CN102397324A

CN102397324A - 藏药独一味中苯丙素苷类物质的测定方法

Info

Publication number: CN102397324A
Application number: CN2010102803514A
Authority: CN
Inventors: 赵亮; 董树清; 刘芹
Original assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Priority date: 2010-09-10
Filing date: 2010-09-10
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2030-09-10
Also published as: CN102397324B

Abstract

本发明公开了一种藏药独一味中苯丙素苷类物质的测定方法。本发明利用苯丙素苷能够被水解释放出苯乙醇类和肉桂酸类化合物的特性，利用高效液相色谱方法对独一味中几种苯乙醇类和肉桂酸类化合物进行分离并采用外标法进行测定，从而达到对独一味中苯丙素苷类物质的准确地测定。

Description

藏药独一味中苯丙素苷类物质的测定方法

技术领域

本发明涉及一种对藏药独一味及其制剂中苯丙素苷类物质分离测定技术，属于分析化学技术领域。

背景技术

独一味为唇形科植物，生长于海拔2700～4500米的高山草甸中，广泛分布于西藏、甘肃、四川等高原地区，是藏族、蒙古族和纳西族民间用药，具有止血镇痛、活血化瘀、抗菌消炎等功效，临床主要用于治疗跌打损伤、外伤出血、风湿痹痛、黄水病。

独一味植物中主要含有黄酮类、环烯醚萜类、苯丙素类物质。中国专利200510035066.5提供了一种独一味为原料提取分离制备含苯丙素苷类物质为主要活性成分制成的注射剂，涉及制备方法及用途。同时该专利所述的苯丙素苷类物质主要为Pedicularioside A和Lamiophlomioside A两种物质，并利用C₁₈制备型液相色谱反复上柱制备得到Pedicularioside A和Lamiophlomioside A两种对照品，对所述的注射剂进行定性定量鉴别。文献(中国中药杂志，2008，33(11)，1346-1347)利用从独一味中分离纯化得到的毛蕊花糖苷和连翘酯苷作对照品，测定了不同产地独一味中的毛蕊花糖苷和连翘酯苷的含量。目前，针对独一味植物中苯丙素苷类成分的测定，所用的方法仅限于从独一味植物中经过多次反复纯化制备出含量较高的苯丙素苷作对照品，采用外标法来定性定量测定独一味中的苯丙素苷的含量，这种方法能够较为准确测定出独一味植物中某种特定的苯丙素苷类如毛蕊花糖苷和连翘酯苷的含量。但是，由于从独一味植物中纯化制备苯丙素苷对照品的工作费工费时、成本较高，同时独一味中某些含量较低的苯丙素苷对照品的制备非常困难，因而这种测定方法常常苦于没有对照品而使测定受到限制，通常只能对独一味中较少几个苯丙素苷进行测定，不能全面反映独一味中苯丙素苷类物质的含量。

发明内容

本发明的目的是提供一种苯丙素苷类物质的高效液相色谱测定方法。

本发明旨在利用苯丙素苷能够被水解释放出苯乙醇类和肉桂酸类化合物的特性，利用高效液相色谱方法对独一味中几种苯乙醇类和肉桂酸类化合物进行分离并采用外标法进行测定，从而达到对独一味中苯丙素苷类物质的准确地测定。

本发明提供的测定方法所采用的对照品是市场上容易购买得到的常规标准品，不需要专门制备，有利于测定方法的标准化，有很好的应用价值。

本发明利用独一味中苯丙素苷被水解释放出羟基酪醇、高香草醇、3，4-二甲氧基苯乙醇、咖啡酸、阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸六种化合物的特性，通过对独一味提取物及其制剂中这六种成分定量测定，从而实现对藏药独一味及其制剂中苯丙素苷类物质的分析测定。

本发明提供的独一味中苯丙素苷类物质的高效液相色谱方法以市场上购买到的羟基酪醇、高香草醇、3，4-二甲氧基苯乙醇、咖啡酸、阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸六种标准品为测定对照品，来定性定量测定实际样品中相应成分的含量。通过对待测定样品在一定条件下水解使其释放出羟基酪醇、高香草醇、3，4-二甲氧基苯乙醇、咖啡酸、阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸六种化合物，在反相离子对色谱的模式下进行高效液相色谱分离，采用外标法进行测定。利用对照品相应位置的色谱峰面积，按标准曲线计算含量，准确测定出实际样品中六种化合物的含量。本发明提供的高效液相色谱方法以十八烷基键合硅胶为色谱柱填料，以甲醇、磷酸二氢钾缓冲溶液、四烷基铵对离子试剂配制成流动相，以反相离子对色谱的模式进行分离，用紫外检测器进行检测。

一种藏药独一味中苯丙素苷类物质的测定方法，其特征在于该方法依次包括以下步骤：

1.样品预处理

1)样品提取与制备

对于固体样品包括独一味原植物、独一味生药、独一味片剂、独一味胶囊、独一味丸剂或独一味冲剂，首先使固体样品中的苯丙素苷类物质完全转移到提取溶剂中，选用极性溶剂为提取溶剂，用提取溶剂回流提取，过滤合并提取液，减压浓缩至十分之一，制成待水解样品溶液；对于液态制剂，直接取样加提取溶剂稀释，过滤即可制成待水解样品溶液；

2)样品水解

将提取得到的待水解样品溶液进行水解，使样品中的苯丙素苷完全水解释放出苯乙醇和肉桂酸类化合物；水解完成后得到的水解液用甲醇稀释供液相色谱测定；

2.对照品溶液制备

将羟基酪醇、高香草醇、3，4-二甲氧基苯乙醇、咖啡酸、阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸六种标准品精密称定适量，用甲醇溶解并稀释成系列对照品溶液；

3.液相色谱测定

以十八烷基键合硅胶为色谱柱填料，以甲醇、磷酸二氢钾缓冲溶液、四烷基铵对离子试剂配制成流动相，以反相离子对色谱模式进行分离分析，用紫外检测器进行检测。

本发明所述的样品提取溶剂为由水、甲醇、乙醇、水和甲醇组成的混合溶剂；或者由水和乙醇组成的混合溶剂；用量为样品量的5～20倍。

本发明所述的固体样品应予粉碎，以利于提高提取效率。生药可粉碎成1厘米以下的颗粒即可，固体制剂研磨粉碎即可。

本发明所述的固体样品的用量为1～50g；液体样品用量为5～100ml。

本发明所述的待水解样品溶液的水解是在酸性条件下水解的，所用的酸为硫酸、盐酸、硝酸、冰醋酸中的一种。

本发明所述的待水解样品溶液的水解酸性条件中酸的浓度为0.1～6.0mol/L。

本发明所述的待水解样品溶液的水解时间为10～180分钟。

本发明所述的水解液用甲醇稀释倍数为1～20倍。

本发明所述的对照品为市售的标示含量大于或等于95％的羟基酪醇、高香草醇、3，4-二甲氧基苯乙醇、咖啡酸、阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸标准品。

本发明所述的对照品溶液为羟基酪醇、高香草醇、3，4-二甲氧基苯乙醇、咖啡酸、阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸标准品的甲醇溶液；其中，各标准品浓度羟基酪醇为0.1～100mmol/L、高香草醇0.1～100mmol/L、3，4-二甲氧基苯乙醇0.1～100mmol/L、咖啡酸0.1～100mmol/L、阿魏酸0.1～100mmol/L、3，4-二甲氧基肉桂酸0.1～50mmol/L。

本发明所述的液相色谱测定是在十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱(ODS)上进行分离的，色谱分离所用的流动相为甲醇/10mmol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(30/70，V/V)，用磷酸调节pH为3.0，添加四丁基溴化铵对离子试剂，使流动相中四丁基溴化铵的浓度达到5～100mmol/L。流动相的流速为1.0ml/min。

本发明所述的液相色谱测定是在紫外检测器上进行检测的，检测使用的波长为290nm。

本发明提供的苯丙素苷类物质的高效液相色谱方法与现有方法相比具有如下优点：

1.对照品容易得到。

2.苯丙素苷的测定全面、准确。

3.测定方法容易标准化。

附图说明

图1是六种对照品的高效液相色谱图。其中：1.羟基酪醇，2.高香草醇，3.3，4-二甲氧基苯乙醇，4.咖啡酸，5.阿魏酸，6.3，4-二甲氧基肉桂酸。

图2是独一味原植物的高效液相色谱图。其中：1.羟基酪醇，2.高香草醇，3.3，4-二甲氧基苯乙醇，4.咖啡酸，5.阿魏酸，6.3，4-二甲氧基肉桂酸。

色谱条件：用Waters 2487色谱仪检测，Diamonsil C18色谱柱(5μm，416mm×250mm)，流动相为甲醇-10mM的磷酸二氢钾水溶液-(30∶70，V/V)，用磷酸调节pH为3.0，添加60mM四丁基溴化铵对离子试剂，检测波长为290nm，流速为1.0mL/min。

具体实施方式

本发明通过下列具体实施例进行详细的描述。

实施例1

样品预处理：准确称取10.0g粉碎的独一味全草加入到500ml烧瓶中，用100ml蒸馏水加热回流提取，共提取3次。将3次所得的提取液合并，纱布过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸馏浓缩至30ml，加入10％盐酸进行水解，调节盐酸的浓度为2mol/L，水解2小时后得到水解液，过滤后定容至50ml，准确量取10ml，再用甲醇稀释10倍定容于100ml容量瓶中，得独一味全草样品溶液供进样分析。

对照品溶液制备：精密称取纯度为98％的羟基酪醇1.54g；纯度为95％的高香草醇1.68g；纯度为95％的3，4-二甲氧基苯乙醇1.82g；纯度为96％的咖啡酸1.80g；纯度为97％的阿魏酸1.94g；纯度为95％的3，4-二甲氧基肉桂酸1.04g溶解于100ml容量瓶中，配制成羟基酪醇浓度为100.0mmol/L；高香草醇浓度为100.0mmol/L；3，4-二甲氧基苯乙醇浓度为100.0mmol/L；咖啡酸浓度为100.0mmol/L；阿魏酸浓度为100.0mmol/L和3，4-二甲氧基肉桂酸浓度为50.0mmol/L的标准溶液。此标准溶液用甲醇稀释成系列对照品溶液供分析使用。系列对照品溶液中，羟基酪醇、高香草醇、3，4-二甲氧基苯乙醇、咖啡酸、阿魏酸有相同的系列浓度，分别为1.0mmol/L、5.0mmol/L、12.5mmol/L、25.0mmol/L、50.0mmol/L；3，4-二甲氧基肉桂酸浓度为0.5mmol/L、2.5mmol/L、6.25mmol/L、12.5mmol/L、25.0mmol/L。

液相色谱测定：用Waters色谱仪一套，包括515色谱泵一台，2487多波长紫外检测器一台，7725i手动进样器一个。在YMC-Pack ODS-A色谱柱(5μm，150×4.6mm ID)上进行高效液相色谱分离测定。流动相是甲醇/10mmol/L的磷酸二氢钾水溶液，配比为30/70(V/V)，用磷酸调节pH为3.0，添加四丁基溴化铵对离子试剂，使流动相中四丁基溴化铵的浓度达到60mmol/L。检测波长为290nm，流速为1.0ml/min，对照品溶液和实际样品溶液均进样20μl进行分析。对照品溶液的高效液相色谱分离结果如图1所示。独一味全草样品溶液的高效液相色谱分离结果如图2所示。独一味全草样品测定的结果为独一味原植物中含羟基酪醇1.73％；高香草醇0.15％；3，4-二甲氧基苯乙醇0.18％；咖啡酸0.05％；阿魏酸0.001％；3，4-二甲氧基肉桂酸0.11％。

实施例2

样品预处理：准确称取6.72g粉碎的独一味片加入到250ml烧瓶中，加25ml蒸馏水和25ml甲醇加热回流提取，共提取3次。将3次所得的提取液合并，滤纸过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸馏浓缩至20ml，加入10％盐酸进行水解，调节盐酸的浓度为2.5mol/L，水解1小时后得到水解液，过滤后定容至50ml，准确量取10ml，再用甲醇稀释10倍定容于100ml容量瓶中，得独一味片制剂样品溶液供进样分析。

液相色谱测定：用Waters色谱仪一套，包括515色谱泵一台，2487多波长紫外检测器一台，7725i手动进样器一个。在YMC-Pack ODS-A色谱柱(5μm，150×4.6mm ID)上进行高效液相色谱分离测定。流动相是甲醇/10mmol/L的磷酸二氢钾水溶液，配比为30/70(V/V)，用磷酸调节pH为3.0，添加四丁基溴化铵对离子试剂，使流动相中四丁基溴化铵的浓度达到40mmol/L。检测波长为290nm，流速为1.0ml/min，对照品溶液和实际样品溶液均进样20μl进行分析。独一味片样品(批号：1090003)测定的结果为独一味片中含羟基酪醇0.8％；高香草醇0.8％；3，4-二甲氧基苯乙醇0.7％；咖啡酸0.01％；阿魏酸0.06％；3，4-二甲氧基肉桂酸0.01％。

Claims

1.一种藏药独一味中苯丙素苷类物质的测定方法，其特征在于该方法依次包括以下步骤：

样品预处理

样品提取与制备

样品水解

对照品溶液制备

将羟基酪醇、高香草醇、3，4-二甲氧基苯乙醇、咖啡酸、阿魏酸、3，4二甲氧基肉桂酸六种标准品精密称定适量，用甲醇溶解并稀释成系列对照品溶液；

液相色谱测定

2.如权利要求1所述的方法，其特征在所述的样品提取溶剂为由水、甲醇、乙醇、水和甲醇组成的混合溶剂；或者由水和乙醇组成的混合溶剂；用量为样品量的5～20倍。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于水解是在酸性条件下水解的，所用的酸为硫酸、盐酸、硝酸、冰醋酸中的一种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于水解酸性条件中酸的浓度为0.1～6.0mol/L。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于水解液用甲醇稀释倍数为1～20倍。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于水解时间为10～180分钟。