CN102408461A

CN102408461A - 一种利用活性碳柱层析和结晶技术提取纯化梓醇的方法

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Publication number: CN102408461A
Application number: CN2011102755248A
Authority: CN
Inventors: 刘明; 王慧森; 李更生
Original assignee: HENAN PROVINCE CHINESE MEDICINE RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: HENAN PROVINCE CHINESE MEDICINE RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2011-09-16
Publication date: 2012-04-11

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从中药鲜地黄块根中分离制备梓醇的方法。即以中药地黄的新鲜块根为原料，采用活性碳柱层析分离纯化的方法，同时灵活运用溶剂提取法、硅胶柱分离法和多种结晶技术制备纯度不同的梓醇产品。目的在于提供一种工艺简捷、环保节能、适宜工业化生产制备梓醇的方法。

Description

一种利用活性碳柱层析和结晶技术提取纯化梓醇的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从中药鲜地黄块根中分离制备梓醇的方法。

背景技术

地黄为常用中药，2010年版《中国药典》一部的成方制剂中有近二百种(194种)选用了地黄，是我国著名的“四大怀药”道地药材之一，地黄来源于玄参科植物地黄Rehmanniaglutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根，具清热凉血、养阴、生津之功效^[1]。

我们课题组成员长期从事地黄化学成分和药理学研究，先后承担了国家七.五攻关课题“常用中药材地黄品种整理和质量研究”、国家九.五攻关课题“地黄质量标准规范化研究”(NO：969030204)、国家青年基金课题“标准物质地黄甙D的研究”(NO：95Y3411，合同：95C018)、河南省自然基金课题“鲜地黄与地黄、熟地黄有效成分比较研究”(NO：0111021700)、“中药地黄、白芷、连翘标准品的研究”(NO：0511043800)以及国家自然科学基金“地黄一源三性物质基础及血清相关性的比较研究”(编号：30873442)等一系列有关中药“地黄”的国家和省级科研课题，对地黄中环烯醚萜苷类成分进行了系统的分离鉴定研究，并大量的富集制备了梓醇等标准品，为地黄的质量控制及药效学评价奠定了基础。其结构如下：

经研究发现，梓醇属于7，8-环氧醚型环烯醚萜苷类化合物，其4-位无取代基，1-位上的羟基与糖缩合成单糖苷，它是中药地黄中降血糖作用的有效成分，并有很好的利尿作用和迟发性的缓下作用，这些都与地黄药效相一致。近年来，国内学者报道了梓醇具有改善东莨菪碱诱导的学习记忆障碍^[2]、抗脑缺血损伤促神经修复和重塑^[3]、抗老年性痴呆改善记忆^[4]和治疗骨质疏松^[5]等等多种药理活性。同时，梓醇也是地黄的指标性成分，2010年版《中国药典》一部规定生地黄药材按干燥品计算含梓醇不得少于0.20％^[1]。

现有标准品梓醇系我们在国家七五期间及河南省自然基金课题研究成果，已经推广应用于地黄药材的质量控制。我们曾对梓醇成分进行分离制备，研究发现梓醇分子量不大，在溶解性方面偏于亲水性，易溶于水和甲醇，可溶于乙醇、丙酮、正丁醇，难溶于氯仿、苯、石油醚等亲脂性有机溶媒，但其热稳定性较差，对酸很敏感，苷键易为酸水解断裂，所得苷元因具有半缩醛结构，性质活泼容易进一步发生氧化聚合等反应。从鲜品加工成生地黄及熟地黄，梓醇的含量降低至原来的1/10^[6-11]。

对于梓醇的分离和提取，其它已有的报道多集中在从地黄中溶出梓醇方面，包括所用溶剂、提取时间、提取方法等因素^[12-14]；王明道^[15-16]等采用了酶法和微波辅助进行怀地黄梓醇的提取工艺研究；樊海燕^[17]、张秀丽^[18]等采用了大孔吸附树脂方法分离纯化梓醇；温学森^[19]、张发成^[20]、刘东锋^[21]等亦采用大孔吸附树脂分离纯化的必备步骤对鲜地黄中的梓醇进行制备。为了寻找一种更适宜工业化生产的方法，我们在相关课题资助下，经多年的试验和研究，优选了活性碳柱层析同时灵活运用多种结晶手段等方法用于梓醇的分离纯化，经反复验证表明工艺稳定、可靠。

活性炭是一种孔结构发达、比表面积巨大的含碳物质，具有吸附量大、再生简单、成本低等特点，活性炭广泛应用于天然产物有效成分的分离，是分离有机化合物，尤其是水溶性化合物的有效手段，在天然产物化学成分的提纯等方面显示了独特的优势，王贤纯^[22]、皮文霞^[23]、张虎极^[24]等采用活性炭柱层析法已经成功分离纯化了姜黄素、山茱萸总苷和莽草酸。

结晶技术作为一种制备纯物质的有效方法之一，在传统医药化工生产中一直占有相当重要的位置。与其他分离方法相比，结晶法具有产品纯度高、能量消耗少、操作温度低、对设备腐蚀程度小、操作简单、成本低等特点，应用非常广泛。

迄今，未见涉及以地黄新鲜块根为原料，采用活性碳柱层析分离纯化的方法，同时灵活运用多种结晶等技术分离制备梓醇的专利报道。

参考文献

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发明内容

本发明是以中药地黄的新鲜块根为原料，采用活性碳层析分离纯化的方法，同时灵活运用溶剂提取法、硅胶柱分离法和多种结晶技术分离制备纯度不同的梓醇产品。目的在于提供一种工艺简捷、环保节能、适宜工业化生产大量分离制备梓醇的方法。

本发明的目的是这样来实现的：

1)药材的前处理

取当年产鲜地黄块根，净选，除去非药用部位、杂质及霉变品、虫蛀品、灰屑等，水洗或漂除去泥沙，切薄片或小块。

2)溶剂提取

在植物材料中拌入碳酸钙或氢氧化钡，以抑制酶的活性和中和植物酸，加入原料量4-5倍的乙醇，以3000～8000rpm转速破碎提取，甩干机离心初步分离去植物破碎组织，过滤提取液，浓缩，干燥成干浸膏。

3)活性炭柱层析

上述提取步骤所获得的产物加水溶解，过滤，通过已处理好的分离柱(颗粒状活性炭于150℃加热处理4.5小时后，再加蒸馏水浸泡1小时，除浮粉后用蒸馏水湿法装柱)，先以水洗脱至流出液近无色，并且糖反应试验阴性(molish反应阴性)结合TLC检查至梓醇出现为止，用75％乙醇溶液继续洗脱至无梓醇检出止，合并醇洗脱液，回收乙醇并浓缩，干燥成干浸膏。

4)硅胶柱分离

上述提取步骤所获得的产物加甲醇或乙醇溶解，过滤，加适量柱层层析硅胶拌样，干燥后，样品加于层析柱的顶端，乙酸乙酯-乙醇(8∶2)洗脱，TLC检测收集合并含梓醇的洗脱液，回收溶剂，残渣60℃以下干燥。

5)结晶

上述提取步骤所获得的产物，以丙酮-水(1∶1)为结晶溶剂，可以采用一次结晶(包括冷却结晶、蒸发结晶、真空结晶、反应和盐析结晶)、重结晶、分级结晶等技术，进行分批(间歇)操作或连续操作，再通过固一液分离、洗涤等操作，得到纯度较高的梓醇产品。

上述从中药地黄的新鲜块根中提取纯化梓醇的制备方法，其特征在于所述药材的前处理：鲜地黄块根在切片或小块前可以削皮也可以不削皮，可以除去鲜地黄中部白色和浅黄色菊花心以外的部分也可以不去除。

其特征在于除采用活性炭柱分离法之外，可以用溶剂提取法、硅胶柱分离法、结晶法等任一种方法，或这些方法的任意组合进行制备得到纯度不同的梓醇产品。

其特征在于各步骤中涉及的浓缩方法包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩等；干燥方法包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。

其特征在于所述提取条件：提取原料中可以采用无氧条件下加热或直接用水蒸气热处理或拌入碳酸钙或氢氧化钡，用来抑制酶的活性和中和植物酸，也可以不灭活直接提取；所用溶剂可以是水或任意一种醇类及酮类溶剂，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂；提取方法可以是破碎提取法，也可以是浸渍、渗滤、煎煮、回流提取、连续回流提取、超声波提取、微波辅助提取、酶法提取等；提取溶液的过滤包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法，使用或不使用以下任一种澄清剂或其组合：醇沉剂、各种树脂、101果汁澄清剂、甲壳素类(如壳聚糖)、ZTC天然澄清剂、明胶、鞣酸等。

其特征在于当使用活性炭柱层析时，可以选用煤质活性炭、木质活性炭、竹基活性炭或者果壳活性炭，优选椰壳活性炭；可以选用粉末状也可以用颗粒状，优选颗粒状；可以加压或减压吸附、洗脱，也可以选用常压；可以选择低温吸附、高温解吸的方式，也可以为常温操作。上样液浓度范围为0.05～1.0g/mL，吸附流速1～6BV/h，树脂柱径高比1∶5～1∶20；水洗除杂，除杂流速为1～6BV/h；解析可以为2～6倍量柱床体积的10％～100％甲醇、乙醇或丙酮等溶剂解析，解析流速为1～6BV/h。

其特征在于：当采用硅胶柱层析法进行制备时，可以选用干柱法，也可以是湿柱法；所用的洗脱液一般是由水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等组成的混合溶剂。

其特征在于结晶技术：结晶溶剂可以为水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷的任一种，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂，优选丙酮-水系统；结晶类型可以为冷却结晶、蒸发结晶、真空结晶和反应与盐析结晶等传统结晶法，也可以为超临界结晶、物理场强化溶液结晶、膜结晶、加压结晶等新型结晶技术。

本发明存在以下优点：

①2010年版中国药典一部地黄药材项下明确规定了其药用部位是块根，以其为原料相比从地黄茎叶等其它非药用部位提取得到的不同纯度的梓醇产品，与原药材“地黄”具有更多的相似性和药理活性，本发明以地黄新鲜块根为原料保证了梓醇不会因干燥而损失，有利于提高产品纯度降低分离纯化难度。

②本发明使用活性炭柱层析不仅仅是脱色，其主要目的是除糖，同时根据梓醇分子结构特征和活性炭吸附特点使用柱层析的方法使产品纯度得到有效富集。其特点是样品上样量大，分离效果好，活性炭来源较易，价格便宜，适用于工业化制备性分离。

③本发明可以选用溶剂提取法、硅胶柱层析分离法、结晶法等任一种方法，或这些方法的任意组合进一步制备得到纯度不同的梓醇产品。其中多种结晶方法的灵活运用保证了产品的高纯度，环保节能。

本发明是在国家自然科学基金(编号：30873442)和河南省自然科学基金项目(0511043800)资助下完成。

下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。

附图说明：

图1为生产原料--鲜地黄块根

图2为活性炭层析柱

图3为结晶溶剂中的梓醇晶体

图4为高纯度的梓醇产品

具体实施方式

实施例1

取鲜地黄块根20Kg，净选，切薄片，立即拌入0.5％碳酸钙，混匀，加95％乙醇100L于破碎提取器中破碎提取(转速：3000rpm)15min，甩干机离心初步分离去除植物破碎组织，滤过，滤液减压回收乙醇，真空干燥得干浸膏1.12Kg。干浸膏加水5.0L溶解，滤过，通过已处理好的活性炭分离柱(颗粒状活性炭于150℃加热处理4.5小时后，再加蒸馏水浸泡1小时，除浮粉后用蒸馏水湿法装柱)，先以水洗脱至流出液近无色，流速为2BV/小时，并且糖反应试验阴性(molish反应阴性)，结合TLC检查至梓醇出现为止，用75％乙醇溶液继续洗脱至无梓醇检出止，流速为3BV/小时，合并醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得梓醇粗品210g。梓醇粗品加甲醇500mL溶解，过滤，加适量柱层析硅胶拌样，干燥后，样品加于硅胶层析柱的顶端，乙酸乙酯-乙醇(8∶2)洗脱，TLC检测收集合并含梓醇的洗脱液，回收溶剂，残渣60℃以下干燥，以丙酮-水(1∶1)为结晶溶剂，于50～60℃加热制备过饱和溶液，趁热过滤，滤液置于10℃冷库静置24小时析晶，抽滤，丙酮-水(1∶1)溶剂洗涤结晶，得梓醇结晶73g(纯度在98％以上)；母液采用分级重结晶的方法，得到纯度不同的梓醇系列产品。

实施例2

取鲜地黄块根100Kg，净选，切薄片，投入提取罐内，加95％乙醇400L回流提取3次，每次1h，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，真空干燥得干浸膏8.56Kg。干浸膏加水50.0L溶解，滤过，分次通过已处理好的活性炭分离柱(颗粒状活性炭于150℃加热处理4.5小时后，再加蒸馏水浸泡1小时，除浮粉后用蒸馏水湿法装柱)，先以水洗脱至流出液近无色，流速为3BV/小时，并且糖反应试验阴性(molish反应阴性)结合TLC检查至梓醇出现为止，用75％乙醇溶液继续洗脱至无梓醇检出止，流速为3BV/小时，合并醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得梓醇粗品890g。梓醇粗品加甲醇2L溶解，过滤，加适量柱层层析硅胶拌样，干燥后，样品分次加于硅胶层析柱的顶端，乙酸乙酯-乙醇(8∶2)洗脱，TLC检测收集合并含梓醇的洗脱液，回收溶剂，残渣60℃以下干燥，以丙酮-水(3∶1)为结晶溶剂，于50～60℃加热制备过饱和溶液，趁热过滤，滤液置于10℃冷库静置24小时析晶，过滤，丙酮-水(3∶1)溶剂洗涤结晶，得梓醇结晶302g(纯度在98％以上)；母液采用分级重结晶的方法，得到纯度不同的梓醇系列产品。

实施例3

取鲜地黄块根50Kg，净选，切成厚度为1～2mm的薄片，立即将其加热至40～50℃，保温100～120min，于破碎提取器中破碎提取加乙醇200L以5000rpm转速匀浆15min，甩干机离心初步分离去植物破碎组织，残渣加50％乙醇200L室温浸渍2次，合并匀浆滤液和浸渍液，回收乙醇，减压浓缩，真空干燥得干浸膏4.87Kg。干浸膏加水40.0L溶解，滤过，分次通过已处理好的活性炭分离柱(颗粒状活性炭于150℃加热处理4.5小时后，再加蒸馏水浸泡1小时，除浮粉后用蒸馏水湿法装柱)，先以水洗脱至流出液近无色，流速为2BV/小时，并且糖反应试验阴性(molish反应阴性)结合TLC检查至梓醇出现为止，用75％乙醇溶液继续洗脱至无梓醇检出止，流速为2BV/小时，合并醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得梓醇粗品487g。梓醇粗品加适量甲醇溶解，过滤，加硅胶H拌样，干燥后，样品分次加于硅胶层析柱的顶端，三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(6∶4∶1∶0.5)洗脱，TLC检测收集合并含梓醇的洗脱液，回收溶剂，残渣60℃以下干燥，以丙酮-水(1∶3)为结晶溶剂，于50～60℃加热制备过饱和溶液，趁热过滤，滤液置于10℃冷库静置24小时析晶，抽滤，丙酮-水(1∶3)溶剂洗涤结晶，得梓醇结晶194g(纯度在98％以上)；母液采用分级重结晶的方法，得到纯度不同的梓醇系列产品。

实施例4

取鲜地黄块根50Kg，净选，切成厚度为1～2mm的薄片，投入提取罐内，加甲醇400L回流提取3次，每次1h，合并提取液，滤过，减压浓缩回收甲醇，真空干燥得干浸膏5.36Kg。干浸膏加水40.0L溶解，滤过，分次通过已处理好的活性炭分离柱(颗粒状活性炭于150℃加热处理4.5小时后，再加蒸馏水浸泡1小时，除浮粉后用蒸馏水湿法装柱)，先以水洗脱至流出液近无色，流速为1BV/小时，并且糖反应试验阴性(molish反应阴性)结合TLC检查至梓醇出现为止，用75％乙醇溶液继续洗脱至无梓醇检出止，流速为2BV/小时，合并醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得梓醇粗品0.51Kg。梓醇粗品加适量1∶2.5倍量乙醇溶解，过滤，滤液减压回收乙醇，硅胶层析柱湿法装柱湿法上样，乙酸乙酯-乙醇-水(7∶3∶1)洗脱，TLC检测收集合并含梓醇的洗脱液，回收溶剂，残渣60℃以下干燥，以丙酮-水(1∶1)为结晶溶剂，于50～60℃加热制备过饱和溶液，趁热过滤，滤液置于10℃冷库静置24小时析晶，抽滤，丙酮-水(1∶1)溶剂洗涤结晶，得梓醇结晶172g(纯度在98％以上)；母液采用分级重结晶的方法，得到纯度不同的梓醇系列产品。

Claims

1.一种利用活性炭和结晶技术从中药地黄的新鲜块根中提取纯化梓醇的方法，其特征在于：

1)药材的前处理

取当年产鲜地黄块根，净选，除去非药用部位、杂质及霉变品、虫蛀品、灰屑等，水洗或漂除去泥沙，切薄片或小块；

2)溶剂提取

在植物材料中拌入碳酸钙或氢氧化钡，以抑制酶的活性和中和植物酸，加入原料量4-5倍的乙醇，以3000～8000rpm转速破碎提取，甩干机离心初步分离去植物破碎组织，过滤提取液，浓缩，干燥成干浸膏；

3)活性炭柱层析分离

上述提取步骤所获得的产物加水溶解，过滤，通过已处理好的分离柱(颗粒状活性炭于150℃加热处理4.5小时后，再加蒸馏水浸泡1小时，除浮粉后用蒸馏水湿法装柱)，先以水洗脱至流出液近无色，并且糖反应试验阴性(molish反应阴性)结合TLC检查至梓醇出现为止，用75％乙醇溶液继续洗脱至无梓醇检出止，合并醇洗脱液，回收乙醇并浓缩，干燥成干浸膏；

4)硅胶柱层析分离

上述提取步骤所获得的产物加甲醇或乙醇溶解，过滤，加适量柱层层析硅胶拌样，干燥后，样品加于层析柱的顶端，乙酸乙酯-乙醇(8∶2)洗脱，TLC检测收集合并含梓醇的洗脱液，回收溶剂，残渣60℃以下干燥；

5)结晶

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述药材的前处理：鲜地黄块根在切片或小块前可以削皮也可以不削皮，可以除去鲜地黄中部白色和浅黄色菊花心以外的部分也可以不去除。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于除采用活性炭柱层析法之外，可以用溶剂提取法、硅胶柱层析法、结晶法等任一种方法，或这些方法的任意组合进行制备得到纯度不同的梓醇产品。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于各步骤中涉及的浓缩方法包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩等；干燥方法包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述提取条件：提取原料中可以采用无氧条件下加热或直接用水蒸气热处理或拌入碳酸钙或氢氧化钡，用来抑制酶的活性和中和植物酸，也可以不灭活直接提取；所用溶剂可以是水或任意一种醇类及酮类溶剂，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂；提取方法可以是破碎提取法，也可以是浸渍、渗滤、煎煮、回流提取、连续回流提取、超声波提取、微波辅助提取、酶法提取等；提取溶液的过滤包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法，使用或不使用以下任一种澄清剂或其组合：醇沉剂、各种树脂、101果汁澄清剂、甲壳素类(如壳聚糖)、ZTC天然澄清剂、明胶、鞣酸等。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于当使用活性炭柱层析时，可以选用煤质活性炭、木质活性炭、竹基活性炭或者果壳活性炭，优选椰壳活性炭；可以选用粉末状也可以用颗粒状，优选颗粒状；可以加压或减压吸附、洗脱，也可以选用常压；可以选择低温吸附、高温解吸的方式，也可以为常温操作；上样液浓度范围为0.05～1.0g/mL，吸附流速1～6BV/h，树脂柱径高比1∶5～1∶20；水洗除杂，除杂流速为1～6BV/h；解析可以为2～6倍量柱床体积的10％～100％甲醇、乙醇或丙酮等溶剂解析，解析流速为1～6BV/h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：当采用硅胶柱层析法进行制备时，可以选用干柱法，也可以是湿柱法；所用的洗脱液一般是由水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等组成的混合溶剂。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于结晶技术：结晶溶剂可以为水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷的任一种，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂，优选丙酮-水系统；结晶类型可以为冷却结晶、蒸发结晶、真空结晶和反应与盐析结晶等传统结晶法，也可以为超临界结晶、物理场强化溶液结晶、膜结晶、加压结晶等新型结晶技术。