CN102389150A - 包封儿茶素的脂质体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包封儿茶素的脂质体的制备方法，依次包括以下步骤：1)、取大豆卵磷脂和胆固醇按照1.5～6∶1的质量比混合后溶解于溶剂I中，或者将大豆卵磷脂溶解于溶剂I中；于30～40℃的水浴中减压蒸发10～30分钟，从而形成一层脂质薄膜；2)、向脂质薄膜中加入溶剂II从而溶解脂质薄膜，再加入含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后形成稳定的单相体系；3)、将单相体系减压后蒸发30～50分钟，从而形成水性悬浊液，得包封儿茶素的脂质体。本发明所得的包封儿茶素的脂质体能提高儿茶素的抗氧化能力，从而提高了儿茶素生物利用度。

Description

包封儿茶素的脂质体的制备方法

技术领域

本发明涉及化学领域的儿茶素和磷脂类，具体地是包封儿茶素的脂质体及其制备方法。

背景技术

脂质体是由磷脂、胆固醇等脂质成分组成的一种多层闭合囊泡结构，可将脂质体分为单室脂质体和多室脂质体两大类。由天然成分组成的脂质体是双分子层结构，类似于生物细胞膜，所以又称为人工生物膜。脂质体中磷脂成分是双亲性分子，既能与水溶性物质结合又能与脂溶性物质结合，水溶性物质包封于囊泡亲水基团夹层中，位于脂质体囊泡中央，而脂溶性物质包封于囊泡的双分子膜中。

构成脂质体双分子层的物质主要有磷脂(天然磷脂、人工合成磷脂)和胆固醇等。磷脂是含有磷脂根的类脂化合物，由卵磷脂，肌醇磷脂，脑磷脂等组成，它普遍存在于动植物细胞的原生质和生物膜中，是构成细胞膜的主要成分之一。其中磷脂酰胆碱(PC)是构成细胞膜中磷脂的主要成份之一，天然来源的PC是由不同长度、饱和度的脂肪链组成的一种混合物，而动物性PC的脂肪链大部分是饱和的，植物性PC含有大量高度不饱和性的脂肪链，虽然饱和脂肪链能增强其脂质体膜的稳定性和非渗透性，但不能降低甚至阻止与膜有关的生化反应。而天然来源PC-大豆卵磷脂富含有大量不饱和脂肪酸，能调整细胞中磷脂与胆固醇比例，增加细胞膜中磷脂的不饱和度、改善生物膜的功能。同时，选择大豆卵磷脂作为制备脂质体的膜材，其具有良好的生物相容性和流动性，而且有利于引发细胞间的生化反应。因此大豆卵磷脂作为制备脂质体的膜材已成为趋势。

儿茶素是茶叶中的提取物，它为还原性多元酚类物质，是茶叶的主要成分。儿茶素能对脂质的吸收产生干扰使得血浆中的三甘油酸酯降低，加速胆固醇的吸收，起去脂减肥，防止动脉粥样硬化等预防心血管疾病的作用，还具有抗氧化，抗衰老功能。儿茶素分子结构中酚羟基具有提供氢体的活性，能与脂肪酸氧化产生的游离基结合，具有抗氧化保鲜的作用。因儿茶素具有较强的抗氧化性，在潮湿、阳光、高温等条件下极易发生氧化、聚合、缩合等反应，在非保护状态下生物利用率不高，针对以上儿茶素在实际利用当中出现的问题，人们希望制备儿茶素脂质体对儿茶素进行包埋，提高它的抗氧化能力，从而解决它的生物利用度低等问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种包封儿茶素的脂质体的制备方法，本发明所得的包封儿茶素的脂质体能提高儿茶素的抗氧化能力，从而提高了儿茶素生物利用度。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种包封儿茶素的脂质体的制备方法，依次包括以下步骤：

1)、取大豆卵磷脂和胆固醇按照1.5～6∶1的质量比混合后溶解于溶剂I中，或者将大豆卵磷脂溶解于溶剂I中；于30～40℃的水浴中减压蒸发10～30分钟，从而形成一层脂质薄膜；所述大豆卵磷脂与溶剂I的质量/体积比为2～8毫克/毫升；

2)、向脂质薄膜中加入溶剂II从而溶解脂质薄膜，再加入含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后形成稳定的单相体系；

所述含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液与步骤1)中的大豆卵磷脂的液料比为：1ml/7～25mg；

所述含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液中儿茶素与磷酸盐缓冲溶液的质量/体积比为10～16毫克/毫升；

3)、将所述单相体系(于室温下，室温一般指10～30℃)减压后蒸发30～50分钟，从而形成水性悬浊液，得包封儿茶素的脂质体。

作为本发明的包封儿茶素的脂质体的制备方法的改进：步骤1)中的溶剂I为氯仿、三氯甲烷、乙醇、二氯甲烷、丙二醇或甲醇。

作为本发明的包封儿茶素的脂质体的制备方法的进一步改进：步骤2)中的溶剂II为乙醚或二异丙醚。

作为本发明的包封儿茶素的脂质体的制备方法的进一步改进：步骤2)中的混合为：在水浴超声仪上超声直至混合物形成稳定的单相体系；例如在30～45kHz的超声波中，在水浴温度为8～12℃下超声10～30min。

作为本发明的包封儿茶素的脂质体的制备方法的进一步改进：步骤1)中在0.02～0.1MPa的真空度下进行减压蒸发。

作为本发明的包封儿茶素的脂质体的制备方法的进一步改进：步骤3)于0.02～0.1MPa的真空度下进行减压蒸发。

在本发明中，步骤1)中的大豆卵磷脂与步骤2)中的溶剂II的质量/体积比为2～8毫克/毫升。步骤2)中：含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液是按照10～16mg儿茶素溶解在1ml的PBS磷酸盐缓冲溶液(pH为6.81)中的比例制备而得的。

在本发明中，大豆卵磷脂、胆固醇和儿茶素均能通过市购的方式获得，大豆卵磷脂可购自北京双旋微生物培养基制品厂，胆固醇可购自中国医药集团上海化学试剂公司，儿茶素购自上海晶纯实业有限公司。

本发明将脂质基质溶于氯仿等溶剂中，然后加入一定浓度的儿茶素溶液，将水溶性儿茶素包封在脂质体囊泡水相中。

胆固醇是构成细胞膜的重要组成成分，是一种中性的脂质，在各类动物细胞成为重要的脂质成分，胆固醇具有调节膜的生物物理特性如膜的流动性、通透性和韧性等，它在膜中与磷脂结合相互作用共同调节磷脂层性质的作用。

脂质体作为载体，价值在于能包封各类物质，能通过物理方式掺入进脂质体囊泡中，水溶性物质则包封在脂质体囊泡的水层中，而脂溶性和双亲性物质则包载于双分子磷脂夹层之间。

本发明具备如下优点：

1、本发明采用脂质薄膜包埋儿茶素的方法制备儿茶素脂质体，并采用水浴超声仪对脂质膜与含有儿茶素的磷酸盐缓冲液混合体系超声，直至混合物为稳定的单体系，此技术大大提高了儿茶素被包埋进脂质体囊泡水相中的含量，同时也提高了儿茶素脂质体体系的稳定性。

2、本发明制备的儿茶素脂质体通过对酱鸭肉抗氧化保鲜的应用后，发现脂质体包埋技术有效的提高了儿茶素的抗氧化能力，其机理应该与缓慢释放儿茶素有关。

3、本发明有效的采用儿茶素脂质体对酱鸭肉进行了抗氧化保鲜应用，探讨了儿茶素脂质体对提高抗氧化保鲜效果的作用机理。且本发明的儿茶素脂质体为脂质体的应用拓宽了道路，首次运用脂质体包埋技术将天然抗氧化剂-儿茶素进行有效的包埋，并首次应用于食品保鲜领域，拥有重大的研究前景。

具体实施方式

实施例1、一种包封儿茶素的脂质体的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、取45mg大豆卵磷脂和11.6mg胆固醇溶解于9ml氯仿中，使其(即大豆卵磷脂和胆固醇)充分溶解，在35℃的水浴中，于真空压(0.075MPa)下，在旋转蒸发仪上蒸发20分钟，从而形成一层脂质薄膜；

2)、向脂质薄膜加入9ml的乙醚从而溶解脂质薄膜，再加入3ml的含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液，在10℃的水浴超声仪上超声(例如在30kHz的超声波中，超声10～20min)使混合物成稳定的单相体系。

含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液是按照10mg儿茶素溶解在1ml的PBS磷酸盐缓冲溶液(pH为6.81)中的比例制备而得的。

3)、将单相体系室温下减压至0.07MPa蒸发10min，从而形成水性悬浊液6ml，即为包封儿茶素的脂质体。

该包封儿茶素的脂质体中，儿茶素浓度为5毫克/毫升。

实验1、将实施例1中制备所得的儿茶素脂质体添加入酱鸭肉中研究其对酱鸭肉的抗氧化作用，探索制备的儿茶素脂质体对提高儿茶素生物利用度的作用。

实验方法与步骤：

1、将酱鸭肉进行去筋去膜处理，分为100g/份，待用。将肉样分别浸入到1L儿茶素溶液(每升儿茶素溶液中含有1g儿茶素，以pH为6.81的PBS磷酸盐缓冲溶液作为溶剂)、1L儿茶素脂质体溶液(在每升儿茶素脂质体溶液中的包封儿茶素的脂质体(实施例1所得)的量能使每升儿茶素脂质体溶液中含有1g儿茶素，以pH为6.81的PBS磷酸盐缓冲溶液作为溶剂)、1L的pH为6.81的PBS磷酸盐缓冲溶液(作为空白对照)中约2min，取出沥干。

肉样沥干后，将其按编号放入聚苯乙烯泡沫塑料托盘中，然后用聚乙烯保鲜膜(P E)覆盖，并用软包装密封试验仪将肉样密封包装好置于冰箱中冷藏，温度为(4±0.5)℃。

2、TBA值的测定

(1)取10g肉样用剪刀剪成糜状，加50ml 7.5％的三氯乙酸(含0.1％EDTA)，振荡30min，使其溶解充分。

(2)水浴中保温40min。

(3)取出冷却1h后离心5min(1600rpm)。

(4)取上清液，加5ml氯仿摇匀，静置。

(5)待分层后取上清液分别在532nm和600nm处比色，记录消光值。

(6)用以下公式计算TBA值：TBA值(mg/100g)＝(A₅₃₂-A₆₀₀)/155×(1/10)×72.6×100，与TBA反应的物质的量(TBARS)以每100g肉中丙二醛的mg数来表示。

实验结果如表1所示：

表1儿茶素脂质体对酱鸭肉抗氧化效果指标TBA

由表1可知，在添加儿茶素和儿茶素脂质体的组别中，其TBA值明显低于对照组。TBA值在酱鸭肉贮存过程中发生明显降低。而在添加儿茶素脂质体的组别中，其TBA值明显低于对照组。比较两组的TBA值，儿茶素脂质体对酱鸭肉的抗氧化作用强于儿茶素。

实验结果说明：通过本发明的脂质体包载技术对儿茶素进行有效的包埋提高了儿茶素的生物活性，提高了儿茶素的生物利用度。

实施例2、一种包封儿茶素的脂质体的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、取22.5mg大豆卵磷脂和12mg胆固醇溶解于9ml二氯甲烷中，使其(即大豆卵磷脂和胆固醇)充分溶解，在35℃的水浴中，真空压于0.035MPa下，在旋转蒸发仪上蒸发30分钟，从而形成一层脂质薄膜；

2)、向脂质薄膜加入9ml的乙醚从而溶解脂质薄膜，再加入3ml的含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液，在10℃的水浴超声仪上超声直至混合物成稳定的单相体系。

含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液是按照12mg儿茶素溶解在1ml的PBS磷酸盐缓冲溶液(pH为6.81)中的比例制备而得的。

3)、将所述单相体系于室温下减压至0.05MPa蒸发15min，直至形成水性悬浊液6ml，得包封儿茶素的脂质体。

该包封儿茶素的脂质体中，儿茶素浓度为6毫克/毫升。

实验2、将实施例2制备所得的儿茶素脂质体进行实验，实验方法与步骤如同实验1。

实验结果如表2所示：

表2儿茶素脂质体对酱鸭肉抗氧化效果指标TBA

由表2可知，在添加儿茶素和儿茶素脂质体的组别中，其TBA值明显低于对照组。TBA值在酱鸭肉贮存过程中发生明显降低。而在添加儿茶素脂质体的组别中，其TBA值明显低于对照组。比较两组的TBA值，儿茶素脂质体对酱鸭肉的抗氧化作用强于儿茶素。

实施例3、一种包封儿茶素的脂质体的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、取67.5mg大豆卵磷脂和11.6mg胆固醇溶解于9ml二氯甲烷中，使其(即大豆卵磷脂和胆固醇)充分溶解，在35℃的水浴中，真空压于0.045MPa下，在旋转蒸发仪上蒸发10分钟，从而形成一层脂质薄膜；

2)、向脂质薄膜加入9ml的乙醚从而溶解脂质薄膜，再加入3ml的含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液，在10℃的水浴超声仪上超声直至混合物成稳定的单相体系。

含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液是按照14mg儿茶素溶解在1ml的PBS磷酸盐缓冲溶液(pH为6.81)中的比例制备而得的。

3)、将所述单相体系于室温下减压至0.03MPa蒸发15min，直至形成水性悬浊液6ml，得包封儿茶素的脂质体。

该包封儿茶素的脂质体中，儿茶素浓度为7毫克/毫升。

实验3、将实施例3制备所得的儿茶素脂质体进行实验，实验方法与步骤如同实验1。

实验结果如表3所示：

表3儿茶素脂质体对酱鸭肉抗氧化效果指标TBA

由表3可知，在添加儿茶素和儿茶素脂质体的组别中，其TBA值明显低于对照组。TBA值在酱鸭肉贮存过程中发生明显降低。而在添加儿茶素脂质体的组别中，其TBA值明显低于对照组。比较两组的TBA值，儿茶素脂质体对酱鸭肉的抗氧化作用强于儿茶素。

实施例4

1)、取67.5mg大豆卵磷脂溶解于9ml二氯甲烷中，使其(即大豆卵磷脂和胆固醇)充分溶解，在35℃的水浴中，真空压于0.045MPa下，在旋转蒸发仪上蒸发20分钟，直至形成一层脂质薄膜；

2)、向脂质薄膜加入9ml的乙醚从而溶解脂质薄膜，再加入3ml的含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液，在10℃的水浴超声仪上超声直至混合物成稳定的单相体系。

含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液是按照16mg儿茶素溶解在1ml的PBS磷酸盐缓冲溶液(pH为6.81)中的比例制备而得的。

3)、将所述单相体系减压至0.03MPa蒸发15min，直至形成水性悬浊液6ml，得包封儿茶素的脂质体。

该包封儿茶素的脂质体中，儿茶素浓度为8毫克/毫升。

实验4、将实施例4制备所得的儿茶素脂质体进行实验，实验方法与步骤如同实验1。

实验结果如表4所示：

表4、儿茶素脂质体对酱鸭肉抗氧化效果指标TBA

由表4可知，在添加儿茶素和儿茶素脂质体的组别中，其TBA值明显低于对照组。TBA值在酱鸭肉贮存过程中发生明显降低。而在添加儿茶素脂质体的组别中，其TBA值明显低于对照组。比较两组的TBA值，儿茶素脂质体对酱鸭肉的抗氧化作用强于儿茶素。

通过上述实验，我们可以得知：实施例1～实施例3所得的包封儿茶素的脂质体优于实施例4；且由于豆卵磷脂和胆固醇的特定用量比关系，从而使实施例1又明显优于实施例2和实施例3。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.包封儿茶素的脂质体的制备方法，其特征是依次包括以下步骤：

1)、取大豆卵磷脂和胆固醇按照1.5～6∶1的质量比混合后溶解于溶剂I中，或者将大豆卵磷脂溶解于溶剂I中；于30～40℃的水浴中减压蒸发10～30分钟，从而形成一层脂质薄膜；所述大豆卵磷脂与溶剂I的质量/体积比为2～8毫克/毫升；

2)、向脂质薄膜中加入溶剂II从而溶解脂质薄膜，再加入含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后形成稳定的单相体系；

所述含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液与步骤1)中的大豆卵磷脂的液料比为：1ml/7～25mg；

所述含儿茶素的磷酸盐缓冲溶液中儿茶素与磷酸盐缓冲溶液的质量/体积比为10～16毫克/毫升；

3)、将所述单相体系减压后蒸发30～50分钟，从而形成水性悬浊液，得包封儿茶素的脂质体。

2.根据权利要求1所述的包封儿茶素的脂质体的制备方法，其特征是：所述步骤1)中的溶剂I为氯仿、三氯甲烷、乙醇、二氯甲烷、丙二醇或甲醇。

3.根据权利要求2所述的包封儿茶素的脂质体的制备方法，其特征是：所述步骤2)中的溶剂II为乙醚或二异丙醚。

4.根据权利要求3所述的包封儿茶素的脂质体的制备方法，其特征是：所述步骤2)中的混合为：在水浴超声仪上超声直至混合物形成稳定的单相体系。

5.根据权利要求4所述的包封儿茶素的脂质体的制备方法，其特征是：所述步骤1)中在0.02～0.1MPa的真空度下进行减压蒸发。

6.根据权利要求5所述的包封儿茶素的脂质体的制备方法，其特征是：所述步骤3)于0.02～0.1MPa的真空度下进行减压蒸发。