーと相互作用するための０個〜４個の「点」を有する合成したレスベラトロール類似体の構造

評価し、テンプレート化したさらなる化合物を以下に示す。実施例では、ＭＩＰテンプレートとしても、ＭＩＰ試験化合物としても用いられている。

さらに好ましい形態では、レスベラトロール類似体は、下記式Iまたは式IIの化合物である：
各Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、およびＲ_６は、独立に、H、OH、CH₃、NH₂、SH、NO₂、COOH、C(O)NH₂、CHO、CN、NC、OCH₃、OC_1〜4アルキル、SC_1〜4アルキル、O-糖、N-糖、P(O)(OH)₂、S(O)₂(OH)、OAr、NHAr、SAr、C_1〜4アルキルAr、NHC_1〜4アルキルAr、OC(O)Ar、C(O)OAr、C(O)Ar、C(O)NAr、CF₃、OCF₃、ハロゲン、NHC_1〜4アルキル、N(C_1〜4アルキル)₂、SC_1〜4アルキル、C(O)C_1〜4アルキル、OC(O)C_1〜4アルキル、C(O)OC_1〜4アルキル、C(O)NHC_1〜4アルキル、C(O)N(C_1〜4アルキル)₂、C_1〜4アルコキシ、C_1〜4アルキレンジオキシ、P(O)(OH)₂、P(O)(OC_1〜4アルキル)₂、S(O)(OC_1〜4アルキル)₂、C(NH₂)=C(NH₂)₂、C(NH₂)=C(CN)₂、C(CN)=C(CN)₂、C(CN)=C(NH₂)₂、C(NH₂)=C(C_1〜4アルキル)₂、C(C_1〜4アルキル)=C(NH₂)₂、C(CN)=C(C_1〜4アルキル)₂、C(C_1〜4アルキル)=C(CN)₂、およびOR₁から選択される。
Ｒ_１は、H、Ac、グルコース、ガラクトース、ガレート（gallate）、フェルレート（ferulate）からなる群から選択することができる。
Ｘは、CHおよびNから選択される。
但し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、およびＲ_６の少なくとも１つは、OHである。

さらに好ましくは、化合物は、式Iの化合物であり、ＸはNである。
適切な架橋剤は、上述したものである。好ましくは、架橋剤は、EDGAである。

別の好ましい形態では、重合した4-ビニルピリジンと重合した架橋剤との比は、３〜１５である。より好ましくは５である。

ＭＩＰの製造に用いるテンプレートの広範なレパートリーによって、分子選択的なＭＩＰではなく化学的分類選択的なＭＩＰの形成の可能性がもたらされるであろう。

したがって、１つの実施態様では、ＭＩＰを、１種以上の異なるポリフェノールまたはその類似体の混合物を用いてインプリンティングする。

第１０の態様では、本発明は、第９の態様のＭＩＰの製造方法であって、
(i)前記ＭＩＰを、ポリフェノールまたはその類似体、およびポロゲンの存在下で重合させる工程と、
(ii)前記ポリフェノールまたはその類似体を、前記ＭＩＰから除去する工程と
を含む方法を提供する。

好ましい形態では、

重合温度および重合を起こさせる時間の長さが重要となり得る。本発明者らは、ＭＩＰを製造するための好ましい温度範囲が50〜55℃であることを見出した。これに対し、引用した文献のインプリントポリマーは、単一の45℃（Xiangら¹）にて過剰な時間（例えば、24時間など）、あるいは単一の60℃（Maら²およびCaoら³）にて製造されている。好ましい形態では、ポロゲンは、水素結合相互作用を促進または容易にするポロゲンから選択される。

より好ましくは、ポロゲンは、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、およびジメチルホルムアミドからなる群から選択される１種以上の溶媒を含む。さらにより好ましくは、ポロゲンは、エタノール、メタノール、およびジメチルスルホキシドからなる群から選択される１種以上の溶媒をさらに含む。

好ましい形態では、ポロゲンは、アセトニトリルとエタノールとの混合物を含む。さらに好ましい形態では、アセトニトリルとエタノールとの比は５：１である。

第１１の態様では、本発明は、１種以上のポリフェノールを試料から抽出する方法であって、前記試料を本発明のＭＩＰまたは本発明の方法によって製造したＭＩＰに曝すことによる方法を提供する。
試料には、これらだけに限定されないが、農業廃棄物、農産物、化学反応混合物、または製造された化合物混合物が含まれる。

抽出は、任意の適切な手段（これらだけに限定されないが、クロマトグラフィー用カラムシステム、回分式吸着（タンク）システム、流動床／膨張床システム、メンブレン関連システム、および「ティーバッグ」タイプの分離装置）を用いて実施することができる。

好ましい形態では、試料は、食料品、例えば、ブドウ種子、ブドウ果皮、ピーナッツ、またはピーナッツミール（peanut meal）などである。

好ましい形態では、ポリフェノールはレスベラトロールである。

第１３の態様では、本発明は、ステロール類およびスタノール類、ならびにこれらの類似体または誘導体からなる群から選択される１種以上の化合物を用いてインプリンティングされたＭＩＰであって、重合したモノマーを含む、ＭＩＰを提供する。

好ましくは、モノマーは、１個以上の水素結合部位またはπ-π結合部位を有する。好ましいモノマーは、上述したものである。

１つの実施態様では、モノマーは、4-ビニルピリジン、メチルメタクリル酸、およびその例については上述した他の部類の官能性モノマーからなる群から選択される。

別の実施態様では、モノマーは、エチレングリコールジメタクリレートである。エチレングリコールジメタクリレートは架橋剤として用いられることが多いが、本発明者は、特定のＭＩＰにおける単独のモノマーとしても用いた。

好ましい形態では、ＭＩＰは、重合して架橋剤をさらに含む。
好ましい架橋剤は、上述したものである。特に好ましい架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレートである。

好ましくは、ステロールおよびスタノールは、フィトステロールおよびフィトスタノールである。

安定なステロールおよびスタノールには、コレステロール、ブラジカステロール、β-シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、β-シトスタノール、およびカンペスタノールが含まれる。

好ましくは、誘導体は、ステロールまたはスタノールのフェルラ酸エステル、例えば、γ-オリザノールの成分などである。適切な誘導体には、カンペステリルフェルレート、β-シトステリルフェルレート、シクロアルタニルフェルレート、カンペステタニフェルレート、シクロアルテニルフェルレート、および24-メチレン-シクロアルタニルフェルレートが含まれる。

好適なポロゲンは、上述したものである。好ましい形態では、ポロゲンは、クロロホルム、トリフルオロ酢酸、水、および、トリフルオロ酢酸と水との混合物からなる群から選択される。

第１５の態様では、本発明は、１種以上のステロールもしくはスタノールまたはこれらの類似体もしくは誘導体を、試料から抽出する方法であって、本発明のＭＩＰまたは本発明の方法によって製造もしくは設計したＭＩＰに曝すことによる方法を提供する。

試料には、これらだけに限定されないが、農業廃棄物、農産物、化学反応混合物、または製造された化合物混合物が含まれる。

好ましい形態では、試料は、食料品、例えば、アボカドオイル、ゴマ油、小麦油、ブドウ種子油などである。

本発明の方法およびＭＩＰにおいて、テンプレートは、非共有結合手段（例えば、π-π相互作用、ドナー-アクセプター相互作用、およびファン・デル・ワールス相互作用）によって、あるいは共有結合手段（例えば、ＭＩＰのモノマーへの共有結合）によってポリマーに組み入れることができる。

共有結合ＭＩＰからのテンプレートの除去は、当業者に好ましいことが知られている任意の手段によって達成することができる。この手段には、これらだけに限定されないが、酸加水水解、塩基加水分解、還元(NaBH₄またはLiAIH₄を使用するもの)、弱酸を用いる洗浄（金属配位結合を外すためのもの）、および、可逆的なウレタン結合を外すための熱分裂が含まれる。可逆的なウレタン結合を外すための熱分裂の手順は、ウレタン結合を高温で切断するための方法（例えば、ＤＭＳＯ中60℃など）の採用に従う。Kiおよびその共同研究者⁴によってＤＭＳＯ中180℃という厳しい条件が分子インプリントシリカ球の製造において記述されているが、この条件は上述した完全に有機ベースのモノマーの部類には適していないであろう。加えて、酵素的開裂は、例えばエステラーゼを用いて可能であると考えられる。

本発明の官能化ポリマーの研究の過程において、本発明者らは、多くの新規かつ進歩性を有する化合物を合成した。本発明の第１７の態様は、これらの新規な化合物を対象とする。

本発明の方法および組成物に用いたさまざまな化合物のリストを、下記表２および表３に示す。表中のこれらの新規な化合物は、本発明の一部を構成する。

好ましい形態では、本発明は、式Iおよび式IIの新規な化合物を提供する：
各Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、およびＲ_６は、独立に、H、OH、CH₃、NH₂、SH、NO₂、COOH、C(O)NH₂、CHO、CN、NC、OCH₃、OC_1〜4アルキル、SC_1〜4アルキル、O-糖、N-糖、P(O)(OH)₂、S(O)₂(OH)、OAr、NHAr、SAr、C_1〜4アルキルAr、NHC_1〜4アルキルAr、OC(O)Ar、C(O)OAr、C(O)Ar、C(O)NAr、CF₃、OCF₃、ハロゲン、NHC_1〜4アルキル、N(C_1〜4アルキル)₂、SC_1〜4アルキル、C(O)C_1〜4アルキル、OC(O)C_1〜4アルキル、C(O)OC_1〜4アルキル、C(O)NHC_1〜4アルキル、C(O)N(C_1〜4アルキル)₂、C_1〜4アルコキシ、C_1〜4アルキレンジオキシ、P(O)(OH)₂、P(O)(OC_1〜4アルキル)₂、S(O)(OC_1〜4アルキル)₂、C(NH₂)=C(NH₂)₂、C(NH₂)=C(CN)₂、C(CN)=C(CN)₂、C(CN)=C(NH₂)₂、C(NH₂)=C(C_1〜4アルキル)₂、C(C_1〜4アルキル)=C(NH₂)₂、C(CN)=C(C_1〜4アルキル)₂、C(C_1〜4アルキル)=C(CN)₂、およびOR₁から選択される。
Ｒ_１は、H、Ac、グルコース、ガラクトース、ガレート（gallate）、フェルレート（ferulate）からなる群から選択することができる。
Ｘは、CHおよびNから選択される。
但し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、およびＲ_６の少なくとも１つは、OHである。

さらに好ましくは、化合物は、式Iの化合物であり、ＸはNである。

第１８の態様では、２種以上の成分を含む試料の前記成分を、少なくとも部分的に分離する方法であって、前記試料を、少なくとも２種のＭＩＰに順次曝す工程を含み、各ＭＩＰが異なるテンプレートを用いてインプリンティングされたものである方法を提供する。

本発明者らは、「ティーバッグ」（すなわちＭＩＰを容易に挿入することができ、あるいは試料に「浸ける」ことができる透過性メッシュ）に入れたＭＩＰを用いて、試料から成分を抽出し、次いで取り出すことができることをさらに明らかにした。適切なメッシュには、綿をベースとする材料、Gilson(登録商標) 63μmシーブメッシュおよびSigma Aldrich 透析チューブセルロース膜(12 kDa MWCO)が含まれる。

したがって、第１９の態様では、透過性メッシュに入ったＭＩＰを提供する。ＭＩＰには、これらだけに限定されないが、本発明のＭＩＰまたは本発明の方法によって製造されるＭＩＰが含まれ得る。

第２１の態様では、(E)-5-[(4-ヒドロキシ-フェニルイミノ)-メチル]-ベンゼン-1,3-ジオールまたは3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミドを用いてインプリンティングされたＭＩＰを提供する。この場合において、ＭＩＰは、重合したモノマーを含む。

１つの実施態様では、ＭＩＰは、架橋剤を含む。

好ましくは、ＭＩＰは、レスベラトロールの抽出に用いられる。

ＭＩＰの製造に用いるモノマー、架橋剤、およびポロゲンは、本発明の他の態様に関して記述したものから選択することができる。

好ましくは、モノマーは4-ビニルピリジンであり、架橋剤はEDGAである。より好ましくは、ＭＩＰの製造に用いるテンプレートとモノマーとの比は、１：３である。

好ましくは、ＭＩＰは、１種以上の本発明の他の態様の１種以上の特徴を含む。

好ましくは、レスベラトロールを、その後ＭＩＰから洗浄するかまたは溶出させる。

本発明の態様が互いに緊密に影響し合うこと、したがって、本発明の１つの態様の特徴が本発明の別の態様に関連していることが当業者に理解されるであろう。

本発明の本質をより明確に理解可能にするために、その好ましい形態を、非限定的な実施例を参照することによって以下に記述する。

［Ａ. レスベラトロールおよびレスベラトロール類似体の合成］
多数のポリ官能化(E)-スチルベン類似体１を、その周りに新規な分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）を生成させることができるテンプレートとして合成した。これらの化合物は、その「飽和」ジフェネチル類似体２と共に、これらのＭＩＰの特性を研究するためのプローブとして使用することもできる。これらの化合物は、鍵工程がパラジウムで触媒された官能化ベンゾイルクロライド３と官能化スチレン４とのカップリングである収束的合成法を用いて合成した。最も良い結果は、酸クロライドをその親安息香酸５から新たに生成させた直後の物を用い、次いで即座に反応に用いた場合に得られた。この合成方法をスキーム１に示す。

窒素アイソスター（isostere）を生成させるための鍵カップリング工程を、下記スキーム２に示す。

ほとんどのＡＲ溶媒は、製造者から購入したままのものを使用した。但し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、４Åモレキュラーシーブで乾燥させ、トルエンはナトリウムワイヤーで無水にした。ミリＱ蒸留水を水性操作に用いた。試薬の飽和水溶液は、例えば、sat.NaHCO₃などのように記述した。水性溶液からの溶媒抽出物は、無水硫酸ナトリウムで無水にし、濾過し、次いで、低圧（10〜400 mbar）下、温度制御されたウォーターターバス中30〜35℃にてロータリーエバポレーターで乾固させた。

分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲル60F₂₅₄（Merck）でコーティングされたアルミニウムシートを用いて実施した。化合物を(i)254 nmの蛍光、および(ii)ヨウ素蒸気への曝露またはエタノール性リンモリブテン酸溶液に浸漬し、チャーが生成するまで加熱することによって可視化した。
カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル60（Merck）、0.040〜0.063 mm（230〜400メッシュ）を用いて実施した。溶出液混合物は、容積／容積で示した。

融点は、Buchi B-545融点測定装置で測定した。

プロトン核磁気共鳴（^１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルは、(i)200 MHz, Brucker AC-200スペクトロメータ、(ii) 300 MHz, Brucker DPX-300スペクトロメータ、または(iii)400 MHz, Brucker DRX-400スペクトロメータで記録した。^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、指定した重水素化溶媒中の溶液について測定した。共鳴は、以下の要素：残存溶媒ピークに対して百万分の一（ppm）で測定した化学シフト（δ）、多重度、水素数、カップリング定数（JHz）、および配置に従って帰属した。多重度は、(s)一重線、(d)二重線、(dd)二重線の二重線、(ddd) 二重線の二重線の二重線、(t)三重線、(dt)三重線の二重線、(td)二重線の三重線、(q)四重線、(m)多重線によって、適宜(b)ブロードを付けて示す。

炭素核磁気共鳴（^１Ｃ−ＮＭＲ）スペクトルは、(i)50 MHz, Brucker AC-200スペクトロメータ、(ii) 75 MHz, Brucker DPX-300スペクトロメータ、または(iii)100 MHz, Brucker DRX-400スペクトロメータで、指定した溶媒中の重水素化溶媒について記録した。

低解像度エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル（ＥＳＩ）は、Micromass PlatformII API QMSエレクトロスプレー質量分析計で記録した。分析は、正（ＥＳＩ＋）および負（ＥＳＩ−）の両方の極性で行った。主なイオンピーク（ｍ／ｚ）は、括弧内にベスピークに対する百分率で表した強度と共に記録した。高解像度エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、Brucker BioApex 47eフーリエ変換質量スペクトルで記録した。

以下の実施例により、合成方法を説明する。

［化合物の合成］
［実施例１］
1,2-ジフェニルエタン(1)：
トランススチルベンおよびメタノール中の10%Pd/Cを、一晩、95 psiにて水素化した。次いで、この反応物を、セライトのパッドを通して濾過し、その透明な濾液をロータリーエバポレーターによって濃縮した。得られた生成物を、（ヘキサンを等濃度で用いる）カラムクロマトグラフィーを用いて精製して、1,2-ジフェニルエタンを透明なオイルとして定量的に得た。これを室温に置いて固化させた。R_f 0.95 (4:1 hexane/EtOAc), 0.30 (hexane); mp 49.5-50.0°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ2.95 (s, 4H, 2 x CH₂), 7.18-7.23(m, 6H, H-2, H-4, H-6, H-2′, H-4′, H-6′), 7.28-7.33 ((m, 4H, H-3, H-5, H-3′, H-5′); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 37.18(2 x CH₂), 125.18(4,4´), 127.59(2,6,2´,6´), 127.71(3,5,3´,5´), 141.01(1,1′); LREI mass spectrum; m/z 182(M・, 100%), 183(16%), 91(51%)

［実施例２］
(E)-4-アセトキシスチルベン, [(E)- 4-アセトキシフェネテンベンゼン](2)：
蒸留直後のベンゾイルクロライド、4-アセトキシスチレン、N-エチルモルホリン、およびパラジウムジアセテート(2.00 mole%)をトルエンに添加し、この混合物を一晩120℃にて加熱した。室温まで冷却した後、酢酸エチルを添加し、溶液を0.1M HClおよび水でそれぞれ2回洗浄した。次いで、有機層を無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して茶褐色固体を得た。EtOAc/ヘキサンから再結晶させると、(E) 4-アセトキシフェネテンベンゼンがベージュ色の微細な針状晶として得られた。R_f 0.53 (2:1 hexane/EtOAc); mp 150-151°C; ¹H NMR (CDCl₃): δ2.28(s, 3H, OAc), 6.99-7.10(m, 4H), 7.21-7.26(m, 1H), 7.30-7.36(m, 2H), 7.46-7.50(m, 4H); ¹H NMR (CD₃OD): δ 2.24 (s, 3H, OAc), 7.03-7.23(m, 5H, J = 13.5 Hz, H_トランス), 7.28-7.34(m, 2H), 7.49-7.57 (m, 4H); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.13(OCOCH₃), 120.81(3,5), 125.55(2′,6′), 126.44(3′, 5′), 126.72(2 x C_トランス), 127.72(2,6), 127.99(4′), 134.18(1), 136.22(1′), 149.13(4′), 168.390(OCOCH₃); LRESI正イオン化質量スペクトル; m/z 261(MNa⁺, 100%), 293(MNa⁺⁺MeOH, 95%)

［実施例３］
(E)-4-ヒドロキシスチルベン, [(E)-4-ヒドロキシフェネテンベンゼン](3)：
水酸化カリウムのメタノール溶液を、メタノールに溶解させた4-アセトキシフェネテンベンゼンに添加した。この反応物を、アルゴン雰囲気下、65℃にて60分間加熱した。この溶液を水に注いだ後、希HClでpH 4まで酸性にした。塩化ナトリウムを添加し、溶液をEtOAcで抽出した。次いで、有機相を分離し、水で3回洗浄した後、無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して、再び薄いピンク色の固体を得た。これを、（2:1 ヘキサン／EtOAcを等濃度で用いる）カラムクロマトグラフィーによって精製して、4-ヒドロキシフェネテンベンゼンを白色固体として得た。R_f 0.42 (2:1 hexane/EtOAc); mp: 189.6-190.0°C; ¹H NMR (CDCl₃): δ4.71(s, 1H, OH), 6.79-6.82(m, 2H, J_オルト= 8.7 Hz, H2, H6), 6.93 (d, 1H, J_トランス= 16.4Hz, H_アルケン), 7.02(d, 1H, J_トランス = 16.4Hz, H_アルケン), 7.18-7.23(m, 1H, H4′), 7.29-7.32(m, 2H, H3′, H5′), 7.37-7.40(m, 2H, H3, H5), 7.44-7.47(m, 2H, H2′, H6′); LRESI負イオン化質量スペクトル; m/z 195([M-H]-, 100%), 196(16%).

［実施例４］
4-フェネチル-アセトキシベンゼン(4)：
メタノール中の(E) 4-アセトキシフェネテンベンゼンおよび10% Pd/Cを95 psiにて一晩水素化した。セライトのパッドを通して濾過すると、透明な濾液が得られ、これをロータリーエバポレーターで濃縮して粘稠なオイルを得た。グラジエント溶出カラムクロマトグラフィー(4:1 ヘキサン/EtOAc〜2:1 ヘキサン/EtOAc)によって、4-フェネチル-アセトキシベンゼンが、透明な粘稠オイルとして得られた。R_f 0.53 (2:1 ヘキサン/EtOAc); ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.26(s, 3H, OAc), 2.89(s, 4H, 2 x CH₂), 6.95-6.99(m, 2H), 7.13-7.20(m, 5H), 7.23-7.29(m, 2H); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.15(CH₃), 36.35, 36.93(2 x CH₂), 120.45(2,6), 125.11(4′), 127.48(2′,6′), 127.56(3′,5′), 128.46(3,5), 138.37(4), 140.64(1′), 148.04(1), 168.56(C=O); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 263(MNa⁺, 100%), 264(18%)

［実施例５］
4-フェネチル-フェノール(5)：
メタノール中の水酸化カリウムを、メタノール中に溶解させた4-フェネチル-アセトキシベンゼンに添加した。この反応物を、アルゴン雰囲気下、65℃にて2時間加熱した。次いで、この透明溶液を水に注ぎ、1M HClでpH 2まで酸性にし、AcOEtで抽出した。有機相を分離し、水で3回洗浄した後、無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して、再び薄いピンク色の固体を得た。これを、（2:1 ヘキサン／EtOAcを等濃度で用いる）カラムクロマトグラフィーによって精製して、4-フェネチル-フェノールを白色固体として得た。R_f 0.55 (2:1 EtOAc/ヘキサン); ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.84(s, 4H, 2 x CH₂), 6.69-6.74(m, 2H, J = 8.6 Hz, ArH_オルト), 6.99-7.04(m, 2H, J = 8.6 Hz, ArH_オルト), 7.12-7.19(m, 3H), 7.22-7.28(m, 2H); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 36.09, 37.24(2 x CH₂), 114.29(2,6), 124.99(4′), 127.42(2′,6′), 127.59(3′,5′), 128.67(3,5), 133.20(4), 140.90(1′), 152.55(1); LRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z 197([M-H]^-, 100%), 198(16%)

［実施例６］
3-アセトキシ安息香酸(6)：
3-ヒドロキシ安息香酸の酢酸エチル中の懸濁液を、氷水中で冷却し、ピリジンを添加し、反応を60分間進行させた。得られた均一な溶液を、室温にて一晩撹拌した。次いで、ギ酸およびさらなる酢酸エチルを添加し、反応物を氷水に注いだ。有機相を分離し、水で6回洗浄し、無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して白色固体を得た。この固体をEtOAc/ヘキサン (1:1)から再結晶させて、3-アセトキシ安息香酸を白色粉末として得た。R_f 0.46(2:1 EtOAc/ヘキサン); mp 133.0-133.5°C; ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.33(s, 3H, OAc), 7.34-7.38(m, 1H, H-4), 7.49(t, 1H, J_オルト = 7.8Hz, H-4), 7.84(t, 1H, J_メタ = 2.0Hz, H-2), 8.00(dt, 1H, H-6); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.00( OC(O)CH₃), 122.42(2), 126.21(4), 126.60(6), 128.56(5), 129.84(1), 149.70(3), 168.19(COCH₃), 170.27(COOH); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 203 (MNa⁺, 100%), 204(11%)

［実施例７］
(E)-4-アセトキシスチルベン, [(E)-3-アセトキシフェネテンベンゼン] (7)：
3-アセトキシ安息香酸のトルエン中の懸濁液、N,N-DMF、および塩化チオニルを、アルゴン雰囲気下、100℃にて3時間加熱した。溶媒を減圧蒸留によって除去して黄色オイルを得た。この物質を無水トルエンに溶解させ、その溶液を、減圧下、30分間超音波にかけて、溶解していたガスを除去した。スチレン、N-エチルモルホリン、およびパラジウムジアセテート(2 mole%)を添加し、この混合物を、アルゴンガス雰囲気下、120℃にて22時間加熱した。この溶液を室温に冷却し、酢酸エチルを加えた。次いで、この溶液を、0.1M HClで3回、水で2回洗浄した後、無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して茶褐色固体を得た。グラジエント溶出カラムクロマトグラフィー (9:1 ヘキサン/EtOAc〜4:1 ヘキサン/EtOAc)によって白色固体を得た。これを2:3 EtOAc/ヘキサン(50 mL)から再結晶させて、白色の微細針状晶を得た。R_f 0.45 (ヘキサン/EtOAc 9:1), 0.75 (ヘキサン/EtOAc 4:1); mp 106.5-107.0^oC; ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.30(s, 3H, OAc), 6.94-7.00(m, 1H, H-4), 7.04(d, 1H, J_トランス, = 16.4Hz, H_アルケン), 7.08(d, 1H, H_アルケン), 7.23-7.28(m, 2H), 7.30-7.37(m, 4), 7.45-7.50(m, 2H, H-2´, H-6´); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.16(OC(O)CH₃), 118.30(4), 119.68(2), 123.21(6), 125.67(2´,6´), 126.76, 126.92(2 x C_アルケン), 127.75(3´,5´), 128.61(4´), 128.84(5), 136.05(1), 138.11(1′), 150.17(3), 168.41(C=O); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 261(MNa⁺, 100%), 293((MNa⁺+MeOH, 74%); HRESI 正イオン化質量スペクトル; C₁₆H₁₄O₂Na⁺; 計算値. 239.1072.

［実施例８］
(E)-3-ヒドロキシスチルベン, [(E)- 3-ヒドロキシフェネテンベンゼン] (8)：
水酸化カリウムのメタノール溶液を、3-アセトキシスチルベンのメタノール中の懸濁液に添加した。この溶液を、アルゴン雰囲気下、70℃にて2時間加熱した。次いで、この透明溶液を、希HClを用いてｐＨ4まで酸性にした。水を添加し、ロータリーエバポレーターによって体積を沈殿物が生じ始めるまで低下させた。水をさらに添加した後、この溶液をEtOAcで4回抽出した。合わせた有機抽出液を無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して淡黄色固体を得た。これをグラジエント溶出カラムクロマトグラフィー (4:1 ヘキサン/EtOAc to 2:1 ヘキサン/EtOAc)によって精製して、(E)-3-ヒドロキシスチルベンを白色固体として得た。R_f 0.36 (4:1 ヘキサン/EtOAc), 0.74 (2:1 ヘキサン/EtOAc); mp: 125.0-125.5^oC, ¹H NMR (CD₃OD): δ 6.70-6.74(m, 1H, H-4), 7.00-7.05(m, 2H), 7.12(s, 2H), 7.16-7.28(m, 2H), 7.33-7.39(m, 2H), 7.53-7.56(m, 2H, H-2´, H-6´); ¹³C JMOD NMR (CD₃OD): δ 114.77(2), 116.60(4), 120.17(6), 128.34(2´,6´), 129.37, 130.45, 130.59(2 x C_アルケン, 4´), 130.50(3´,5´), 131.49(5), 139.61(1′), 141.05(1), 159.54(3); LRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z 195([M-H]^-, 100%), 196(16%), 391([2M-H]^-)

［実施例９］
3-フェネチル-アセトキシベンゼン (9a) および 3-フェネチルフェノール (9b)：
(E)-3-アセトキシスチルベンおよびメタノール中の10%Pd/Cの混合物を、90 psiにて一晩水素化した。セライトのパッドを通して濾過し、これをロータリーエバポレーターによって濃縮すると、再び灰色のオイルが得られた。これをグラジエント溶出カラムクロマトグラフィー (9:1 EtOAc/ヘキサン〜4:1 EtOAc/ヘキサン)によって精製して2種の主生成物、白色粉末としての3-フェネチル-アセトキシベンゼン、および白色固体としての3-フェネチルフェノールを得た。
3-フェネチル-アセトキシベンゼン; R_f 0.32 (9:1 ヘキサン/EtOAc); ¹H NMR (CDCl₃): δ δ2.30 (s, 3H, OAc), 2.96 (s, 4H, 2 x CH₂), 6.94-6.98(m, 2H), 7.05-7.08(m, 1H), 7.19-7.25(m, 3H), 7.27-7.34(m, 3H)
3-フェネチルフェノール; R_f 0.16 (9:1 ヘキサン/EtOAc); ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.83-2.95(m, 4H, 2 x CH₂), 4.84(bs, 1H, OH), 6.64-6.68(m, 2H), 6.75-6.78(m, 1H), 7.12-7.31(m, 6H)

［実施例１０］
3,5-ジアセトキシ安息香酸 (10)：
3,5-diヒドロキシ安息香酸の酢酸エチル中の懸濁液を、氷水中で冷却した。酢酸エチルおよびピリジンを添加し、反応をさらに60分間進行させた。この均一な溶液を、室温にて一晩撹拌した。ギ酸を添加した後、この溶液を氷水に注いだ。さらなる酢酸エチルを添加し、有機相を分離し、sat. NaHCO₃および水で連続的にそれぞれ2回洗浄した後、無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して白色固体を得た。EtOAc/ヘキサンから再結晶すると、3,5-ジアセトキシ安息香酸が白色粉末として生成した。R_f 0.20 (1:1 ヘキサン/EtOAc), 0.39 (3:1 ヘキサン/EtOAc); mp 161-162°C, 文献mp: 157-159^oC Turner et al, Macromolecules, 1993, 26, 4617-4623; ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.29 (s, 6H, 2 x OAc), 7.18 (pseudo t, 1H, J = 2.1 Hz, H4), 7.70 (pseudo d, 2H, J = 2.1 Hz, H2, H6); ¹³C JMOD NMR (CD3OD): δ 18.43(2 x CH3), 118.94(C4), 119.02(C2,6), 131.70(C1), 150.19(C5), 165.46(COOH), 168.17(2 x OCOCH3); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 261 (MNa⁺, 100%)

［実施例１１］
(E)-3,5-ジアセトキシスチルベン, [(E)-5-スチリル-1,3-フェニレンジアセテート] (11)：
3,5-ジアセトキシ安息香酸をトルエン中に懸濁させた。N,N-DMFおよび塩化チオニルを添加し、反応物をアルゴン雰囲気下、100℃にて3時間加熱した。溶媒を減圧蒸留によって除去して淡黄色固体を得た。これを無水トルエン中に懸濁させ、減圧下、15分間超音波にかけた。スチレン、N-エチルモルホリン、およびパラジウムジアセテート(2 mole%)を添加し、この反応混合物を、アルゴンガス雰囲気下、120℃にて一晩加熱した。室温に冷却した直後に酢酸エチルを添加し、この溶液を、0.1M HClで3回、および水で2回連続的に洗浄した後、無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して茶色固体を得た。カラムクロマトグラフィー(6:1 ヘキサン/EtOAcから出発しておよび2:1 ヘキサン/EtOAcで終わるグラジエント)によって精製して、(E)-5-スチリル-1,3-フェニレンジアセテートを白色粉末として得た。さらに、EtOAc/ヘキサンから再結晶させると、白色の微細針状晶が生成した。R_f 0.44 (4:1 ヘキサン/EtOAc); mp 90.0-90.5°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.31(s, 6H, 2 x OAc), 6.83(pseudo t, 1H, J = 2.1Hz, H-4), 7.04(d, 1H, J = 16.3Hz, H_トランス), 7.09(d, 1H, J = 16.3 Hz, H_トランス), 7.12-7.14(m, 2H, H-2, H-6), 7.25-7.30(m, 1H, H-4´), 7.34-7.39(m, 2H, H-3´, H-5´), 7.47-7.50(m, 2H, H-2´, H-6´); ¹³C JMOD NMR (CDCl3): δ 20.09(3 x CH₃), 113.32(4), 115.89(2,6), 125.73(2´, 6´), 125.98, 127.13(2 x C_トランス), 127.75(3´, 5´), 129.72(4´), 135.69(1′), 138.72(1), 150.35(3, 5), 167.93(2 x C=O); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 319(MNa⁺, 100%); HRESI 正イオン化質量スペクトル; C18H16O4Na⁺; 計算値. 319.0946, 実測値 319.0943

［実施例１２］
(E)-3,5-ジヒドロキシスチルベン, [(E)-5-スチリルベンゼン-1,3-ジオール] (12)：
水酸化カリウムのメタノール溶液を、メタノールに懸濁させた(E)-5-スチリル-1,3-フェニレンジアセテートに添加した。この溶液を、窒素雰囲気下、70℃にて100分間加熱した。室温に冷却した直後に、1M HClを添加することによって、この溶液をｐＨ3にまで酸性にし、ロータリーエバポレーターによって容積を低下させ、沈殿が生成し始めた時に濃縮を停止した。酢酸エチルを添加し、有機相を分離し、洗浄水が中性になるまで水で4回洗浄した。次いで、この有機相を無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して橙色オイルを得た。グラジエント溶出カラムクロマトグラフィー (2:1 ヘキサン/EtOAc to 1:1 ヘキサン/EtOAc)で精製して、(E)-5-スチリルベンゼン-1,3-ジオールを白色固体として得た。R_f 0.17 (ヘキサン/EtOAc 4:1), 0.62 (ヘキサン/EtOAc 1:1); mp 157.0-157.5^oC, ¹H NMR (CD₃OD): δ 6.18(pseudo t, 1H, J = 2.2Hz, H-4), 6.46 (d, 2H, J = 2.2Hz, H-2, H-6), 6.95(d, 1H, J = 16.3Hz, H_トランス), 7.01(d, 1H, J = 16.3 Hz, H_トランス), 7.15-7.21(m, 1H, H-4´), 7.26-7.32(m, 2H, H-3´, H-5´), 7.44-7.48(m, 2H, 2´, 6´); ¹³C JMOD NMR (CD₃OD): δ 100.91(4), 103.92(2,6), 125.13(2´, 6´), 126.19, 127.27, 127.48(2 x C_トランス, 4´), 127.31(3´, 5´), 136.32(1′), 138.52(1), 157.28(3, 5); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 213(MH⁺, 100%), 214(18%); HRESI 正イオン化質量スペクトル; C₁₄H₁₂O₂Na⁺; 計算値. 235.0735, 実測値 235.0729

［実施例１３］
5-フェネチル-1,3-フェニレンジアセテート(13a)および3-ヒドロキシ-5-フェネチルフェニルアセテート」(13b)：
(E)-5-スチリル-1,3-フェニレンジアセテートおよびメタノール中の10% Pd/Cの混合物を、90 psiにて一晩水素化した。セライトのパッドを通して濾過すると、透明溶液が得られた。これをロータリーエバポレーターによって濃縮して再び透明なガム状物を得た。次いで、これをグラジエント溶出カラムクロマトグラフィー (4:1 EtOAc/ヘキサン〜2:1 EtOAc/ヘキサン)にかけた。この手順によって2種の主要な生成物：(i) 5-フェネチル-1,3-フェニレンジアセテートが透明オイルとして、(ii) 3-ヒドロキシ-5-フェネチルフェニルアセテートが粘稠オイルとして得られた。
5-フェネチル-1,3-フェニレンジアセテート; R_f 0.61 (2:1 ヘキサン/EtOAc); mp 48.0-48.5°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.25 (s, 6H, 2 x OAc), 2.90 (s, 4H, 2 x CH₂), 6.75 (pseudo t, 1H, J = 2.1Hz, H-4), 6.80 (pseudo d, 2H, J = 2.1Hz, H-2, H-6), 7.13-7.30(m, 5H, H-2´, H-3´,H-4´, H-5´, H-6´); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.07(OCOCH₃), 36.26, 36.59(2 x CH₂), 112.04(4), 118.01(2,6), 125.13(4´), 127.43, 127.47(2´,3´,5´,6´), 140.16(1′), 143.21(1), 150.04(3,5), 167.99(OCOCH3); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 321(MNa⁺, 100%), 322(20%); HRESI 正イオン化質量スペクトル; C₁₈H₁₈O₄Na⁺; 計算値. 321.1103, 実測値 321.1095
3-ヒドロキシ-5-フェネチルフェニルアセテート」; R_f 0.42 (2:1 ヘキサン/EtOAc); ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.25(s, 3H, OAc), 2.79-2.91(m, 4H, 2 x CH₂), 6.41(pseudo t, 1H, J = 2.2Hz, H-4), 6.48(pseudo d, 2H, J = 2.3Hz, H-2, H-6), 7.13-7.20(m, 3H, H-2´, H-4´, H-6´), 7.23-7.29(m, 2H, H-3´, H-5´); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.19(OCOCH₃), 36.26, 36.59(2 x CH₂), 105.82(2), 112.47(4), 112.50(6), 125.04(4´), 127.42, 127.45(2´,3´,5´,6´), 140.48(1′), 143.61(5), 150.32(1), 155.66(3), 169.43(OCOCH3); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 279(MNa⁺, 100%), 280(20%)

［実施例１４］
5-フェネチルベンゼン-1,3-ジオール (14)：
メタノールに溶解させた水酸化カリウムを、5-フェネチル-1,3-フェニレンジアセテートのメタノール溶液に添加し、アルゴン雰囲気下、70℃にて150分間加熱した。室温に冷却した直後に、1M HClを添加するこのよってこの溶液をｐＨ3にまで酸性にした。ついで、この溶液を酢酸エチルで4回抽出し、合わせた抽出液を無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して褐色オイルを得た。クロマトグラフィーによって(4:1 ヘキサン/EtOAcから出発して2:1 ヘキサン/EtOAcで終了するグラジエントによって溶出させて)精製して5-フェネチルベンゼン-1,3-ジオールを透明オイルとして得た。R_f 0.36 (2:1 ヘキサン/EtOAc); ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.75-2.81(m, 2H, CH₂), 2.84-2.90(m, 2H, CH₂), 4.70(bs, 2H, 2 x OH)), 6.17(pseudo t, 1H, J = 2.2Hz, H-4), 6.22(d, 2H, J = 2.2Hz, H-2, H-6), 7.13-7.19(m, 3H, H-2´, H-4´, H-6´), 7.23-7.29(m, 2H, H-3´, H-5´); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 36.25, 36.61(2 x CH₂), 99.85(4), 107.41(2,6), 125.00(4´), 127.41(2´, 6´), 127.49(3´,5´), 140.72(1′), 144.16(1), 155.47(3,5); LRESI 負イオン化質量スペクトル m/z 213([M-H]^-, 100%), 214(14%), 427([2M-H]^-, 13%)

［実施例１５］
(E)-3,4′-ジアセトキシスチルベン, [(E)-3-(4-アセトキシスチリル)フェニルアセテート」] (15)：
無水トルエン中の3-アセトキシ安息香酸の懸濁液、N,N-DMF、および塩化チオニルをアルゴン雰囲気下、200℃にて3時間加熱した。減圧蒸留によって溶媒を除去し、得られた固体を無水トルエンに再び溶解させた後、この溶液を、減圧下、20分間超音波にかけた。4-アセトキシスチレン、N-エチルモルホリン、およびパラジウムジアセテート(2 mole%)を添加し、この混合物をアルゴンガス雰囲気下、120℃にて一晩加熱した。室温に冷却した直後に酢酸エチルを添加し、次いで0.1 M HClで3回および水で2回洗浄した後、無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して茶褐色の液体を得た。クロマトグラフィーによって(4:1 ヘキサン/EtOAcから出発して2:1 ヘキサン/EtOAcで終了するグラジエントによって溶出させて)精製して、大部分の(E)-3,4′-ジアセトキシスチルベンと、少量の4-アセトキシスチレンとを得た。EtOAc/ヘキサンから再結晶させて、(E)-3-(4-アセトキシスチリル)フェニルアセテートのみを白色雲母板結晶として得た。R_f 0.32 (4:1 ヘキサン/EtOAc), 0.59 (2:1 ヘキサン/EtOAc); mp 124.5-125.0°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.28(s, 3H, OAc), 2.29(s, 3H, OAc), 6.93-7.09(m, 5H, H-4, 2 x H_トランス, H-3´, H-5´), 7.21-7.22(m, 1H, H-2), 7.30-7.34(m, 2H, H-5, H-6), 7.45-7.50(m, 2H, H-2´, H-6´); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.11(2 x OC(O)CH₃), 118.27(4), 119.74(2), 120.86(3´,5´), 123.19(6), 126.55(2´,6´), 126.96, 127.76(2 x C_トランス), 128.61(5), 133.79(1′), 137.92(1), 149.32(4´), 150.15(3), 168.35(2 x C=O)

［実施例１６］
(E)-3,4′-ジヒドロキシスチルベン, [(E)-3,4´-(エテン-1,2-ジイル)ジフェノール] (16)：
水酸化カリウムのメタノール溶液を、メタノール中の(E)-3-(4-アセトキシスチリル)フェニルアセテートの懸濁液に添加し、アルゴン雰囲気下、70℃にて100分間加熱した。室温にまで冷却した直後に、1M HClを添加することによって、この溶液をｐＨ3にまで酸性化した。次いで、水を添加し、沈殿が生じ始めるまでロータリーエバポレーターによって容積を低下させた。さらなる水および酢酸エチルを添加し、2つの相を分離した。有機相を、水性洗浄液が中性になるまで水で3回洗浄した後、無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮してクリーム色の固体を得た。クロマトグラフィーによって(2:1 ヘキサン/EtOAcから出発して1:1 ヘキサン/EtOAcで終了するグラジエントによって溶出させて)精製して、(E)-3,4´-(エテン-1,2-ジイル)ジフェノールをクリーム色の粉末として得た。R_f 0.35 (2:1 ヘキサン/EtOAc); mp 213.0-213.5^oC, ¹H NMR (CD₃OD): δ 6.60-6.63(m, 1H, H-2), 6.74 (d, 2H, J_オルト = 8.7Hz, H-3´, H-3´), 6.85(d, 1H, J = 16.3Hz, H_トランス), 6.89-6.94(m, 2H, H-4, H-6), 6.98(d, 1H, J = 16.3 Hz, H_トランス), 7.09(pseudo t, 1H, J_オルト = 7.9Hz, H-5), 7.33(d, 2H, H-2´, H-6´); ¹³C JMOD NMR (CD₃OD): δ 111.21(2), 112.79(4), 114.15(3´, 5´), 116.68(6), 124.51(5), 126.49(2´, 6´), 127.14(C_トランス), 128.12(1′), 128.22(C_トランス), 138.35(1), 155.90(4´), 156.20(3); LRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z 211([M-H]^-, 100%), 212(13%); HRESI 正イオン化質量スペクトル; C₁₄H₁₂O₂Na⁺; 計算値. 235.0735, 実測値 235.0730

［実施例１７］
3-(4-アセトキシフェニルエチル)フェニルアセテート」 (17)：
(E)-3,4´-(エテン-1,2-ジイル)ジフェノールおよびメタノール中の10% Pd/Cの混合物を、85 psiにて一晩水素化した。セライトのプラグを通す濾過によって透明な溶液が得られ、この溶液をロータリーエバポレーターで濃縮して透明の粘稠オイルが得られた。この物質を、2:1 ヘキサン/EtOAcを用いて等濃度のカラムクロマトグラフィーにかけることによって精製して、3-(4-アセトキシフェニルエチル)フェニルアセテートを透明な粘稠オイルとして得た。この物質は、室温で一晩置くとゆっくりと固化した。R_f 0.69 (2:1 ヘキサン/EtOAc); mp 69.5-70.0°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.259 (s, 3H, OAc), 2.263 (s, 3H, OAc), 2.89 (s, 4H, 2 x CH₂), 6.88-6.92 (m, 2H, H-4, H-6), 6.94-7.02(m, 3H, J_オルト = 8.6Hz, H-2, H-3´, H-5´), 7.12-7.16(m, 2H, H-2´, H-6´), 7.22-7.28(m, 1H, H-5); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.07(2 x OCOCH₃), 35.91, 36.55(2 x CH₂), 118.23(4), 120.38(3´,5´), 120,96(2), 124.99(6), 128.30(5), 128.38(2´, 6´), 137.96(1′), 142.25(1), 148.03(4´), 149.85(3), 168.43, 168.51(2 x OCOCH3); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 321(MNa⁺, 100%), 299(MH⁺, 10%)

［実施例１８］
3,4´-(エタン-1,2-ジイル)ジフェノール (18)：
メタノール中の水酸化カリウムを、メタノール中に懸濁させた3-(4-アセトキシフェニルエチル)フェニルアセテートに添加し、アルゴン雰囲気下、80℃にて2時間加熱した。室温に冷却した直後に、1 M HClを添加することによってｐＨ3にまで酸性化した。次いで、水を添加し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して容積を低下させた。次いで、この溶液を酢酸エチルで3回抽出し、合わせた抽出液を無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して粘稠な黄色オイルを得た。この物質を、2:1 ヘキサン/EtOAcを用いて等濃度のカラムクロマトグラフィーにかけることによって精製して、3,4´-(エタン-1,2-ジイル)ジフェノールを透明な粘稠オイルとして得た。R_f 0.41 (2:1 ヘキサン/EtOAc); mp 108.0-108.5°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.84(s, 4H, 2 x CH₂), 4.60(s, 1H, OH), 4.65(s, 1H, OH), 6.63-6.78(m, 5H, H-2, H-4, H-6, H-3´, H-5´), 7.00-7.07(m, 2H, , H-2´, H-6´), 7.10-7.18(m, 1H, H-5); ¹H NMR (CD₃OD): δ 2.79(s, 4H, 2 x CH₂), 6.58-6.73(m, 5H, H-2, H-4, H-6, H-3´, H-5´),6.97-7.02(m, 2H, , H-2´, H-6´), 7.15-7.10(m, 1H, H-5); ¹³C JMOD NMR (CD₃OD): δ 34.19, 35.45(2 x CH₂), 109.81(4), 112.13(3´,5´), 112.52(2), 117.17(5), 126.38(6), 126.56(2´, 6´), 130.24(1′), 140.94(1), 152.24(4´), 154.13(3); LRESI 負イオン化質量スペクトル m/z 213([M-H]^-, 100%), 427([2M-H]^-, 66%)

［実施例１９］
(E)-3,5-ジメチル-4′-アセトキシスチルベン, [(E)-4-(3,5- ジメチルスチリル)フェニルアセテート」] (19)：
3,5-ジメチル安息香酸を無水トルエン中に懸濁させた。N,N-DMFおよび塩化チオニルを添加し、アルゴン雰囲気下、この反応物を100℃にて3時間加熱した。室温に冷却した直後に、溶媒を減圧蒸留によって除去した。残った黄色オイルをトルエンに溶解させ、減圧下でこの溶液を超音波にかけた。4-アセトキシスチレン、N-エチルモルホリン、およびパラジウムジアセテート(2 mole%)を添加し、この混合物を120℃にて一晩加熱した。室温に冷却した直後に、酢酸エチルを添加し、この溶液を0.1M HClで3回および水で2回順次洗浄し、無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して茶褐色オイルを得た。グラジエント溶出カラムクロマトグラフィー (9:1 ヘキサン/EtOAc〜7:1 ヘキサン/EtOAc)によって精製して、主生成物としての4-アセトキシスチレンと、第二の生成物としてのクリーム色固体とを得た。次いで、この固体をヘキサンで処理して(E)-4-(3,5-ジメチルスチリル)フェニルアセテートを白色固体として得た。この生成物をヘキサンを再結晶させると、半透明の微細針状晶が生成した。R_f 0.34 (9:1 ヘキサン/EtOAc), 0.59 (2:1 ヘキサン/EtOAc); mp 84.9-85.0°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.28(s, 3H, OAc), 2.31(s, 6H, 2 x CH₃), 6.89(bs, 1H, H4), 6.97(d, 1H, J = 16.4Hz, H_トランス), 7.02-7.07(m, 3H, H3′, H5′, H_トランス), 7.10(bs, 2H, 2,6), 7.45-7.50(m, 2H, J_オルト = 8.7Hz, H2′, H6′); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.12(OCOCH₃), 20.32(2 x CH₃), 120.79(3′, 5′), 123.49(2,6), 128.20, 128.55(4, 2 x C_アルケン), 134.38((1′), 136.14(1), 137.14(3,5), 149.02(4′), 168.40(3 x C=O); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 555(2M+Na⁺, 14%), 321(MNa⁺+MeOH, 53%), 289(MNa⁺, 100%), 267(MH⁺, 12%)

［実施例２０］
(E)-3,5-ジメチル-4′-ヒドロキシスチルベン, [(E)-4-(3,5-ジメチルスチリル)フェノール] (20)：
水酸化カリウムのメタノール溶液を、メタノールに溶解させた(E)-4-(3,5-ジメチルスチリル)フェニルアセテートに添加し、窒素雰囲気下、65℃にて2時間加熱した。次いで、この溶液を氷水に注いだ後、1M HClを用いてｐＨ3にまで酸性化した。合わせた抽出液を無水にし、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して黄色固体を得た。フラッシュクロマトグラフィーによって（9:1 ヘキサン/EtOAcから出発して4:1 ヘキサン/EtOAcで終了するグラジエントによって）精製して、(E)-4-(3,5-ジメチルスチリル)フェノールが白色粉末として得られた。R_f 0.29 (4:1 ヘキサン/EtOAc); mp: 142.0-142.2°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.31(s, 6H, 2 x CH₃), 4.66(s, 1H, OH), 6.77-6.81(m, 2H, J_オルト = 8.7Hz, 3′,5′), 6.86(bs, 1H, 4), 6.88(d, 1H, J_トランス = 16.1Hz, alkene), 7.00(d, 1H, alkene), 7.08(s, 2H, 2,6), 7.34-7.39(m, 2H, 2′,6′); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 19.25(2 x CH₃), 114.22(3′, 5′), 122.82(2,6), 124.88(C_アルケン), 126.55(2′, 6′), 126.72(C_アルケン), 127.43(4), 128.39(1′), 136.58(3,5), 136.66(1), 155.74(4′); LRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z 223([M-H]^-, 100%), 224(18%); HRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z [M-H]^- 計算値. 223.1123, 実測値 223.1126

［実施例２１］
4-(3,5-ジメチルフェネチル)フェニルアセテート (21)：
(E)-4-(3,5-ジメチルスチリル)フェニルアセテートおよびメタノール中の10% Pd/Cを、90 psiにて一晩水素化した。セライトのパッドを通してろ過すると、透明な溶液が得られ、これをロータリーエバポレーターで濃縮して粘稠オイルが得られた。グラジエント溶出カラムクロマトグラフィー(9:1 EtOAc/ヘキサン to 4:1 EtOAc/ヘキサン)によって精製して、4-(3,5-ジメチルフェネチル)フェニルアセテートが粘稠なオイルとして得られた。R_f 0.64 (2:1 ヘキサン/EtOAc), 0.32 (4:1 ヘキサン/EtOAc), 0.18 (9:1 ヘキサン/EtOAc); ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.267, 2.270, 2.271(3 x s, 9H, 2 x CH₃, OAc), 2.77-2.90(m, 4H, 2 x CH₂), 6.79(bs, 2H, 2,6), 6.82 (bs, 1H, 4), 6.95-7.00(m, 2H, J_オルト = 8.6Hz, 2′,6′), 7.14-7.19(m, 2H, 3′,5′); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.13(OCOCH₃), 20.40(2 x CH₃), 36.52, 36.92 (2 x CH₂), 120.47(3′, 5′), 125.44(2, 6), 126.78(4), 136.89(3,5), 138.65(1′), 140.64(1), 148.06(4′), 168.57(OCOCH₃); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 291(MNa⁺, 100%), 292(20%), 269(MH⁺, 5%)

［実施例２２］
4-(3,5-ジメチルフェネチル)フェノール (22)：
水酸化カリウムんのメタノール溶液を、メタノールに溶解させた4-(3,5-ジメチルフェネチル)フェニルアセテートに添加し、アルゴン雰囲気下、65℃にて3時間加熱した。ロータリーエバポレーターによって濃縮して容積を低下させ、濃縮液を水に注いだ後、ｐＨ3にまで酸性にし、EtOAcで3回抽出した。次いで、合わせた抽出液を無水にし、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して透明な粘稠オイルを得た。クロマトグラフィーによって（9:1 ヘキサン/EtOAcから出発して4:1 ヘキサン/EtOAcで終了するグラジエントによって）精製して、4-(3,5-ジメチルフェネチル)フェノールを透明な粘稠オイルとして得た。R_f 0.71 (2:1 EtOAc/ヘキサン), 0.59 (2:1 ヘキサン/EtOAc), 0.39 (4:1 ヘキサン/EtOAc); ¹H NMR (CD₃OD): δ 2.28(s, 4H, 2 x CH₃), 2.78-2.84(m, 1H, 2 x CH₂), 4.59(bs, 1H, OH), 6.71-6.76(m, 2H, J_オルト = 8.5Hz, 2,6), 6.80(bs, 2H, 2′,5′), 6.82(bs, 1H, 4′), 7.03-7.07(m, 2H, 3,5); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.57(2 x CH₃), 36.42, 37.36(2 x C_アルケン), 114.64(3,5), 125.65(2′,6′), 126.88(4′), 128.86(2,6), 133.72(1), 137.06(3′, 5′), 141.14(1′), 152.67(4); LRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z 225([M-H]^-, 100%), 226(17%); HRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z MH⁺ 計算値. 227.1436, 実測値 227.1438

［実施例２３］
3,5-ジアセトキシベンゾイルクロライド (23)：
3,5-ジアセトキシ安息香酸のトルエン中の懸濁液、N,N-DMF、および塩化チオニルを、窒素雰囲気下、100℃にて3時間加熱した。減圧蒸留によって溶媒を除去し、残った粘稠な液体をヘキサンで処理して黄色固体を析出させた。ロータリーエバポレーターによってヘキサンを除去し、淡黄色粉末を得た。この化合物は、即座に反応に用いた。R_f 0.88 (2:1 EtOAc/ヘキサン). R_f 0.88 (2:1 EtOAc/ヘキサン)

［実施例２４］
(E)-3, 4′,5- トリアセトキシスチルベン, [(E)-5-(4-アセトキシスチリル)-1,3-フェニレンジアセテート] (24)：
3,5-ジアセトキシベンゾイルクロライド、4-アセトキシスチレン、N-エチルモルホリン、およびパラジウムジアセテート(0.45 mole%)を、無水トルエン(20 mL)に溶解させ、窒素雰囲気下、120℃にて一晩加熱した。室温にまで冷却した直後に、酢酸エチルを添加し、反応液を0.1M HClおよび水でそれぞれ2回洗浄した後、無水にし、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して茶褐色固体を得た。1:1 ヘキサン/Et₂Oの等濃度の溶出液を用いるクロマトグラフィーによって精製すると、白色固体が得られた。この物質をグラジエントクロマトグラフィー(4:1 ヘキサン/EtOAc〜2:1 ヘキサン/EtOAc)によって精製して、E-5-(4-アセトキシスチリル)-1,3-フェニレンジアセテートを白色固体として得た。
R_f 0.29 (2:1 ヘキサン/EtOAc); mp 112.5-113.0^oC, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.27(s, 9H, 3 x OAc), 6.80(pseudo t, 1H, J = 2.1Hz, 4′), 6.93(d, 1H, J = 16.3Hz, H_トランス), 7.03(d, 1H, J = 16.3 Hz, H_トランス), 7.04-7.09(m, 4H, 3,5,2′,6′), 7.44-7.47(m, 2H, 2,6); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.07(3 x CH₃), 113.39(4′), 115.88(2′,6′), 120.88(3,5), 126.19, 126.64, 128.64(2 x C_トランス, 2, 6), 133.45(1), 138.53(1′), 149.46(4), 150.34(3′, 5′), 167.91, 168.30(3 x C=O); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 377 (MNa⁺, 100%), 378 (21%)

［実施例２５］
(E)-3, 4′,5- トリアセトキシスチルベン, (E)-5-(4-アセトキシスチリル)-1,3-フェニレンジアセテート (25)：
3,5-ジアセトキシ安息香酸、N,N-DMF、および塩化チオニルの無水トルエン中の混合物を、アルゴン雰囲気下、100℃にて3時間加熱した。溶媒を、減圧蒸留によって除去し、次いで、この固体状の白色残渣を無水トルエンに懸濁させ、減圧下で超音波にかけた。4-アセトキシスチレン、N-エチルモルホリン、およびパラジウムジアセテート(2.0 mole%)を添加し、この混合物を120℃にて一晩加熱した。室温に冷却した直後に、酢酸エチルを添加し、この溶液を0.1M HClで3回洗浄した後、無水にし、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して茶褐色固体を得た。グラジエント溶出カラムクロマトグラフィー(2:1 ヘキサン/EtOAc〜100% EtOAc)によって精製して、(E)-5-(4-アセトキシスチリル)-1,3-フェニレンジアセテートを白色固体として得た。R_f 0.29 (2:1 ヘキサン/EtOAc); mp 112.5-113.0°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.27(s, 9H, 3 x OAc), 6.80(pseudo t, 1H, J = 2.1Hz, 4′), 6.93(d, 1H, J = 16.3Hz, H_トランス), 7.03(d, 1H, J = 16.3 Hz, H_トランス), 7.04-7.09(m, 4H, 3,5,2′,6′), 7.44-7.47(m, 2H, 2,6); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.07(3 x CH₃), 113.39(4′), 115.88(2′,6′), 120.88(3,5), 126.19, 126.64, 128.64(2 x C_トランス, 2, 6), 133.45(1), 138.53(1′), 149.46(4), 150.34(3′, 5′), 167.91, 168.30(3 x C=O); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 377 (MNa⁺, 100%), 378 (21%)

［実施例２６］
(E)-3, 4′,5- トリアセトキシスチルベン, (E)-5-(4-アセトキシスチリル)-1,3-フェニレンジアセテート (26)：
3,5-ジアセトキシベンゾイルクロライド、4-アセトキシスチレン、N-エチルモルホリン、およびパラジウムジアセテート(0.45 mole%)を、無水トルエンに溶解させ、窒素雰囲気下、120℃にて一晩加熱した。室温に冷却した直後に、酢酸エチルを添加し、反応液を0.1M HClで2回、次いで水で洗浄した、無水にし、ろ過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して茶褐色固体を得た。(1:1 ヘキサン/Et₂O)の等濃度の溶出液を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色固体を得た。この物質を、グラジエント溶出クロマトグラフィー(4:1 ヘキサン/EtOAc〜2:1 ヘキサン/EtOAc)によって精製して、(E)-5-(4-アセトキシスチリル)-1,3-フェニレンジアセテートを白色固体として得た。R_f 0.29 (2:1 ヘキサン/EtOAc); mp 112.5-113.0^oC, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.27(s, 9H, 3 x OAc), 6.80(pseudo t, 1H, J = 2.1Hz, 4′), 6.93(d, 1H, J = 16.3Hz, H_トランス), 7.03(d, 1H, J = 16.3 Hz, H_トランス), 7.04-7.09(m, 4H, 3,5,2′,6′), 7.44-7.47(m, 2H, 2,6); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.07(3 x CH₃), 113.39(4′), 115.88(2′,6′), 120.88(3,5), 126.19, 126.64, 128.64(2 x C_トランス, 2, 6), 133.45(1), 138.53(1′), 149.46(4), 150.34(3′, 5′), 167.91, 168.30(3 x C=O); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 377 (MNa⁺, 100%), 378 (21%)

［実施例２７］
(E)-5-(4-ヒドロキシスチリル)ベンゼン-1,3-ジオール (27)：
メタノールに溶解させた水酸化カリウムを、メタノールに懸濁させた(E)-5-(4-アセトキシスチリル)-1,3-フェニレンジアセテートに添加し、窒素雰囲気下、65℃にて1時間加熱した。容積を、ロータリーエバポレーターによって濃縮し、次いで、この溶液を、1M HClを添加することによってｐＨ3にまで酸性にした。酢酸エチルを添加した後、この溶液を飽和塩水で3回洗浄した後、無水にし、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して暗赤色固体を得た。EtOAcを等濃度の溶出液として用いるカラムクロマトグラフィー(0,040-0,063 mm SiO₂)によって精製して、(E)-5-(4-ヒドロキシスチリル)ベンゼン-1,3-ジオールを淡いベージュ色の固体として得た。R_f 0.65 (EtOAc); ¹H NMR (CD₃OD): δ 6.13(pseudo t, 1H, J = 2.2 Hz, 4), 6.41-6.42(m, 2H, 2,6), 6.71-6.79(m, 3H, H_トランス, 3′,5′), 6.93(d, 1H, J = 16.3Hz, H_トランス), 7.29-7.36(m, 2H, J_オルト = 8.6Hz, 2′,6′). ¹³C JMOD NMR (CD₃OD): δ. LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 229(MH⁺, 100%), 230(23%)

［実施例２８］
4-(3,5-ジアセトキシフェネチル)-アセトキシベンゼン：
(E)-4-(3,5-ジアセトキシフェネチレン)-アセトキシベンゼンおよびメタノール中の10% Pd/Cの混合物を、95 psiにて一晩水素化した。セライトのパッドを通してろ過すると、透明な溶液が得られ、これをロータリーエバポレーターで濃縮して粘稠なオイルを得た。2:1 EtOAc/ヘキサンを等濃度の溶出液として用いるカラムクロマトグラフィー(0,040-0,063 mm SiO₂)によって精製して、4-(3,5-ジアセトキシフェネチル)-アセトキシベンゼンを透明粘稠オイルとして得た。これは、室温に置くと、白色固体に固化した。R_f 0.68 (2:1 EtOAc/ヘキサン), 0.52 (2:1 Et₂O/ヘキサン); mp 52.0-52.5°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.25(s, 6H, 2 x OAc), 2.26(s, 3H, OAc), 2.88(s, 4H, 2 x CH₂), 6.75-6.77(m, 3H), 6.95-6.98(m, 2H, J_オルト = 8.4 Hz, ArH), 7.12-7.14(m, 2H, ArH); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.03(3 x CH₃), 35.57, 36.47 (2 x CH₂), 112.08(4′), 118.00(3,5), 120.46(2′,6′), 128.33(2, 6), 137.64(1), 142.91(1′), 148.02(4), 150.01(3′, 5′), 167.98, 168.53(3 x C=O); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 379 (MNa⁺, 100%), 380 (21%)

［実施例２９］
4-(3,5-ジヒドロキシフェネチル)-フェノール (29)：
メタノール中の水酸化カリウム溶液を、メタノール中の4-(3,5-ジアセトキシフェネチル)-アセトキシベンゼンに添加し、次いで、アルゴン雰囲気下、65℃にて30分間加熱した。次いで、この溶液を水に注ぎ、1M HClでｐＨ4にまで酸性にした。NaClを添加し、この溶液をEtOAcで抽出した。有機相を分離し、飽和塩水で2回洗浄した後、無水Na₂SO₄で無水にし、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して橙色固体を得た。2:1 EtOAc/ヘキサンを用いる等濃度のカラムクロマトグラフィーによって精製して、4-(3,5-diaヒドロキシフェネチル)-フェノールを白色固体として得た。R_f 0.44 (2:1 EtOAc/ヘキサン); Mp: 160.5-161.0^oC, ¹H NMR (CD₃OD): δ 2.61-2.75(m, 4H, 2 x CH₂), 6.05(擬 t, 1H, J = 2.2 Hz, 4′), 6.09-6.10(m, 2H, 2′,6′), 6.61-6.66(m, 2H, J_オルト = 8.6 Hz, 3,5), 6.91-6.96(m, 2H, 2,6); ¹³C JMOD NMR (CD₃OD): δ 35.56, 37.08(2 x CH₂), 98.81(4′), 105.82(2′,6′), 113.66(3,5), 128.01(2, 6), 131.82(1), 143.33(1′), 153.85(4), 156.80(3′, 5′); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 231(MH⁺, 100%), 232(12%), 253 (MNa⁺, 11%); HRESI 正イオン化質量スペクトル; MH⁺ 計算値. 231.1021, 実測値 231.1014

［実施例３０］
(E)-3,5-ジニトロ-4′-アセトキシスチルベン, (E)-4-(3,5-ジニトロスチリル)フェニルアセテート」 (30)：
3,5-ジニトロベンゾイルクロライド、4-アセトキシスチレン、N-エチルモルホリン、およびパラジウムジアセテート(2 mole%)を、無水トルエンに添加し、アルゴンガス雰囲気下、120℃にて一晩加熱した。室温に冷却した直後に、酢酸エチルを添加し、この溶液を0.1M HClで4回、水で2回洗浄した。次いで、有機相を無水Na₂SO₄で無水にし、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して暗褐色固体を得た。この物質をCH₂Cl₂に懸濁させ、シリカを添加した後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。次いで、残った粉末をカラム上に薄い厚さで担持させ、CH₂Cl₂を用いて等濃度で溶出させるクロマトグラフィー(0,040-0,063 mm SiO₂)によって精製して、(E)-4-(3,5-ジニトロスチリル)フェニルアセテートを明るい黄色固体として得た。R_f 0.42 (CH₂Cl₂); mp, 217.5-218.0°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.30(s, 3H, OAc), 7.08-7.17(m, 3H, H_3´, H_5´), 7.32(d, 1H, J_トランス = 16.3Hz, H_アルケン), 7.54-7.58(m, 2H, J_オルト = 8.5 Hz, H_2´, H_6´), 8.60-8.61(m, 2H, J_メタ = 2.0Hz, H₂, H₆), 8.87(擬 t, 1H, H₄); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 20.31(CH₃), 115.92(4); 121.75(3′, 5′), 124.22(C_アルケン), 125.48(2,6), 127.66(2′,6′), 132.42(C_アルケン), 133.15(1′), 140.39(1), 148.05(3,5), 150.28(4′), 168.55(CO); EI MS: m/z 328(M+, 6%), 286(100%), 147(30%)

［実施例３１］
(E)-3,5-ジニトロ-4′-ヒドロキシスチルベン, (E)-4-(3,5-ジニトロスチリル)フェノール) (31)：
水酸化カリウムのメタノール溶液を、メタノールに懸濁させた(E)-4-(3,5-ジニトロスチリル)フェニルアセテートに添加し、アルゴン雰囲気下、65℃にて2時間加熱した。この反応溶液の容積を、ロータリーエバポレーターによって濃縮して半分にした後、氷水に注ぎ、1M HClを用いてｐＨ3にまで酸性にした。次いで、残った明るい黄色固体を、酢酸エチルで抽出し、有機相を取り出し、水で3回洗浄した。抽出液を無水Na₂SO₄で無水にした後、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して明るい橙色粉末を得た。R_f 0.31 (CH₂Cl₂); ¹H NMR (CD₃OD): δ 6.79(m, 2H, J_オルト = 8.5 Hz, H_3´, H_5´), 7.16(d, 1H, J_トランス = 16.2Hz, H_アルケン), 7.40-7.49(m, 3H, H_アルケン, H_2´, H_6´), 8.67-8.69(m, 2H, H₂, H₆), 8.73(m, 1H, H₄); ¹³C JMOD NMR (CD₃OD): δ. ESI MS: m/z 286(100%), 147(53%)

［実施例３２］
(E)-5-[(4-ヒドロキシ-フェニルイミノ)-メチル]-ベンゼン-1,3-ジオール (32)：
3,5-diヒドロキシベンズアルデヒド、4-アミノフェノール、および無水硫酸ナトリウムのジクロロメタン中の混合物を、室温にて3時間激しく撹拌した。さらなる無水硫酸ナトリウムを添加し、1時間撹拌を続けた。ロータリーエバポレーターによって濃縮してジクロロメタンを除去した。残った白色粉末を、沸騰したエタノールに懸濁させ、次いで減圧ろ過によって除去した。回収した固体をさらに沸騰エタノールで洗浄した。透明な濾液を合わせて、ロータリーエバポレーターによって濃縮して(E)-5-[(4-ヒドロキシ-フェニルイミノ)-メチル]-ベンゼン-1,3-ジオールを薄いピンク色の固体として得た。文献(WO 2006/108864 A2) 162°C (分解); ¹H NMR (d₆-DMSO): δ 6.36(擬 t, 1H, J = 2.2Hz, H-4), 6.80-6.85(m, 4H, H-2, H-6, H-3´, H-5´), 7.16-7.22(m, 2H, J_オルト = 8.8Hz, H-2´, H-6´), 8.43 (s, 1H, imine-H), 9.47 (bs, 3H, 3 x フェノールic-OH); ¹³C JMOD NMR (d₆-DMSO): δ 106.27(4), 107.41(2,6), 116.70(3´,5´), 123.42(2´,6´), 139.35(1), 143.61(1′), 157.16(4′), 158.38(imine-C), 159.62(3,5); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 230(MH⁺, 100%), 231(13%); HRESI 正イオン化質量スペクトル;C₁₃H₁₁NO₃Na⁺; 計算値. 252.0637, 実測値 252.0633

［実施例３３］
3,4,5-トリアセトキシ安息香酸 (33)：
3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸の酢酸エチル中の懸濁液を、氷水中で冷却した後、無水酢酸およびピリジンを添加した。この反応を45分間進行させた後、この溶液を3時間加熱還流させた。次いで、さらなる無水酢酸を添加し、この溶液を室温にて一晩撹拌した。ギ酸を添加し、溶液を氷水に注いだ。有機相を取り出した後、at. NaHCO₃で3回、水で2回洗浄し、無水にし、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して白色固体を得た。1:1 EtOAc/ヘキサンから再結晶させて、3,4,5-トリアセトキシ安息香酸を白色粉末として得た。R_f 0.47 (EtOAc); mp 167.5-168.0°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.279 (s, 6H, 2 x OAc), 2.284 (s, 3H, OAc), 7.84 (s, 2H, arom); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ. LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 319(M+Na⁺, 100%), 負イオン化質量スペクトル; m/z 295([M-H]^-, 100%)

［実施例３４］
(E)-3,4,5,4′-テトラアセトキシスチルベン[(E)-5-(4-アセトキシスチリル)ベンゼン-1,2,3-トリylトリアセテート] (34)：
3,4,5-トリアセトキシ安息香酸をトルエンに懸濁させた。N,N-DMFおよび塩化チオニルを添加し、反応物をアルゴン雰囲気下、100℃にて3時間加熱した。溶媒を減圧蒸留によって除去して淡黄色固体を得た。この酸クロライドを無水トルエンに懸濁させ、この混合物を減圧下で30分間超音波にかけた。4-アセトキシスチレン、N-エチルモルホリン、およびパラジウムジアセテート(2 mole%)を添加し、この混合物をアルゴン雰囲気下、120℃にて一晩加熱した。室温に冷却した直後に、酢酸エチルを添加し、この溶液を水で1回、0.1M HClで3回、再び水で順次洗浄した後、無水にし、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して暗褐色の粘稠オイルを得た。グラジエント溶出カラムクロマトグラフィー(無水ヘキサン〜無水EtOAc)によって精製して、4-アセトキシスチレンを分離して回収し、(E)-3,4,5,4′-テトラアセトキシスチルベンを得た。(E)-3,4,5,4′-テトラアセトキシスチルベンを、ヘキサン:酢酸エチル(3:2)から再結晶させて、(E)-3,4,5,4′-テトラアセトキシスチルベンを白色針状晶として得た。R_f 0.49 (1:1 ヘキサン/EtOAc), 0.23 (2:1 ヘキサン/EtOAc); mp 162.5-163.0°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.26(s, 3H, OAc), 2.27(s, 6H, 2 x OAc), 2.28(s, 3H, OAc), 6.91(d, 1H, J = 16.2Hz, H_トランス), 6.99(d, 1H, H_トランス), 7.04-7.08(m, 2H, J_オルト = 8.6Hz, J_メタ = 1.9Hz, H-3′, H-5′), 7.20(bs, 2H, H-2, H-6), 7.42-7.47(m, 2H, H-2′, H-6′); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 19.12, 19.62, 20.08(OCOCH₃), 117.45(2,6), 120.87(3′,5′), 125.65(C_アルケン), 126.64(2′,6′), 128.70(C_アルケン), 132.76(1), 133.39(4), 134.89((1′), 142.61(3,5), 149.47(4′), 165.99, 166.82, 168.30(OCOCH₃); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 435 (MNa⁺, 100%); HRESI 正イオン化質量スペクトル; 計算値ulated for m/z C₂₂H₂₀O₈Na⁺, 435.1056, 実測値 435.1061

［実施例３５］
(E)-3,4,5,4´-テトラヒドロキシスチルベン[(E)-5-(4-ヒドロキシスチリル)ベンゼン-1,2,3-トリオール] (35)：
p-トルエンスルホン酸一水和物(4 mg, 0.021 mmol)のメタノール(9 mL)中の溶液を、メタノール(9 mL)に懸濁させた(E)-3,4,5,4´-テトラアセトキシスチルベン (150mg, 0.3623 mmol)に添加した。この反応物を、アルゴン雰囲気下、4時間加熱還流させた。溶媒を、ロータリーエバポレーターによって除去した後、残ったピンク色固体をヘキサンによって結晶化させた。この固体をろ過によって取り出し、空気乾燥させて、ピンク色粉末を得た。グラジエント溶出カラムクロマトグラフィー(2:1 EtOAc/ヘキサン〜無水EtOAc)によって精製して、(E)-3,4,5,4´-テトラヒドロキシスチルベンを淡黄色粉末として得た。R_f 0.34 (2:1 EtOAc/ヘキサン); ¹H NMR (CD₃OD): δ 6.50 (bs, 2H, H-2, H-6), 6.70(d, 1H, J_トランス =16.2Hz, H_アルケン), 6.69-6.76 (m, 2H, J_オルト = 8.7Hz, H-3´, H-5´), 6.77(d, 1H, H_アルケン), 7.25-7.30(m, 2H, H-2´, H-6´); ¹³C JMOD NMR (CD₃OD): δ 104.12(2,6), 114.07(3´,5´), 124.55, 124.90 (2 x C_アルケン), 126.01(2´,6´), 128.45(1′), 128.56(1), 131.62(4), 144.63(3, 5), 155.42(4´); LRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z 243([M-H]^-, 100%), 244(17%)

［実施例３６］
5-(4-アセトキシフェネチル)ベンゼン-1,2,3-トリルトリアセテート (36)：
(E)-3,4,5,4´-テトラアセトキシスチルベンおよびメタノール中の10% Pd/Cの混合物を、90 psiにて一晩水素化した。この溶液をセライトのパッドを通してろ過した後、ロータリーエバポレーターによって濃縮して灰色オイルを得た。次いで、このオイルを酢酸エチルに溶解させ、氷水中で冷却した後、無水酢酸およびピリジンを添加した。反応を、60分間進行させた後、さらなる無水酢酸を添加し、その後80℃にて3時間加熱した。次いで、この混合物を室温にて一晩撹拌した。次いで、この反応溶液を氷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。その後、有機相を取り出し、水で4回洗浄した後、ろ過し、グラジエント溶出クロマトグラフィー(4:1 ヘキサン/ EtOAc〜1:1 ヘキサン/EtOAc)によって精製して、5-(4-アセトキシフェネチル)ベンゼン-1,2,3-トリルトリアセテートを白色粉末として得た。R_f 0.36 (1:1 ヘキサン/EtOAc); mp 121.5-122.0°C, ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.24 (s, 6H, 2 x OAc), 2.25 (s, 3H, OAc), 2.26 (s, 3H, OAc), 2.87 (bs, 4H, 2 x CH₂), 6.89 (bs, 2H, H-2, H-6), 6.95-6.99 (m, 2H, J_オルト = 8.4Hz, J_メタ = 2.0Hz, H-3´, H-5´), 7.11-7.16(m, 2H, H-2´, H-6´); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 19.11, 19.59, 20.06(4 x OCOCH₃), 35.54, 36.23(2 x CH₂), 119.56(2,6), 120.49(3´,5´), 128.32(2´,6´), 131.72(4), 137.54(1′), 139.02(1), 142.19(3, 5), 148.04(4´), 166.08, 166.86, 168.51(4 x OCOCH3); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 437(MNa⁺, 100%), 438(22%); HRESI 正イオン化質量スペクトル; C₂₂H₂₂O₈Na⁺; 計算値. 437.1212, 実測値 437.1196

［実施例３７］
5-(4-ヒドロキシフェネチル)ベンゼン-1,2,3-トリオール (37)：
p-トルエンスルホン酸一水和物のメタノール溶液を、1-(3,4,5-トリ-O-アセチルフェネチル)-4-O-アセチルベンゼンのメタノール中の懸濁液に添加した。この反応物を、アルゴンガス雰囲気下、85℃にて一晩加熱した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、得られたオイルを、（2:1 EtOAc/ヘキサンを等濃度で用いる）カラムクロマトグラフィーによって精製して、5-(4-ヒドロキシフェネチル)ベンゼン-1,2,3-トリオールを白色固体として得た。R_f 0.55 (2:1 EtOAc/ヘキサン); mp 180.0-188.5^oC, ¹H NMR (CD₃OD): δ 2.55-2.61(m, 2H, CH₂), 2.66-2.72(m, 2H, CH₂), 6.13(bs, 2H, H-2, H-6), 6.61-6.65(m, 2H, J_オルト = 8.5Hz, H-3′, H-5′), 6.90-6.93(m, 2H, H-2′, H-6′); ¹³C JMOD NMR (CD₃OD): δ 39.03(CH₂), 39.75(CH₂), 109.36(2,6), 116.74(3′,5′), 131.14(2′,6′), 132.74(4), 135.11(1′), 131.37(1), 147.43(3,5), 156.83(4′); LRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z 245 ([M-H]^-, 100%), 246(18%); HRESI 負イオン化質量スペクトル; 計算値ulated m/z for C₁₄H₁₄O₄-H^- 245.0814, 実測値 245.0814

［実施例３８］
3,5-ジ(tert-ブチルジメチルシリロキシ)ベンズアルデヒド (38)：
反応は、アルゴン雰囲気下で行った。ジイソプロピルエチルアミンを、無水N,N-DMFに溶解させた3,5-diヒドロキシベンズアルデヒドの溶液に添加した。この溶液を室温にて20分間充分に激しく撹拌した後、無水N,N-DMFに溶解させたtert-ブチルジメチルシリルクロライドを、滴下することによって15分間かけて添加した。この混合物を、室温にて一晩撹拌した。次いで、反応物を氷水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、合わせた抽出液を無水にし（無水Na₂SO₄）、ロータリーエバポレーターによって濃縮して褐色オイルを得た。カラムクトマトグラフィーによって（ヘキサン(100%)から出発して9:1ヘキサン/EtOAc)で終了するグラジエントによって溶出させて）精製して、3,5-di(tert-ブチルジメチルシリロキシ)ベンズアルデヒドを透明オイルとして得た。R_f 0.80 (4:1 ヘキサン/EtOAc), 0.50 (19:1 ヘキサン/EtOAc); ¹H NMR (CDCl₃): δ 0.22 (s, 12H, 2 x Si(CH₃)₂), 0.99 (s, 18H, 2 x SiC(CH₃)₃), 6.59 (擬 t, 1H, J = 2.3 Hz, H₄), 6.96 (擬 d, 2H, J = 2.3 Hz, H₂, H₆), 9.86 (s, 1H, CHO); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ -4.15(SiCH₃). 18.46(C(CH₃)₃), 25.90(C(CH₃)₃), 114.61(2,6), 118.59(4), 138.73(1), 157.55(3,5), 191.80(CHO)

［実施例３９ａ］
(5-ビニル-1,3-フェニレン)ビス(オキシ)ビス(tert-ブチルジメチルシラン (39a)：
反応は、アルゴン雰囲気下で行った。まず、メチレントリフェニルホスホランを、メチルトリフェニルホスフィンブロマイド(34.787g, 97.443mmol, Aldrich Chem社)およびカリウムtert-ブトキシド(9.010g, 73.856mmol, Aldrich Chem社)の無水THF中の混合物を加熱還流させることによって、系内で発生させた。室温に戻した後、3,5-ジ(tert-ブチルジメチルシリロキシ)ベンズアルデヒドの無水THF溶液を滴下により添加し、この反応物を一晩加熱還流させた。次いで、酢酸エチル (600mL)を添加し、この溶液を水で洗浄し、無水にし(無水Na₂SO₄)、ろ過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して褐色オイルを得た。カラムクロマトグラフィーによって（ヘキサン(100%)から出発して7:1 ヘキサン/EtOAcで終了するグラジエントによって溶出させて）精製して、(5-ビニル-1,3-フェニレン)ビス(オキシ)ビス(tert-ブチルジメチルシラン)を淡黄色オイルとして得た。R_f 0.44 (50:1 ヘキサン/EtOAc), 0.75 (25:1 ヘキサン/EtOAc); ¹H NMR (CDCl₃): δ 0.21 (s, 12H, 2 x Si(CH₃)₂), 0.99 (s, 18H, 2 x SiC(CH₃)₃), 5.02 (dd, 1H, J =12.8 Hz, J =1.5 Hz, H_alk), 5.66 (dd, 1H, J =13.2 Hz, J =0.7 Hz, H_alk), 6.59 (擬 t, 1H, J =1.6 Hz, H₂), 6.96 (擬 d, 2H, J = 1.6 Hz, H₄, H₆), 6.58 (dd, 1H, H_alk); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ -8.03(SiCH₃). 18.56(C(CH₃)₃), 26.06(C(CH₃)₃), 111.80(4,6), 112.02(2), 114.20(=CH₂), 137.12(CH=), 139.78(5), 156.97(1,3); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 365(MH⁺, 100%), 366(37)

［実施例３９ｂ］
5-ビニルベンゼン-1,3-ジオール, [3,5-ジヒドロキシスチレン] (39)：
反応は、アルゴン雰囲気下で行った。THFに溶解させたテトラブチルアンモニウムフルオライドを、無水THF中の(5-ビニル-1,3-フェニレン)ビス(オキシ)ビス(tert-ブチルジメチルシラン)に、15分間かけて滴下により添加した。この反応物を、室温にて90分間置いた。次いで、容積を、ロータリーエバポレーターによって低下させて等量の酢酸エチルで置換した。次いで、この溶液を水で洗浄し、無水にし(無水Na₂SO₄)、ろ過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して褐色オイルを得た。（1:1 ヘキサン/EtOAcを等濃度で用いる）カラムクロマトグラフィーによって精製して、粘稠な淡黄色オイルを得た。さらなるカラムクロマトグラフィーによって（4:1 ヘキサン/EtOAcから出発して1:1 ヘキサン/EtOAcで終了するグラジエントによって溶出させて）精製して、5-ビニルベンゼン-1,3-ジオールを淡黄色オイルを得た。R_f 0.58 (1:1 ヘキサン/EtOAc), 0.76 (1:2 ヘキサン/EtOAc); ¹H NMR (CD₃OD): δ 5.16 (dd, 1H, J =10.8 Hz, J =1.1 Hz, H_alk), 5.66 (dd, 1H, J =17.6 Hz, J =1.2 Hz, H_alk), 6.22 (擬 t, 1H, J =2.2 Hz, H₂), 6.40 (擬 d, 2H, J = 2.2 Hz, H₄, H₆), 6.58 (dd, 1H, H_alk); ¹³C JMOD NMR (CD₃OD): δ 102.24(2), 104.92(4,6), 112.95(=CH₂), 137.11(CH=), 140.07(5), 158.31(1,3); LRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z 135([M-H]^-, 100%), 136(17%)

［実施例４０］
5-ビニル-1,3-フェニレンジアセテート, [3,5-ジアセトキシスチレン] (40)：
反応は、アルゴン雰囲気下で行った。5-ビニルベンゼン-1,3-ジオールを酢酸エチルに溶解させた。ピリジンおよび無水酢酸を添加し、反応物を4時間加熱還流させ、室温にて一晩置いた。容積をさらなる酢酸エチルによって増加させ、この溶液を水で洗浄し、無水にし(無水Na₂SO₄)、ろ過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して黄色半固体を得た。4:1 ヘキサン/EtOAcを等濃度で用いるカラムクロマトグラフィーによって精製して、5-ビニル-1,3-フェニレンジアセテートを透明オイルとして得た。R_f 0.29 (4:1 ヘキサン/EtOAc); ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.30 (s, 6H, 2 x OAc), 5.33 (d, 1H, J =10.9 Hz, H_alk), 5.75 dd, 1H, J =17.5 Hz, H_alk), 6.66 (dd, 1H, H_alk), 6.84 (擬 t, 1H, J =2.1 Hz, H₂), 7.03 (擬 d, 2H, J = 2.1 Hz, H₄, H₆); ¹³C JMOD NMR (CDCl₃): δ 21.37(2 x CH₃), 114.93(2), 116.18(=CH₂), 117.04(4,6), 135.66(CH=), 140.27(5), 151.54(1,3), 169.22(2 x CO); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 243(MH⁺, 100%), 244(13%)

［実施例４１］
(E)-3,3´,5,5´-テトラアセトキシスチルベン (41)：
(2+2)付加体である(E)-3,5,3′,5´-テトラアセトキシスチルベン〔系統的命名法では、(E)-5,5´-(エテン-1,2-ジイル)ビス(ベンゼン-5,3,1-トリル)テトラアセテート〕の調製を試みた。
3,5-ジアセトキシ安息香酸(1.841g, 7.735mmol, batch BDp125-21-9-07)を、ナトリウムワイヤで無水にしたトルエン (50mL)中に懸濁させた。N,N-DMF(0.5mL)および塩化チオニル(5.0mL, 69mmol)を添加し、この反応物を、アルゴンガス雰囲気下、3時間加熱還流させた。溶媒を減圧蒸留(0.1mm/60^oC)によって除去し、次いで、得られた黄色固体を無水トルエン(25mL)に再び溶解させ、15分間超音波にかけて溶解ガスを除去した。3,5-ジアセトキシスチレン(1.547g, 7.032mmol, batch BDp143-18-10-07)、N-エチルモルホリン(983μL, 7.735mmol)、およびパラジウムジアセテート(35mg, 0.0155mmol, 2mole %)を添加し、アルゴンガス雰囲気下、この混合物を一晩加熱還流させた。室温に戻した後、酢酸エチル(200mL)を添加し、この溶液を水(5 x 50mL)で順次洗浄し、無水にし(無水 Na₂SO₄)、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して3.269gの暗褐色のガム状物を得た。TLCによって、この粗生成物が複数の生成物であることが分かった。¹H NMR (300MHz, CDCl₃)は、トランス-スチルベン生成物の明確な存在を全く示さず、スチレン出発物質の存在を示した。ESI質量スペクトルは、ペンタ-O-アセテートまたは部分的にジアセチル化された付加体の存在を全く示唆しなかった。正モードでは、スチレン出発物質を示すm/z 243 [MNa⁺]が示された。負モードでは、酸出発物質を示すm/z 237 [M-H]^-が示された。次いで、粗生成物を再びアセチル化した。3.269g全部を酢酸エチル(150mL)およびピリジン(40mL)に溶解させ、無水酢酸(40mL)を添加した。この反応物を5時間加熱還流させ、室温にて一晩置いた。次いで、ジクロロメタン(500mL)を添加し、この溶液を水で洗浄し(6 x 400mL)、無水にし(無水 Na₂SO₄)、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して5.253gの暗褐色粘稠オイル（これはまだピリジン臭がしていた）を得た。カラムクロマトグラフィー（0,040-0,063 mm SiO₂）によって（ヘキサン/EtOAcから出発して2:1 ヘキサン/EtOAcで終了するグラジエントによって溶出させて）精製して、主生成物である3,5-ジアセトキシスチレン(1.506g)を透明オイルとして得た。¹H NMR (CDCl₃): δ 2.30 (s, 6H, 2 x OAc), 5.32 (d, 1H, J =10.8 Hz, H_alk), 5.74 dd, 1H, J =17.5 Hz, H_alk), 6.65 (dd, 1H, H_alk), 6.77 (擬 t, 1H, J =2.1 Hz, H₂), 7.03 (擬 d, 2H, J = 2.1 Hz, H₄, H₆)

［机上実施例４２］
(E)-3,5-3′,5′-テトラヒドロキシスチルベン (42)：

［机上実施例４３］
3,5-ジアセトキシ-5-(3,5-ジアセトキシ-フェネチル)-ベンゼン(43)：

［机上実施例４４］
3,5-Diヒドロキシ-5-(3,5-ジヒドロキシ-フェネチル)-ベンゼン(44)：

［実施例４５］
(E)-3,4,5-3′,5′-ペンタアセトキシスチルベン (45)：
一般的な方法論は、Spencer, Aの「Selective Preparation of Non-Symmetrically Substituted Divinylbenzenes by Palladium Catalysed Arylations of Alkenes with Bromobenzoid Acid Derivatives」、J. Organomet. Chem., 1984, 265, 323-331⁵によった。(2+2)付加体BDp145-22-10-07の調製に失敗したため、触媒を増加させた量で用いた。
3,4,5-トリアセトキシ安息香酸(2.294g, 7.75mmol, batch BDp79-1-8-07)を、ナトリウムワイヤで無水にしたトルエン(500mL)に懸濁させ、トルエン(500mL)および塩化チオニル(10.0mL, 138mmol)を添加した。この反応物を、アルゴンガス雰囲気下、3時間加熱還流させた。全ての物質が、30分以内に溶解した。溶媒を減圧蒸留(0.1mm/60^oC)によって除去して、白色固体を得、これを無水トルエン (20mL)に再び溶解させ、減圧下で30分間超音波にかけて溶解したガスを除去した。3,5-ジアセトキシスチレン(1.365g, 6.205mmol, batch BDp143-18-10-07)、N-エチルモルホリン(985μL, 7.775mmol)、およびパラジウムジアセテート(87mg, 0.3875mmol, 酸クロライドに対して5mole %)を添加し、この混合物をアルゴンガス雰囲気下で一晩加熱還流させた。さらなるパラジウムジアセテート(87mg, 0.3875mmol, 5mole %)を添加し、加熱をさらに4時間続けた。室温に戻した後、酢酸エチル(500mL)を添加し、この溶液を、0.1M HCl (300mL)および水(3 x 300mL)で順次洗浄し、無水にし(無水 Na₂SO₄)、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して3.371gの暗褐色ガム状物を得た。TLCによって、この粗生成物が、多数の生成物であることが分かった。¹H NMR (400MHz, CDCl₃)は、トランス-スチルベン生成物の明確な存在を全く示さず、スチレン出発物質の存在を示した。ESI質量スペクトルは、正モードでも負モードでも、ペンタ-O-アセテートまたは部分的にジアセチル化された付加体の存在を全く示唆しなかった。3,4,5-トリアセトキシ安息香酸 (2.294g, 7.75mmol, batch BDp79-1-8-07)を、ナトリウムワイヤで無水にしたトルエン(500mL)に懸濁させ、塩化チオニル(10.0mL, 138mmol)を添加した。この反応物を、アルゴンガス雰囲気下、3時間加熱還流させた。全ての物質が、30分以内に溶解した。溶媒を減圧蒸留(0.1mm/60^oC)によって除去して、白色固体を得、これを無水トルエン (20mL)に再び溶解させ、減圧下で30分間超音波にかけて溶解したガスを除去した。3,5-ジアセトキシスチレン(1.365g, 6.205mmol, batch BDp143-18-10-07)、N-エチルモルホリン(985μL, 7.775mmol)、およびパラジウムジアセテート(87mg, 0.3875mmol, 酸クロライドに対して5mole %)を添加し、この混合物をアルゴンガス雰囲気下で一晩加熱還流させた。さらなるパラジウムジアセテート(87mg, 0.3875mmol, 5mole %)を添加し、加熱をさらに4時間続けた。¹H NMR (CDCl₃): δ 2.28 (s, 6H, 2 x OAc), 5.32 (d, 1H, J =10.8 Hz, H_alk), 5.73 dd, 1H, J =17.5 Hz, H_alk), 6.64 (dd, 1H, H_alk), 6.82 (擬 t, 1H, J =2.1 Hz, H₂), 7.01 (擬 d, 2H, J = 2.1 Hz, H₄, H₆)

［机上実施例４６］
(E)-3,4,5-3′,5′-ペンタアセトキシスチルベン (46)：

［机上実施例４７］
1,2,3,トリアセトキシ-5-(3,5-ジアセトキシ-フェネチル)-ベンゼン-(47)：

［机上実施例４８］
1,2,3,トリヒドロキシ-5-(3,5-ジヒドロキシ-フェネチル)-ベンゼン-(48)：

［実施例４９］

4-(3,5-diアミノフェネチル)-フェノール (49)：
(E)-3,5-ジニトロ-4′-アセトキシスチルベンおよびメタノール中の10% Pd/Cの混合物を、90 psiにて一晩水素化した。セライトのパッドを通してろ過すると、淡いピンク色の溶液が得られ、これをロータリーエバポレーターによって濃縮して淡いピンク色の固体を得た。

［実施例５０］
3,4,5-トリアセトキシ安息香酸 (50)：
3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸の酢酸エチル中の懸濁液を、氷浴で冷却し、無水酢酸およびピリジンを添加した。1時間後、得られた溶液を、次に3時間加熱還流させた。さらなる無水酢酸を添加し、この溶液を室温にて一晩撹拌した。次いで、ギ酸を添加し、この溶液を氷吸いに注いだ。有機相を分離し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液および水で洗浄し、無水にし(無水Na₂SO₄)、ろ過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して白色固体を得た。EtOAc/ヘキサンの1:1混合物から再結晶させて、3,4,5-トリアセトキシ安息香酸を（2回の再結晶で）得た。R_f 0.47 (EtOAc); mp 167.5-168.0^oC; ¹H NMR (300MHz, CDCl₃): δ 2.279 (s, 6H, 2 x OAc), 2.284 (s, 3H, OAc), 7.84 (s, 2H, arom); ¹³C JMOD NMR (75MHz, CDCl₃): δ 20.48, 20.87(3 x OCOCH₃), 123.16(2,3), 127.75(1), 139.71(4), 143.89(3,5), 166.72, 167.93(3 x OCOCH₃), 169.96(CO₂H); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 319(M+Na⁺, 100%), 負イオン化質量スペクトル; m/z 295([M-H]^-, 100%)

［実施例５１］
(E)-3,4,5-トリアセトキシスチルベン (51)：
3,4,5-トリアセトキシ安息香酸を無水トルエンに懸濁させ、N,N-DMFおよび塩化チオニルを添加した。この反応物を、窒素雰囲気下、100℃にて4時間加熱し、溶媒を減圧蒸留によって除去して黄色固体を得た。この固体を無水トルエンに懸濁させ、減圧下で30分間超音波にかけて溶解ガスを除去した。スチレン、N-エチルモルホリン、およびパラジウム(II) 二アセテート(2 mole%, Aldrich)を添加し、この混合物を、窒素雰囲気下、一晩加熱還流させた。室温に戻した後、酢酸エチルを添加し、この溶液を水、0.1M HCl、および水で順次洗浄し、無水にし(無水Na₂SO₄)、ろ過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して暗褐色粘稠オイルを得た。カラムクロマトグラフィーによって（3:1 ヘキサン/EtOAcから出発して2:1 ヘキサン/EtOAcで終了するグラジエントによって溶出させて）精製して、(E)-3,4,5-トリアセトキシスチルベンをクリーム色固体として得た。mp 119.0-119.5^oC; ¹H NMR (300MHz, CDCl₃): δ 2.30(s, 3H, OAc), 2.31(s, 6H, 2 x OAc), 7.02(d, 1H, J = 16.3Hz, H_トランス), 7.05(d, 1H, H_トランス), 7.26(bs, 2H, H-2, H-6), 7.26-7.32(m, 1H, H-4´), 7.34-7.40(m, 2H, H-3′, H-5′), 7.47-7.52(m, 2H, J_オルト = 8.6Hz, H-2′, H-6′); ¹³C JMOD NMR (75MHz, CDCl₃): δ 20.38, 20.87(OCOCH₃), 118.70(2,6), 126.68 (C_アルケン), 126.96(2′,6′), 128.34(C_アルケン), 128.99(3′,5′), 131.02(4′), 133.97(4), 136.32(1), 136.88(1′), 143.87(3,5), 167.25(OCOCH₃), 168.09(2 x OCOCH₃); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 377 (MNa⁺, 100%), 393 (MK⁺, 41%)

［実施例５２］
(E)-3,4,5-トリヒドロキシスチルベン [(E)-5-スチリルベンゼン-1,2,3-トリオール] (52)：
p-トルエンスルホン酸一水和物のメタノール溶液を、メタノール(50mL)に溶解させた3,4,5-トリアセトキシスチルベンに添加し、次いで、この反応物を、窒素ガスの加圧雰囲気下で、85℃にて一晩加熱した。溶媒を、ロータリーエバポレーターによって濃縮して、サーモンピンク色の固体を得た。この固体を、2:1 EtOAc/ヘキサンを等濃度で用いる）カラムクロマトグラフィーによって精製して、(E)-3,4,5-トリヒドロキシスチルベンをピンクベージュ色粉末として得た。R_f 0.63 (2:1 EtOAc/ヘキサン); mp 172.0-172.5^oC, ¹H NMR (300MHz, CD₃OD): δ 6.61(bs, 2H, H-2, H-6), 6.90(d, 1H, J_トランス = 16.3Hz, H_アルケン), 6.96(d, 1H, H_アルケン), 7.18-7.23(m, 1H, H-4′), 7.30-7.35(m, 2H, H-3′, H-5′), 7.46-7.50(m, 2H, H-2′, H-6′); ¹³C JMOD NMR (75MHz, CD₃OD): δ 107.71(2,6), 127.82(C_アルケン), 127.91(2′,6′), 128.78(C_アルケン), 130.39(3′,5′), 130.83(4′), 131.11(1), 135.32(4), 139.95(1′), 147.82(3,5); LRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z 227([M-H]^-, 100%), 228(15%)

［実施例５３］
5-フェネチルベンゼン-1,2,3-トリルトリアセテート (53)：
(E)-3,4,5-トリアセトキシスチルベンおよびメタノール中の10% Pd/Cを、90 psiにて一晩水素化した。次いで、この反応物を、セライトのパッドを通してろ過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して、灰色固体を得た。この固体を酢酸エチルに溶解させ、氷浴中で冷却し、無水酢酸およびピリジンを添加し、この反応物を80℃にて3時間加熱した。さらなる無水酢酸を添加し、この溶液を室温にて一晩撹拌した。次いで、反応物を氷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。この抽出液を水で洗浄し、無水にし(無水Na₂SO₄)、ろ過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して黄色オイルを得た。このオイルをクロマトグラフィー（2:1 ヘキサン/ EtOAcの等濃度の溶出）にかけて、5-フェネチルベンゼン-1,2,3-トリルトリアセテートをクリーム色の固体として得た。R_f 0.49 (1:1 ヘキサン/EtOAc), 0.66 (1:2 ヘキサン/EtOAc); mp 79.5-80.0^oC; ¹H NMR (300MHz, CDCl₃): δ 2.28(s, 6H, 2 x OAc), 2.29(s, 3H, OAc), 2.93(bs, 4H, 2 x CH₂), 6.95(bs, 2H, H-2, H-6), 7.16-7.24(m, 3H, H-2´, H-4´, H-6´), 7.26-7.33(m, 2H, H-3´, H-5´); ¹³C JMOD NMR (75MHz, CDCl₃): δ 20.23(OCOCH₃), 20.70(2 x OCOCH₃), 37.30, 37.44(2 x CH₂), 120.70(2,6), 126.26(4´), 128.53(2´,6´), 128.60(3´,5´), 132.83(4), 140.40(1), 141.16(1′), 143.33(3, 5), 167.22(OCOCH₃), 168.00(2 x OCOCH₃); LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 379(MNa⁺, 100%)

［実施例５４］
5-フェネチルベンゼン-1,2,3-トリオール (54)：
メタノールに溶解させたp-トルエンスルホン酸一水和物を、5-フェネチルベンゼン-1,2,3-トリルトリアセテートのメタノール溶液に添加した。この反応物を、窒素の加圧雰囲気下で85℃にて一晩加熱し、次いで、溶媒をロータリーエバポレーターによって除去した。残ったサーモンピンク色の固体を、1:1 EtOAc/ヘキサンを等濃度で用いるカラムクロマトグラフィーによって精製して、5-フェネチルベンゼン-1,2,3-トリオールをクリーム色固体として得た。R_f 0.50 (1:1 EtOAc/ヘキサン); mp 124.0-124.5^oC; ¹H NMR (300MHz, CD₃OD): δ 2.67-2.76(m, 2H, CH₂), 2.79-2.87(m, 2H, CH₂), 6.23(bs, 2H, H-2, H-6), 7.12-7.17(m, 3H, H-2′, H-4′, H-6′), 7.23-7.28(m, 2H, H-3′, H-5′); ¹³C JMOD NMR (75MHz, CD₃OD): δ 39.39(CH₂), 39.82(CH₂), 109.32(2,6), 127.44(4′), 129.93(2′,6′), 130.17(3′,5′), 132.80(4), 135.15(1), 143.95(1′), 147.46(3,5); LRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z 229([M-H]^-, 100%)

さらなる「3点」の実施例は、3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド (17)の合成を用いて得た。用いた手順は、S.J. Kimら(Amorepacific Corporation; Applicant)の「Hydroxybenzamide derivatives, the method for preparing thereof and the cosmetic composition containing the same」、WO2007/021067 A1に記載されている手順である。下記スキームに、市販の3,5-ジヒドロキシ安息香酸(25)および4-アミノフェノールから出発するこの調製をまとめる。

試薬および条件：(i) Ac₂O, Et₃N, EtOAc, 還流, 4時間, 収率34%; (ii) Et₃N, THF, CH₃SO₂Cl, 30分間; (iii) 4-アミノフェノール, 0^oC, 4時間, 収率82%; (iv) Ac₂O, ピリジン, DMAP, EtOAc, 還流, 2時間, 収率76%; (v) (a) KOH_(aq), 還流, 75分間; (b) HCl_(aq), 収率。55%; (vi) (a) KOH_(aq), 還流, 2時間; (b) HCl_(aq), 収率60%

［実施例５５］
5-(4-ヒドロキシフェニルカルバモイル)-1,3-フェニレンジアセテート (55)：
反応は、アルゴンガスの加圧雰囲気下で行った。トリエチルアミンを、0℃に冷却した3,5-diアセトキシ安息香酸の無水THF溶液に添加した。次いで、メタンスルホニルクロライドを、シリンジによってゆっくりと添加し、反応物をさらに25分間撹拌した。次いで、4-アミノフェノールを添加し、反応物を0℃にてさらに4時間保持した後、-20℃にて一晩貯蔵した。次いで、この反応物を、1M HClで酸性(pH 2)にし、ロータリーエバポレーターによって溶媒を除去した。残ったガム状物を、EtOAcに溶解させ、水で洗浄し、無水にし(無水 Na₂SO₄)、ろ過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して白色固体を得た。¹H NMR (CD₃OD)は、純粋な5-(4-ヒドロキシフェニルカルバモイル)-1,3-フェニレンジアセテートが最高で75%存在することを示した。この物質を、次の反応に用いた。R_f 0.56 (2:1 EtOAc/ヘキサン)

［実施例５６］
5-(4-アセトキシフェニルカルバモイル)-1,3-フェニレンジアセテート (56)：
「粗」5-(4-ヒドロキシフェニルカルバモイル)-1,3-フェニレンジアセテートを酢酸エチルに懸濁させ、次いで、4-(ジメチルアミノ)ピリジン、ピリジン、および無水酢酸を添加し、この溶液を2時間加熱還流させ、室温に一晩おいた。さらなる酢酸エチルを添加し、この反応物を、0.1M HClおよび水で洗浄し、無水にし(無水Na₂SO₄)、ろ過し、ロータリーエバポレーターによって溶媒を除去した。残った粉末を、乾燥したプラグとしてのシリカカラム上に担持させ、クロマトグラフィー（2:1 EtOAc/ヘキサンから出発して5:1 EtOAc/ヘキサンで終了するグラジエントによって溶出）にかけて、5-(4-アセトキシフェニルカルバモイル)-1,3-フェニレンジアセテートを白色粉末として得た。¹H NMR (d₆-DMSO)は、この粉末が、約80%の純度であることを示した。この物質を、次の加水分解反応にそのまま用いた。R_f 0.63 (2:1 EtOAc/ヘキサン)

［実施例５７］
3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド (57)：
（方法１：ジアセテートの加水分解）
反応は、アルゴンガスの加圧雰囲気下で行った。水酸化カリウムの水溶液を、「粗」5-(4-ヒドロキシフェニルカルバモイル)-1,3-フェニレンジアセテートに添加した。この反応物を、75分間加熱還流させ、室温に戻し、1M HClを沈殿が形成されるまで添加した(およそ3のpH)。この沈殿を、減圧ろ過によって取り出し、この固体を、漏斗内で水を用いて繰り返し洗浄した後、減圧下で乾燥させて、3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミドをふわふわの微細な白色針状晶として得た。R_f 0.39 (4:1 EtOAc/ヘキサン); mp 266.0-266.5^oC; ¹H NMR (CD₃OD): δ 6.47(擬 t, 1H, J_メタ = 2.2Hz, H-4), 6.77-6.82(m, 4H, H-3′, H-5′, H-2, H-6), 7.43-7.46(m, 2H, J_オルト = 8.9Hz, H-2′, H-6′); ¹H NMR (d₆-DMSO): δ 6.42(擬 t, 1H, J_メタ = 2.2Hz, H-4), 6.72-6.78(m, 4H, H-3′, H-5′, H-2, H-6), 7.51-7.56(m, 2H, J_オルト = 8.9Hz, H-2′, H-6′), 9.20(s, 1H), 9.51(s, 2H), 9.83(s, 1H) ; ¹³C JMOD NMR (CD₃OD): δ 104.41(4), 104.67(2,6), 113.92(3′,5′), 122.13(2′,6′), 129.10(1′), 136.08(1), 153.26(4′), 157.41(3,5), 166.70(C=O); LRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z 244 ([M-H]^-, 100%), 489([2M-H]^-, 29%); HRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z for C₁₃H_11NO₄, 計算値ulated [MH]⁺ 246.0766, 実測値 246.0764

（方法２：トリアセテートの加水分解）
反応は、アルゴンガスの加圧雰囲気下で行った。水酸化カリウムの水溶液を、「粗」5-(4-ヒドロキシフェニルカルバモイル)-1,3-フェニレンジアセテートに添加した。この反応物を、2時間加熱還流させ、室温に戻し、1M HClを沈殿が形成されるまで添加した(およそ3のpH)。この沈殿を、減圧ろ過によって取り出し、水を用いて繰り返し洗浄した。この白色固体を減圧下で乾燥させて、3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミドをふわふわの微細な白色針状晶として得た。融点およびスペクトルデータは、上述により調製した物質と同一であった。

［実施例５８］
原料とし、評価し、テンプレート化したさらなる化合物を、以下に示す。これらの実施例を、ＭＩＰテンプレートとしても、ＭＩＰテスト被検物質としても用いた。

これらの化合物は、合成するかまたは外部から購入したものであり、以下の事項のための有用なテンプレートを提供する：(i)規定のテンプレートを取り囲むＭＩＰの構築、(ii)純粋な化合物および複数の化合物混合物を用いる結合の評価、および(iii)前記ＭＩＰの標的化合物に対する選択性の完全な特徴付け（合成したテンプレートを試験化合物として用いる特徴付けおよび実際のバイオプロセス廃棄物を用いる特徴付け）。

ＭＩＰシステムの開発を、より複雑なレスベラトロール類似体（例えば、フラボン類の分子、他の種類のポリフェノール類など）をテンプレートとして取り囲むものに方向付けた。
他の分子およびその類似体であって現在ＭＩＰの可能性のあるテンプレートとして研究されているものには、例えば、カテキン、モリン、エラグ酸、ＭＩＰ_アミドを用いることによって標的とされるプロシアニジンが含まれる。ＭＩＰのテンプレート化のための別の可能性のある種類の分子は、天然に存在するレスベラトロール誘導体、例えばグルクロニド類などである。Romero-Perezら⁶ は、ブドウ果皮中に大量のグルクロニド類が、典型的にはレスベラトロールの量を上回る量で存在することを報告している(J. Agric. Food Chem., Vol. 49, No. 1, 2001, 210-215)。このような化合物類に特異的なＭＩＰを開発すれば、これらの生物活性分子を、レスベラトロールを単離するために用いた同じ供給原料からの二次的な下流製品として濃縮、分離、および抽出するために非常に価値があると考えられる。必要であれば、これらのグルクロニド類は、その後、化学的または酵素的にレスベラトロールに変換することもできるであろう。D. A. Learmonth (Bioconjugate Chem., 2003, 14, 262-267)⁷ は、これらのグルクロニドテンプレートの調製方法を報告している（図１）。

われわれは、選択性および個々の標的分子に対する容量が共により高い「共有結合した」ＭＩＰ新規な種類のＭＩＰの開発についても研究した。試験的な実験によって、図２に示すように、少量の(E)-5-(4-(メタクリロイルオキシ)スチリル)-1,3-フェニレンビス(2-メチルアクリレート)が、探索的なＭＩＰ研究の最初の候補として既に生成している。

(E)-3,4′,5-トリ(メタクリロイル)オキシスチルベン (BDp47-5-12-2006)〔系統的命名法では、 (E)-5-(4-(メタクリロイルオキシ)スチリル)-1,3-フェニレンビス(2-メチルアクリレート)〕：
反応は、アルゴン雰囲気下で行った。レスベラトロールを無水アセトニトリルに溶解させ、これに無水硫酸ナトリウムを添加した。この溶液を30分間激しく撹拌し、固体物質をろ過によって除去した。次いで、トリエチルアミンを濾液に添加し、即座に氷浴で冷却した。アセトニトリルに溶解させたメタクリロイルクロライドをゆっくりと添加し、この反応溶液を室温にまで放冷した後、一晩撹拌した。次いで、この反応物を、再び氷浴中で冷却し、さらなるトリエチルアミン、次いで氷水を添加した後、この溶液をさらに20分間撹拌した。酢酸エチルを添加し、相を分離した。有機相を水で4回洗浄した後、無水にし、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して茶褐色のガム状物を得た。このガム状物を、グラジエント溶出カラムクロマトグラフィー（9:1 ヘキサン/ EtOAc〜4:1 ヘキサン/EtOAc）によって精製して、(E)-3,4′,5-トリ(メタクリロイル)オキシスチルベンを透明オイルとして得た。R_f 0.47 (4:1 ヘキサン/EtOAc); ¹H NMR (CDCl₃): δ 2.04 (s, 9H, 3 x CH₃), 5.72-5.76 (m, 3H, 3 x ビニル), 6.33-6.34 (m, 3H, 3 x ビニル), 6.88(擬 t, 1H, J_メタ = 2.1Hz, H-4), 6.97(d, 1H, J = 16.3Hz, H_トランス), 7.10(d, 1H, H_トランス), 7.10-7.15(m, 4H, H-2, H-6, H-3´, H-5´), 7.47(dt, 2H, J_オルト = 8.6Hz, H-2´, H-6´). LRESI 正イオン化質量スペクトル; m/z 455(MNa⁺, 100%), 456(31%)

［実施例Ｓ１］
trans-4-O-アセチルフェルラ酸 [(E)-3-(4-アセトキシ-3-メトキシフェニル)アクリル酸.] (S1)：
（方法１）フェルラ酸を、氷浴中で冷却した水酸化ナトリウムの水溶液に添加した。この懸濁液を、全ての固体が溶解するまで十分に撹拌した後、無水酢酸を添加した。5分後に、氷浴をはずし、この溶液を室温にてさらに90分間撹拌した。この反応物を、0℃に再び戻し、2M HCl水溶液を添加して白色の沈殿を生じさせた(pH約4)。この沈殿を減圧ろ過し、さらなる水を用いて漏斗内で繰り返し洗浄した。ヘキサン/酢酸エチルから再結晶させて、白色結晶としてのトランス-4-O-アセチルフェルラ酸を（2回の再結晶で）集めた。R_f 0.52 (4:1 EtOAc/ヘキサン); mp 197.5-198.0^oC; lit mp 192^oC (Roberts et al, Eur. J. Med. Chem., (1994), 29, 841-854⁸); ¹H NMR (300MHz, CDCl₃): δ 2.33(s, 3H, OAc), 3.88(s, 3H, OMe), 6.40(d, 1H, J_トランス = 15.9Hz, H_アルケン), 7.06-7.17(m, 3H, arom), 7.73(d, 1H, J_トランス = 15.9Hz, H_アルケン)
（方法２）フェルラ酸をピリジンに溶解させた。無水酢酸(15.0mL)を添加し、この反応物を室温にて一晩撹拌した。次いで、この溶液を、氷に注ぎ、2M HClで酸性(pH 2)にした。得られた白色固体をろ過によって取り出し、さらなる水を用いて漏斗内でさらに洗浄した後、乾燥した。クロロメタンおよびエタノールから再結晶させて、白色結晶としてのトランス-4-O-アセチルフェルラ酸を（2回の再結晶で）集めた。Mp 201.0-201.5^oC; 文献mp 192^oC (Robertsら, Eur. J. Med. Chem., (1994), 29, 841-854⁸); R_fおよび¹H NMR (300MHz, CDCl₃)は上述により調製した物質と同一であった。

［実施例Ｓ２］
3-O-(trans-4-O-アセチルフェルロイル)-エルゴステロール〔(系統的命名法では、 (E)-((3S,10R,13R,17R)-17-((2R,5R,E)-5,6-ジメチルヘプト3-エン-2-イル)-10,13-ジメチル-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル) 3-(4-アセトキシ-3-メトキシフェニル)アクリレート)〕 (S2)：
trans-4-O-アセチルフェルラ酸を、無水ジクロロメタンに溶解させ、4-ジメチルアミノピリジンおよびN,N-ジシクロヘキシルカルボジイミドを添加した。この反応物を室温にて60分間撹拌して、活性化された酸を生成させ、次いでエルゴステロールを添加し、さらなるジクロロメタンで洗い入れた。この溶液を室温にて一晩撹拌し、得られた白色固体をろ過によって除去した。濾液をロータリーエバポレーターによって濃縮して白色固体を得た。この固体をカラムクロマトグラフィーによって（50:1 CHCl₃/MeOHから出発して50:4 CHCl₃/MeOHで終了するグラジエントによって溶出させて）精製して、3-O-(trans-4-O-アセチルフェルロイル)-エルゴステロールを白色固体として得た。R_f 0.58 (2:1 ヘキサン/EtOAc), 0.90 (49:1 CHCl₃/MeOH); mp 181.5-182.05^oC; ¹H NMR (300MHz, CDCl₃): δ 0.64(s, 3H, CH₃), 0.83(d, 3H, J = 6.8Hz, CH₃), 0.85(d, 3H, J = 6.8Hz, CH₃), 0.93(d, 3H, J = 6.8Hz, CH₃), 0.99(s, 3H, CH₃), 1.04(d, 3H, J = 6.6Hz, CH₃), 1.20-2.60(ブロードな多重線プロトンの数が決定できない), 2.32(s, 3H, OAc), 3.86(s, 3H, OCH₃), 4.80-4.90(m, 1H, H-3), 5.14-5.28(m, 2H, H-22, H-23), 5.38-5.42(m, 1H, H-6/5), 5.59-5.61(m, 1H, H-5/6), 6.40(d, 1H, J_トランス = 15.9Hz, H_アルケン), 7.03-7.14(m, 3H, 芳香族), 7.65(d, 1H, J_トランス = 15.9Hz, H_アルケン); ¹³C JMOD NMR (75MHz, CDCl₃): δ 12.30(18), 16.43, 17.84, 19.89, 20.18, 20.82(5 x CH₃), 21.28(11), 21.35(CH₃), 23.24(15), 28.48, 28.50(2,16), 33.33(25), 37.01, 37.37, 38.19, 39.29(10,4,13,1,12), 40.64(20), 43.07(24), 46.31(9), 54.77, 55.99, 56.10(14, OCH₃,17), 73.22(3), 111.47(2_芳香族), 116.59(7), 119.08(6), 120.55(C_アルケン), 121.41(6_芳香族), 123.44(5_芳香族), 132.23(23), 133.70(1_芳香族), 135.80(22), 138.72(5), 141.65(8), 141.71(4_芳香族), 143.97(C_アルケン), 151.63(C-OCH₃), 166.36( C3-OCOCH=), 168.89(Ar-OCOCH₃)

［実施例Ｓ３］
3-O-(trans-フェルロイル)-エルゴステロール〔(系統的命名法では、 (E)-((3S,10R,13R,17R)-17-((2R,5R,E)-5,6-ジメチルヘプト3-エン-2-イル)-10,13-ジメチル-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル) 3-(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)アクリレート)〕(S3)：
3-O-(trans-4-O-アセチルフェルロイル)-エルゴステロールを、クロロホルムおよびメタノールの2:1の混合液に溶解させ、炭酸カリウムを添加した。この反応物を65℃にて6時間加熱した。室温に戻した後、飽和アンモニウムクロライド水溶液を添加し、この溶液をジクロロメタンを用いて繰り返し抽出した。合わせた抽出液を、水で洗浄し、無水にし(無水Na₂SO₄)、濾過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して白色固体を得た。カラムクロマトグラフィーによって（CH₂Cl₂から出発して98:2 CH₂Cl₂/MeOHで終了するグラジエントによって溶出させて）精製して、3-O-(trans-feruloyl)-エルゴステロールを白色固体として得た。R_f 0.31 (4:1 ヘキサン/EtOAc), 0.49 (100% CH₂Cl₂), 0.84 (98:2 CH₂Cl₂/MeOH); mp 182.0-182.5^oC; ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 0.64(s, 3H, CH₃), 0.84-0.85(m, 6H, 2 x CH₃), 0.92(d, 3H, J = 6.8Hz, CH₃), 0.99(s, 3H, CH₃), 1.04(d, 3H, J = 6.6Hz, CH₃), 1.26-2.08(ブロードな多重線プロトンの数が決定できない), 2.41-2.48(m, 1H), 2.56-2.61(m, 1H), 3.93(s, 3H, OCH₃), 4.82-4.86(m, 1H, H-3), 5.15-5.26(m, 2H, H-22, H-23), 5.39-5.40(m, 1H, H-6/5), 5.59-5.60(m, 1H, H-5/6), 5.83(s, 1H, OH), 6.28(d, 1H, J_トランス = 15.9Hz, H_アルケン), 6.91(d, 1H, J_オルト = 8.2Hz, H6_arom), 7.03-7.10(m, 2H, H_arom), 7.60(d, 1H, J_トランス = 15.9Hz, H_アルケン); ¹³C JMOD NMR (100MHz, CDCl₃): δ 12.41(18), 16.55, 17.95, 19.99, 20.29, 21.46(5 x CH₃), 21.40(11), 23.35(15), 28.62(2,16), 33.44(25), 37.17, 37.49, 38.32, 39.41(10,4,13,1,12), 40.75(20), 43.17(24), 46.42(9), 54.88, 56.10, 56.26(14, OCH₃,17), 73.09(3), 109.70(2_芳香族), 115.08(7), 116.36(C_アルケン), 116.69(6), 120.59(5_芳香族), 123.36(6_芳香族), 127.44(1_芳香族), 132.34(23), 135.92(22), 138.96(5), 141.83(8), 144.93(C_アルケン), 147.13(4_芳香族), 148.28(C-OCH₃), 166.99(C=O)

［実施例Ｓ４］
3-O-エルゴステリルシンナメート〔(系統的命名法では、 (3S,10R,13R,17R)-17-((2R,5R,E)-5,6-ジメチルヘプト3-エン-2-イル)-10,13-ジメチル-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルシンナメート)〕(S4)：
trans-桂皮酸を、無水ジクロロメタンに溶解させ、4-ジメチルアミノピリジンおよびN,N-ジシクロヘキシルカルボジイミドを添加し、この反応物を室温にて15分間撹拌した。次いで、エルゴステロールを、さらなる無水ジクロロメタンと共に添加し、この反応物を室温にて一晩撹拌した。得られた白色固体を、ろ過によって除去し、この固体をさらなるジクロロメタンを用いて洗浄した。合わせた濾液をロータリーエバポレーターによって濃縮し、次いで、得られた白色固体を、カラムクロマトグラフィーによって（CH₂Cl₂ (100%)から出発して97:3 (v/v) CH₂Cl₂/MeOHで終了するグラジエントによって溶出させて）精製して、再び白色固体を得た。¹H NMR (300MHz, CDCl₃)は、この固体には、表題化合物が95%の純度で存在することを示した。一部の試料を取り、ヘキサンおよび酢酸エチルの2:1の混合物から再結晶させて、3-O-エルゴステリルシンナメートを「キラキラ輝く」白色雲母状板状結晶として得た
R_f 0.68 (4:1 ヘキサン/EtOAc), 0.89 (99:1 CH₂Cl₂/MeOH); mp 171.0-171.1^oC, ¹H NMR (300MHz, CDCl₃): δ 0.64(s, 3H, CH₃), 0.83(d, 3H, J = 6.8Hz, CH₃), 0.85(d, 3H, J = 6.7Hz, CH₃), 0.93(d, 3H, J = 6.8Hz, CH₃), 0.99(s, 3H, CH₃), 1.04(d, 3H, J = 6.6Hz, CH₃), 1.23-2.62(ブロードな多重線プロトンの数が決定できない), 4.80-4.91(m, 1H, H-3), 5.14-5.28(m, 2H, H-22, H-23), 5.38-5.42(m, 1H, H-6/5), 5.59-5.61(m, 1H, H-5/6), 6.43(d, 1H, J_トランス = 16.0Hz, H_アルケン), 7.36-7.40(m, 3H, 3_芳香族, 4_芳香族, 5_芳香族), 7.51-7.55(m, 2H, 2_芳香族, 6_芳香族), 7.68(d, 1H, H_アルケン); ¹³C JMOD NMR (75MHz, CDCl₃): δ 12.42(18), 16.56, 17.97, 20.01, 20.31, 21.48(5 x CH₃), 21.41(11), 23.36(15), 28.60, 28.63(2,16), 33.45(25), 37.14, 37.50, 38.33, 39.42(10,4,13,1,12), 40.76(20), 43.19(24), 46.44(9), 54.90(14), 56.11(17), 73.26(3), 116.72(7), 119.02(6), 120.64(C_アルケン), 128.38(2_芳香族,6_芳香族), 129.20(3_芳香族,5_芳香族), 130.50(4_芳香族), 132.35(23), 134.90(1_芳香族), 135.93(22), 138.92(5), 141.81(8), 144.81(C_アルケン), 166.68( C=O)

［実施例Ｓ５］
(E)-4-O-アセトキシ桂皮酸〔(系統的命名法では、 (E)-3-(4-アセトキシフェニル)アクリル酸)〕(S5)：
p-クマリン酸をピリジンに溶解させ、無水酢酸およびDMAPを添加した。全ての固体は速やかに溶解した。この溶液を室温にて一晩撹拌した。次いで、この反応物を氷に注ぎ、2M HClを添加して(pH 3にまで)酸性にした。得られた白色固体をろ過によって取り出し、漏斗内でさらなる水を用いて洗浄した後、減圧下、乾燥剤によって乾燥させた。この乾燥した物質を酢酸エチルから再結晶させて、(E)-4-O-アセトキシ桂皮酸を白色針状晶として得た。容積を低下させた濾液からは第2回目の白色針状晶が得られた。R_f 0.52 (4:1 EtOAc/ヘキサン); mp 201.1-201.2^oC; 文献mp 205-208^oC (Roberts et al, Eur. J. Med. Chem., (1994), 29, 841-854⁷); ¹H NMR (300MHz, CD₃OD): δ 2.31(s, 3H, OAc), 6.48(d, 1H, J_トランス = 16.0Hz, H_アルケン), 7.17-7.20(m, 2H, J_オルトs = 8.6Hz, 3_芳香族, 5_芳香族), 7.64-7.73(m, 3H, H_アルケン 2_芳香族, 6_芳香族); LRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z 205 ([M-H]^-, 100%), 206 (12%)

［実施例Ｓ６］
3-O-(trans-4-O-アセトキシシンナモイル)-エルゴステロール〔(系統的命名法では、 (E)-((3S,10R,13R,17R)-17-((2R,5R,E)-5,6-ジメチルヘプト3-エン-2-イル)-10,13-ジメチル-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル) 3-(4-アセトキシフェニル)アクリレート)〕(S6)：
(E)-4-O-アセトキシ桂皮酸、4-ジメチルアミノピリジン、およびN,N-ジシクロヘキシルカルボジイミドの無水ジクロロメタン中の混合物を、室温にて20分間撹拌した。次いで、エルゴステロールを添加し、さらなる無水ジクロロメタンで洗い入れ、この反応物を室温にて一晩撹拌した。得られた白色固体をろ過によって除去し、漏斗内でさらなるジクロロメタンで洗浄した。合わせた濾液をロータリーエバポレーターによって濃縮して黄色固体を得た。カラムクロマトグラフィーによって（CH₂Cl₂から出発して97:3 CH₂Cl₂/MeOHで終了するグラジエントによって溶出させて）精製して、3-O-(trans-4-O-アセトキシシンナモイル)-エルゴステロールを白色固体として得た。R_f 0.60 (4:1 ヘキサン/EtOAc), 0.56 (CH₂Cl₂100%); mp 181.1-181.2^oC; ¹H NMR (300MHz, CDCl₃): δ 0.64(s, 3H, CH₃), 0.82-0.86(m, 6H, 2xCH₃), 0.92(d, 3H, J = 6.8Hz, CH₃), 0.99(s, 3H, CH₃), 1.04(d, 3H, J = 6.6Hz, CH₃), 1.22-2.57(ブロードな多重線プロトンの数が決定できない), 2.31(s, 3H, OAc), 4.79-4.90(m, 1H, H-3), 5.10-5.28(m, 2H, H-22, H-23), 5.38-5.41(m, 1H, H-6/5), 5.58-5.61(m, 1H, H-5/6), 6.38(d, 1H, J_トランス = 16.0Hz, H_アルケン), 7.10-7.14(m, 2H, J_オルト = 8.6Hz, 3_arom,5_arom), 7.51-7.56(m, 2H, 2_arom,6_arom), 7.67(d, 1H, H_アルケン); ¹³C JMOD NMR (75MHz, CDCl₃): δ 12.34(18), 16.46,17.90,19.94,20.24,21.34,21.41(5 x CH₃, OC(O)CH₃), 21.32(11), 23.29(15), 28.52,28.55(2,16), 33.37(25), 37.05,37.40,38.23, 39.34(10,4,1,12), 40.69(20), 43.09(13), 43.11(24), 46.35(9), 54.81(14), 56.03(17), 73.24(3), 116.66(7), 119.08(6), 120.59(C_{cinn alkene}), 122.34(3_arom,5_arom), 129.39(2_arom,6_arom), 132.27(23), 132.49(1_arom), 135.85(22), 138.78(5), 141.69(8), 143.58(C_{cinn alkene}), 152.32(4_arom), 166.42(C3-OCOCH₃), 169.22(Ar-OCOCH₃)

［実施例Ｓ７］
3-O-(trans-クマロイル)-エルゴステロール〔(系統的命名法では、 (E)-((3S,10R,13R,17R)-17-((2R,5R,E)-5,6-ジメチルヘプト3-エン-2-イル)-10,13-ジメチル-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル) 3-(4-ヒドロキシフェニル)アクリレート)〕(S7)：
炭酸カリウムを、クロロホルムおよびメタノールの2:1混合液に溶解させた3-O-(trans-4-O-アセチルフェルロイル)-エルゴステロールに添加した。次いで、これを70℃にて6時間加熱し、さらなるクロロホルム(10.0mL)およびメタノール(5.0mL)を添加し、この反応物を室温にて一晩撹拌したままにした。飽和アンモニウムクロライド水溶液およびさらなるジクロロメタンを添加し、2つの相を分離した。有機相を水で繰り返し洗浄し、無水にし(無水Na₂SO₄)、ろ過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮してクリーム色固体を得た。酢酸エチルから再結晶させて、純粋な3-O-(trans-クマロイル)-エルゴステロールを白色固体として得た。容積を低下させた濾液からは第2回目の白色固体が得られた。R_f 0.28 (100% CH₂Cl₂); mp 213.1-213.2^oC; ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 0.64(s, 3H, CH₃), 0.82-0.85(m, 6H, 2 x CH₃), 0.92(d, 3H, J = 6.8Hz, CH₃), 0.99(s, 3H, CH₃), 1.04(d, 3H, J = 6.6Hz, CH₃), 1.24-2.09(ブロードな多重線プロトンの数が決定できない), 2.41-2.47(m, 1H), 2.56-2.60(m, 1H), 4.81-4.85(m, 1H, H-3), 5.15-5.26(m, 3H, H-22, H-23, OH ), 5.39-5.41(m, 1H, H-6/7), 5.59-5.60(m, 1H, H-7/6), 6.29(d, 1H, J_トランス = 15.9Hz, H_アルケン), 6.80-6.86(d, 2H, J_オルト = 8.6Hz, H3_arom, H5_arom), 7.41-7.45(m, 2H, H2_arom, H6_arom), 7.62(d, 1H, H_アルケン); ¹³C JMOD NMR (75MHz, CDCl₃): δ 12.43(18), 16.58,17.96,20.01,20.30,21.47(5 x CH₃), 21.42(11), 23.34(15), 28.62(2,16), 33.46(25), 37.17,37.51,38.33,39.43(10,4,1,12), 40.76(20), 43.19(24), 43.21(13), 46.45(9), 54.91(14), 56.12(17), 73.23(3), 116.24,116.44,116.69,(7,C_{cinn alkene},3_arom,5_arom), 120.61(6), 127.73(1_arom), 130.29(2_arom,6_arom), 132.37(23), 135.94(22), 138.98(5), 141.89(8), 144.62(C_{cinn alkene}), 158.02(4_arom), 167.28(C3-OCOCH₃); LRESI 負イオン化質量スペクトル; m/z 541([M-H]^-, 100%), 542(51%); HR EI 負イオン化質量スペクトル; 計算値ulated for [C₃₇H₄₉O₃-H]^- 541.36817, 実測値 541.36801

［実施例Ｓ８］
エルゴステリルベンゾエート〔(系統的命名法では、 3S,10R,13R,17R)-17-((2R,5R,E)-5,6-ジメチルヘプト3-エン-2-イル)-10,13-ジメチル-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルベンゾエート)〕(S8)：
反応は、窒素ガスの加圧雰囲気下で行った。エルゴステロールを無水ピリジンに溶解させ、この溶液を氷浴中で冷却した。新たに蒸留したベンゾイルクロライドを添加し、反応物を室温に戻し、一晩撹拌したままにした。次いで、この反応物を、氷水に注ぎ、白色固体をジクロロメタンで抽出した。次いで、有機相を水および飽和NaHCO₃水溶液で順次洗浄し、無水にし(無水Na₂SO₄)、ろ過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮して淡い茶褐色固体を得た。CH₂Cl₂(100%)を等濃度で用いるカラムクロマトグラフィーによって精製して、エルゴステリルベンゾエートを白色固体として得た。R_f 0.69 (100% CH₂Cl₂); mp 157.1-157.2^oC; lit mp 169-171^oC [Dolle, R.E.; Kruse, L.I. J. Org. Chem. 1985, 51, 4047-4053⁹]; ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 0.65(s, 3H, CH₃), 0.83(d, 3H, J = 6.6Hz, CH₃), 0.85(d, 3H, J = 6.6Hz, CH₃), 0.93(d, 3H, J = 6.8Hz, CH₃), 1.01(s, 3H, CH₃), 1.05(d, 3H, J = 6.6Hz, CH₃), 1.26-2.67(ブロードな多重線プロトンの数が決定できない), 4.92-5.01(m, 1H, H-3), 5.16-5.27(m, 2H, H-22, H-23), 5.40-5.42(m, 1H, H-6/5), 5.60-5.62(m, 1H, H-5/6), 7.39-7.45(m, 2H, 3_arom, 5_arom), 7.53-7.57(m, 1H, 4_arom), 8.01-8.06(m, 2H, 2_arom, 6_arom); ¹³C JMOD NMR (100MHz, CDCl₃): δ 12.43(18), 16.59, 17.96, 20.01, 20.30, 21.47(5 x CH₃), 21.42(11), 23.36(15), 28.59, 28.63(2,16), 33.45(25), 37.13, 37.27, 37.52, 38.32(10,4,12), 40.76(20), 43.19(24), 43.20(13), 46.44(9), 54.91(14), 56.11(17), 73.74(3), 116.72(7), 120.68(6), 128.61(2_arom,6_arom), 129.89(3_arom,5_arom), 131.17(1_arom), 132.36(23), 133.07(4_arom), 135.92(22), 138.88(5), 141.87(8), 166.31(C=O)

［実施例Ｓ９］
エルゴステリル-3,4-ジメトキシシンナメート (BDp145-19-6-2008; 5.478g 最終的な精製が必要な粗生成物)〔系統的命名法では、 (E)-((3S,10R,13R,17R)-17-((2R,5R,E)-5,6-ジメチルヘプト3-エン-2-イル)-10,13-ジメチル-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル) 3-(3,4-diメトキシフェニル)アクリレート〕：
用いた手順は、Condo Jr, A.M.; Baker, D.C.; Moreau, R.A.;およびHicks, K.B.の、J. Agric. Food Chem., (2001), 49, 4961-4964, 「Improved Method for the Synthesis of trans-Feruloyl-β-sitostanol」¹⁰ に記載されているβ-シトスタノールについて報告されている手順である。3,4-ジメトキシ桂皮酸 (1.765g, 8.475mmol, Aldrich Chem.社)を、ジクロロメタン(30.0mL, アルミナに通すことによって無水にしたもの)に溶解させ、4-ジメチルアミノピリジン(105mg, 0.861mmol, Sigma)およびN,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.925g, 9.345mmol, Aldrich)を添加した。この反応物を、室温にて20分間撹拌して、活性化した酸を生じさせた。次いで、さらなる無水ジクロロメタン(10.0mL)と共にエルゴステロール (3.360g, 8.470mmol, Aldrich)を添加し、この溶液を室温にて一晩撹拌した。得られた白色固体をろ過によって除去し、さらなるジクロロメタン(3 x 30mL)で洗浄した。濾液を合わせ、ロータリーエバポレーターによって濃縮して5.478gの淡黄色固体を得た。TLCは、この固体の大部分が、R_f値の高い新規な化合物と、エルゴステロールとの混合物であることを示した。R_f 0.45 (4:1 ヘキサン/EtOAc)、0.58 (CH₂Cl₂ 100%)。

［B 分子インプリントポリマー(molecularly imprinted polymer):レスベラトロール
分子インプリントポリマーの設計］
分子インプリントポリマー(MIP)の設計には、テンプレートとモノマーとの間でポリマー化前複合体を形成するような、目的とするテンプレート種と良好な相互作用を示すモノマー種の選択が必要である。分子モデリング及びNMRスペクトル分析法などのツールの使用は、「仮想スクリーン(virtual screen)」を実施することによって適切なモノマーの選択を支援し、MIPの開発に必要とされるポリマーの調製数を減少させる。

分子モデリング
溶剤を考慮に入れずにPM3構造最適化を用いてモデリング計算を行い、理論的形成エネルギー値δH_fを得た。レスベラトロールの構造最適化及び表面電子ポテンシャルを得て、レスベラトロールと官能性モノマーとなり得るモノマーとの相互作用の方法についてある程度の理解が得られた(図3)。

クラスターサイズが1〜6モノマー単位の範囲のモノマークラスターをモデル化した。これらの計算から、これらのクラスターサイズにおけるモノマーの自己相互作用に関する予測δH_f値を得た(Table4(表1))。レスベラトロールパラメーターへの理論的構造最適化及び表面電子パラメーターの導入により、下記式:
δE_i=(δH_{f_複合体}−(δH_{f_テンプレート}+δH_{f_モノマー}))
を用いて、複合体の平均形成エネルギーの推定が可能となる(図4)。
架橋性モノマーの存在は、これらのモデリング計算には含めなかった。

4-ビニルピリジン系複合体
4VPは、水素結合及び芳香族π-π相互作用の両方によって相互作用すると予想される(図5)。

Table4(表1)は、MIPの形成におけるレスベラトロール対4VPの最適比が理論的には1:3であるべきことを示している。イミン(E)-5-[(4-ヒドロキシ-フェニルイミノ)-メチル]-ベンゼン-1,3-ジオール又はアミド3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミドに関する同様な研究も、1:3の比を示している。

Maら及びZhuangら(J. Chromatographic Sci.(2008)、46(8)、739〜742頁)はいずれも、レスベラトロール及び4-ビニルピリジンからのMIPの製造を報告している。しかし、彼らは、経験的手法又はモデリング手法のいずれによっても1:3のレスベラトロール:4-VP最適比を特定しなかった。

アクリルアミドと4-ビニル安息香酸との複合体
4-ビニルピリジン(4VPyr)と共に、アクリルアミド(AAM)及び4-ビニル安息香酸(4VBA)を含む種々の他の官能性モノマー(これらに関するデータは以下に示す)を用いて、モデリング滴定実験を行った。AAMは、Xiangら¹によって非体系的実験において1:6:30のレスベラトロール:AAM:EGDMA比に基づいて使用されているので、わずか3当量のAAMの必要性を示す本発明者らのモデリング試験が最適なMIPの作成に必要であった事実にもかかわらず、本発明者らは比較のためにこの製造を再現した。1:6:30の比を用いて得られたAAM系MIPに関する静電的結合評価データは、レスベラトロールに対しては若干低い親和性が観察されるが4-ビニルピリジンを用いるMIPよりも選択性能が著しく低いことを示した結果によって、モデリング試験からの本発明者らの結論を裏付けた。また、4VBAを官能性モノマーとして用いて、MIP8(最も好結果の4VP系MIP)の製造に使用された製造条件に基づいて、分子インプリントポリマーを製造した。この場合には、モデリングデータは、モノマー比に対して信頼性のある最小値を示すことができず、ほとんどの場合、好ましくない相互作用を予測した(2、3及び4当量の4VBAに対して)。静電的結合評価データは、レスベラトロールの認識が観察されず且つごくわずかな親和性しか観察されなかったことによって、この予測を裏付けた(図6)。この結果は、4VBAとレスベラトロールの電子不足芳香族基との間に好適なドナー-アクセプター相互作用が欠如していることによって好ましい相互作用が起こることができないことによって説明できる。

¹H NMRスペクトル分析滴定
レスベラトロールをCD₃CN中に溶解させ、漸増モル当量の4VPで滴定した。各添加時に、¹H NMRスペクトルを記録し、芳香族性-OHシフトの変化を追跡した。芳香族性-OHシフトの一貫した低磁場移動によって、H結合相互作用の存在が証明された(Table5(表3)及び図7)。8当量以降は、OHピークは観察できなくなった。

種々のポロゲン混合物中に4VP及びEGDMAをそれぞれ官能性モノマー及び架橋性モノマーとして用いて、レスベラトロールインプリントモノリスを製造した(Table6(表4))。重合後、モノリスを粉砕し、粒度60〜90μmに篩い分けし、続いて、酢酸(10%v/v)を含むメタノール中で反復洗浄して、テンプレートを除去した。

レスベラトロールをテンプレートとする分子インプリントポリマー(MIP)
第1世代及び第2世代の分子インプリントポリマー(MIP)を、Table6(表4)に記載されるようにして以下の手法を用いて製造した。スバシール(suba seal)を装着したガラス試験管中で、テンプレート(レスベラトロール)及び官能性モノマー(4VP)を10分間、超音波処理した後、架橋剤(エチレングリコールジメタクリレート、EGDMA)及び遊離基開始剤(AIBN)を添加し、続いて10分間N_2(g)パージを行った。熱重合を、第1世代MIPについては、45℃で12時間、次いで50℃で24時間実施し、第2世代MIPについては、50℃で16時間、次いで55℃で5時間及び60℃で4時間実施し、バルクモノリスポリマーを生成した。テンプレートを用いない以外は全く同じ方法で、非インプリント対照ポリマー(NIP)を製造した。モノリスポリマーを反応管から取り出し、Retsch 200ボールミルを用いて粉砕し、次いで粒度60〜90μmに篩い分けした。アセトン中へポリマー粒子の懸濁及び20μmガラスフリットによる濾過を繰り返すことによって、微粒子を除去した。UV-VIS分光光度法によってv_max235nm、307nm及び321nmに観察されるテンプレートが認められなくなるまで、メタノール/酢酸(10%)中で洗浄を繰り返すことによって、レスベラトロールテンプレートを除去した。洗浄抽出物のUV-Vis分析は、>99%のテンプレートが除去されたことを示した。

典型的なMIP製造の一例について、以下に記載する:

MIP 8(LS3-54p118-1-7-08)の製造
15mL試験管中のEtOH 1mL及びACN 5mL中に、レスベラトロール228. 2mg(1mmol)及び4VP 321μL(3mmol)を溶解させ、スバシールでシールした。この溶液をN_2(g)で2分間パージし、次いで20分間超音波処理した。この溶液に、EGDMA 2.83mL(15mmol)及びAIBN遊離基開始剤51mg(0.31mmol)を加えた。次に、この反応混合物をN_2(g)で更に2分間パージした後、50℃の水浴中に18時間浸漬した。次いで、水温を24時間60℃に上昇させた。重合開始によりN_2(g)が遊離されるので、試験管に、圧力弁として作用する、プランジャーを含むニードルシリンジバレルを装着した。NIP対照ポリマーについて、レスベラトロールテンプレートを添加せずにこれを繰り返した。

次に、バルクポリマーモノリスを試験管から取り出し、圧潰し、Retsch 200ボールミルを用いて粒度60〜90μmまで粉砕した。次いで、得られたポリマー粒子をMeOH/AcOH(10%)(v/v)中で繰り返し洗浄して、テンプレート及び全ての未反応モノマー種を除去した。次に、MIP及びNIP材料をMeOHで洗浄して、微量のAcOHを全て除去し、減圧乾燥させた。

MIP結合評価
最初のMIP結合試験を、Mettler Toledo MiniBlock(商標)システムに取り付けた4.5mLのフリット付きポリプロピレン反応管を用いて行った。短時間のインキュベーションとそれに続くフラクションコレクションチューブへの真空支援濾過後速やかに、この装置を用いて、第1世代MIPのレスベラトロール親和性を評価した。これらの評価は、最も好適なテンプレート対官能性モノマー比を特定するように設計した。再結合試験を以下のようにして行った:
(1)MIP(又はそれぞれのNIP対照)50mgを、25μmポリプロピレン多孔質フリットを装着した反応管に計り入れ;
(2)レスベラトロール(0.05mM)のアセトニトリル中再結合溶液を加え、反応混合物を、連続的に振盪しながら室温で30分間インキュベートし;
(3)濾液を収集し、アセトニトリルで5倍希釈し(アリコート3mLを、路長1cmの石英キュベット及び実験的に決定した5点検量線から計算した遊離レスベラトロール濃度を用いて、UV-VISスペクトル分析法によってv_max235nm、307nm及び321nmで分析した。次いで、MIP(又はそれぞれのNIP)に結合したレスベラトロールの濃度を、最初のレスベラトロール濃度と最終遊離レスベラトロール濃度との差として求めた。次に、これを結合量Bとしてμモル/g(ポリマー)で表した);
(4)MIPを、アセトニトリルメタノール及び酢酸(10%v/v)含有メタノールで、再びメタノールで順次洗浄して、結合したレスベラトロールを除去した。

再結合溶液がレスベラトロールを含まない以外は前記手法と全く同様にして、レスベラトロール結合に関するMIP陰性対照実験を行った。

図8は、テンプレートとしてレスベラトロールを及び官能性モノマーとして4VPを用いて製造したMIPへのレスベラトロールの結合を示している。テンプレートレスベラトロールへのMIPの親和性及び結合の再現性を証明するために、アセトニトリル中レスベラトロール溶液(0.05mM)1mLを用いて、多重迅速スクリーニングアッセイを行った。インプリンティング効果の証拠は、製造及び試験したレスベラトロールインプリントポリマーのいずれについても明らかに明白であった。

最も適切なテンプレート対官能性モノマー比を更に確認するために、レスベラトロール濃度の10倍増加(0.5mM)を用いるアッセイを使用した。結果を図9に示す。

MIPの性能をNIP対照に対して関連づける相対インプリンティングファクター(imprinting factor)(IF)を、各MIPについて、
IF=B_MIP/B_NIP
[式中、B_MIP及びB_NIPはそれぞれ、MIP及びNIPに結合したレスベラトロールの量である]
から求めた。

したがって、モデリングデータによれば、最も好適なテンプレート:モノマー比は、官能性モノマーとして4VPを用いたレスベラトロールインプリントポリマーの製造に関しては1:3であることが特定された(Table7(表5))。このようにして製造したMIPは、低いレスベラトロール濃度及び中等度のレスベラトロール濃度(それぞれ、0.05mM及び0.5mM)における連続的な反復結合試験後に、高い性能レベル(最も高い能力及びIF値)の維持を示した。

ポロゲン及び架橋量の効果
続いて、この配合に基づくMIPを、種々の量のEGDMAを用いて製造して、結合親和性に対する架橋の効果を判定した。MIPの例は、MIP2、MIP5、MIP7、MIP8、MIP9及びMIP10である。

しかし、MIP7は、擬似沈殿重合(pseudo precipitation polymerisation)を引き起こし、物理的に軟質であるか又は弱く且つ粒度<20μmの微粒子又はビーズまで縮小されたタルク様ポリマーを生成したことが観察された。これは、レスベラトロールテンプレートの溶解に少ない架橋量及び大きいポロゲン体積が必要であることが原因であった。このような粒度は分析法には有用であるが、小さい粒度は結合性能に関係なく、許容され得ないほど高い背圧をもたらすため、このポリマーは、更なる大規模又は工業規模の分離手法には適さないと考えられた(データは示さず)。

したがって、少量のEtOHをACNポロゲン(MIP8)中に含ませて、テンプレートレスベラトロールの溶解度を増加させることによって、ポロゲン体積が減少し、好適な粒度に粉砕及び篩い分けされ得るモノリシックポリマーが製造された。

ACN/EtOH(5:1v/v)ポロゲン混合物を含むポリマーの製造例を、MIP8(LS2-6p10-7-2-07)について以下に記載する:

静電的結合アッセイを用いて、架橋の効果を評価した。アッセイの一例を以下に詳述する:

1.7mLエッペンドルフチューブ中に、MIP30mg、アセトニトリル中レスベラトロール(0.5mM)1.5mLを計り入れ、得られたサンプル混合物を、28℃においてロータリーサスペンションミキサー(rotary suspension mixer)を用いて18時間混合した。各サンプルを二重反復で調製し、NIP対照サンプルについても繰り返した。これに加えて、各ポリマー30mgとブランクアセトニトリル溶液1.5mLとを用いて、ブランク対照サンプルを調製した。次に、サンプルを13000rpmにおいて15分間遠心分離し、200μLのアリコートを取り出し、γ=321nmの波長でのUV-VIS検出を用いる定組成条件下での逆相HPLC分析を行った。曲線下の面積を測定し、実験的な5点検量線を用いて遊離レスベラトロール濃度を求めた。MIPに結合したレスベラトロールの濃度を、結合溶液の濃度から遊離レスベラトロール濃度を差し引くことによって計算した。結果を図10に記載する。

本発明の重要な態様は、MIP製造とその結果生じる結合親和性を再現できることである。これの一例として、MIP8を複数のバッチで製造し(図11)、結合性能を、前述した静電的結合試験によって観察した。これらの結果は、良好な再現性と約10〜11μモル/g(ポリマー)の一貫したレスベラトロールの結合性能とを明白に示した。

本発明の範囲内で検討したMIPの結合特性に関する更なる試験は、静電容量(static capacity)試験及び静電的交差反応性試験を含み、MIP8を用いるこれらの例を以下に記載する。静電的結合アッセイ:1.7mLエッペンドルフチューブにポリマー(MIP及びNIPの両方)30mgを量り入れ、これに、漸増濃度の、アセトニトリル中一定容量(1.5mL)のレスベラトロール溶液を添加した。得られた混合物を、約40rpmで18時間(特に断らない限り)混合しながらインキュベートした後、混合物を13000rpmで15分間遠心分離した。上清の200μLアリコートを取り出し、逆相HPLC分析によってUV検出を用いて分析し、上清中のレスベラトロール濃度を5点検量線によって求めた。これを最初の結合溶液から差し引いて、結合したレスベラトロールの量を得た。結合(B)を結合した検体Bとしてμmol/g(ポリマー)で表した。

予備データは、明白な能力を示さないが(曲線中のプラトーによって示されるように)、NIP対照ポリマーへの非特異的結合が、反復結合実験全体にわたってかなりばらつきが大きく(図12)且つ驚くほど結合性が高いことが観察された。

静電的交差反応性結合アッセイ
静電的交差反応性試験については、結合手法は、検体結合溶液の濃度を0.5mMに保った以外は前記と同じであった。

MIP_E(LS 2-6p10-7-1-07)に関する交差反応性試験は、様々な範囲の0、1、2、3及び4点化合物を用いて進めた。この試験に用いた化合物は次の通りである:レスベラトロール(1)、3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド(BDp105-21-8-07)(2)、「グリーン(green)」レスベラトロール(BDp55-11-12-2006)(3)、(E)-5-(4-ヒドロキシスチリル)ベンゼン-1,2,3-トリオール(BDp75-23-7-2007)(4)、(E)-4-(3,5-ジニトロスチリル)フェノール(BDp15-2-11-06)(5)、(E)-4-(3,5-ジメチルスチリル)フェノール(BDp127-22-9-06)(6)、(E)-5-スチリルベンゼン-1,3-ジオール(BDp123-8-3-07)(7)、カフェイン酸(caffeic acid)(8)、(E)-3,4'-(エテン-1,2-ジイル)ジフェノール(BDp35-23-5-07)(9)、(E)-4-スチリルフェノール(BDp81-5-10-2007)(10)、(E)-3-スチリルフェノール(BDp47-15-6-07)(11)、(E)-スチルベン(12)、5-(4-ヒドロキシフェネチル)ベンゼン-1,3-ジオール(BDp55-12-7-2006)(13)、5-(4-ヒドロキシフェネチル)ベンゼン-1,2,3-トリオール(BDp67-16-7-2007)(14)、3-(4-ヒドロキシフェネチル)フェノール(BDp35-23-5-07)(15)、ビスフェノールA(16)、3-フェネチルフェノール(BDp55-27-6-07)(17)、4-フェネチルフェノール(BDp89-9-8-06)(18)。

このセクションに用いたナンバリングスキームは、図13中のナンバリングスキームに対応する。

交差反応性結合データ(図13)は、MIP8への結合親和性に関係する構造要件の一部を取り上げている。結合親和性が、複数の水素結合単位とC=C、C=N又はNH-C=O連結基とが一緒に存在することによって強く影響されることは明らかである。アミド及びイミン類似体(それぞれ2及び3)の親和性及び選択性は、レスベラトロールと同様であり、適用された検体の約55%がMIP8上に保持されている。興味深いことに、追加のOH基を保持しながらC=C二重結合を除去すると(14)、MIP8及びNIP8のいずれに対しても収着が約65%低下した。この同じ傾向は、それほどではないが、全ての種に関して観察された。これは、C=C結合によって与えられる電子密度又は剛性の増大によって、MIP8の親和性及び多くの場合、選択性が増加することを示している。

他の注目に値する観察は、最小の親和性が観察されるニトロ類似体(5)、ジメチル類似体(6)及びスチルベン類似体(12)の場合に見られるように、2つ以上の-OH単位の除去時に親和性が喪失されることである。

レスベラトロール類似体をテンプレートとして用いるMIP
MIP8に対して親和性を示す一部のレスベラトロール類似体、例えば、アミド類似体及びイミン類似体(図13)もまた、テンプレートとしてMIP材料中に組み入れることによって、レスベラトロール及び/又は他のポリフェノールを結合できる空洞を作成し、その結果としてテンプレートとしてレスベラトロールを用いなくてすむようにした。これらのMIP材料は、MIP8に関して前述した手法を用いて、Table8(表6)に要約したようにして製造した。

レスベラトロール類似体をテンプレートとする分子インプリントポリマーの例を図14に示す。図14は、静電的条件下でアセトニトリル溶液からのレスベラトロールを結合するそれぞれの能力を示している。アミド類似体及びイミン類似体がインプリントされたポリマーは良好なレスベラトロール親和性を示し、アミドインプリントポリマーの結合性能はMIP8に匹敵した。

分子インプリント固相抽出(MISPE)試験
ポリフェノールなどの生物活性物質の、工業規模での分離及び濃縮にMIP技術を成功裏に適用するためには、良好な分離及び大流量を与える方式が必要である。したがって、この技術に適切な方式の一例は、固相抽出などの、拡張性のある液体クロマトグラフィー技術であると予想された。

MISPEカラム調製の一例
最初のMISPEカラム及び非インプリント固相抽出(NISPE)カラムを、20μmガラスフリットでキャップされた3.5mLのシリンジバレル中で調製した。乾燥MIP100mgを、シリンジバレル中にスラリー充填し、一夜沈降させた。第2のガラスフリットキャップを、湿潤充填カラム上に載せ、次いで、カラムを湿潤状態に保つように注意することによってカラム充填における空隙及び亀裂の形成を防ぎながら、プランジャーを用いてそっと圧縮した。これを、それぞれのNIP対照材料について繰り返した。カラムを、メタノール、酢酸(10%v/v)含有メタノール、メタノール及びアセトニトリルで連続的に洗浄した。

一般的なMISPEアッセイプロトコール
酢酸(10%v/v)含有メタノール、メタノール及びアセトニトリルを連続的に用いて、MIPカラムを予備状態調整した。MISPEカラムに1mLのレスベラトロール(又は検体)溶液(0.5mM)を装填後、次の洗浄ステップからの溶出液及び溶媒を、単一のフラクションチューブに収集した。結合分子の溶離は、酢酸(10%v/v)含有メタノールでの数回の洗浄によって実施した。サンプルを遠心分離によって清澄化し、上清のアリコートを逆相HPLCによって分析した。アセトニトリル又はアセトニトリル/H₂O以外の溶媒を含むサンプルは、真空下で30℃において蒸発させ、次いでアセトニトリル中で戻してから、分析を行った。サンプルは全て、流速0.5mL/分で移動相としてのアセトニトリル/H₂O(7:3)中へ定組成溶離させることによってクロマトグラフ処理した。レスベラトロールの検出及び定量化には321nmでのUV-VIS検出を用いた。

MISPE材料の製造を、変形された方法及び装置を用いて更に改善し、複数の再現可能なMISPEアッセイにおいてレスベラトロールに対する吸着選択性の増大を示すMIPが得られた。この操作を、種々のテンプレート:官能性モノマー:架橋剤(T:FM:XL)比及び別のポロゲンを用いて製造されるいくつかの異なるMIPに適用した。これらのMISPEカラム上でのレスベラトロールの保持を図15に示す。図15は、アセトニトリル/エタノール(5:1v/v)と1:3:15のT:FM:XL比とを用いて製造されたMIPが、他のMIP調製物より性能面で明らかに優れ、アセトニトリルで徹底的に洗浄後のインプリンティングファクターが10:1に近いことを示している。ポロゲン溶媒中のエタノールの存在は、有益な影響をもたらす。これは、テンプレートの溶解度の増加、ポロゲン体積の減少による又は製造のポリマー化前段階においてπ-πスタッキングなどの分子間相互作用に影響を及ぼすことによる、構造剛性の増加によってもたらされると考えられる。

続いて、半水性条件(水中エタノール(20%v/v))下において、MISPE方式で、水中20%(v/v)エタノールによる2回の洗浄とそれに続くメタノール中1%(v/v)アセトニトリル及びアセトニトリルによる連続洗浄とを含む清浄化ステップを用いて、MIP8の性能を調べた。図16は、最初のレスベラトロール溶液の約80%が保持され且つエタノール水溶液でのすすぎによる清浄化後のインプリンティングファクターが約2であることにより、MIP8への高吸着を示している。一方、アセトニトリルによる洗浄を適用して非特異的結合を除去した後には、良好な吸着レベルを保持しながら、MIPとNIPとの間の選択性が著しく増大した。

MIP8へのレスベラトロール親和性に対するエタノール及び水分含量の影響を、水性結合条件下でエタノール含量を増加させることによって調べた。比較し易いように、レスベラトロールの結合量を最初の装填溶液の百分率として表す(図17)。これに加えて、図17は、非特異的結合を除去するための清浄化溶媒として、アセトニトリルの代わりに環境に優しいエタノール水溶液を適用することを示している。このデータによると、20〜50%のEtOH含量は、水性条件下にある場合にレスベラトロールの優先的な認識をもたらすように見える。

農業供給原料からの複合サンプルの適用
ブドウ圧搾廃棄物などの複合供給原料からレスベラトロールを濃縮する、ひいてはオーストラリアの食品産業にとって有効な価値付加プロセスとなる、MIP 8の能力を評価するために、ブドウ種子サンプルを、MIP8を充填した100mg MISPEカラムに適用した。

生のブドウ種子は、CSIRO、Food Science Australia Werribeeによって提供された(バッチNo.02VIN03)。2×10gのサンプルを量り分け、そのうち1つにはレスベラトロール200μgを加え、Romero-Perezらによって報告された手法⁶に基づいてアセトン中で連続的にソックレー抽出を行い、対照BDp119-14-9-2006抽出物及び添加BDp119-14-9-2006抽出物を生成した。1gの各抽出物を別々に80%(v/v)エタノール中に懸濁させ、次いで30分間超音波処理し、3000rpmで30分間遠心分離した。各可溶性抽出物の1mLのアリコートを、100mgのMIP 8を充填したオフラインMISPEカラムに適用し、次いで80%(v/v)エタノールで洗浄し、続いて、アセトニトリルによる連続洗浄及びメタノール中10%(v/v)AcOHによる最終溶離を行った。水中80%(v/v)エタノール中のレスベラトロール標準溶液を、MIP 8を充填した別個のMISPEカラムに適用し、ブドウ種子抽出物と同一の方法で処理した。非インプリント対照カラム(NISPE)を、それらの各MIP対応物と全く同じ方法で処理した。MIPSEカラムから回収された結合材料のアリコートを、HPLCによって分析した(図18参照)。

図18B)及び図18C)は、MISPEカラムからの溶離後2.735分に観察されたレスベラトロールと一致するピークによって示されるように、MIP 8を充填したMISPEカラムは、ブドウ種子抽出物などの複合供給原料からレスベラトロールを濃縮できたことを示している。これに対して、NISPEカラムについてはこのようなピークは観察されなかった。

1gのMIP材料上でのピーナッツミール(peanut meal)抽出物の分子インプリント固相抽出(MISPE)の実証
10gのピーナッツミールの抽出物(BDp63-9-7-07)を、500mLのEtOH/H₂O(50/50v/v)溶液として調製した。混合物を遠心分離し、濾過した後、100mLのアリコートを、1gのMIP8材料(1s3-26p62-1-4-08)を用いて分子インプリント固相抽出(MISPE)によって処理した。次に、MIPカラムを、4カラム容量(4×10mL)のエタノール水溶液(EtOH/H₂O 50/50v/v)で洗浄し、続いて、3カラム容量のアセトン水溶液(アセトン/H₂O 50/50v/v)を用いて選択的なクリーンアップウォッシュ(clean up wash)を行った。残りの結合検体を、5×5mLのMeOH中10% AcOH及び2×5mLのアセトンによって溶離させた。1gの非インプリント対照ポリマー(NIP)を充填したカラムを用いて、この手法を繰り返した。溶出フラクションを合わせ、蒸発乾固し、50%EtOH水溶液中で1mLとし、その200μLのアリコートを、逆相HPLCによって0.5mL/分の流速で定組成溶離を用いて分析した(Table9(表7))。

結果の要約
逆相HPLCによって作成した、非処理及びMISPE処理ピーナッツミール抽出物のクロマトグラム(図19)は、レスベラトロールの選択的濃縮(約20倍の濃度増加)及び未知検体の保持(濃縮は観察されなかった)(RT=9.6分)を示した。MISPE処理操作はまだ最適化が必要であり、したがってレスベラトロール及び他の検体の濃縮はまだ改善の可能性があることに留意すべきである。

1gのMIP材料上でのピーナッツミール抽出物の分子インプリント固相抽出(MISPE)の実証(40倍濃縮)
実験の要約
ピーナッツミール抽出物(10g)を500mLのEtOH/H₂O(50/50v/v)中で生成した。混合物を遠心分離し、濾過した後、100mLのアリコートを、1gの分子インプリントポリマー(MIP)材料を用いて分子インプリント固相抽出(MISPE)によって処理した。次に、MIPカラムを、4カラム容量(4×10mL)のエタノール水溶液(EtOH/H₂O 50/50v/v)で洗浄し、続いて、3カラム容量のアセトン水溶液(アセトン/H₂O 50/50v/v)を用いて選択的なクリーンアップウォッシュを行った。残りの結合検体を、5×5mLのMeOH中10%AcOH及び2×5mLのアセトンによって溶離させた。1gの非インプリント対照ポリマー(NIP)を充填したカラムを用いて、この手法を繰り返した。溶出フラクションを合わせ、蒸発乾固し、50%EtOH水溶液中で1mLとし、その200μLのアリコートを、逆相HPLCによって0.5mL/分の流速で勾配溶離を用いて分析した(Table10(表8))

結果の要約
逆相HPLCによって作成した、非処理及びMISPE処理ピーナッツミール抽出物のクロマトグラム(図20)は、インプリンティングファクター(I)(66)でレスベラトロールの選択的濃縮を示した。注目できるのは、正m/zが577amuの未知検体(RT=9.6分)も捕捉されたが、有意な濃縮は観察されなかったことである。MISPE処理操作はまだ十分な最適化が必要であるので、レスベラトロール及び他の検体の濃縮は更に改善の可能性があることに留意すべきである。

［C 分子インプリントポリマー:フィトステロール］
フィトステロール及びフィトスタノールは、ヒトの低比重リポタンパクコレステロール(LDL-C)レベルを最大15%低下させることが知られており、現在市販されているいくつかの製品は、天然由来の脂肪酸エステルの形態のフィトスタノール(スタノールエステル)及びフィトステロールである。フィトステロールは、動物脂肪コレステロールと構造的に類似した植物脂肪である。全ての植物、例えば、特に果物、野菜、穀類、香辛料、種子及び木の実は、これらのステロール化合物又はステロリンを含む。最もよく見られるフィトステロールのいくつかは、β-シトステロール、スチグマステロール及びカンペステロールなどである。植物油はフィトステロールの特に豊富な供給源であるが、全ての供給源が高コレステロール又は高コレステロール血症の治療又は予防に有効であると考えられている。図21は、コレステロール並びによく見られるフィトステロール(β-シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール及びブラシカステロール)及びフィトスタノール(β-シトスタノール及びカンペスタノール)の化学構造を図示している。

γ-オリザノール。γ-オリザノールは、シクロアルテノール及び24-メチレンシクロアルタニルなどのトリテルペンアルコールのフェルラ酸エステルの混合物である。γ-オリザノールは、抗酸化活性、血清コレステロールの低下、コレステロール吸収の減少並びに早期アテローム性動脈硬化の減少、血小板凝集の阻害、腫瘍促進の阻害、更年期障害の治療及び抗潰瘍活性などの潜在的な機能を有することが示唆されている。図22は、γ-オリザノール中の6つの主要成分:カンペステリルフェルレート、カンペスタニルフェルレート、β-シトストリルフェルレート、シクロアルテニルフェルレート、シクロアルタニルフェルレート及び24-メチレン-シクロアルタニルフェルレートを図示している。

γ-オリザノールの機能は有望であるので、米ぬか及びγ-オリザノールは、大きな市場可能性を有すると考えられ、コレステロール低下作用及び抗酸化作用をもたらし得る広範囲の製品及び機能性食品に適用できる。

分子インプリントポリマーの製造
これまで製造された種々の非共有結合性及び共有結合性MIPの種々の調製物を、Table11(表9)に要約する。

重合:非共有結合性アプローチ(テンプレートコレステロール、ポロゲンクロロホルム)
分子インプリントポリマー(MIP)は、テンプレート分子としてコレステロール及びスチグマステロールを別々に用いて製造した。MIP及びそれらの各非インプリント対照ポリマー(NIP)を、以下の手法に従って製造した。テンプレート(コレステロール又はスチグマステロール:1eq)、官能性モノマー(4VP又はメチルアクリル酸:3eq)をポロゲン(CHCl₃)中に溶解させ、次いで10分間超音波処理した。続いて、架橋剤(エチレングリコールジメタクリレート、EGDMA:30eq)及び遊離基開始剤(AIBN:0.25eq)を加え、60℃において24時間、熱重合を行った。NIPを、テンプレートの不存在下で同一の方法で製造した。

重合:非共有結合性アプローチ(テンプレートコレステロール、ポロゲン H₂O:TFA(9:1))
分子インプリントポリマー(MIP)は、テンプレート分子としてコレステロール用いて製造した。MIP及びそれらの各NIPは、以下の方法に従って製造した:テンプレート(コレステロール:1eq)、官能性モノマー(MMA:3eq)をポロゲン(H₂O:TFA、9:1)中に溶解させ、次いで10分間超音波処理した。続いて、架橋剤(エチレングリコールジメタクリレート、EGDMA:30eq)及び遊離基開始剤(AIBN:0.25eq)を加え、65℃において24時間、熱重合を行った。NIPを、テンプレートの不存在下で同一の方法で製造した。

分子インプリントポリマーの性能:
図23及び24はそれぞれ、テンプレート分子としてコレステロールを用いて製造したMIPの2つの「非共有結合性モデル」の性能を示している。コレステロール溶液(0.5mM)の結合を、レスベラトロールの部に記載した再結合実験を用いて評価した:溶出液中のコレステロールの存在は、208nmにおける吸光度の測定によって定量化した。これらのMISEPEカラム上でのコレステロールの保持が示される。これは、これらの方法を用いて製造したMIPが、少なくとも10:1のインプリンティングファクターでコレステロールを特異的に吸収することを示している。

同様な再結合実験は、これらのMIPがいずれも、図25及び26に示すように、スチグマステロールを結合できることを示した。

スチグマステロールとコレステロールとの化学構造の違いがMIPの全体認識に影響を及ぼすかどうかを調べるために、テンプレートとしてスチグマステロールを用いて第2の組のMIP及びNIPを製造した。MIPは、T:MMA:EDGMAを1:3:30の比で用いて前述のようにして製造した。再結合実験の結果を、図27に示す。

MIP19及びMIP20との比較による、ポロゲン 9:1 H₂O:TFAとコレステロール及びスチグマステロールとを用いた「グリーンポリマー(Green Polymer)」(MIP21及びNIP21)の評価
導き出すことができる予備的結論は、「グリーンポリマー」がスチグマステロール及びコレステロールの両方をある程度認識でき(図28及び29を参照)、したがって、異なる種類のフィトステロールとフィトスタノールとを生物活性標的として識別しようとする更なる検討及び適用のための最も好適なモデルシステムとなることである。

ポリマーを再生利用しようとする試みは有望であった。これを、図30に要約する(クロロホルムをポロゲンとする)。ポリマーの機能に顕著な変化を生じずに再利用可能な形態でMIP/NIP技術を適用及び適合できるため、結果は期待の持てるものである。

テンプレートとしてコレステリルフェルレートを用いる非共重合性重合
1. MIPの非共重合性重合のためのテンプレートとしてのステリルフェルレートの合成
スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール及びβ-シトステロールを含むフィトステロールの混合物を、入手の容易なフェルラ酸を用いて、対応するフェルラ酸エステルに誘導体化した(図31)。

トランス-4-O-アセチルフェルラ酸の合成

フェルラ酸を、水中Ac₂O/NaOHを用いてアセチル化して、トランス-4-O-アセチルフェルラ酸を生成した。生成物を、1M HClを用いて溶液のpHを4〜5に調整することによって精製して、白色沈殿物を形成した。続いて、これをH₂Oで洗浄し、乾燥させ、結晶質固体として収集した。

¹H (300MHz, CDCl₃) 7.0〜7.5 (m, 3H, Ar)、6.2 (m, 1H)、3.70 (s, 3H, OCH₃)、2.0 (s, 3H, CH₃)。

3-O-(トランス-4-O-アセチルフェルロイル)コレステロールの合成:
トランス-4-O-アセチルフェルラ酸及びコレステロールを、乾燥CH₂Cl₂に溶解させた。DMAP及びCH₂Cl₂中DCCを加え、混合物を室温で18時間撹拌した。固体副生成物を濾去し、溶液をH₂Oで1回、次いで10% HOAcで2回、H₂Oで2回、連続的に抽出した。有機抽出物を合し、無水MgSO₄上で乾燥させ、蒸発させて、白色固体を得た。固体を最少量のTHFに溶解させ、0℃において一夜冷却して、残留副生成物を全て沈殿させた。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させて、固体を形成した。この固体を、カラムクロマトグラフィーによって25%EtOAc/ヘキサン中への定組成溶離によって精製して、最終生成物を灰白色の結晶質固体として得た。
¹H (300MHz, CDCl₃) 7.62 (d, 1H, J=16Hz, Ar)、7.10 (m, 2H, Ar)、6.37 (d, 1H)、4.83 (m, 1H)、3.86 (s, 3H)、2.33 (s, 3H)、0.6〜2.0 (m, 50H)。

3-O-(トランス-4-O-アセチルフェルロイル)β-シトステロールの合成:
トランス-4-O-アセチルフェルラ酸及びβ-シトステロールを乾燥CH₂Cl₂に溶解させた。DMAP及びCH₂Cl₂中DCCを加え、混合物を室温で18時間撹拌した。固体副生成物を濾去し、溶液をH₂Oで1回、次いで10% HOAcで2回、H₂Oで2回、連続的に抽出した。有機抽出物を合し、無水MgSO₄上で乾燥させ、蒸発させて、白色固体を得た。固体を最少量のTHFに溶解させ、0℃において一夜冷却して、残留副生成物を全て沈殿させた。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させて、固体を形成した。この固体を、カラムクロマトグラフィーによって25% EtOAc/ヘキサン中への定組成溶離によって精製して、最終生成物を灰白色の結晶質固体として得た。
¹H (300MHz, CDCl₃) 7.62 (d, 1H, J=16Hz, Ar)、7.10 (m, 2H, Ar)、6.37 (d, 1H)、4.83 (m, 1H)、3.86 (s, 3H)、2.33 (s, 3H)、0.6〜2.0 (m, 50H)。

3-O-(トランス-4-フェルロイル)-コレステロールの合成:
3-O-(トランス-4-O-アセチルフェルロイル)コレステロールを2:1 CHCl₃:MeOHに溶解させ、K₂CO₃(0.2eq)を添加し、混合物を6時間還流させた。続いて、NH₄Cl飽和水溶液の添加によって反応を止め、有機相を分離し、H₂Oで2回洗浄し、MgSO₄上で乾燥させた。3:1 CHCl₃:MeOHから再結晶後、最終生成物を灰白色の固体として得た。
¹H (300MHz, CDCl₃) 7.62 (d, 1H, J=16Hz, Ar)、7.10 (m, 2H, Ar)、6.91 (d, 1H)、6.2 (d, 1H)、5.96 (s, 1H)、4.83 (m, 1H)、3.86 (s, 3H)、0.6〜2.0 (m, 50H)。

重合:非共重合性アプローチ(テンプレートコレステリルフェルレート(2a)、ポロゲンクロロホルム)
分子インプリントポリマー(MIP)は、テンプレート分子としてコレステリルフェルレートを用いて製造した。MIP及びそれらの各NIPを、以下の手法に従って製造した。テンプレート(コレステリルフェルレート:1eq)、官能性モノマー(4VP又はメチルアクリル酸:3eq)をポロゲン(CHCl₃)に溶解させ、次いで10分間、超音波処理した。続いて、架橋剤(エチレングリコールジメタクリレート、EGDMA:30eq)及び遊離基開始剤(AIBN:0.25eq)を添加し、60℃において24時間、熱重合を実施した。NIPを、テンプレートの不存在下で同一の方法で製造した。

予備的再結合試験を、以下のようにして実施した:

MIP対照は、再結合溶液がテンプレートを含まない以外は同様にして処理した。

結合データを、ポリマーに結合した適用コレステリルフェルレート、コレステロール又はスチグマステロールの百分率として分析した。遊離コレステリルフェルレート、コレステロール又はスチグマステロールの濃度は、4点検量線から求めた。次いで、結合したコレステリルフェルレートの百分率(図32及び33)は、結合%=100-((C_f/C_i)×100)[式中、C_fは遊離コレステリルフェルレートの濃度であり、C_iは最初のコレステリルフェルレートの濃度である]として計算できた。

「カートリッジ」再結合試験全般

コレステリルフェルレートをインプリンティング用テンプレートとして「共有結合性アプローチ」を用いた重合
分子インプリントポリマー及びそれらの各非インプリント対照ポリマー(NIP)を、以下のようにして製造した:ポロゲンとしてCHCl₃中4VP:架橋剤(1:10)(架橋剤はEGDMAである)を用い、遊離基開始剤としてAIBNを用いた。

共有結合性インプリントポリマー及びその非インプリント相当物の性能。
性能を、図34に詳述する。

今後の検討は、ポリマーの性能及び選択性を最適化するために、ポロゲン(例えば、エタノール、H₂O/TFA)の効果の検討を含む。

「ハイブリッドアプローチ」を用いる重合:
一貫性を保つために、「ハイブリッドポリマー」を、T:M:C比を1:3:30として製造した。Tがコレステロールである場合、Mは(E)-3-(4-(メタクリルオキシ)-3-メトキシフェニル)アクリル酸であり、CはEDGMAである。

ポリマーの性能:
ポリマーの性能は、「ハイブリッドアプローチ」が当該基質に、増大した可撓性及び選択性を加えることを示している。

ハイブリッドポリマーは、エステル様基質に関する良好な選択性及び低レベル〜中レベルの非特異的結合を示す(図35)。ポリマー組成は、提供された廃棄物材料の粗混合物への適用に好適である。

［D. 生物活性ポリフェノール(E)-レスベラトロールの選択的認識のための分子インプリントポリマーの製造］
この実施例においては、非共有結合性自己組織化(self-assembly)による(E)-レスベラトロールインプリントポリマーの設計及び製造、並びに構造的に類似した類似体全体にわたる(E)-レスベラトロールに対する選択性の評価を記載する。

材料及び方法
試薬。レスベラトロール3-β-D-グルコピラノシド(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン-3-β-D-グルコピラノシド) 5、(E)-スチルベン 8、4-ビニルピリジン(4VP)、エチレングリコールジメタクリレート(EGDMA)及び2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)(AIBN)は、Sigma-Aldrichから購入した。MIPの製造及び評価に用いた溶媒は全て、HPLCグレードである。

装置。サンプルのHPLC分離には、真空脱ガス装置を有するバイナリーポンプ、900μLサンプルループを有するオートサンプラー、サーモスタット付きカラムコンパートメント及びダイオードアレイ検出器からなるAgilent Technologies 1100 LCシステム(Waldbronn、Germany)を使用した。注入サンプルは、Zorbax Eclipse XDB-C18カラム(4.6×150mm、粒度5μm)でRP-HPLCによって分析した。

化合物。選択化合物は、中心のE-スチルベンコアの周囲の、潜在的結合部位の数及びそれらの相対位置を比較検討できるように選んだ。一般的な合成方法をスキーム4に要約する。

試薬及び条件:括弧内に示す収率は、(E)-レスベラトロールに典型的である。(i)Ac₂O、pyr、DMAP、EtOAc、0〜40℃、2時間、(72%)、又はAc₂O、Et₃N、EtOAc、還流、4時間、(34%);(ii)SOCl₂、DMF、トルエン、100℃、3時間、(100%);(iii)2%Pd(OAc)₂、NEM、トルエン、還流、一夜、(51%);(iv)(a)KOH、MeOH、還流、60分、次いで(b)HCl(aq)、(79%)又はTsOH、MeOH、85℃、一夜、(95%)。

(E)-レスベラトロール 1及びヒドロキシル化スチルベン類似体(E)-5-(4-ヒドロキシスチリル)ベンゼン-1,2,3-トリオール 2、(E)-5-スチリルベンゼン-1,3-ジオール 3、(E)-3-(4-ヒドロキシスチリル)フェノール 4、(E)-4-スチリルフェノール 6、(E)-3-スチリルフェノール 7、(及び更なるポリフェノール)の製造に関する詳細な説明は、前記で報告してある。この方法は、官能化された安息香酸をより活性なその酸塩化物に転化させ、蒸留による溶媒除去後に直ちに適切なスチレンと共反応させることを伴った。触媒量の酢酸パラジウムによって、カップリング反応を良好に促進した。このカップリング反応は、カルコン中間体を経て進行すると報告されている。しかし、これらの条件下では、スチルベン付加物のみが単離された。これは、完全な脱カルボニル化反応がこの反応過程で同時に起こったことを示している。生成物のE立体化学は、¹H NMRにおいて特徴的なJ_trans=16Hzカップリング定数によって容易に確認され、Z異性体は検出されなかった(予想J_cis=≦12Hz)。

分子モデリング。モデリング計算は全て、Pentium(登録商標) IV 2.0 GHzプロセッサ環境でWindows(登録商標) V100用ソフトウェアパッケージとしてSpartan'08を用いて実施した。モデリング操作は、前述の方法に基づいて行った。PM3力場を用いて半経験的平衡配置レベル理論(semi-empirical equilibrium geometry level theory)を適用することにより、溶媒効果を配慮せずに気相で形成エネルギー値(δH_f)をテンプレート、モノマークラスター及びモノマー-テンプレートクラスターについて計算した。1〜6モノマー単位の範囲のモノマークラスターサイズをモデル化し、これらのクラスターサイズでのモノマーの自己相互作用について、δH_f値を求めた。次に、テンプレート又はモノマークラスターのいずれに対しても事前定義済みの方向を与えずに、(E)-レスベラトロール構造ファイルを各クラスターファイルに挿入した。平衡配置は、反復アプローチを用いて求めた。最低3回の反復により、複合体の平均形成エネルギーの理論推定値(δE_i)を得た。これは、下記式:
δE_i=δH_{f_複合体}-(δH_{f_テンプレート}+δH_{f_モノマー})
を用いて求めた。

¹H NMRスペクトル分析滴定。CD₃CN中に溶解させた(E)-レスベラトロール(23mg、0.1mM)を、漸増モル当量の4-ビニルピリジン(4VP)で滴定した。各添加後に¹H NMRスペクトルを記録し、H結合相互作用の存在が、添加の増加に伴う芳香族性-OHシグナルの一貫した低磁場シフトによって示されるまで、この芳香族性-OHシフトの変化を追跡した。ピークの広幅化によって芳香族性-OHシグナルがもはや検出できなくなるまで、このプロセスを続けた。

MIPの製造。MIPは、官能性モノマー4VP(322μL、3mmol)を加えたガラス試験管中でテンプレート(E)-レスベラトロール(228mg、1mmol)をCH₃CN/EtOH(6mL、5:1v/v)に溶解させることによって製造した。混合物を10分間超音波処理し、架橋剤EGDMA(2.314mL、15mmol)及び遊離基開始剤AIBN(51mg、0.31mmol)を添加した。このポリマー化前混合物にN₂(g)を5分間スパージし、50℃のサーモスタット付き水浴中に24時間入れた。多数のポリマー生成物を、60℃で更に24時間加熱することによってアニールさせた。次いで、ポリマーを反応管から取り出し、次いでRetsch 200ボールミルを用いて圧潰及び粉砕した。続いて、粉砕粒子を篩い分けし、粒度63〜100μmの粒子を貯留した。ポリマー粒子のアセトン中への懸濁及び上清のデカントからなるサイクルの反復によって、微粒子を除去した。軽く撹拌しながら10容量%のAcOHを含むMeOH(50mL)中で繰り返し洗浄することによって、(E)-レスベラトロールテンプレートをMIP樹脂から除去した。洗液を、UV-Visスペクトル分析法によって321nmで監視し、少なくとも3回又はテンプレートがもはや検出できなくなるまで繰り返した。次いで、MIPをMeOHで洗浄して、微量のAcOHを除去し、濾過し、真空乾燥させた。非インプリント対照ポリマー(NIP)は、テンプレート分子の不存在下で行う以外は全く同じ方法で製造した。MIP及びNIPの製造の要約を、Table 12(表12)に示した。

MIPの評価。CH₃CN中0〜4mMの濃度範囲にわたる(E)-レスベラトロール飽和試験を、MIP及びNIPを一定ポリマー重量で用いて行った。MIP及びNIP基準材料を用いて観察した結合事象の比較により、インプリンティングが(E)-レスベラトロールの吸着に及ぼした影響の程度が明らかになった。ポリマー(30mg)を、1.7mLのエッペンドルフチューブ中に量り入れ、検体溶液(1.5mL、0〜4mM)と共に、回転ミキサー上において40rpmで18時間インキュベートした。次いで、混合物を13000rpmにおいて15分間遠心分離して、リガンド結合ポリマーをペレット化した:上清のアリコート(200μL)を取り出し、RP-HPLCによって321nmにおけるUV検出を用いて分析し、非結合(E)-レスベラトロールの濃度を、直線状の5点検量線から求めた。最初の総検体濃度からこの値を差し引いて、結合した検体の量(B)(μmol/g(ポリマー)として表す)を得た。

架橋剤とランダムに分散された官能性モノマーとの相互作用によって生じる非特異的表面結合を更に検討するために、静電的結合アッセイを、MIP及びNIPについて並行して行った。ポリマー(30mg)を1.7mLのエッペンドルフチューブに量り入れ、(E)-レスベラトロール溶液(1.5mL、CH₃CN中0.5mM)を添加した。次いで、得られた混合物を前述のようにして処理し、分析した。

結果及び考察
分子インプリントポリマーの設計。(E)-レスベラトロールインプリントポリマーの合理的設計に役立つ複数の方法を用いた。分子モデリング法を用いて、(E)-レスベラトロールと様々な範囲の潜在的官能性モノマークラスターとの分子間相互作用の強さを推定した。このアプローチにより、4-ビニルピリジン(4VP)が好適な官能性モノマー(FM)として特定され、4VP:(E)-レスベラトロールのモル比3:1が最も安定なポリマー化前複合体の形成に最適であることが予測された(図36)。これらの相互作用は¹H NMRスペクトル分析法による滴定分析によって確認された。4VPによる滴定は、低磁場に合計約0.8ppm移動するフェノール性OH基の化学シフトをもたらした。ピリジン及びフェノール分子に関わるような自己組織化相互作用が報告されている。この作用により、芳香族分子間O-H…N水素結合相互作用によって多層クラスターが形成された。

分子インプリントポリマーの製造。ポロゲン溶液(CH₃CN:EtOH、5:1v/v)に少量のEtOHを混和して、H結合能を損なわずに(E)-レスベラトロールの溶解度を増加させることによって、固体インプリントブロックコポリマーモノリスを製造した。この極性プロトン性溶媒は、近傍で既にクラスター化されている芳香族基間の芳香族π-π相互作用の増大に役立つと同時に、フェノール性ピリジニルクラスター系内の既存の相互作用を安定化させると考えられる。

分子インプリントポリマーの評価。図37は、ポリマーP1及びN1と(E)-レスベラトロールとから得られた静電的結合等温線を示す。選択的能力(selective capacity)(B_MIP-B_NIP=14 μmol/g)は、インプリントポリマー内に(E)-レスベラトロール結合空洞又は領域が成功裏に形成されたことによるインプリンティング効果を検証している。非インプリント対照ポリマーN1によって結合された(E)-レスベラトロールの量がより少なかったのは、ランダムに分散された官能性モノマーとの非特異的表面相互作用による可能性が最も高い。したがって、これらの評価はP1の複数のバッチを用いて実施するので、自己組織化に基づくMIPは製造毎に変動する可能性があり、このような変動が大きいエラーバーの原因となる可能性が最も高い。しかし、この能力は製造毎に変動し得ることが観察されたが、選択的能力は本質的に一定のままであった。このことは、インプリンティング効果は、同様なMIPではバッチ毎に大きく影響されないことを示唆している。

スキャッチャード分析の結果、2つの異なる線状領域を有する、非直線で上に凹の曲線が示された。典型的には、これが、(i)結合部位の不均一性、(ii)結合の共同性又は(iii)多価リガンド結合を説明する。典型的には、このうちの(i)が、非共有結合によって製造されたインプリントポリマーへの分子の結合を説明すると考えられる。

ランダムに分散された4VPとの非特異的表面相互作用が非インプリントポリマーN1の結合反応に関与していることを確認するために、ポリマーP2((E)-レスベラトロールインプリントポリ-EGDMA、FMなし)、N2(非インプリントポリ-EGDMA、FMなし)及びN3(非インプリントポリ-4VP、架橋剤なし)を製造した。同一条件下における(E)-レスベラトロールの結合に対するこれらのポリマーのそれぞれの親和性を図38に示す。ポリマーP2及びN2は、無視し得る(E)-レスベラトロール吸着を示した。これは、架橋剤EGDMAがポリマー結合反応にそれほど寄与しないことを示している。更に、P2が(E)-レスベラトロールを認識できないことは、(E)-レスベラトロールのサイズ及び形状を有する結合空洞の存在が、溶液からこの分子を活発に捕捉するのに不十分であることを示唆している。この発見は、空洞の適切なサイズに加えて、空洞部位内に適切にトポロジカルに(topologically)配置された相補的な官能基の重要性をはっきり示している。N3への(E)-レスベラトロールの中程度の結合は、ポリマーマトリックス全体への官能性モノマー4VPのランダム分散が非特異的分子結合の原因であることを実証した。

単一検体の(非競合的)交差反応性試験を用いて、標的分子上に存在する水素結合OH基の位置及び数の、分子認識に対する影響を調べた。(E)-レスベラトロール及び様々な構造類似体の、(E)-レスベラトロールインプリントポリマーP1に対する静電的結合親和性を、平衡結合アッセイを用いて明らかにした。結合した検体の濃度は、最初の検体濃度と溶液中の残留検体の濃度の差によって求めた(図39、Table13(表13))。この分析は、テトラ-オール2がP1及びN1のいずれに対しても高レベルの親和性を示したことによって、フェノール性OH基の数がP1への特異的結合及びN1への非特異的結合の量に明白な影響を与えたことを示した。3つ未満のフェノール性OH基を有する検体は、N1に対して最小の親和性(≦2.21μmol/g)を示した。この観察は、アミノ酸インプリント系(38)について報告された観察と同様であり、より多数の官能基を有する非テンプレート検体は、ポリマーマトリックス内のランダムに分散された官能基とより高い非特異的結合を示した。最良の結合は、12.36μmol/gの良好な結合能力及び2.35のインプリンティングファクター(IF)(IF=B_MIP/B_NIP)を有するテンプレート(E)-レスベラトロールによって観察された。フェノール性OH基が1つ少ない(E)-レスベラトロールの類似体(検体3及び4)は、(E)-レスベラトロールについて観察された結合度の約50%の検体結合度の低下を示したが、これらの分子の非特異的結合が著しく低下したので、比較的高い認識(それぞれ、IF=4.02及び2.89)をもたらした。フェノール性OH基が2つ少ない(E)-レスベラトロール類似体(検体6及び7)は、更に減少した、P1への特異的結合を示し、OH基の相対位置による差は本質的になかった。P1への(E)-スチルベン8の結合は、フェノール性OH基が存在しないため、事実上消失した。興味深いことに、天然のモノグリコシル化誘導体である(E)-レスベラトロール3-β-D-グルコピラノシド5のP1への結合は、モノフェノール性(E)-レスベラトロール類似体6及び7に関して観察された結合と同等であった。嵩高いグルコース基の存在が、結合空洞内のメタ位OH基との相互作用を妨げ、その結果、パラ位OH基が水素結合可能な唯一の官能基として残されたと推測される。

ポリフェノール類似体のポリマーP1への結合を、競合条件下で検討した。それぞれ0.5mMの(E)-レスベラトロール1と類似体2、3、4、6及び8との等モル混合物に関する競合静電的交差反応性アッセイの結果を、Table 14(表14)に示す。混合物の複雑さを減らすために、類似体5及び7は、前記でP1に対して無視し得る親和性を示したため、この混合物には含めなかった。ポリマーP1は、インプリンティングファクター(IF2.26)及び選択性(α 1.26) （α=(B_MIP-B_NIP)/B_NIP）で、(E)-レスベラトロールに対して良好な認識を保持し、これらのパラメーターは単一検体実験(IF2.35、α 1.36)と事実上変わらなかった。この結果は、P1が(E)-レスベラトロールに、構造的に類似したその類似体よりも優先的に結合することを明白に示している。混合物からの(E)-レスベラトロールに対するP1の結合能力は低下した(7.78μmol/g)が、これは、テトラ-オール類似体による利用可能な結合部位の競合の結果と考えられる。テトラ-オール類似体は、非競合試験(19.37μmol/g、IF1.17、α 0.17)と比較して、P1に対して事実上変わらない結合(19.84μmol/g)を示し、認識(IF1.41)及び選択性(α 0.41)が改善されていた。このIF増加は、混合物中に存在する他の検体の非特異的結合によって生じた、ポリマー全体にランダムに分布した4VPに対する(E)-レスベラトロールの非特異的結合が減少した結果と考えられる。単一検体アッセイにおいて良好な認識を示した(E)-レスベラトロール類似体3及び4(それぞれ、IF4.02及び2.89)は、両類似体に関するIF及びαの低下によって明らかなように、P1上の利用可能な結合部位を(E)-レスベラトロール1及び化合物2と競合できなかった。単一検体に関する前記の静電的結合の結果によれば、化合物6及び8は、本質的に無視し得る結合を示した。化合物8は引き続き、最小認識量と一致する最低値を示した。これらの結果は、単一検体アッセイに関して得られた結果に一致して、-OH基が数及びコア分子中の位置に関して重要であることを強調している。芳香環のメタ及びパラ位に少なくとも2つの-OH基を有する(E)-レスベラトロールの類似体(化合物1、2、3、4)は、中程度から良好な親和性を明白に示し、結合親和性と芳香環結合OH基の存在数との間に良好な相関が認められた。

結論
(E)-レスベラトロールインプリントポリマーは、非共有結合性自己組織化によって製造され、単一及び混合検体サンプルのいずれの場合にも、テンプレートに対して、同様なポリフェノール類似体よりも特異性の高い分子認識を有することが示された。化合物の認識は、芳香族OH基の存在に影響され、メタ及び/又はパラ位にこのような基が少なくとも2つ必要であった。3つを超える芳香族OH基を有する化合物は、(E)-レスベラトロールインプリントポリマーに対して強い親和性を示したが、それらの分子認識は、高レベルの非特異的結合によって阻害された。優れた認識は、3次元結合空洞と相補性を有するメタ及びパラ位の3つの芳香族OH基によって結合空洞と相互作用できるレスベラトロールの場合に観察された。

［E. 分子インプリントポリマーに関するポリフェノールテンプレートセレクトフォア(selectophore)］
ここに報告するのは、(E)-レスベラトロールのイミン及びアミドセレクトフォアの合成である。これらのセレクトフォアは、いずれも「シングルポット」製造によって合成できるので、(E)-レスベラトロールよりも容易且つ効率的に製造される。(E)-レスベラトロールインプリントポリマーと比較した、この新しいポリフェノールセレクトフォアインプリントポリマーの性能も報告する。

結果及び考察
セレクトフォアの製造
(E)-レスベラトロール1は、アルケン拘束部分(alkene constraint)を有するポリフェノール化合物として思い浮かべることができる。次に、この拘束部分(constraint)に差異がある類似体、即ち、イミン：(E)-5-[(4-ヒドロキシ-フェニルイミノ)-メチル]-ベンゼン-1,3-ジオール2、及びアミド：3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド3を、合成のために選択した。3つの化合物は全て、同一三次元空間を占有することができる2つのレソルシノールヒドロキシルを有し、第3のフェノール性ヒドロキシルは次に、非常によく似ているが同一ではない位置を取ると考えられる。

この研究所における以前の試験は、MIPの製造のための最初のテンプレートとして(E)-レスベラトロールを用いた。(E)-レスベラトロールの合成方法は数多く報告されているが、これらの合成方法のほとんどは、the Principles of Green Chemistry及び現代工業の実際(modern industrial practicality)をいずれも無視するものである。これらの方法は全て、かなりの材料損失を生じる多段合成法と、必然的な精製プロセス、有害試薬の多数回取扱い、保護及び脱保護プロセス並びに化学反応の駆動エネルギーを常に必要とする。

(E)-レスベラトロールの合成に使用した方法をスキーム5に要約する。この方法を用いて、3,5-ジヒドロキシ安息香酸4を(E)-レスベラトロール1に変換した。

この多段法は目的生成物を29%の全収率で回収したが、典型的には完了までに5日超を必要とし、腐蝕性材料及び有害材料の発生及び取扱い並びにクロマトグラフィー精製を余儀なくされた。

イミンセレクトフォア(E)-5-[(4-ヒドロキシ-フェニルイミノ)-メチル]-ベンゼン-1,3-ジオール2は、スキーム6に示されるようにして、市販4-アミノフェノール5及び3,5-ジヒドロキシベンズアルデヒド6から製造した。

本発明者らは、この方法が、簡単な濾過処理後に清浄な生成物を定量的収率で迅速に生成する点で非常に有利であることを発見した。このイミン生成物の安定性を、d₆-DMSO及びCD₃CN中での¹H NMR試験によって確認し、この化合物が6日間にわたって変化がないことが示された。このイミンセレクトフォアはまた、MIPの製造に使用した条件下でテンプレートとして用いた場合及びこれらのMIPの結合特性の評価に検体として使用した場合に、元のままの形を保った。

セレクトフォアの第3の例は、アミド3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド3であった。最初に、基準試料を、スキーム7に示した多段法で製造した。

この多段製造に関する実験の全詳細は、添付した電子補足情報に含めた。このアミド3のこのような多段製造は、(E)-レスベラトロール1の合成において遭遇する同じ「ノン-グリーン」問題に明白に苦慮した。本発明者らが比較的多量のこのアミド3を継続的に必要としていることが、これに代わる改良法の開発を本発明者らに促した。この改良法をスキーム8に要約する。

溶媒除去とそれに続く磨砕及び水洗による処理により、純粋なアミド3を迅速に76%の収率で回収した。このカルボジイミド活性化カップリングの「グリーンな」利点は、報告された多段合成と同じ出発試薬を使用するが、今回はアミドがシングル-ポット操作を用いて改善された全収率で生成され、エネルギーの追加、官能基の保護及び脱保護又はクロマトグラフィー精製を必要としなかったことである。

分子インプリントポリマー(MIP)
合成された3種のセレクトフォアを、MIP製造のためのテンプレートとして及び新しいポリマーの結合特性を照合するための検体として用いた。簡潔に言えば、分子インプリントポリマー(MIP)の製造は、ポロゲン中におけるセレクトフォアテンプレート、官能性モノマー及び架橋剤の混合物の熱開始遊離基重合を含むものであった。次いで、得られた固体材料を粉砕し、適切な粒度の粒子を振り分けによって取り去り、酸で洗浄して、テンプレートを脱着した。非インプリントポリマー(NIP)を、テンプレート分子の不存在下で同一の方法で製造した。単一検体結合試験を、(E)-レスベラトロールインプリントポリマー(MIP_RES)及び対応するNIPを用いて実施した。これらの試験において、ポリマーは、新しく調製した検体溶液を用いて一夜インキュベートし、次いで上清を除去し、その濃度をRP-HPLCによって測定した。最初の濃度から差し引くことによって、ポリマーによって結合された検体の量(B)を得た。これらの結果を、図40に要約する。

この実験設計の範囲内では、MIP_RESは、アルケン、アミド及びイミン分子に対して同様な結合能力及び同等の選択的親和性(B_MIP-B_NIP)をいずれも示した。これらの結合パラメーターの類似性は、MIP_RESがこれらのポリフェノールセレクトフォアのそれぞれに対して包括的な(generic)交差反応性を示すことを示唆している。この結果は、溶液中でこれらの分子の全てが取っている同様な空間配置と一致している。これらの3つの異なる結合に関連する誘起効果の差は、芳香族ヒドロキシル基からの距離及び芳香族π電子雲の両方によって緩和される可能性があるので、これらのセレクトフォアはまた、同様な電子的特性を有すると考えられる。したがって、これらのセレクトフォアは、これらのMIP空洞内の認識表面において同様に結合される。

次に、アミド及びイミンセレクトフォアが(E)-レスベラトロールテンプレート模倣物として好適かどうかを評価した。これらの化合物のそれぞれを、MIP_RESの製造に使用したのと同様なプロトコールを用いて新しいMIP(即ち、それぞれMIP_AMIDE及びMIP_IMINE)を製造するためのテンプレートとして用いた。静電的結合アッセイを前述と同様に実施し、これらのMIPが(E)-レスベラトロールを認識する能力を、図41に報告する。

セレクトフォアインプリントMIP_AMIDE及びMIP_IMINEはいずれも、(E)-レスベラトロールに対して選択的な親和性を示したが、MIP_RESに比較して能力が低かった。これらの分子が溶液中で同様な配座を有することができるという事実にもかかわらず、インプリンティング過程で相補的結合官能性基である4-ビニルピリジンのピリジニル窒素によって占められるステレオトポロジカルな(stereotopological)空間は、3種のMIPの全てについて異なるに違いない。MIP_AMIDE及びMIP_IMINEの両方について観察された低下した結合能力及びより低い選択的親和性はまた、これらのインプリントポリマーが、低下したアルケン(E)-レスベラトロール結合能力を有し且つアルケン(E)-レスベラトロールの有利な配座を維持することを反映していると考えられる。この発見は、アルケン拘束部分の相対構造剛性の増加の結果と考えられる。

結論
ポリフェノール(E)-レスベラトロールの空間的に限定された官能性を有する構造類似体又はセレクトフォアを合成するための方法を開発した。これらの化合物を、「よりグリーンな」シングル-ポット法を用いてより容易に常用に従って製造した。次に、セレクトフォアを、MIPを製造するためのテンプレート模倣物として用いた。これらの新しいポリマーは、この代表的なポリフェノール化合物に対して、同等ではあるが同一ではない結合を示すことがわかった。

このアプローチは、新しいMIPの探索及び特性決定に使用できる技術であり、本発明者らの発見は、適切なセレクトフォアが、構造的に類似した化合物を抽出できる包括的なMIPのより簡便な製造を可能にする好適なテンプレートとなり得ることを示唆している。

実験
AR溶媒は、4Åの分子篩上で乾燥させたジメチルホルムアミド(DMF)、ナトリウムワイヤー上で乾燥させたトルエン並びにKOHペレット上で乾燥させたピリジン及びトリエチルアミンを除いて、メーカーから購入したまま用いた。水を含む操作には、Milli-Q蒸留水を用いた。溶媒混合物は容量/容量として表す。溶媒抽出物は、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、次いで30〜35℃において低圧(≧10mbar)で回転蒸発により蒸発乾固させた。分析薄層クロマトグラフィー(TLC)は、Merck(登録商標)1.05554.001プレートを用いてシリカゲル上で行った。成分は、(i)254nmの螢光並びに(ii)リンモリブデン酸エタノール溶液ディップ及びチャー(char)によって可視化した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、Merck(登録商標)1.09385.1000を用いて行った。融点は、開放型ガラス毛細管法によって測定し、補正しなかった。NMRスペクトルは、Bruker DPX-300に、¹H NMRの場合は300MHz及び¹³C JMOD NMRの場合は75MHzで記録した。重水素化溶媒を指示通りに用い、内部基準には残留溶媒ピークを用いた。J値はHzで示す。低分解能エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル(ESI)は、Micromass Platform II API QMS Electrospray質量分析計を用いて正(ESI⁺)極性及び負(ESI^-)極性の両方で記録した。高分解能エレクトロスプレー質量スペクトル(HRMS)は、Bruker BioApex 47e Fourier Transform質量分析計に記録した。混合物は、37kHz/150W Elmasonic S100超音波洗浄ユニット中で超音波処理した。ポリマーは、Retsch PM 200 Planetary Ball Millを用いて粉砕し、Retsch AS 200篩振盪機で分粒した。

ポリフェノールセレクトフォアの合成
3,5-ジアセトキシ安息香酸
3,5-ジヒドロキシ安息香酸(15.40g、0.100mol)の酢酸エチル(220mL)中懸濁液を、氷浴中で冷却した。無水酢酸(24.52mL、0.2421mol)、ピリジン(16.16mL、0.1998mol)及び4-(ジメチルアミノ)ピリジン(100mg、0.81855mmol)を添加し、反応混合物を0℃において60分間、次いで室温で一夜撹拌した。蟻酸(5.12mL、0.1357mmol)を添加し、反応混合物を氷(約500g)上に注いだ。追加の酢酸エチル(300mL)を添加し、有機相を分離させ、水(2×200mL)、NaHCO₃飽和水溶液(100mL)、更なる水(2×200mL)で洗浄し、次いで乾燥及び蒸発させて、白色固体を得た。5:1EtOAc/ヘキサン(120mL)からの再結晶により、3,5-ジアセトキシ安息香酸の2回のクロップを白色粉末として得た(合算収量 17.07g、72%)。R_f 0.20 (1:1 EtOAc/ヘキサン)、0.39 (3:1 EtOAc/ヘキサン);融点161〜162℃(EtOAc/ヘキサンから) (文献上の.融点: 157〜159℃); δ_H(CDCl₃) 2.29 (s, 6H, 2 x OAc)、7.18 (擬似t, 1H, J 2.1, 4-H)及び7.70 (擬似d, 2H, J 2.1, 2-H, 6-H); δ_C(CD₃OD) 18.43、118.94、119.02、131.70、150.19、165.46及び168.17; m/z (ESI) 261 (MNa⁺, 100%)。

(E)-3,4',5-トリアセトキシスチルベン
トルエン(130mL)、DMF(500μL)及び塩化チオニル(16.00mL、220.6mmol)の混合物中に懸濁させた3,5-ジアセトキシ安息香酸(8.022g、33.706mmol)を、アルゴンガス雰囲気下で100℃において3時間加熱した。溶媒を真空蒸留によって除去し、残渣をトルエン(85mL)中に再懸濁させ、真空下で超音波処理して、溶存ガスを除去した。4-アセトキシスチレン(5.74mL、37.5mmol)、N-エチルモルホリン(4.31mL、33.9mmol)及び二酢酸パラジウム(35mg、0.16mmol、0.46モル%)を添加し、反応混合物を2時間加熱還流させた。追加の二酢酸パラジウム(116mg、0.52mmol、1.54モル%)を添加し、反応混合物を一夜還流させた。室温に戻した後、酢酸エチル(500mL)を添加し、溶液を0.1M HCl(2×300mL)及び水(300mL)で洗浄し、次いで乾燥させ、蒸発させて、ブラウン色の固体を回収した。カラムクロマトグラフィー(2:1 Et₂O/ヘキサンで定組成溶離)で精製することにより、白色固体7.888gを得た。これは、¹H NMRにより、大部分が目的付加物であることが示された。更なるクロマトグラフィー(4:1ヘキサン/EtOAcから始めて、2:1ヘキサン/EtOAcで終了する勾配溶離)により、純粋な(E)-3,4',5-トリアセトキシスチルベン(6.071g、51%)を白色固体として回収した。R_f 0.29 (2:1 ヘキサン/EtOAc);融点112.5〜113.0℃(文献上の融点116℃); δ_H (CDCl₃) 2.27 (s, 9H, 3 x OAc)、6.80 (擬似t, 1H, J 2.1, 4'-H)、6.93 (d, 1H, J 16.3, H_trans)、7.03 (d, 1H, J 16.3, H_trans)、7.04〜7.09 (m, 4H, 3-H, 5-H, 2'-H, 6'-H)及び7.44〜7.47 (m, 2H, 2-H, 6-H); δ_C(CDCl₃) 20.07、113.39、115.88、120.88、126.19、126.64、128.64、133.45、138.53、149.46、150.34、167.91及び168.30; m/z (ESI) 377 (MNa⁺, 100%)、378 (21)。

アルケン1; (E)-レスベラトロール
反応は、アルゴンガス雰囲気下で行った。メタノール(3.0mL)中に溶解させた水酸化カリウム(22mg、0.3922mmol)を、(E)-3,4',5-トリアセトキシスチルベン(113mg、0.319mmol)のメタノール(10mL)中懸濁液に添加した。固体は直ちに溶解した。透明な溶液を穏やかに60分間加熱還流し、色合いの顕著な暗色化が認められた。次いで、回転蒸発によって容量を半分に減少させ、残っている溶液を1M HCl水溶液で酸性化した(pH2)。酢酸エチル(150mL)を添加し、反応混合物を飽和ブライン(3×20mL)で洗浄し、乾燥させ、蒸発させて、ダークレッド色の固体を回収した。カラムクロマトグラフィー(100% EtOAcで定組成溶離)で精製することにより、(E)-レスベラトロール(58mg、79%)をペールベージュ色の固体として得た。R_f 0.65 (EtOAc);融点261.0〜263.0℃(文献上の融点255〜260℃); δ_H(CD₃OD) 6.13 (擬似t, 1H, J 2.2, 4-H)、6.41〜6.42 (m, 2H, 2-H, 6-H)、6.71〜6.79 (m, 3H, H_trans, 3'-H, 5'-H)、6.93 (d, 1H, J 16.3, H_trans)及び7.29〜7.36 (m, 2H, J_ortho 8.6, 2'-H, 6'-H); δ_C(CD₃OD) 100.30、103.47、114.12、124.64、126.43、127.06、128.07、138.97、155.89及び157.20; m/z (ESI) 229(MH⁺, 100%)、230(23)。

イミン2; (E)-5-[(4-ヒドロキシ-フェニルイミノ)-メチル]-ベンゼン-1,3-ジオール
3,5-ジヒドロキシベンズアルデヒド(300mg、2.174mmol)、4-アミノフェノール(237mg、2.174mmol)及び無水硫酸ナトリウム(309mg、2.176mmol)のジクロロメタン(15mL)中混合物を、室温で3時間、激しく撹拌した。追加の無水硫酸ナトリウム(309mg、2.176mmol)を添加し、更に1時間、撹拌を続けた。回転蒸発によってジクロロメタンを除去し、白色残渣を沸騰エタノール(10mL)中に再懸濁させ、熱時濾過した。固体を、漏斗中で追加の熱エタノール(10mL)で洗浄した。透明な濾液を合し、回転蒸発により蒸発乾燥させて、(E)-5-[(4-ヒドロキシ-フェニルイミノ)-メチル]-ベンゼン-1,3-ジオール(501mg、100%)をペールピンク色の固体として得た。R_f 0.48 (2:1 EtOAc/ヘキサン);加熱すると黒ずみ、融点> 340℃; δ_H(d₆-DMSO) 6.36 (擬似t, 1H, J 2.2, 4-H)、6.80〜6.85 (m, 4H, 2-H, 6-H, 3'-H, 5'-H)、7.16〜7.22 (m, 2H, J_ortho 8.8, 2'-H, 6'-H)、8.43 (s, 1H, イミン-H)、9.47 (bs, 3H, 3 xフェノール性-OH); δ_C(d₆-DMSO) 106.27、107.41、116.70、123.42、139.35、143.61、157.16、158.38及び159.62; m/z (ESI) 230(MH⁺, 100%)、231(13); m/z (HRESI) 252.0633 ([M + Na]⁺ C₁₃H₁₁NO₃Na⁺の計算値は252.0637)。

アミド3; 3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド
反応は、陽圧のアルゴンガス下で行った。3,5-ジヒドロキシ安息香酸(2.310g、15.000mmol)及び4-アミノフェノール(1.962g、18.000mmol)をDMF(90.0mL)中に溶解させた。N-エチル-N' -(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド(3.450g、17.997mmol)を添加し、反応混合物を室温で一夜撹拌した。溶媒を高真空下で回転応発によって除去し、油状残渣を、固体が形成されるまで、水と共蒸留させた。この固体を冷0.01M HCl(50mL)を用いて磨砕し、濾過し、ペールパープル色の生成物を漏斗中で冷水(4×20mL)によって洗浄した。固体を、真空下で乾燥剤を用いて乾燥させて、純粋な3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド(2.791g、76%)を得た。R_f 0.39 (4:1 EtOAc/ヘキサン);融点266.0〜266.5℃; δ_H(CD₃OD) 6.47 (擬似t, 1H, J_meta 2.2, 4-H)、6.77〜6.82( m, 4H, 3'-H, 5'-H, 2-H, 6-H)、7.43〜7.46 (m, 2H, J_ortho 8.9, 2'-H, 6'-H); δ_H(d₆-DMSO) 6.42 (擬似t, 1H, J_meta 2.2, 4-H)、6.72〜6.78 (m, 4H, 3'-H, 5'-H, 2-H, 6-H)、7.51〜7.56 (m, 2H, J_ortho 8.9, 2'-H, 6'-H)、9.20 (s, 1H)、9.51 (s, 2H)及び9.83 (s, 1H); δ_C(CD₃OD) 104.41、104.67、113.92、122.13、129.10、136.08、153.26、157.41及び166.70; m/z (ESI) 244 ([M-H]^-, 100%)、489([2M-H]^-, 29); m/z (HRESI) 246.0764 ([M + H]⁺ C₁₃H₁₂N₁O₄ ⁺の計算値は246.0766)。

分子インプリントポリマーの製造
使い捨てガラス試験管中でセレクトフォアテンプレート(1mmol)をポロゲン(5:1アセトニトリル/EtOH、6ml)中に溶解させることによって、分子インプリントポリマー(MIP)を製造した。アセトン(6mL)はアミド3に関しては、最初の混合物容量中へのその不完全な可溶化のため、好ましいポロゲンであった¹⁰。官能性モノマー 4-ビニルピリジン(322μL、3mmol)を添加し、混合物を10分間、超音波処理した。次いで、エチレングリコールジメタクリレート(2.314mL、15mmol)と架橋剤として添加し、2,2-アゾビス(イソブチロ)ニトリル(51mg、0.31mmol)を遊離基開始剤として添加した。このポリマー化前混合物に窒素ガスを5分間スパージしてから、サーモスタット付き水浴中で50℃において24時間、加熱した。反応管から固体ポリマーを取り出し、乳鉢及び乳棒で圧潰し、Retsch 200ボールミルを用いて微粉砕した。粉砕物を篩い分けし、粒度63〜100μmの粒子を貯留した。この粒度範囲を繰り返しアセトン中に懸濁させ、上清を捨てて、微粒子を除去した。次に、結合したテンプレートを、洗液がテンプレートを含まなくなるまで(UV-Visスペクトル分析法によって321nmで監視)10%酢酸メタノール溶液で繰り返し洗浄することによって、ポリマーから除去した。テンプレート分子の不存在下で同じ方法を用いて、非インプリント対照ポリマー(NIP)を製造した。

分子インプリントポリマーの評価
MIP及びNIPの両方について、同一条件下で並行して実験を行った。

エッペンドルフチューブ中のポリマー(30mg)に、検体溶液(1.5mL、アセトニトリル中0.5 mM)を加えた。これを40rpmで18時間混合し、ポリマーを、13000rpmで15分間遠心分離することによって沈降させた。上清の200μLアリコートを取り出し、RP-HPLCによって321nmのUV検出を用いて分析した。濃度は、直線状の5点検量線と比較して求めた。結合した検体の量(B)をこの値と最初の値の差として求め、μmol/g(ポリマー)の単位で報告した。

［F. 分子インプリンティングによる、ピーナッツ副産物からの生物活性ポリフェノール(E)-レスベラトロールの濃縮］
分子インプリンティング技術を用いた、(E)-レスベラトロールの単離及び濃縮並びにピーナッツ圧搾廃棄物からの関連ポリフェノールの測定のための迅速な方法を報告する。

材料及び方法
化合物
4-ビニルピリジン(4VP)、エチレングリコールジメタクリレート(EGDMA)及び2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)(AIBN)、(+)-カテキン水和物(使用前に凍結乾燥)、カフェイン酸及び(E)-ピセイドは、Sigma-Aldrich(Sydney、NSW、Australia)から入手した。4-VP及びEGDMAはそれぞれ、使用直前に真空蒸留及びアルミナカラムクロマトグラフィーによって精製した。使用した溶媒は全て、HPLCグレードである。

(E)-レスベラトロール1は、前記方法を用いて合成した。

MIPの製造
(E)-レスベラトロールインプリントポリマー(MIP_RES)は、(E)-レスベラトロール及び4-VPを(モル当量比1:3で)アセトニトリル/EtOH(5:1v/v)中に溶解させることによって製造した。得られた混合物をN₂(g)で2分間パージし、20分間超音波処理した後、EGDMA(15モル当量)及び遊離基開始剤AIBNを添加した。次に、この反応混合物をシールし、N_2(g)で2分間パージし、次いで50℃の水浴中に入れ(18時間)、続いて60℃において熱的アニール処理を行った(24時間)。非インプリントポリマー(NIP)を対照として、(E)-レスベラトロールテンプレートを含ませずに同じ方法で製造した。得られた硬質バルクモノリスを、Retsch 200ボールミルを用いて粉砕して、粒度分布60〜90μmを得た。これを、篩い分けによって単離した。テンプレートが321nmの吸光度によって抽出媒体中にもはや認められなくなるまで、MeOH/AcOH(9%v/v)中で繰り返し洗浄することによって、テンプレート分子を抽出した。次いで、MIP粒子をMeOHで洗浄して、微量のAcOHを除去し、アセトン中で繰り返し沈降させることによって微粒子を取り出した。続いて、得られたMIP粒子を40℃において一夜真空乾燥させた。

静電的選択性試験
MIP及びNIPの両方について30mgの一定ポリマー量を用いて、選択性試験を行った。NIPは、架橋剤及びランダムに分散した官能性モノマーとの相互作用によって生じる非特異的結合の程度を測定するために用いた。ポリマーを、アセトニトリル中検体溶液(0.5mM)1.5mL中でインキュベートした。得られた混合物を40rpmで18時間混合し、次いで13000rpmで15分間遠心分離した。上清のアリコート(200μL)を取り出し、逆相HPLCによって321nmでのUVスペクトル分析によって分析し、遊離検体の濃度を、直線状5点検量線から求めた。遊離検体濃度を最初の総検体溶液濃度から差し引くことによって、μmol/g(ポリマー)で表される、結合した検体の量(B)を計算した。

MISPE検証試験
小規模MISPE試験を、MIP又はNIP固定相100mgを含むSPEカラムで行った。MeOH中ポリマー固定相(100mg)を、ポリプロピレンフリット(孔径20μm)を装着した3mLシリンジバレル中にスラリー充填した。続いて、得られたSPEカラムを、有機及び水性試験のためにそれぞれアセトニトリル又はEtOH/H₂O(1:1v/v)1.5mL(3カラム容量)で状態調整した。その後、アセトニトリル又はEtOH/H₂O(1:1v/v)中(E)-レスベラトロール(0.5mL)溶液1mLをオンカラム装填した。次いで、複数の選択的清浄化ステップ(各1mL)を、アセトニトリル又はEtOH/H₂O(1:1v/v)中1% AcOHを用いて各カラムに適用した。その後、各カラムを、MeOH中10% AcOH(2mL)を用いて溶離させた。清浄化ステップ及び溶離ステップから収集したフラクションを蒸発乾固し、EtOH/H₂O(1:1v/v)中で1mLに戻し、RP-HPLCによって分析した。(E)-レスベラトロールの濃度を、5点検量線を用いて求めた。

逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)
RP-HPLC分離は、真空脱ガス装置を有するバイナリーポンプ、900μLサンプルループを有するオートサンプラー、サーモスタット付きカラムコンパートメント及びダイオードアレイ検出器からなるAgilent Technologies 1100 LCシステム(Waldbronn、Germany)で行った。注入サンプルは、40℃においてZorbax Eclipse XDB-C₁₈カラム(4.6×150mm、粒度5μm)で分析した。移動相はH₂O中0.1%AcOH(溶媒A)及びEtOH/H₂O(溶媒B)中0.1%AcOHからなり、以下の勾配を適用した:0〜2分:25% B定組成、2〜6分:25〜37.5% B、6〜9分:37.5% B定組成、9〜12分:37.5〜62.5%B、12〜15分:62.5% B定組成、15〜18分:62.5〜100%B、18〜22分:100%B定組成、22〜25分:100〜25%B、25〜29分:25%B定組成。流速は0.5mL/分とした。注入容量は5μLとし、UV-Visダイオードアレイ検出器(80Hz)は、吸光波長λ=280、321及び370nmに設定した。

LC-ESI-MS
クロマトグラフ分離は全て、イオントラップMSシステム(Agilent 1100 Series LC/MSD-SL)に連結したAgilent 1100 Capillary LCシステム(Agilent Technologies、Palo Alto、CA、USA)を用いて行った。MIP溶出液の分離は、3.5μmの粒子を充填したZorbax300SB-C₁₈(150mm×内径0.3mm)キャピラリーカラムを用いて行った。カラムの出口は、UV検出器を介さずにイオントラップ質量分析計のエレクトロスプレー源に直接接続した。0.1%FAを含むアセトニトリル/H₂O(60:40v/v)中0.3mg/mLのMIP流出液サンプルの分離は、H₂O中0.1 % FA(溶媒A)及びアセトニトリル中0.1 % FAからなる移動相を用い、以下の勾配:0〜15分:10%B、15〜65分:10〜65%B、65〜70分:60〜95%Bを適用して行った。流速は4μL/分とした。注入容量は0.2μLとした。ESI-MS/MS分析は、正イオンモードで行った。質量分析計はデータ依存モードで操作し、前駆イオン走査においてイオン強度の上位2つのイオンを次の自動化MS/MSに供した。システム制御及びデータ収集は、全て、Agilent ChemStation及びMSD Trap Controlソフトウェアを用いて行った。

ピーナッツ圧搾廃棄物の抽出物の調製
EtOH:H₂O(1000mL、4:1v/v)中ピーナッツ圧搾廃棄物(200g)を60分間超音波処理した後、混合物を濾過し、溶媒を蒸発させて、抽出物17.9gを回収した。このピーナッツ圧搾廃棄物抽出物10.0gをメスフラスコ内のEtOH/H₂O(1:1v/v)中で500mLに戻し、必要になるまで4℃で保存した。使用前に、ピーナッツ圧搾廃棄物抽出物を室温で平衡化させ、超音波処理して、溶液を清澄化した。

ピーナッツ圧搾廃棄物の抽出物のMISPE
MISPE試験を、1.0gのMIP_RES又は対応NIP(対照固定相として)を用いて行い、前記ピーナッツ圧搾廃棄物抽出物から(E)-レスベラトロールを選択的に保持し且つ濃縮する能力を調べた。カラムは、MeOH、次いでEtOH、最後に0.1%AcOHを含むEtOH/H₂O(1:1、v/v)を、それぞれ3カラム容量で用いて状態調整した。ピーナッツ圧搾廃棄物抽出物(2×50mL)を各カラムに適用した。漏出(breakthrough)フラクションは、真空下で収集し、カラムに再循還させて、固定相とピーナッツ圧搾廃棄物抽出物内のポリフェノール成分との相互作用を最大にした。次いで、各カラムをEtOH/H₂O(1:1v/v)(20mL)で洗浄し、続いて、1%AcOHを含むEtOH/H₂O(1:1v/v) (20mL)及び次にアセトン/H₂O(1:1v/v)(30mL)からなる連続的な選択的清浄化ステップを行って、非特定的結合を破壊させた。次いで、MeOH中10%AcOH(25mL)による酸性溶離ステップを適用して、各カラムから該当する化合物を脱着及び除去した。溶出フラクションを合し、蒸発乾固し、EtOH/H₂O(1:1v/v)中で1.0mLに戻し、RP-HPLCによって分析した。

結果及び考察
分子インプリントポリマー
(E)-レスベラトロールインプリントポリマー空洞は、(E)-レスベラトロールの酸性フェノール性ヒドロキシル基と4VP官能性モノマーの電子豊富なピリジル窒素との最初の自己会合によって生成された。主に自己組織化水素結合相互作用によって形成された、結果として得られたポリマー化前複合体は、フェノール基とピリジニル芳香族基とが近傍にあるため、更なる芳香族π-π相互作用の関与によって安定化されると考えられる。この自己組織化複合体は次に、架橋剤EGDMAの存在下でスチリル官能価の重合によって「フリーズ」された。テンプレート分子の除去の結果、(E)-レスベラトロールに対して相補性を有するMIP空洞が得られた。

MIP_RESの交差反応性を、いくつかの構造的に関連した天然ポリフェノール:(E)-レスベラトロール、カフェイン酸、(+)-カテキン及び(E)-ピセイドを用いて評価した。MIP_RESに関しては、認識(MIP-NIP)の順序は、(E)-レスベラトロール1>カフェイン酸2>カテキン3>(E)-ピセイド4であった(Table15(表15))。カフェイン酸及び(+)-カテキンの両方に対するMIP_RESの結合能力は、テンプレート分子について観察された結合能力と同等であるが、これは、NIPによるこれらの化合物の非特異的結合の増大によって相殺される。(E)-レスベラトロールと比較してカフェイン酸及び(+)-カテキン上に多数存在する、NIPと水素結合を形成し得る基が、より強い非選択的結合、ひいてはNIP対照ポリマーへのより大きい親和性の原因であり、その結果、認識の低下がもたらされると結論付けることができる。グルコシル化レスベラトロール分子(E)-ピセイドについては無視し得る認識が観察された。これは、MIP_RES結合空洞への接近を妨げる嵩高いグルコース置換基の存在によると推定される。更にまた、(E)-レスベラトロールと比較して(+)-カテキンへのNIPの結合能力が低下したことは、MIP及びNIPへの非特異的結合へのH-結合相互作用の関与を更に裏付けている。MIP_RESが(E)-レスベラトロールに対して、他の構造的に関連した分子に対するより高い選択性を示す(これは、ポリフェノールを多く含む供給源中に存在するものに典型的である)ことから、MIP_RESに基づくSPE抽出によって、複合農業副産物マトリックスから標的(E)-レスベラトロールが選択的に単離されると予想された。

(E)-レスベラトロール精製用のMISPE収着剤としてのMIP_RESの使用が実行可能であることを立証するために、小規模の予備実験を、有機及び水性の両環境においてMIP_RES固定相を用いて行った。有機清浄化ステップと比較した、弱い又は非特異的な結合を破壊する水性清浄化ステップの効果と同様に、(E)-レスベラトロールに対するMIP_RESの結合能力をこの方式で測定した(図42)。典型的には、非特異的な疎水的相互作用を最低限に抑え且つ非特異的な又は弱い結合相互作用を破壊するために、アセトニトリル又はジクロロメタンなどの有機溶媒をこの清浄化ステップに用いた。MIP_RESは、有機条件下では(E)-レスベラトロールに対して優れた結合能力を示した。一方、水溶液から(E)-レスベラトロールを抽出するMIP_RESの能力は、効力の低下にもかかわらず、加工環境又は製造環境において典型的に発生する条件下における、この化合物の抽出及び溶離へのMIPの使用が適用可能なことを明白に立証している(図42)。したがって、MIP_RES又は対応するNIP対照を含むより大きいグラム規模のカラムを、(E)-レスベラトロール及びカテキン系オリゴマーを含む生物活性ポリフェノールの複合混合物を含むピーナッツ圧搾廃棄物水性抽出物から(E)-レスベラトロールを抽出するためのMISPE固定相として使用した。

ピーナッツ圧搾廃棄物の抽出物のMISPE
ピーナッツ圧搾廃棄物は、ピーナッツ油製造の副産物であり、フィトステロール、フラバノール及び他のポリフェノールを含む様々な生物活性成分を含む、圧縮後のピーナッツ及び殻の残滓に相当する。しかし、この副産物は、埋め立て又は飼料として定期的に処分されるので、これらの生物活性物質は十分活用されずに残ることが多い。ピーナッツ及びピーナッツ派生品は地球全体で大量に消費されるので、その結果生じるピーナッツミール副産物は、生物活性ポリフェノール(E)-レスベラトロールなどの生物活性成分の重要な貯蔵庫となり、(E)-レスベラトロールは、ピーナッツ市場の種類に応じて0.02〜1.79μg/gの範囲の量で存在する。したがって、本発明者らは、ピーナッツミール液体抽出物から(E)-レスベラトロールを選択的に単離及び濃縮するために、MIP_RESをMISPE方式で用いた。ピーナッツミール抽出物及びその後のMIP溶出液のRP-HPLCクロマトグラムを、図43に示す。MIP_RESは明らかに、ピーナッツミール抽出物の有意なサンプル清浄化と(E)-レスベラトロール(R_t=12.2分)及びいくつかの未知化合物の濃縮をもたらした。MIP_RESからの溶出液中に存在する(E)-レスベラトロールの量(39.5μg/mL)は、この重要な生物活性物質が粗供給原料から約60倍濃縮されたことを意味する。NIP溶出液のクロマトグラムは(E)-レスベラトロールの有意な濃縮を示さず、NIP溶出液中には(E)-レスベラトロールが未処理ピーナッツミール抽出物中で測定されるのと同様な量で存在するので、この濃縮は、(E)-レスベラトロールインプリンティング効果のみによると考えられる。

MIP_RES溶出液を、タンデム液体クロマトグラフィー-ESI-質量分析(LC-ESI-MS)によって正イオンモードで分析し、(E)-レスベラトロール基準と比較することによって(E)-レスベラトロールの存在を確認した(R_t=12.2分、229m/z[M+H]⁺)。

(E)-レスベラトロールに加えて、MIP_RES空洞は、R_t=9.9分のピークによって示される第2の分子に対しても親和性を示した。このピークは、NIP対照ポリマーによって保持されなかったより極性の化合物に関連する。LC-ESI-MSは、577m/z及び865m/zの、[M+H]⁺イオンに相当する質量ピークの存在を示した。これらはそれぞれ、A型プロシアニジンの二量体及び三量体の予想質量と相関する。

結論
分子インプリント固相抽出法の適用が、ピーナッツ副産物からの生物活性ポリフェノールの単離及び濃縮に関して実証された。わずかなサンプル調製に関して、固定相カラムとして(E)-レスベラトロールインプリントポリマーを用いることにより、有意なサンプル清浄化とピーナッツ圧搾廃棄物の水性抽出物からの(E)-レスベラトロールの60倍濃縮がもたらされた。

［G. レスベラトロール及び関連ポリフェノールのタンデム分子インプリント固相抽出］
この実施例においては、ピーナッツミールから(E)-レスベラトロール及び関連ポリフェノールを高純度で単離及び濃縮するための迅速タンデムMISPEアプローチを報告する。

材料及び方法
化合物
4-ビニルピリジン(4VP)、エチレングリコールジメタクリレート(EGDMA)及び2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)(AIBN)、カテキン並びにピセイドは、Sigma-Aldrich (Sydney、NSW、Australia)から入手した。4-VP及びEGDMAはそれぞれ、使用直前に真空蒸留及びアルミナカラムクロマトグラフィーによって精製した。使用した溶媒は全て、HPLCグレードである。

(E)-レスベラトロール1及び構造的に関連したポリフェノール類似体 3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド2は、前述のようにして合成した。

MIPの製造
いくつかのMIP及びそれらの非テンプレート対応物(NIP)を、Table 16(表16)に要約するようにして製造した。MIP_RESは、50℃(18時間)において製造し、続いて60℃(24時間)において熱的アニール処理を行った。MIP_AMIDEは、55℃(40時間)において異なるポロゲンを用いて製造した。これらの製造はいずれも、同程度の結合性能を有するMIPを生じた。

逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)
RP-HPLC分離を、真空脱ガス装置を有するバイナリーポンプ、900μLサンプルループを有するオートサンプラー、サーモスタット付きカラムコンパートメント及びダイオードアレイ検出器からなるAgilent Technologies 1100 LCシステム(Waldbronn、Germany)で行った。注入サンプルは、40℃においてZorbax Eclipse XDB-C₁₈カラム(4.6×150mm、粒度5μm)で分析した。移動相はH₂O中0.1%AcOH(溶媒A)及びEtOH/H₂O又はMeOH/H₂O(8:2v/v)中0.1% AcOH(溶媒B)からなり、以下の勾配を適用した:0〜2分:25%B定組成、2〜6分:25〜37.5%B、6〜9分:37.5%B定組成、9〜12分:37.5〜62.5%B、12〜15分:62.5%B定組成、15〜18分:62.5〜100%B、18〜22分:100%B定組成、22〜25分:100〜25%B、25〜29分:25%B定組成。流速は0.5mL/分とした。注入容量は5μLとし、UV-Visダイオードアレイ検出器(80Hz)を吸光波長λ=280、321及び370nmに設定した。

ピーナッツミールの抽出物の調製
EtOH:H₂O(1000.0mL、4:1v/v)中のピーナッツミール(200g)を60分間超音波処理した後、混合物を濾過し、溶媒を蒸発させて、抽出物17.9gを回収した。次の実験に使用するためのピーナッツミール抽出物の調製を、メスフラスコ中でこの材料10.0gをEtOH/H₂O(1:1v/v)の溶液に添加し、500mLに希釈することによって行った。これを必要となるまで4℃で保存した。使用前に、ピーナッツミール抽出物を室温にし、超音波処理して、溶液を清澄化した。

レスベラトロール飽和試験
0〜2mMの濃度範囲における(E)-レスベラトロール飽和試験を、MIP及びそれらのNIP対応物の両方について、一定量(30mg)のポリマーを用いて行った。NIPの応答を用いて、架橋剤及びランダムに分散された官能性モノマーとの相互作用による非特異的結合の程度を測定した。ポリマーを、レスベラトロールを含むアセトニトリル1.5mL中において40rpmで18時間、混合しながらインキュベートし、13000rpmで15分間遠心分離して、ポリマーをペレット化した。上清のアリコート(200μL)を取り出し、RP-HPLCによって321nmでのUV検出を用いて分析し、非結合(E)-レスベラトロールの濃度を、直線状5点検量線から求めた。この濃度を、総検体溶液濃度から差し引いて、μmol/g(ポリマー)として表される結合検体の量(B)を得た。

静電的選択性試験
選択性試験を、MIP及びNIPの両方について、一定量(30mg)のポリマーを用いて行った。ポリマーを、レスベラトロール又は構造的に類似した類似体3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド2、カテキン3及び(E)-ピセイド4と共に別々にインキュベートした。これらの各化合物の結合を、前述のようにして評価した。

ピーナッツミール抽出物のMISPE
予備的なMISPE試験を、MIP_RES又はMIP_AMIDE(250mg)を用いて行い、前記ピーナッツミール抽出物からレスベラトロール及び他のポリフェノールを選択的に保持し且つ濃縮する能力を調べた。ピーナッツミール抽出物の溶液(25mL)を各カラムに適用し、漏出フラクションを真空下で収集し、カラムを通して再循還させて、固定相とピーナッツミール抽出物内のポリフェノール成分との相互作用を最大にした。次に、各カラムをEtOH/H₂O(1:1v/v、3カラム容量、6mL)、次いでH₂O(10mL)で洗浄して、抽出物の非結合及び/又は弱結合水溶性成分を除去した。非特異的結合の破壊には、アセトン水溶液(アセトン/H₂O、1:1v/v、2mL)による選択的清浄化ステップを用いた。次にMeOH中10%AcOH(10×1mL)による酸性溶離ステップを用いて、該当する、特異的に結合した化合物を各ポリマーから脱着及び除去した。溶出フラクションを合し、蒸発乾固し、次にEtOH/H₂O(1:1v/v)中で1.0mLに戻した。これらの濃縮溶出液を遠心分離によって清澄化し、上清をRP-HPLC分析によって除去した。

ピーナッツミール抽出物のタンデムMISPE
別個のMIP_RES又はMIP_AMIDEカラム(それぞれ1000mg)を、1%AcOHを含むEtOH/H₂O(1:1v/v) (15mL)を用いて予備状態調整した。ピーナッツミール抽出物(100mL)を、直列の2つのMIPカラムの1つ目(MIP_RES)に装填した。これを、図44Aに示す。次いで、MIP_RESカラムからのフロースルーをMIP_AMIDEカラムに装填し、MIP_AMIDEカラムからのフロースルーを更なる検討のために収集した。次に、MIP_RESカラムを、1% AcOHを含むEtOH/H₂O(1:1v/v)100mLで洗浄し、洗浄フラクションをMIP_AMIDEカラムに装填した。最後に、両MIPカラムを別々に、3×10mLのMeOH中10%AcOHを用いて溶離させ、溶出液を2mLのフラクションで収集した(図44B)。フロースルー及び洗浄フラクションのそれぞれのサンプルを、分析のために貯留した。

第2サイクル(図44C)の前に、MIP_RES又はMIP_AMIDEカラムを、0.1%AcOHを含むEtOH/H₂O(1:1v/v)を用いて予備状態調整した。次いで、合したレスベラトロール枯渇抽出物及び洗浄フラクションを、直列のこれらのカラムに前述のようにして再装填し、残留ポリフェノール化合物を全て単離した。次に、MIP_RESカラムを、1%AcOHを含むEtOH/H₂O(1:1v/v)25mLで洗浄し、洗浄フラクションをMIP_AMIDEカラムに装填し、1%AcOHを含むEtOH/H₂O(1:1v/v)で溶離させた。

続いて、2つのサイクルのタンデムMISPEからの処理抽出物をMIP_RESのより大きいカラム(5g)に再装填して、残留ポリフェノール化合物を可能な限り大量に抽出した。このカラムを、10%AcOHを含むMeOH(3カラム容量)、MeOH(3カラム容量)及びEtOH/H₂O(1:1、v/v)中1% AcOH(3カラム容量)で予備状態調整した。残った処理ピーナッツミール抽出物(前述の第1のMISPE適用からのフロースルー及び洗浄液を含む)を適用し(100mL)、その後のフロースルーを収集した。次に、カラムを、EtOH/H₂O(1:1、v/v)中1% AcOH(50mL)で溶離させた。

結果及び考察
分子インプリントポリマー
レスベラトロール1又は3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド2をテンプレートとする分子インプリントポリマーを、官能性モノマー4VPを用いて製造した。4VPの使用は、これらのテンプレート化合物のいずれにおいても、電子豊富なピリジン窒素と酸性フェノール基との間に水素結合又はイオン相互作用の可能性を与えた。芳香族π-π相互作用はまた、架橋剤EGDMAの存在下での重合過程でその後に「フリーズ」されるポリマー化前複合体の安定化に関与し得る。MIP_RESの結合特性及び性能は、複数の構造的に関連する類似体及び他のポリフェノール化合物を含む複合混合物中に存在する(E)-レスベラトロールを特異的に認識できる(E)-レスベラトロール選択性MIPの製造に関する前記記載において、報告してある。

テンプレート分子だけでなく、複合食品廃棄物マトリックス中に存在する(E)-レスベラトロール及び場合によっては他の構造的に関連した化合物も結合し得る、インプリントポリマー内の「擬似」(E)-レスベラトロール空洞を生じるであろうMIP_AMIDEを製造するためのテンプレートとして、3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド2を合成した。

MIP_AMIDEの(E)-レスベラトロール結合親和性を測定するために、(E)-レスベラトロール飽和試験を行った(図44)。この化合物の天然に存在する範囲を越える2mM超の(E) -レスベラトロールを含む溶液に関する結合結果は再現性がなかったので、示さない。MIP_AMIDEは、静電的結合等温線の漸近線から求めた場合、約15μmol/gの(E)-レスベラトロール結合能力を示した(図44A)。これは、対応する(E)-レスベラトロールインプリントポリマーによって観察された値よりも約20%低い。NIP_AMIDEに対する(E)-レスベラトロールの非特異的結合の程度は、3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミドインプリント空洞がMIP_AMIDEの結合能力の増大の原因であることを明白に示している。しかし、MIP_AMIDEに対する選択的結合能力(MIP-NIPとして表される)(5〜7μmol/g、図44B)は、MIP_RESに対して観察される値(9〜11μmol/g)よりもかなり低かった。この観察は、各MIP空洞間の三次元構造の違いによると考えられる。これらのMIPを異なるテンプレート分子を用いて生成することによって各MIP空洞内のモノマーの固定化官能基の相補的な空間的配向(spatial orientation)を明らかにし、それによってテンプレート再結合時のそれらの結合パートナーとの相互作用の可能性を最大にした。このため、構造的に類似したレスベラトロール類似体3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド2をテンプレート分子としてMIP_AMIDEを製造すると、標的分子(E)-レスベラトロールとの強い相互作用を形成するそれらの能力を低下させる、官能性モノマーの相対配向に関して配座がわずかに異なる分子空洞が生成された。

MIP_RES及びMIP_AMIDEの両方の交差反応性を、構造的に関連したいくつかのポリフェノールを用いた結合部位の照合によって評価した(図45)。MIP_RES選択的認識(MIP-NIP)の順序は、(E)-レスベラトロール1>アミド2>カテキン3>(E)-ピセイド4であり、MIP_AMIDEの選択的認識は、アミド2≧(E)-レスベラトロール1>カテキン3>(E)-ピセイド4であった。MIP_AMIDEは、(E)レスベラトロールに対して高い交差反応性を示し、この化合物とテンプレート分子3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミド2の両方に対して同等の選択的結合を示した。MIP_RES及びMIP_AMIDEはいずれも、選択性は低下したが、それぞれのテンプレート分子の結合に匹敵する同様なカテキンへの結合能力を示した。分子上に増加した数の潜在的H-結合基が存在することにより、より多数の非選択的会合がもたらされ、その結果としてNIPによる親和性が増大し、したがって、それぞれのテンプレート分子と比較してカテキンの特異的認識が低下した。MIP_RES及びMIP_AMIDEはグルコシル化(E)-レスベラトロール分子(E)-ピセイドに対して本質的に認識を示さなかった。この結果は、MIP結合空洞への接近を妨げる嵩高いグリコール置換基によると推定される。

ピーナッツミール抽出物のMISPE
ピーナッツミール又はピーナッツ圧搾物は、ピーナッツ油製造過程で生成され、圧搾後のピーナッツ及び殻の残滓に相当する。ピーナッツは可変量(0.02〜1.79μg/g)の(E)-レスベラトロールを含み(11)、この量は、ブドウ絞りかすにおいて観察された量より多い。したがって、ピーナッツミール抽出物中、即ち、(E)レスベラトロール及びカテキン系オリゴマーを含む生物活性ポリフェノール複合混合物に存在する成分の結合を、MIP_RES及びMIP_AMIDEを用いて評価した。液体のピーナッツミール抽出物を調製し、MIP_RES若しくはMIP_AMIDEカラム又はそれぞれのNIP対照に別々に適用した。ピーナッツミール抽出物及びその後のMIP溶出液のRP-HPLCクロマトグラムを、図46に示す。MIP_RESは、ピーナッツミール抽出物を有意に清浄化し、且つR_t=12.2分で溶出される(E)-レスベラトロール及びいくつかの未知化合物を濃縮したのは明白である(図46B)。これに対して、MIP_AMIDEは、R_t=9.7分で溶出される未知化合物に対して優先的選択性を示したが、無視できるほど少ない(E)-レスベラトロールの保持を示し、溶出液中には(E)-レスベラトロールがピーナッツミール抽出物とほぼ同様なレベルで存在する(図46C)。MIP_AMIDEは前述のように(E) -レスベラトロールに親和性を示すが、複合体混合物からのこの分子への親和性の明らかな欠如は、混合物中に存在する他の分子への親和性の方が高い結果であるか、又はMIP空洞への可変の親和性を有する多数の分子によって生じる質量作用の法則の結果によると考えられる。NIP対照カラムによる(E)-レスベラトロールの非特異的結合のレベル(図46D)は、抽出物中に存在するレベル及びまたMIP_AMIDEによって結合されるレベルよりもごくわずかに高いが、後者の場合には未知物質の存在が結合表面を事実上飽和させた可能性がある。

MIP_RESからの溶出液(図46B)を、タンデム液体クロマトグラフィー-ESI-質量分析(LC-ESI-MS)を用いて正イオンモードで分析した。一価イオン([M+H]⁺)として229m/zの分子質量を有する(E)-レスベラトロール基準と比較することによって、R_t=12.2分のピークが(E)-レスベラトロールのみからなることが確認された。更に、LC-ESI-MSを用いて、MIP_AMIDE溶出液中に存在するR_t=9.7分の未知化合物を調べた。このピークは、A型プロシアニジンに一致する577m/z ([M+H]⁺)の分子質量を有する化合物を含むことが示された。A型プロシアニジンが多くを占める低分子量カテキンオリゴマーは、約9.5質量%の量でピーナッツ薄皮中に存在する既知の抗酸化剤である(12)。

複数の生物活性成分を単一供給源から捕捉及び単離できるタンデム分離及び単離ストラテジーにおいて複数のMIPを使用する概念を考察した。その概略を図47に示す。ピーナッツミール抽出物を2つのMIPに順に、即ち、MIP_RESの次にMIP_AMIDEに装填して、MIPが最大選択性を示す主要分子を単離した。これらの同一の溶出及び洗浄されたタンデムMIPへの枯渇ピーナッツミール抽出物の再装填は、残っているが同様に価値のある他のポリフェノール化合物の単離に役立った。

ピーナッツミール抽出物のタンデムMISPE処理からの典型的なRP-HPLCクロマトグラムを、図48に示す。ピーナッツミール抽出物のクロマトグラム(図48A)は、R_t=17分に(E)-レスベラトロールの小さいピークを示し、これは64μgの総(E)-レスベラトロールに相当する。(E)-レスベラトロールに対応するピークは、MIP_RES(図48B)から、次いでMIP_AMIDE(図48C)からの溶出液中に同様に観察される。これらの結果は、MIP_RESからのフロースルー中に残る非結合化合物の多くを排除しながら、MIP_AMIDEが(E)-レスベラトロールも特異的に捕捉する精製可能性をはっきりと示している。

MIP_RESとMIP_AMIDEとのタンデムな組み合わせは、Table17(表17)に要約するように、レスベラトロールのほぼ定量的な(96%)回収を可能にした。この結果は、両MIPカラムが、(E)-レスベラトロールを選択的に保持及び濃縮できると共に、粗供給原料からもほぼ完全に回収できることを明白に示している。

意外なことに、MIP_AMIDEカラムはまた、A型プロシアニジンと思われる化合物(R_t=15分、577m/z[M+H]⁺)よりも(E)-レスベラトロールに対して優先的な選択性を示し、この結果は、MIP_AMIDEが(E)-レスベラトロールに比較的して未知化合物に優先的に結合することを示した観察(図46C)とは異なっている。しかし、タンデムMISPE実験は、小規模実験で用いた容量よりもかなり大容量のピーナッツミール抽出物を用いて行った。したがって、MIP_AMIDEが、プロシアニジンを排除して、このピーナッツミール抽出物中に存在するより多量の(E)-レスベラトロールを選択的に保持すること、及びMIP_AMIDE結合部位が、これらのMIP_AMIDE結合部位を競合する可能性がある他の化合物を排除して、(E)-レスベラトロールでほとんど飽和されることは明らかである。MIP_AMIDEが(E) -レスベラトロール及びプロシアニジンの両方と結合できるという小規模実験での観察は、利用可能なMIP_AMIDE結合部位の飽和が少量の利用可能な(E)-レスベラトロールによっては達成されない結果として、占有されていない残りのMIP_AMIDE結合部位にプロシアニジンが結合されるという事実を明らかに反映している。更に、プロシアニジンが大規模実験においては全く結合しなかったことから、MIP_AMIDEが(E)-レスベラトロールよりもプロシアニジンに低い親和性、特異性及び選択性を示すことがわかる。

タンデムMISPEカラムが最初の供給原料から(E)-レスベラトロールのほとんど(96%)を選択的に除去したので、MIP_RES及びMIP_AMIDEがいずれも、利用可能なMIP結合部位に対する競合の減少によって、レスベラトロールが枯渇したピーナッツミール抽出物中に残っているプロシアニジンに選択的に結合することが予想された。したがって、処理されたピーナッツミール抽出物からのフロースルー及び洗浄フラクションを合し、再状態調整したタンデムMIP_RES及びMIP_AMIDEカラムに再適用した。前述と同一条件を用いて得られた、MIP_RES及びMIP_AMIDEカラムから回収された抽出物のRP-HPLCクロマトグラムは、(E)-レスベラトロールが結合せず、いずれのカラムからも溶出されないことを示した(図49)。しかし、予想通り、プロシアニジンに対応するピーク(R_f=15分)は、両MIPカラムからのクロマトグラムに明らかに存在していた。MIP_RES及びMIP_AMIDEカラムはいずれも、同様な量のプロシアニジンを保持した(図49B及び49C)。これらの結果は、(i)測定可能な(E)-レスベラトロールが全て、ピーナッツミール抽出物の1回目のタンデムMISPE処理によって抽出物から成功裏に除去されていたこと、並びに(ii) MIP_RES及びMIP_AMIDEがいずれも、この抽出物からの(E)-レスベラトロールの枯渇時にA型プロシアニジンを成功裏に濃縮できたことを裏付けている。

結論
ここに報告した発見は、分子インプリントポリマー(MIP)が、レスベラトロール及びA型プロシアニジンなどのポリフェノールを含む混合物を、徹底的なサンプル前処理を必要とせずに、ピーナッツミール抽出物から選択的に分別できることを立証している。また、これらのMIPを使用することによって、迅速タンデムMISPE(即ち、直列のMIP)アプローチを用いて同一供給原料から2種以上のポリフェノールを別々に単離又は濃縮することができる。

［H. 複合供給原料の成分分離における、「ティーバッグ」MIPの使用］
この技術は、MIPの実際的応用の新しいアプローチと言える。加工用廃棄物流(例えば、ピーナッツ副産物、ワイン醸造所のブドウ種子及び皮、リンゴジュースの生産廃棄物)からの生物活性物質の抽出は、はるかに少量の標的生物活性物質の単離及び回収のために多くの材料を地理的に異なった場所から運んでくるので、考慮すべき物流問題となり得る。したがって、バルクスケール材料の最初の分離又は予備濃縮を、廃棄物発生場所で実施することを検討することがより有利であると考えられる。そうすれば、材料の取扱いがより容易になり、単一の専用再処理施設での最終分離及び精製のために、材料はより容易にまとめられることになる。別法として、廃棄物発生場所又はその近くで、廃棄物流から価値のある材料を抽出する最初のプロセスへのローテクを適用して、抽出を実施することができる。この方法の一例は、供給原料からの標的分子の単離へのMIP充填「ティーバッグ」の使用に基づくことができた。

これらの検討に用いるための「ティーバッグ」を、コットン系材料、Gilson(登録商標)63μm篩網(sieve mesh)及びSigma Aldrich透析チューブ用セルロース膜(12kDa MWCO)から作成した。ティーバッグは、電気めっきされた金属ティーインフューザー中に収容して、撹拌中の物理的損傷から保護した。ティーバッグは数日間、頑強であり、エタノール、水及び酢酸の混合物中への浸漬に耐える。

ティーバッグ中のMIPを用いた結合実験を行った。レスベラトロール結合実験に使用したMIPは、前記実施例中に記載したMIP8(本特許出願において番号を付けた)、MIP_E、MIP_AMIDE及びMIP_IMINEである。フィトステロール結合実験に使用したMIPは、1:3:30の比のテンプレート:4VP:EDGMAを用いて製造した。

フィトステロールに関する静電的結合系における「ティーバッグ」MIPの使用:前述のように、エルゴステロール、カンペステロール、コレステロール、スチグマステロール、コレステリルフェルレート、フェルラ酸及びクマリンをMIPのテンプレートとした。MIPをティーバッグのポリマーバッグ中に充填し、次いで粗植物抽出物中に18時間入れた。続いて、ティーバッグを混合物から取り出し、MeOH中10%酢酸溶液中に4時間移した。ティーバッグを取り出し、溶液を蒸発乾固させ、得られた固体を20%ACN/MeOH中で約0.5Mに戻し、HPLC及びESI/MSによって分析した。MIPの性能の評価は、アボカド油、ゴマ油、小麦油、グレープシードオイル、β-シトステロールビタミン補填剤、及びLipton Green Tea(商標)から得た緑茶抽出物を用いて行った。抽出した個々の成分を同定した。いくつかの異なるポリマーを単独で又はそれぞれ、個々のティーバッグ中に入れ、抽出溶液から最大量及び最大数の該当化合物を同時に及び並行して抽出することができた。個々のMIPの再生利用も立証した。この結果は、性能を著しく低下させることなく、これらのMIPを再利用できることを示した。¹³C NMRスペクトルのピークにより、捕捉及び単離された種々のフィトステロールの分析が可能となる。例えば、装填カンペステロールをテンプレートとするMIPから溶離された結合フラクションの場合は、¹³C NMRスペクトルのピークは純粋なカンペステロールのみを示し、これは、カンペステロールのみがこのMIPによって特異的且つ選択的に吸収されたことを裏付けている。他方、コレステロールをテンプレートとするMIPの場合は、粗抽出物中に存在するスチグマステロールがかなり吸着された。これは、コレステロールを、より高価で製造の困難なポリマーを分子インプリンティングするためのバイオミメティック(biomimetic)テンプレートとして(グリーンなレスベラトロール-レスベラトロールのイミン類似体と同様な方法で)使用できることを示唆している。

レスベラトロールの静電的結合系における「ティーバッグ」MIPの使用
対応する実験を、MIP8(本特許出願において番号を付けた)、MIP_E、MIP_AMIDE及びMIP_IMINEを用いる「ティーバッグ」MIPへのレスベラトロールの結合に関して、以下の供給原料例:ピーナッツ薄皮及びマッシュ副産物、ワイン醸造所のブドウ種子及び皮、リンゴジュースの生産廃棄物並びにLipton Green Tea(商標)から得た緑茶抽出物を用いて行った。

［I. MIPの逐次適用］
図50は、供給材料抽出物から複数の標的を単離するためのMIPの逐次適用の一例を示す。

本明細書全体を通して、用語「含む」又はその変化形は、記載した要素、整数値若しくはステップ又は要素、整数値若しくはステップの群の包含を意味するが、他の全ての要素、整数値若しくはステップ又は要素、整数値若しくはステップの群の排除を意味するものではないと理解するものとする。

本明細書中で言及した全ての出版物は、参照することによって本明細書中に組み入れる。本明細書中に含めた資料、行為、材料、装置、物品などについての全ての記述は、本発明の背景を示すことのみを目的とする。任意又は全てのこれらの事柄は、先行技術基準の一部を形成するか、又は本出願の各請求項の優先日前にオーストラリア若しくは他の国に存在した、本発明に関連する分野における通常の一般知識であったと認めるものと解釈してはならない。

当業者ならば、広範囲に記載した本発明の精神又は範囲から逸脱しなければ、具体的な実施形態中に示した本発明に多くの変形形態及び/又は変更形態が可能なことがわかるであろう。したがって、これらの実施形態は、あらゆる点で、例示と見なすべきであって、制限的に考えてはならない。

[参考文献]

Claims

化合物に対して所望のレベルの特異性を有する分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）の製造方法であって、
１種以上の非共有結合部位を含むモノマーと架橋剤とをテンプレートおよびポロゲンの存在下で重合させる工程と、その後前記テンプレートを除去する工程とを含み；
前記テンプレートが、前記化合物に構造的に類似しているかまたは前記化合物に構造的に類似する部分を含み；
前記テンプレートが、前記モノマーの非共有結合部位と相補的である１種以上の非共有結合部位を含み；かつ、
前記テンプレートが、前記化合物より多いかまたは少ない非共有結合部位を有し、これによって前記ＭＩＰが、前記化合物自体をテンプレートとして用いる場合と比較して前記化合物に対して異なるレベルの特異性を有する、製造方法。
分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）に用いるためのモノマーであって１種以上の非共有結合部位を含むテンプレートと共にインプリンティングされることとなるものの選択を案内する方法であって、
前記ＭＩＰが、前記選択されたモノマーと架橋剤とのテンプレートおよびポロゲンの存在下での重合、ならびにその後の前記テンプレートの除去によって製造されることとなるものであり；
前記方法が、前記テンプレートの非共有結合部位と相補的である１種以上の非共有結合部位を有する一群のモノマーを準備する工程と、前記一群のモノマーの各モノマーと前記テンプレートとの間で形成される複合体の生成エネルギーを評価する工程と、前記選択におけるファクターとして前記複合体の生成エネルギーを用いて、前記一群のモノマーから前記選択されたモノマーを選択する工程とを含む、方法。
テンプレートを用いてインプリンティングされることとなる分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）の製造におけるテンプレートに対するモノマーの比を選択する方法であって、
前記ＭＩＰが、モノマーを、架橋剤と共に、テンプレートおよびポロゲンの存在下で重合させる工程と、その後前記テンプレートを除去する工程によって製造されることとなるものであり；
前記方法が、前記テンプレートとさまざまな数の前記モノマーとの間で形成される前記複合体の生成エネルギーを評価する工程と、前記選択におけるファクターとして前記複合体の生成エネルギーを用いて、テンプレートに対するモノマーの比を選択する工程とを含む、方法。
ＭＩＰの製造に用いるためのポリマー化前複合体であって、
前記ポリマー化前複合体が、それぞれ１種以上の非共有結合部位を含む１種以上のモノマーと、テンプレートとを含み；
前記テンプレートが、前記モノマーの前記１種以上の非共有結合部位と相補的である１種以上の非共有結合部位を含む、ポリマー化前複合体。
請求項１に記載の方法によって製造されるＭＩＰ。
モノマーを、架橋剤と共に、テンプレートおよびポロゲンの存在下で重合させる工程と、その後前記テンプレートを除去する工程とによって製造されるＭＩＰであって、前記モノマーの選択が、請求項２に記載の方法によって案内される、ＭＩＰ。
トランス-エチレン連結基を含む化合物の類似体を設計する方法であって、
前記トランス-エチレン連結基を、イミン連結基、アミド連結基、または二級アミン連結基で置き換えることを含む、方法。
トランス-エチレン連結基を有する化合物に対して特異的であるＭＩＰを製造する方法であって、
モノマーと架橋剤とをテンプレートおよびポロゲンの存在下で重合させる工程と、その後前記テンプレートを除去する工程とを含み；
前記テンプレートが前記化合物の類似体であり；かつ、
前記類似体が、請求項７に記載の方法によって設計される、方法。
ポリフェノールまたはその類似体を用いてインプリンティングされた分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）であって、
前記ＭＩＰが、重合した4-ビニルピリジンを、重合した架橋剤と共に含む、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）。
請求項９に記載のＭＩＰの製造方法であって、
(i)前記ＭＩＰを、ポリフェノールまたはその類似体、およびポロゲンの存在下で重合させる工程と、
(ii)前記ポリフェノールまたはその類似体を、前記ＭＩＰから除去する工程と
を含む、方法。
１種以上のポリフェノールを試料から抽出する方法であって、前記試料を請求項１に記載のＭＩＰに曝すことによる、方法。
クロマトグラフィーによって試料の構成成分を少なくとも部分的に分離する方法であって、
(i)請求項１に記載のＭＩＰを含むクロマトグラフィー用カラムを準備する工程と、
(ii)前記試料を、前記クロマトグラフィー用カラムに通す工程と、
(iii)前記クロマトグラフィー用カラムから前記試料のフラクションを集める工程と
を含む、方法。
ステロール類およびスタノール類、ならびにこれらの類似体または誘導体からなる群から選択される１種以上の化合物を用いてインプリンティングされたＭＩＰであって、重合したモノマーを含む、ＭＩＰ。
請求項１３に記載のＭＩＰの製造方法であって、
(i)ステロールもしくはスタノールまたはこれらの類似体もしくは誘導体と、ポロゲンとの存在下で前記ＭＩＰを重合させる工程と、
(ii)ステロールもしくはスタノールまたはこれらの類似体もしくは誘導体を、前記ＭＩＰから除去する工程と
を含む、方法。
１種以上のステロールもしくはスタノールまたはこれらの類似体もしくは誘導体を、試料から抽出する方法であって、前記試料を請求項１３に記載のＭＩＰに曝すことによる、方法。
クロマトグラフィーによって試料の構成成分を少なくとも部分的に分離する方法であって、
(i)請求項１３に記載のＭＩＰを含むクロマトグラフィー用カラムを準備する工程と、
(ii)前記試料を前記クロマトグラフィー用カラムに通す工程と、
(iii)前記クロマトグラフィー用カラムから前記試料のフラクションを集める工程と
を含む、方法。
本明細書に記載した新規な化合物。
２種以上の成分を含む試料の前記成分を、少なくとも部分的に分離する方法であって、
前記試料を、少なくとも２種のＭＩＰに順次曝す工程を含み、各ＭＩＰが異なるテンプレートを用いてインプリンティングされたものである、方法。
浸透性メッシュに入ったＭＩＰ。
試料から成分を抽出する方法であって、前記試料を請求項１９に記載のＭＩＰに曝す工程を含む、方法。
(E)-5-[(4-ヒドロキシ-フェニルイミノ)-メチル]-ベンゼン-1,3-ジオールまたは3,5-ジヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)ベンズアミドを用いてインプリンティングされたＭＩＰであって、重合したモノマーを含む、ＭＩＰ。
試料からレスベラトロールを抽出する方法であって、前記試料を、請求項２１に記載のＭＩＰに曝す工程を含む、方法。