CN102391335A - 异戊烯基黄酮醇糖苷类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有通式(I)结构的异戊烯基黄酮醇糖苷类衍生物及其制备方法和应用，所述异戊烯基黄酮醇糖苷类衍生物中，R1为鼠李糖基，R2、R3、R4、R7为H，R5为甲氧基，R6为羟基；或R1、R4、R6、R7为H，R2为木糖基，R3为乙酰基，R5为羟基；或R1、R3、R6、R7为H，R2为木糖基，R4为葡萄糖基，R5为羟基；或R1为鼠李糖基，R2、R3、R6为H，R4为葡萄糖基，R5为甲氧基，R7为羟基。本发明还涉及戊烯基黄酮醇糖苷类衍生物在预防和治疗骨质疏松症的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药发明领域，具体涉及一种防治骨质疏松症的异戊烯基黄酮醇糖苷类衍生物，其制备方法及含有该化合物的药物组合物。
背景技术
骨质疏松症是以骨量减少，骨的微细结构破坏为特征的一种全身性代谢性的骨骼疾病，其表现为骨脆性增加，易诱发骨折。据统计，目前全球约2亿人口患有骨质疏松，其发病率在常见病、多发病中列第7位。世界卫生组织预计，到2050年骨质疏松引起的骨折会从1990年的100万例上升到600万例，高发地区也会从现在的欧洲、北美洲向亚洲、非洲和南美洲转移，其中亚洲的骨质疏松性骨折将占到全部总数的50％。在我国，目前患有骨质疏松症的人群约占我国总人口的6.97％，随着人口老龄化加剧，骨质疏松患者数目还将大大增加。
近几十年来，治疗骨质疏松症的药物发展迅速。目前所用的药物主要有如下几类，包括雌激素、降钙素、二磷酸盐等抑制骨吸收药物，氟化物、他汀类等促进骨形成的药物，钙剂、维生素D等促进骨矿化的药物。也有一些中成药制剂开始应用于临床，如骨疏康胶囊、密骨胶囊、仙灵骨葆胶囊等。这些药物能够不同程度地预防和治疗骨质疏松症，缓解病痛，降低骨折发生率，但也存在着毒副作用大、远期疗效不确定、价格昂贵等诸多缺点。
因此，新的疗效确切、毒副作用低、容易获得的抗骨质疏松症的成分在预防及治疗骨质疏松症中显示出广阔的应用前景。
中药淫羊藿是传统的补肾壮阳药，《本草纲要》中有“补命门，益精气，坚筋骨”之说，淫羊藿很早就被应用于治疗骨质疏松症的复方 中药中，但其抗骨质疏松作用直到近年来才引起人们的高度重视，并开展了大量基础实验和临床应用研究。李青南等用去睾丸法造成SD大鼠的骨质疏松症模型，然后给模型大鼠灌服淫羊藿水煎提取液，每周6次，持续7周后发现，灌药组胫骨近端骨小梁的股吸收率明显降低，股形成率和矿化沉积率则明显增加，同时发现该药物具有促进骨髓细胞DNA合成的作用(李青南，吴铁，谢华等，中草药，1993年第12期)。
中国专利申请CN03127917.1公开了淫羊藿苷在制备治疗或预防骨质疏松药物中的应用；
中国专利申请CN200910300311.9公开了朝藿定C治疗骨质疏松的用途
淫羊藿苷 朝藿定C
最近，通过对于柔毛淫羊藿的进一步研究，又从中分离得到了4种新的异戊烯基黄酮醇糖苷类衍生物，基于光谱分析，证实了它们的结构，并通过动物实验证实其药效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治骨质疏松症的化合物。
本发明的另一目的在于提供一种该化合物的制备方法。
本发明进一步的目的是提供该化合物的应用。
本发明的另一目的是提供上述化合物的药物组合物。
本发明提供的一种具有通式(I)结构的异戊烯基黄酮醇糖苷类衍生物：
其中，
当R1为鼠李糖基，R2、R3、R4、R7为H，R5为甲氧基，R6为羟基时，该衍生物的化学名称为4′-甲氧基-3′，5，7-三羟基-8-异戊烯基-黄酮-3-O-α-L-(2-O-α-L-鼠李糖基)鼠李糖苷(化合物1)，其结构式如式(II)；
当R1、R4、R6、R7为H，R2为木糖基，R3为乙酰基，R5为羟基时，该衍生物的化学名称为4′，5，7-三羟基-8-异戊烯基-黄酮-3-O-α-L-(3-O-β-D-木糖基-4-O-乙酰基)鼠李糖苷(化合物2)，其结构式如式(III)；
式(II) 式(III)
当R1、R3、R6、R7为H，R2为木糖基，R4为葡萄糖基，R5为羟基时，该衍生物的化学名称为4′，5-二羟基-8-异戊烯基-黄酮-3-O-α-L-(3-O-β-D-木糖基)鼠李糖基-7-O-β-D-葡萄糖苷(化合物3)，其结 构式如式(IV)：
当R1为鼠李糖基，R2、R3、R6为H，R4为葡萄糖基，R5为甲氧基，R7为羟基时，该衍生物的化学名称为4′-甲氧基-5-羟基-8-(5-羟甲基-4-甲基)异戊烯基-黄酮-3-O-α-L-(2-O-α-L-鼠李糖基)鼠李糖基-7-O-β-D-葡萄糖苷(化合物4)，其结构式如式(V)所示：
式(IV) 式(V)
本发明中的异戊烯基黄酮醇糖苷类衍生物是从小檗科淫羊藿属植物柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim.)的地上部分中分离得到的，具体提取方法包括如下步骤：
1)取柔毛淫羊藿的地上部分，用6-10倍量的50-80％的乙醇加热回流提取，提取液干燥后，得到提取物；
2)将提取物混悬于水中，过滤后，取滤液上大孔吸附树脂色谱柱，依次用水、30％、95％乙醇-水洗脱；
3)将95％乙醇-水洗脱部分用硅胶开放柱色谱分离，采用氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，洗脱液以每1/3柱保留体积为一份收集，根据硅胶薄层色谱上斑点不同进行合并，最后共得到14个馏分；其中氯仿-甲醇按照体积比100∶0(简写为CHCl3-MeOH 100∶0)洗脱得到馏分1；CHCl3-MeOH 98∶2洗脱得到馏分2和3；CHCl3-MeOH 95∶5洗脱得到馏分4和5；CHCl3-MeOH 9∶1洗脱得到馏分6-8；CHCl3-MeOH 8∶2洗脱得到馏分9-11；CHCl3-MeOH 7∶3洗脱得到馏分12-14。
4)用CHCl3-MeOH 9∶1洗脱的馏分7经ODS柱色谱分离，采用甲醇- 水系统梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4个柱保留体积，每1/3柱保留体积为一份收集，根据薄层色谱斑点情况进行合并；甲醇浓度依次为40％，60％，80％，其中40％的甲醇洗脱得到7A、7B、7C和7D；60％的甲醇洗脱得到7E、7F、7G和7H；80％的甲醇洗脱得到7I(简写为7A-7I)，共9个子馏分。其中60％甲醇洗脱的子馏分7H经Sephadex LH-20柱色谱分离，以CHCl3-MeOH 1∶1洗脱，洗脱液再经HW-40柱色谱分离，以50％甲醇洗脱得到化合物2。
5)用CHCl3-MeOH 8∶2洗脱的馏分10经ODS开放柱色谱分离，采用甲醇-水系统梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4个柱保留体积，每1/3柱保留体积为一份收集，根据薄层色谱斑点情况进行合并；甲醇浓度依次为30％，50％，65％，分别得到10A、10B、10C、10D和10E；10F、10G和10H；10I(简写为10A-10I)，共得到9个子馏分。其中用50％甲醇洗脱的子馏分10F采用Sephadex LH-20柱色谱，以60％甲醇洗脱，收集黄色色带，之后经ODS制备液相(洗脱液为80％甲醇溶液)分离，收集保留时间为31.4min的色谱峰，即得到化合物3；
另一用65％甲醇洗脱子馏分10I采用Sephadex LH-20柱色谱，以60％甲醇洗脱，收集黄色色带，再经ODS制备液相(洗脱液为65％甲醇溶液)分离，收集保留时间为45.5min的色谱峰，即为化合物1。
6)用CHCl3-MeOH 8∶2洗脱的馏分11经ODS开放柱色谱分离，采用甲醇-水系统梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4个柱保留体积，每1/3柱保留体积为一份收集，根据薄层色谱斑点情况将洗脱液进行合并。甲醇浓度依次为20％，35％，50％，分别得到11A和11B；11C、11D和11E；11F和11G共7个子馏分。其中20％甲醇洗脱的子馏分11B经SephadexLH-20柱色谱分离，先后采用氯仿-甲醇(1∶1)和35％甲醇溶剂系统分离，最后经ODS制备液相(洗脱液为50％甲醇溶液)分离，收集保留时间为16.0min的色谱峰，即为化合物4。
所述提取方法中：步骤1)干燥方法为减压蒸干；所述大孔吸附树脂的型号为HP-20。
本发明还提供了上述化合物在制备预防和治疗骨质疏松症的药物中的应用。
本发明还提供了含有上述通式(I)结构的化合物的药物组合物，由通式(I)化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
所述药学上可接受的载体或稀释剂是指药学领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。
其中所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素或葡萄糖等；
所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等；
所述崩解剂选自微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素或交联羧甲基纤维素钠；
所述润滑剂选自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸钙、碳酸氢钠、二氧化硅、滑石粉或硬脂酸镁；
所述表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯(吐温)等；
所述矫味剂选自阿斯巴甜、蔗糖素、甜蜜素或糖精钠；
本发明提供的组合物可以通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。其中口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、颗粒剂、丸剂、滴丸、胶囊剂或粉剂；制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、口服液等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮液等，优选的形式是片剂、胶囊、栓剂、鼻喷雾剂和注射剂。
本发明提供的药物组合物可以按照药学领域的常规生产方法制备。
本发明的药物组合物含有重量比为0.1～99.5％的活性成分，优选为0.5～95％的活性成分，更优选的是5～85％的活性成分。
本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～10mg/kg体重，优选0.1～5mg/kg体重。可以依次或多次施用。
现有技术报道显示，淫羊藿苷、朝藿定C具有抗骨质疏松的作用，相关药物可用于骨质疏松症的预防和治疗。我们的研究结果显示淫羊藿苷、朝藿定C能够促进成果样细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性，但与其结构类似的化合物如朝藿定A(VI)、朝藿定B(VII)则不具有促进成骨样细胞ALP活性的作用；另外，体外活性实验结果显示，淫羊藿苷不能促进成骨样细胞的钙结节形成率。说明该类化合物结构上的微小变化会对活性产生很大影响。本发明提供的化合物则能够显著促进成骨样细胞的钙结节形成率。
朝藿定A(VI) 朝藿定B(VII)
本发明的有益之处在于提供了一系列新的具有骨形成促进作用的异戊烯基黄酮醇糖苷类衍生物及含有该新化合物的组合物，可作为药物、食品或食品添加剂用于骨质疏松症的预防及治疗。
附图说明
图1：化合物1-4及类似物对MC3T3-E1细胞的ALP活性的影响(**P＜0.01，*P＜0.05)；
图2：化合物1-4及类似物对MC3T3-E1细胞的钙结节形成的影响(**P＜0.01，*P＜0.05)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：本发明的异戊烯基黄酮醇糖苷类衍生物的制备
1、取干燥的柔毛淫羊藿的地上部分(除根径等之外的地上部分)2kg，用8倍量的60％乙醇加热回流提取2次，每次2h，提取液经减压蒸干后，得到提取物245g；
2、将提取物混悬于5L水中，过滤后，取滤液上大孔吸附树脂HP-20色谱柱(Ф9×70cm)，依次用水、30％、95％(v/v)乙醇-水洗脱，其中，95％(v/v)乙醇-水洗脱部分共得到80g；
3、将80g 95％(v/v)乙醇-水洗脱部分用硅胶开放柱色谱分离，采用氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，洗脱液以每1/3柱保留体积为一份收集，根据硅胶薄层色谱上斑点不同将洗脱液进行合并，最后共得到14个馏分；其中氯仿-甲醇按照体积比100∶0(简写为CHCl3-MeOH 100∶0)洗脱得到馏分1；CHCl3-MeOH 98∶2洗脱得到馏分2和3；CHCl3-MeOH95∶5洗脱得到馏分4和5；CHCl3-MeOH 9∶1洗脱得到馏分6-8；CHCl3-MeOH 8∶2洗脱得到馏分9-11；CHCl3-MeOH 7∶3洗脱得到馏分12-14。
4、用CHCl3-MeOH 9∶1洗脱的馏分7经ODS柱色谱分离，采用甲醇-水系统梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4个柱保留体积，每1/3柱保留体积为一份收集，根据薄层色谱斑点情况进行合并；甲醇浓度依次为40％，60％，80％，分别得到7A、7B、7C和7D；7E、7F、7G和7H；7I(简写为7A-7I)，共9个子馏分。其中60％甲醇洗脱的子馏分7H经SephadexLH-20柱色谱分离，以CHCl3-MeOH 1∶1洗脱，洗脱液再经HW-40柱色谱分离，以50％甲醇洗脱得到化合物2(16mg)。
5、用CHCl3-MeOH 8∶2洗脱的馏分10经ODS开放柱色谱分离，采用甲醇-水系统梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4个柱保留体积，每1/3柱保留体积为一份收集，根据薄层色谱斑点情况进行合并；甲醇浓度依次为30％，50％，65％，分别得到10A、10B、10C、10D和10E；10F、10G和10H；10I(简写为10A-10I)，共9个子馏分。其中用50％甲醇洗脱的子馏分10F采用Sephadex LH-20柱色谱，以60％甲醇洗脱，收集黄色色 带，之后经ODS制备液相(洗脱液为80％甲醇溶液)分离，收集保留时间为31.4min的色谱峰，即得到化合物3(26mg)。
另一用65％甲醇洗脱的子馏分10I采用Sephadex LH-20柱色谱，以60％甲醇洗脱，收集黄色色带，再经ODS制备液相(洗脱液为65％甲醇溶液)分离，收集保留时间为45.5min的色谱峰，即为化合物1(9mg)。
6、用CHCl3-MeOH 8∶2洗脱的馏分11经ODS开放柱色谱分离，采用甲醇-水系统梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4个柱保留体积，每1/3柱保留体积为一份收集，根据薄层色谱斑点情况将洗脱液进行合并。甲醇浓度依次为20％，35％，50％，分别得到11A和11B，11C、11D和11E；11F和11G共7个子馏分。其中子馏分11B经Sephadex LH-20柱色谱分离，先后采用氯仿-甲醇(1∶1)和35％甲醇溶剂系统分离，最后经ODS制备液相(洗脱液为50％甲醇溶液)分离，收集保留时间为16.0min的色谱峰，即为化合物4(21mg)。
7、通过理化常熟和现代波谱学手段(UV、IR、MS、NMR)鉴定了上述化合物的结构(式(I)所示)，如下表1所示：
式(I)
表1：柔毛淫羊藿中分离得到的异戊烯基黄酮醇糖苷类衍生物
1)化合物1，橙黄色粉末，Molish反应呈阳性。UV图谱(CH3OH)显示λmax nm(logε)：258(4.13，sh)，270(4.17)，346(3.91)，为黄酮类化合物的紫外特征吸收。ESI-MS给出准分子离子峰m/z 699[M+Na]+，1375[2M+Na]+，675[M-H]-，提示分子量为676。HR-ESI-MS给出m/z677.2448[M+H]+(Calcd for C33H41O15，677.2440)，确定该化合物的分子式为C33H40O15，计算其不饱和度为14。
在化合物1的13C-NMR(100MHz，in DMSO-d6)谱中，共显示33个碳信号，结合DEPT-135谱，其中包括12个季碳信号，15个叔碳信号，1个仲碳信号，1个甲氧基碳信号及4个甲基碳信号。在1H-NMR(400MHz，in DMSO-d6)谱中，低场区的氢信号δ12.58(1H，s)为结构中的缔合羟基(5-OH)的氢信号。芳香区存在4个氢信号，其中氢信号δ6.28(1H，s)提示结构中存在一个五取代的苯环，另外一组偶合的氢信号δ7.36(1H，dd，J＝8.4，2.1Hz)，7.34(1H，d，J＝2.1Hz)，7.08(1H，d，J＝8.4Hz)提示结构中存在1，2，4-三取代苯环片段。氢信号δ5.15(1H，t，J＝7.0Hz，H-12)，3.38(2H，m，H-11)，1.68(3H，s，H-14)和1.62(3H，s，H-15)，结合13C-NMR谱中的五个碳信号[δ21.2(C-11)，122.4(C-12)，130.9(C-13)，17.7(C-14)，25.4(C-15)]，提示结构中存在一个异戊烯基。此外，在1H-NMR谱中还显示了两组氢信号：δ5.34(1H，d，J＝1.3Hz，H-1″)/0.83(3H，d，J＝6.0Hz，H-6″)和δ4.86(1H，d，J＝1.1Hz，H-1″′)/1.08(3H，d，J＝6.2Hz，H-6″′)，提示结构中存在两个鼠李糖基。将化合物进行酸水解反应，并通过衍生化反应及HPLC分析，确定所含糖的绝对构型为L-鼠李糖。通过1H-1H COSY谱，可以将两个糖基的氢信号分别进行归属，再结合HSQC谱，可能确定相关的碳信号的归属。在HMBC谱中，5位羟基的氢信号(δ12.58)和碳信号δ158.8，98.5，103.7都有远程相关，可以确定这三个碳依次为C-5，C-6和C-10。H-6(δ6.28)和C-5(δ158.8)，C-7(δ162.6)，C-8(δ105.9)，C-10(δ103.7)都有远程相关，同时，H-11(δ3.38)和C-8相关，确定异戊烯基连接在C-8位上。甲氧基的氢信号(δ3.85)和C-4′(δ150.5)存在远程相关，说 明甲氧基连接在C-4′位上。此外，糖的端基氢信号H-1″(δ5.34)与C-3(δ134.2)存在远程相关，确定一个鼠李糖基连在苷元的C-3位上。同时，H-2″(δ4.10)和C-1″′(δ101.6)相关，H-1″′(δ4.86)和C-2″(δ75.5)相关，确定另一个鼠李糖基连接在内侧鼠李糖基的2位上。
综合核磁图谱信息，将化合物1鉴定为4′-甲氧基-3′，5，7-三羟基-8-异戊烯基-黄酮-3-O-α-L-(2-O-α-L-鼠李糖基)鼠李糖苷，为一个新化合物。
2)化合物2，黄色粉末，Molish反应呈阳性。UV图谱(CH3OH)显示λmax nm(logε)：270(4.25)，316(3.97，sh)，350(3.91)，为黄酮类化合物的紫外特征吸收。ESI-MS给出准分子离子峰m/z 697[M+Na]+，1371[2M+Na]+，673[M-H]-，提示分子量为674。HR-ESI-MS给出m/z675.2296[M+H]+(Calcd for C33H39O15，675.2283)，确定该化合物的分子式为C33H38O15，计算其不饱和度为15。
在化合物2的1H-NMR(400MHz，in DMSO-d6)谱中，低场区的氢信号δ12.48(1H，s)为结构中的缔合羟基(5-OH)的氢信号。芳香区存在5个氢信号，其中氢信号δ6.10(1H，s)提示结构中存在一个五取代的苯环，另外一组偶合的氢信号δ7.71(2H，d，J＝8.7Hz)和6.93(2H，d，J＝8.7Hz)，提示结构中存在一个对取代苯环。氢信号δ5.17(1H，t，J＝5.9Hz，H-12)，3.34(2H，m，H-11)，1.67(3H，s，H-14)和1.61(3H，s，H-15)，结合13C-NMR(100MHz，in DMSO-d6)谱中的五个碳信号[δ21.3(C-11)，123.3(C-12)，129.9(C-13)，17.8(C-14)，25.4(C-15)]，提示结构中存在一个异戊烯基。对比已知化合物的核磁数据，确定化合物2的苷元结构为去甲基淫羊藿素。在1H-NMR谱中存在一个甲基的氢信号δ1.97(3H，s)，结合碳信号δ169.7和20.8，推测结构中存在一个乙酰基。此外，在1H-NMR谱中还显示了两个糖的端基氢信号δ5.30(1H，brs，H-1″)，4.22(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″′)。经酸水解、衍生化反应及HPLC分析，确定了糖的绝对构型为L-鼠李糖和D-木糖。糖区的信号可通过1H-1H COSY和HSQC谱进行归属。在HMBC谱中，鼠李糖的 端基氢信号H-1″(δ5.30)和C-3(δ133.1)存在远程相关，说明鼠李糖基连接在苷元母核的C-3位上。另一木糖的端基氢信号H-1″′(δ4.22)与C-3″(δ76.5)相关，确定木糖连接在鼠李糖的3位上。此外，H-4″(δ4.84)和乙酰基的羰基碳信号(δ169.7)有远程相关，说明乙酰基连接在C-4″位。
综合二维核磁图谱信息，将化合物2鉴定为4′，5，7-三羟基-8-异戊烯基-黄酮-3-O-α-L-(3-O-β-D-木糖基-4-O-乙酰基)鼠李糖苷，为一个新化合物。
3)化合物3，橙黄色粉末，Molish反应呈阳性。UV图谱(CH3OH)显示λmax nm(logε)：270(4.13)，321(3.87，sh)，350(3.85)，为黄酮类化合物的紫外特征吸收。ESI-MS给出准分子离子峰m/z 817[M+Na]+，1611[2M+Na]+，795[M+H]+，793[M-H]-，提示分子量为794。HR-ESI-MS给出m/z 795.2726[M+H]+(Calcd for C37H47O19，795.2706)，确定该化合物的分子式为C37H46O19，计算其不饱和度为15。
将化合物3与化合物2的1D NMR数据进行比较，在化合物3中未发现乙酰基结构片段的相关信号，但比化合物2多了一组葡萄糖基的相关信号。在化合物3的1H-NMR(400MHz，in DMSO-d6)谱中，给出了三个端基氢信号：δ5.30(1H，brs，H-1″)，4.32(1H，d，J＝7.3Hz，H-1″′)，5.07(1H，d，J＝7.3Hz，H-1″″)。经酸水解、衍生化反应及HPLC分析，并根据偶合常数，确定了它们的绝对构型依次为α-L-鼠李糖，β-D-木糖，β-D-葡萄糖。糖区的信号可通过1H-1H COSY和HSQC谱进行归属。在13C-NMR(100MHz，in DMSO-d6)谱中，C-3的化学位移值(δ134.0)提示鼠李糖连接在苷元的3位上。在13C-NMR(100MHz，in DMSO-d4)谱中，C-3的化学位移值(δ134.0)提示鼠李糖连接在苷元的3位上。在HMBC谱中，H-1″′(δ4.32)和C-3″(δ69.5)有远程相关，提示木糖连接在鼠李糖的3位上。在ROESY谱中，H-1″″(δ5.07)和H-6(δ6.63)相关，提示葡萄糖连接在苷元的C-7位。
综合二维核磁图谱信息，将化合物3鉴定为4′，5-二羟基-8-异戊烯 基-黄酮-3-O-α-L-(3-O-β-D-木糖基)鼠李糖基-7-O-β-D-葡萄糖苷，为一个新化合物。
4)化合物4，黄色粉末，Molish反应呈阳性。UV图谱(CH3OH)显示λmax nm(logε：270(4.38)，316(4.14，sh)，348(4.07)，为黄酮类化合物的紫外特征吸收。ESI-MS给出准分子离子峰m/z 861[M+Na]+，839[M+H]+，873[M+Cl]-，提示分子量为838。HR-ESI-MS给出m/z839.2982[M+H]+(Calcd for C39H51O20，839.2968)，确定该化合物的分子式为C39H50O20，计算其不饱和度为15。
在化合物4的13C-NMR(100MHz，in DMSO-d6)谱中，显示37根谱线，共39个碳信号，结合DEPT-135谱，其中包括11个季碳信号，21个叔碳信号，3个仲碳信号，1个甲氧基碳信号及3个甲基碳信号。在1H-NMR(400MHz，in DMSO-d6)谱中，低场区的氢信号δ12.61(1H，s)为结构中的缔合羟基(5-OH)的氢信号。芳香区的单峰氢信号δ6.64(1H，s)提示结构中存在一个五取代的苯环，另外一组相互偶合的芳香氢信号δ7.90(2H，d，J＝9.0Hz)和7.12(2H，d，J＝9.0Hz)，提示结构中存在一个对取代苯环。氢信号δ3.85(3H，s)提示结构中存在一个甲氧基。氢信号δ5.37(1H，m，H-12)，3.47，3.60(各1H，m，H-11)，1.66(3H，s，H-14)，3.73(2H，br s，H-15)，结合13C-NMR(100MHz，in DMSO-d6)谱中的五个碳信号[δ20.8(C-11)，120.9(C-12)，135.6(C-13)，13.7(C-14)，66.1(C-15)]，提示结构中存在一个羟化的异戊烯基。经酸水解、衍生化反应及HPLC分析，确定了化合物4中含有两种类型的糖，即L-鼠李糖和D-葡萄糖。在13C-NMR(100MHz，in DMSO-d6)谱中，两组氢信号δ5.41(1H，d，J＝1.3Hz，H-1″)/0.81(3H，d，J＝5.6Hz，H-6″)，4.88(1H，br s，H-″′)/1.11(3H，d，J＝6.2Hz，H-6″′)提示结构中存在两个鼠李糖。此外，可以确定氢信号δ5.01(1H，d，J＝7.5Hz，H-1″″)为葡萄糖的端基氢信号。糖区的其他信号可通过1H-1H COSY和HSQC谱分别进行归属。在ROESY谱中，H-1″″(δ5.01)和H-6(δ6.64)之间存在远程相关，提示葡萄糖连接在苷元的C-7位；H-1″(δ5.41)与 H-6′(δ7.12)相关，提示一个鼠李糖连在苷元的3位上。在HMBC谱中，H-1″′(δ4.88)与C-2″(δ75.5)远程相关，说明另一鼠李糖连接在内侧鼠李糖的2位上。此外，甲氧基氢信号(δ3.85)与C-4′(δ161.4)相关，说明甲氧基连在C-4′位。
综合二维核磁图谱信息，将化合物4鉴定为4′-甲氧基-5-羟基-8-(5-羟甲基-4-甲基)异戊烯基-黄酮-3-O-α-L-(2-O-α-L-鼠李糖基)鼠李糖基-7-O-β-D-葡萄糖苷，为一个新化合物。
表2：化合物1-4的苷元部分的核磁数据(in DMSO-d6)
表3：化合物1-4的糖基部分的核磁数据(in DMSO-d6)
“o”是指与其他信号重叠的峰值
实验例2：实施例1所得化合物及类似物对成骨样细胞系MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性(ALP)的影响。
以成骨样细胞系MC3T3-E1细胞的ALP活性，评价实施例1中得到的化合物及结构类似物朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的促进成骨细胞分化的作用。
将MC3T3-E1细胞接种于24孔板(1×105细胞/孔)，在含有10％FBS(胎牛血清)的α-MEM培养液中进行培养(37℃、湿度95％、5％CO2)。
2天后，将MC3T3-E1细胞换入含0.3％FBS并含不同浓度化合物(0.01μmol/L，0.1μmol/L，1μmol/L)的α-MEM培养液中，以该细胞在等体积含0.3％FBS的α-MEM培养液中培养作为空白组，继续培养10天。
培养结束后，倒弃原培养液，用0.2％Nonidet P-40(2mL)固定细胞，细胞经超声粉碎后，加1mol/L Tris-HCl(160mL)于200μL样品液中，采用Lowry法检测ALP活性。
实验结果见图1，该图显示了化合物在不同浓度下对MC3T3-E1细胞的ALP活性的影响。
结果显示：以空白组为对照，化合物1-4、朝藿定C、淫羊藿苷能够促进MC3T3-E1细胞的ALP活性，提示化合物1-4、朝藿定C、淫羊藿苷具有促进成骨细胞分化的功能，进而可能促进骨形成，从而发挥抗骨质疏松的作用。朝藿定A和朝藿定B则没有该方面的作用。
实验例3：对成骨样细胞系MC3T3-E1细胞的钙结节形成促进率的影响
以成骨样细胞系MC3T3-E1细胞的钙结节形成率，评价实施例1中得到的化合物及结构类似物朝藿定C和淫羊藿苷的促进成骨细胞钙化的活性，具体方法为：
将MC3T3-E1细胞接种于12孔板(1×105细胞/孔)，在含有10％FBS的α-MEM培养液中进行培养(37℃、湿度95％、5％CO2)。
两天后，将细胞换入含1μmol/L化合物或空白溶剂的α-MEM培养液中，加入10mmol/L的β-甘油磷酸钠和50μg/mL的抗坏血酸溶液诱导矿化。
隔天更换培养液，12天后终止培养，以茜素红染色，作形态计量分析。以矿化面积(A)作为指标，计算矿化促进率：(A药物组-A对照组)/A 对照组×100％。
实验结果见图2，该图是化合物1-4及结构类似物朝藿定C和淫羊藿苷对MC3T3-E1细胞的钙结节形成促进率的影响。
结果显示：以空白组作为对照，化合物1-4、朝藿定C能够不同程度的促进MC3T3-E1细胞钙结节的形成，提示化合物1-4和朝藿定C具有促进成骨细胞矿化的功能，进而可能促进骨形成，从而发挥抗骨质疏松的作用；淫羊藿苷则不具有该方面的活性。
实施例4：化合物1的片剂
取1g化合物1，27g微晶纤维素及2g硬脂酸镁，按照等量递加法混合均匀，用单冲压片机直接将混合物压成直径6mm的片剂。
片剂规格：每片300mg，含化合物1的量为10mg/片。
实施例5：化合物2的颗粒剂
取1g化合物1，与淀粉29g混合，加水制成软材，过12目筛网进行制粒、然后干燥、整粒，然后分装，即得颗粒剂。
规格：每袋300mg，含化合物1的量为10mg/袋。
实施例6：化合物2和3的胶囊剂
取化合物2和化合物3各2g，与乳糖34g、硬脂酸镁2g混合，按照等量递加法混合均匀，然后灌装胶囊。
规格：每粒胶囊400mg，含化合物2和化合物3各20mg。
实施例7：化合物2和3的冲剂
取化合物2和3各1g，与维生素D5g、淀粉22g、糊精11g混合，加水制成软材，过80目筛，分装，即得。
规格：每袋400mg，含化合物2和3各10mg。
实施例8：化合物4的糖浆剂
取1g化合物4，用水300mL溶解，加入乳酸钙20g、橙香精30g，溶解后，加单糖溶液至1000mL，制得糖浆剂。
规格：本糖浆剂中化合物4的含量为1mg/mL。
实施例9：实施例4-8药物对去卵巢骨质疏松模型小鼠的抗骨质疏松的 影响
1、实验动物：3月龄的雌性C57BL/6J小鼠；
2、造模方法：取小鼠，用乙醚麻醉后俯位固定，在背部脊柱处切口，于无菌条件下摘除双侧卵巢作为骨质疏松症模型小鼠；
假手术组背部两侧切口后再缝合。
3、实验分组：术后恢复两周，挑选存活下来的小鼠56只，随机分成7组，分别灌胃给以如下药物，同时小鼠每天给以重蒸水和去除雌激素的鼠粮：
假手术组：背部两侧切口后再缝合的小鼠，给予重蒸水，10mL/kg体重/d；
病理模型组：造模后存活的小鼠，给予重蒸水，10mL/kg体重/d；
实施例4组：实施例4的片剂研磨成粉，混悬于重蒸水中灌胃给药，300mg/kg体重/d；
实施例5组：实施例5的颗粒剂研磨成粉混悬于重蒸水中灌胃给药，300mg/kg体重/d；
实施例6组：实施例6的胶囊内容物混悬于重蒸水中灌胃给药，400mg/kg体重/d；
实施例7样品：实施例7的冲剂粉末溶于水，灌胃给药，400g/kg体重/d；
实施例8样品：实施例8的糖浆剂直接灌胃给药，30mL/kg体重/d。
4、实验方法：连续给药3个月后，乙醚麻醉小鼠，腹主动脉取血后，取出小鼠左侧的股骨和胫骨，剔除肌肉和软骨，用PBS浸润的纱布包好，采用Micro-CT技术测定股骨远端和胫骨近段的骨密度。
5、实验统计：经T检验分析，表示为：mean±S.E.M.。
6、实验结果：
试验结果见表4：
表4：实施例4-8药物对骨质疏松小鼠的骨密度的影响
| 组别 | 动物数(n) | 股骨骨密度(mg/ccm) | 胫骨骨密度(mg/ccm) |
[0132]
| 假手术组 | 8 | 116.10±3.12 | 115.33±2.87 |
| 病理模型组 | 8 | 56.79±2.69 | 54.94±6.71 |
| 实施例4组 | 8 | 111.45±8.30*** | 109.58±4.15*** |
| 实施例5样品 | 8 | 117.26±8.02*** | 116.73±3.89*** |
| 实施例6样品 | 8 | 122.82±2.08*** | 117.78±3.99*** |
| 实施例7样品 | 8 | 83.28±6.55** | 80.29±6.01** |
| 实施例8样品 | 8 | 75.89±3.29 | 73.43±5.47 |
注：与模型组比较，**P＜0.01，***P＜0.01
实验结果显示：与病理模型组相比，实施例4-7的药品均能显著改善由于去卵巢所引起的小鼠股骨和胫骨骨量的丢失，可以作为预防或治疗骨质疏松症的药物使用。实施例8的药品对骨的作用虽然没有统计学意义，却表现出能够抑制骨量丢失的趋势，可以作为预防骨质疏松的保健品应用。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种防治骨质疏松症的具有通式(I)结构的异戊烯基黄酮醇糖苷类衍生物：
其中，R1为鼠李糖基，R2、R3、R4、R7为H，R5为甲氧基，R6为羟基，称为化合物1；
或R1、R4、R6、R7为H，R2为木糖基，R3为乙酰基，R5为羟基，称为化合物2；
或R1、R3、R6、R7为H，R2为木糖基，R4为葡萄糖基，R5为羟基，称为化合物3；
或R1为鼠李糖基，R2、R3、R6为H，R4为葡萄糖基，R5为甲氧基，R7为羟基，称为化合物4。
2.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)取柔毛淫羊藿的地上部分，用6-10倍量的50-80％的乙醇加热回流提取，提取液干燥后，得到提取物；
2)将提取物混悬于水中，过滤后，取滤液上大孔吸附树脂色谱柱，依次用水、30％、95％乙醇-水洗脱；
3)将95％乙醇-水洗脱部分用硅胶开放柱色谱分离，采用氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，洗脱液以每1/3柱保留体积为一份收集，根据硅胶薄层色谱上斑点不同进行合并，共得到14个馏分，其中CHCl3-MeOH 100∶0洗脱得到馏分1；CHCl3-MeOH 98∶2洗脱得到馏分2和3；CHCl3-MeOH 95∶5洗脱得到馏分4和5；CHCl3-MeOH 9∶1洗脱得到馏分6-8；CHCl3-MeOH 8∶2洗脱得到馏分9-11；CHCl3-MeOH 7∶3洗脱得到馏分12-14；
4)用CHCl3-MeOH 9∶1洗脱的馏分7经ODS柱色谱分离，采用甲醇-水系统梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4个柱保留体积，每1/3柱保留体积为一份收集，根据薄层色谱斑点情况进行合并，甲醇浓度依次为40％，60％，80％，分别得到7A、7B、7C和7D；7E、7F、7G和7H；7I，其中60％甲醇洗脱的子馏分7H经Sephadex LH-20柱色谱和HW-40柱色谱分离，以CHCl3-MeOH 1∶1洗脱，洗脱液再经HW-40柱色谱分离，以50％甲醇洗脱得到纯化后得到化合物2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法的步骤4)替换为：用CHCl3-MeOH 8∶2洗脱的馏分10经ODS开放柱色谱分离，采用甲醇-水系统梯度洗脱，甲醇浓度依次为30％，50％，65％，分别得到10A、10B、10C、10D和10E；10F、10G和10H；10I，共得到9个子馏分，其中用50％甲醇洗脱的子馏分10F采用Sephadex LH-20柱色谱，以60％甲醇洗脱，收集黄色色带，之后经ODS制备液相分离，得到化合物3。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法的步骤4)替换为：用CHCl3-MeOH 8∶2洗脱的馏分10经ODS开放柱色谱分离，采用甲醇-水系统梯度洗脱，甲醇浓度依次为30％，50％，65％，分别得到10A、10B、10C、10D和10E；10F、10G和10H；10I，共得到9个子馏分，用65％甲醇洗脱的子馏分10I采用Sephadex LH-20柱色谱，以60％甲醇洗脱，之后经ODS制备液相分离，得到化合物1。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法的步骤4)替换为：用CHCl3-MeOH 8∶2洗脱的馏分11经ODS柱色谱分离，采用甲醇-水系统梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4个柱保留体积，每1/3柱保留体积为一份收集，根据薄层色谱斑点情况将洗脱液进行合并，甲醇浓度依次为20％，35％，50％，分别得到11A和11B；11C、11D和11E；11F和11G，共得到7个子馏分，其中20％甲醇洗脱的子馏分11B经Sephadex LH-20柱色谱分离，先后采用体积比为1∶1氯仿-甲醇和35％甲醇溶剂系统分离，最后经ODS制备液相分离，得到化合物4。
6.权利要求1所述的化合物在制备预防和治疗骨质疏松症的药物中的应用。
7.一种含有权利要求1所述化合物的药物组合物，其特征在于，该药物组合物由权利要求1所述化合物和药学上可接受的载体或稀释剂组成。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物选自片剂、胶囊、栓剂、鼻喷雾剂或注射剂。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有重量百分数为0.1～99.5％的活性成分。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有重量百分数为0.5～95％的活性成分，优选为含有重量百分数为5～85％的活性成分。
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Owner name: SINOPHARM GROUP TONGJITANG (GUIZHOU) PHARMACEUTICA Free format text: FORMER NAME: GUIZHOU TONGJITANG PHARMACEUTICAL CO., LTD. |
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Address after: 550009 No. 296 Southwest Ring Road, Xiaohe District, Guizhou, Guiyang Patentee after: Sinopharm group (Guizhou) Pharmaceutical Co., Ltd. Address before: 550009 No. 296 Southwest Ring Road, Xiaohe District, Guizhou, Guiyang Patentee before: Guizhou Tongjitang Pharmaceutical Co., Ltd. |
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| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
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