CN102387864A - 用于分析的含细胞流体薄层的制备 - Google Patents

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Abstract

一种用于产生流体样品薄层以供分析的设备，该设备具有分析腔室(45)的二维阵列和耦接到该阵列以能并行填充分析腔室的进入通道(25)的分支图案。分析腔室为平面的，且具有小于进入通道高度的高度以便在填充流体样品时产生薄层。该阵列能在给定面积中在各腔室之间具有更多间隔件，从而可减小腔室高度变化，同时仍能快速地填充腔室。分析腔室可适合于由诸如血液的规定流体样品进行毛细填充。排出通道(35)的图案可耦接到该阵列。进入通道和排出通道可形成梳状图案，梳状图案的指状件相交叉，且该分析腔室布置于梳状图案的相交叉的指状件之间。

Description

用于分析的含细胞流体薄层的制备
技术领域
本发明涉及制备流体薄层以供分析的设备和方法，且涉及分析这种薄层的系统和方法，特别地涉及用于自动分析盒中的样品的方法和设备。本发明特定而言涉及制备细胞薄层（特别是诸如红细胞这样的细胞单层，例如不存在重叠的红细胞）以供分析的设备和方法，且涉及分析这种细胞薄层或单层的系统和方法，特别地，涉及用于自动分析盒中的样品的方法和设备。
背景技术
可利用具体试剂对细胞染色且在显微镜中检查细胞群来进行基于细胞的分析。对于基于成像的细胞诊断（例如使用显微镜，照相机和用于图像分析和诊断的软件应用）而言，重要的是形成分离细胞的单层以避免由于细胞重叠所致的错误解析。多年来，已知这样一种方法，其涉及用手(涂片)在载玻片上刮出一定体积的相关流体(例如血液)。对于集成的闭合盒，不能使用这个过程。替代地可使用窄通道的毛细填充。
从美国专利6,599,475-B1获知来提供一种塑料光学器皿来形成红细胞的薄单层以供显微镜分析。提供多个串联起来且由分隔壁分开的隔室。这些壁分别仅允许红细胞中的某些流动，以实现红细胞稀释，使得在这些隔室中的最后隔室中获得所隔离的红细胞的单层。为了实现在整个器皿上恒定的厚度，分隔壁具有焊接特征且透明盖被焊接到顶部。隔室可具有600×600×3微米的尺寸。
对于如分析血液样品的疟疾寄生物这样的应用而言，需要分析大量血液以实现所需检测限度。对于大约为红细胞尺寸(5μm)的层厚度而言，这意味着需要检查较大表面积(平方厘米)。
US6,165,739-A1描述了一种用于激光细胞测量的载玻片或塑料载片，其具有多个毛细间隙腔室。流体样品可从储集器同时进入所有腔室。在每个腔室中提供不同反应物以使得能进行多个同时反应。
发明内容
本发明的目的在于，提供用于制备流体薄层以供分析的替代设备和方法，和/或提供用于分析这种薄层的系统和方法，特别地涉及自动分析盒中样品的设备。本发明的一单独目的在于，提供从具有细胞的流体来制备层以供分析的设备和方法，其中层具有诸如红血胞这样的细胞的单层，例如不具有重叠的细胞（诸如红血胞），且涉及分析这种细胞单层的系统和方法，特别地涉及自动分析盒中的样品的方法和设备。
根据第一方面，本发明提供：
一种产生流体样品薄层或者产生含细胞(特别是红细胞)的流体层以供分析的设备，每一层具有单层细胞(特别是红细胞)，该设备具有分析腔室的二维阵列和进入通道的分支图案，进入通道的分支图案耦接到阵列中的分析腔室中的每一个以能并行填充这些分析腔室，分析腔室分别具有大致平面形状，该平面形状具有小于进入通道高度的高度以便产生流体样品薄层或者产生含细胞(特别是红细胞)的流体层，当腔室被填充流体样品时，每一层具有细胞单层。
通过提供分析腔室的二维阵列和并行地耦接腔室的进入通道的图案，可在给定面积中提供各腔室之间更多的间隔件，从而可减小腔室高度变化，同时仍能快速地填充腔室。
实施例可具有任何额外特征且某些这样的额外特征在下文中更详细地描述。
根据本发明的设备优选地还包括在进入通道(25)与分析腔室(45)之间的额外区域(55)，其中此区域高度小于进入通道(25)且大于分析腔室(45)。在一更优选的实施例中，额外区域(55)的高度小于6微米。此额外区域(55)的优点在于，具有成熟寄生物的红细胞将富集在此区。这将会防止白细胞集中在扫描区边缘从而阻碍正确分析。
腔室和/或通道可具有适合于由规定流体样品(例如含细胞的流体，特别是血液)进行毛细填充的尺寸。在本发明的实施例中，适合于毛细填充的尺寸可由用标准水溶液（诸如PBS或纯水）进行的毛细填充来限定。这意味着适合于根据本发明进行毛细填充且能够根据本发明进行毛细填充的通道例如在标准温度和压力下，使用PBS(磷酸盐缓冲盐水)作为标准，或者可选地在标准温度和压力下例如利用纯水通过毛细作用来填充。
本发明的装置优选地具有多个腔室，其与梳状或分形（fractal）填充通道和通风通道的使用相结合。在一优选实施例中，总表面将为20mm2且视场为0.2×0.2=0.04mm2，这表示500个反应腔室。用于本发明的实施例中任何实施例的腔室的数量可在1个腔室与1000个腔室之间。优选地，分析腔室中每一个的总面积在100mm2与2000mm2之间和/或分析腔室的高度在1μm与10μm之间。
该设备具有排出通道的图案，其中一个或多个排出通道耦接到分析腔室中的每一个。进入通道和排出通道的图案可分别包括梳状图案，梳状图案的指状件相交叉，且分析腔室布置于梳状图案的相交叉的指状件之间。本发明的另一方面为，在排出通道或通风口处或邻近处引入流体挡止件。通过在通道壁中引入急剧的过渡部，诸如在所有方向改变通道宽度，液体与壁的接触线被破坏，这是因为该角度不能突然变化。这导致在所谓的接触线阻塞(pinning)之后的流体阻滞。弯月面在该表面处被冻结。如果通道为方形的且具有4个壁，那么加宽在相同点位在所有4个壁处进行，阻塞可为很稳定的。壁过渡部优选地增加角计数(angle count)，即，它们可优选地逐步扩展。对于如血液的流体，水蒸发可通过弯月面处液体的玻璃化而导致永久阻塞。
该设备可具有适合于接收诸如含细胞的流体样品(例如血液)这样的流体样品的单个样品端口，样品端口流体地连接到进入通道的分支图案使得它们通过毛细作用而进行填充。进入管的优选最小高度为17微米，因为此将防止由较大白细胞、单核细胞所致的堵塞。
包括进入通道但不包括排出通道的通道和/或腔室优选地具有亲水性表面。这种亲水性表面可具有制造它们的材料的性质或者可为通过其它手段引起的性质，例如，通过电晕放电，通过等离子体放电或者通过涂覆亲水性涂层所引起的性质。通风通道优选地被布置为提供用于液体的流体挡止件，但允许气体通过，例如，通过使它们具有疏水性表面或者在一个点位处改变通风通道的宽度以在宽度变化点位使液体阻塞。在腔室上方或下方表面中的至少一个优选地是透明的或光通透的(optically clear)使得允许光学检查和测量。分析腔室的二维阵列和可选地耦接到阵列中的分析腔室以使得该分析腔室能被并行填充的进入通道的分支图案优选地由聚合材料（特别是塑料材料）制成。在优选实施例中，分别具有大致平面形状的分析腔室具有由其内已形成腔室的下部件和形成腔室顶部的覆盖部件所限定的高度。覆盖部件优选地比下部件柔性更强，使得例如通过胶合，焊接（特别是声波焊接）、溶剂结合、熔化等将覆盖部件附连到下部件并不改变尺寸，特别是不改变形成于下部件中的腔室底壁的平面度。
个别分析腔室的大小可在0.02mm2与500mm2之间。分析腔室的高度可在1μm与10μm之间。分析腔室的高度取决于待分析的细胞或寄生物。对于红细胞，优选高度在2微米与4微米之间，且更优选地为3微米。更小的间隙高度将移除所有正常血细胞且得到纯血浆。更大间隙高度将得到红细胞与例如寄生物的混合物。
进入通道和排出通道可具有10μm至200μm的深度和50至1000μm的宽度。
本发明的另一方面提供一种制备流体样品薄层或制备含细胞(特别是红细胞)的流体层以供分析的方法，其中每一层具有细胞(特别是红细胞)单层，该方法使用具有分析腔室的二维阵列和进入通道的分支图案的设备，进入通道的分支图案耦接到阵列中的分析腔室中的每一个以能并行填充分析腔室，分析腔室中的每一个具有大致平面形状，该平面形状具有小于进入通道高度的高度以便在腔室被填充流体样品时产生含细胞(特别是红细胞)的流体薄层或层，每一层具有细胞(特别是红细胞)单层，该方法具有以下步骤：提供流体样品，以及将流体样品供应到进入通道的图案以使得流体样品填充分析腔室。该填充优选地是通过毛细作用进行的。在本发明的实施例中，通过毛细作用进行的填充可由用标准水溶液，诸如PBS或可选地纯水进行的毛细填充来限定。这表示根据本发明通过毛细作用的填充意味着例如在标准温度和压力下使用PBS(磷酸盐缓冲的盐水)作为标准(或可选地纯水)的毛细作用进行填充。PBS为包含氯化钠、磷酸钠和(在某些配方中)氯化钾和磷酸钾的盐缓冲溶液。溶液的渗量（osmolarity）和离子浓度通常匹配人体的渗量和浓度。制作PBS的一种方式包括将800g NaCl、20g KCl、144g Na2HPO4·12H2O和24g KH2PO4溶解于8升蒸馏水中且加水直至10L。pH为大约6.8，但当稀释到1×PBS时，pH将变为7.4。在稀释时，所得到的1×PBS将具有137mM NaCl，10mM磷酸盐，2.7mM KCl的最终浓度且pH为7.4。另一种制备由Sambrook、Fritsch和Maniatis，(1989)在Molecular Cloning中描述：A Laboratory Manual，第二版，纽约冷泉港，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)，第3卷，附录B.12：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4·12H2O和0.24g KH2PO4溶解于800ml的蒸馏水中。利用HCL调整pH为7.4且添加H2O至1升。
根据本发明的某些方法的毛细作用使用这样的腔室和/或通道，即，该腔室和/或通道具有能例如在标准温度和压力下利用上文所述的PBS制备中的任一种或者可选地在标准温度和压力下利用纯水来填充的尺寸。
本发明的方法优选地使用大量腔室，其与梳状或分形填充通道和通风通道的使用相结合。根据本发明的实施例的装置可具有大量腔室。在一优选实施例中，总表面将为20mm2且视场为0.2×0.2=0.04 mm2，这意味着500个反应腔室。用于本发明的实施例中任何实施例的腔室数量可在100个腔室与1000个腔室之间。
本发明的方法可结合具有排出通道图案的设备使用，其中一个或多个排出通道耦接到分析腔室中的每一个。进入通道和排出通道的图案可分别包括梳状图案，梳状图案的指状件相交叉，且分析腔室布置于梳状图案的相交叉的指状件之间。本发明的另一方面为在排出通道或通风口处或邻近处对样品流体进行流体阻止的方法步骤。通过在通道壁中引入急剧的过渡部以便在所有方向改变通道宽度，液体与壁的接触线被破坏，这是因为该角度不能突然变化。这导致在所谓的接触线阻塞之后的流体阻滞。弯月面在该表面处被冻结。如果通道为方形的且具有4个壁，那么加宽在相同点位在所有4个壁处进行，阻塞可为很稳定的。壁过渡部优选地增加角计数，它们可优选地逐步扩展。对于如血液的流体，水蒸发可通过弯月面处液体的玻璃化而导致永久阻塞。
本发明的另一方面提供一种制造这种设备的相对应方法。
本发明的另一方面提供一种分析系统，包括：光学检测器，其用于分析流体样品薄层或者分析含细胞(特别是红细胞)的流体层，每一层具有细胞单层；和用于产生流体样品薄层或者产生含细胞(特别是红细胞)的流体层的设备，每一层具有细胞单层，该设备具有分析腔室的二维阵列和进入通道的分支图案，进入通道的分支图案耦接到该阵列中的分析腔室中的每一个以能并行填充分析腔室，分析腔室分别具有大致平面形状，该平面形状具有小于进入通道高度的高度以便当腔室被填充流体样品时产生含细胞(特别是红细胞)的流体薄层或层，每一层具有细胞单层。
本发明的另一方面提供一种分析流体样品薄层或分析含细胞(特别是红细胞)的流体层的方法，每一层具有细胞单层，使用具有分析腔室的二维阵列和进入通道的分支图案的设备来制备，进入通道的分支图案耦接到阵列中的分析腔室中的每一个以使得能并行填充分析腔室，分析腔室分别具有大致平面形状，该平面形状具有小于进入通道高度的高度以便当腔室被填充流体样品时产生含细胞(特别是红细胞)的流体的薄层或层，每一层具有细胞单层，该方法具有以下步骤：提供光学检测器，且在分析腔室中使用光学检测器来分析含细胞(特别是红细胞)的流体的薄层或层，每一层具有细胞单层。
额外特征中的任何特征可组合在一起，且与这些方面中的任何方面组合。其它优点，特别是优于现有技术的优点对于本领域技术人员将是显然的。举例而言，本发明并不使用单个腔室，而是使用并行地耦接的腔室阵列。该阵列可为二维阵列，因此允许紧凑设计。腔室的二维阵列流体地耦接以能使它们被并行地填充。特别地，本发明的装置具有多个分析腔室，腔室具有小于(例如显著地小于)进入通道高度的高度。
在不偏离本发明的权利要求的情况下可做出许多变型和修改。因此，应清楚地理解到，本发明的形式只是说明性的且并不旨在限制本发明的范围。
附图说明
现将参看附图以举例说明的方式来描述如何来实行本发明，在附图中：
图1是盒的部分的平面图，示出分析区的阵列和重复的相交叉的通道结构。
图2是盒的截面图。
图3是根据本发明的一实施例的分析区与通风通道之间过渡部的透视放大图。
图4示出包括盒的分析系统的示意图。
图5示出根据本发明的盒的部分的平面图，其示出包括额外分析区以用于被成熟寄生物所感染的红细胞。
图6是根据图5的盒的截面图。
具体实施方式
现将针对特定实施例且参看特定附图来描述本发明，但本发明并不限于此而是仅受权利要求限制。所描述的附图只是示意性的而不是限制性的。在附图中，出于说明目的，某些元件的大小可被夸大且并未按照比例绘制。在本说明书和权利要求中使用术语“包括”，其并不排除其它元件或步骤。当提及单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“一”，或“该”时，其也包括这些名词的复数，除非具体地规定为其它情况。
在权利要求中所用的术语“包括”不应被理解为限于后面所列出的器件；其并不排除其它元件或步骤。因此，表达“包括器件A与B的装置”的范围应不限于仅由构件A与B组成的装置。对于本发明这意味着，装置的仅相关构件是A与B。
而且在说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三和类似用语用于区分类似元件且未必描述顺序或时间次序。应了解如此使用的术语可在适当情况下互换且本文所描述的本发明的实施例能够以本文所描述或图示的顺序之外的其它顺序来操作。
此外，在说明书和权利要求中使用术语顶部、底部、上、下和类似术语是出于描述目的且未必描述相对位置。应了解如此使用的术语可在适当情况下互换且本文所描述的本发明的实施例能以本文所描述或图示方位之外的其它方位来操作。
本发明涉及用于对例如盒中的样品进行自动分析的设备和方法。为了对盒中的样品进行自动分析，对流体样品的层厚度进行准确控制可为重要的。这些实施例中的至少某些涉及薄细胞涂片制备和由塑料制成的新盒的设计。细胞涂片制备优选地表示形成含细胞(特别是红细胞)的流体层，每一层具有单层细胞。细胞优选地为非重叠的。细胞优选地为红细胞。其可有利地用于分析系统以进行血液引发的疾病(诸如寄生物)的医疗诊断，疟疾显微镜检查诊断为其一实例。由于红细胞并不包含DNA，在血液中外来细胞的存在可由任何方法来确定，例如由任何光学方法来确定，例如，验证DNA存在的任何染色方法。举例而言，本发明的一优点可为，对于给定性能而言具有更低的成本和/或更快操作和/或提供更大面积用于分析。
低成本构件（诸如由模制塑料制成的构件）通常缺少在较大面积上实现恒定的通道高度所需的平面度。如将在下文中更详细地描述，可用塑料以低成本制成微结构，该微结构可提供微米范畴内的更精确的层厚度，且很少受使用者影响。在本发明的某些实施例中，形成具有窄间隙的区阵列，其由具有较大间隙的通道连接。在某些情况下，可根据图像分析要求来调整面积大小和纵横比。个别面积显著小于待分析的总面积。以此方式能快速且良好地控制细胞单层的生成。
将以介绍实施例的方式来简要描述由本发明的某些实施例所解决的某些问题或缺点：
为了生成血液的薄涂片(例如，细胞单层，特别是红细胞单层，特别是非重叠红细胞层)，需要在较大表面积上铺展样品。但在此情形下，设计闭合盒而且是塑料盒(以保持成本较低)带来不同的技术挑战。盒可为一次性盒。盒为可装配到测量设备内（例如通过狭缝接合到测量设备内）以允许分析盒的内含物的装置。举例而言，由小间隙(在盒中底部至顶部的距离，大约为涂片的薄高度)带来的流动阻力使得更难利用流体样品在大面积上迅速填充分析区。而且，当在大表面积上在塑料中制造这种薄间隙时，可存在较大过程变化，造成间隙大小变化，这将在下文中更详细地解释。
● 由通道内流体的流动阻力来限制具有窄间隙的大面积的毛细填充(                                                
Figure 2010800160814100002DEST_PATH_IMAGE001
)，其中压降为Δpv，通道长度为L，平均流动速度为v，通道高度为h。通道高度h大约为细胞厚度，细胞形成强流动阻力。这意味着能够克服的距离受限。
● 流动速度和可填充的距离取决于流体的黏度，η，其在血液的情况下可在宽范围变化，主要取决于血细胞比容值(红细胞浓度)。
● 毛细力随着间隙高度的倒数成比例变化(
Figure 82867DEST_PATH_IMAGE002
)，其中Δpc为毛细力，表面张力由σ给出，流体与基底的接触角为Θ，间隙高度为h。
● 小厚度变化导致较强的流动速度变化并因此导致不可预测的填充模式，不完全填充和夹杂空气。
● 对于低成本的盒，基底和覆盖物需要由塑料制成，其通过挤压(箔)或者注射模制(较厚部件和框架)来加工。注射模制导致形状偏差，这归因于该过程不均匀冷却的固有属性。这导致在局部和更多整体处大约数十微米的平面度偏差。以严格的厚度公差和平面度来加工箔，但抗弯刚度很低(用1/d3来衡量)使得可预料大间隙变化，这导致不均匀的且不可再现的填充，且可能会导致过大的间隙，过于大的间隙引起细胞堆叠且不利于图像分析。这是很重要的，因为染色剂（stain）的有效光学厚度的变化导致图像分析(阈值等)的变化且和因此导致错误的阴性或阳性。
由于所有这些原因，难以产生低成本的盒来进行诸如血液的流体样品的薄涂片制备，该薄涂片制备以用于例如基于成像的疟疾诊断所需的层厚度精确度来进行。
图1，根据第一实施例的盒的平面图：
本发明的某些实施例具有呈微流体腔室阵列形式的分析区。对于给定总面积，这能允许更多间隔件，且因此帮助维持规定高度。这些腔室可由进入通道并行耦接以便能进行快速填充。单个采样端口可被布置为流体连接到进入通道以允许流体样品容易进入。也可布置通风通道。通道可呈相交叉的图案以便能并行地更快速地填充许多腔室。在某些情况下，存在一组相交叉的指状件以用于样品朝向分析区阵列的毛细流动。该填充优选地是通过毛细作用。在本发明的实施例中，通过毛细作用进行的填充可由例如在标准温度或压力下利用标准水溶液（如PBS），或可选地在标准温度和压力下利用纯水所进行的毛细填充来限定。PBS为包含氯化钠、磷酸钠和(在某些配方中)氯化钾和磷酸钾的盐缓冲溶液。溶液的渗量和离子浓度通常匹配人体的渗量和浓度。制作PBS的一种方式包括将800g NaCl、20g KCl、144g Na2HPO4·12H2O和24g KH2PO4溶解于8升蒸馏水中且加水直到10L。pH为大约6.8，但当稀释到1×PBS时，其将变为7.4。在稀释时，所得到的1×PBS将具有137mM NaCl，10mM磷酸盐，2.7mM KCl的最终浓度且pH为7.4。另一制备由Sambrook, Fritsch和Maniatis，(1989)在Molecular Cloning中描述：A Laboratory Manual，第二版，纽约冷泉港，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)，第3卷，附录B.12：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4·12H2O和0.24g KH2PO4溶解于800ml的蒸馏水中。利用HCL调整pH为7.4且添加H2O至1升。
当例如在标准温度和压力下使用上述PBS溶液中任一种时或在标准温度和压力下可选地利用纯水时，毛细作用可由毛细力所进行的填充来限定。
为了从特定量的全血生成可自动读取的红细胞单层，进入管和分析腔室的形式和配置是至关重要的。分析腔室的入口和进入管易于由较大白细胞堵塞。所有分析腔室的总入口宽度大小必须设置成使这种情况最小化。为了分析一微升全血，分析腔室入口的最小总宽度为至少110mm(一微升中白细胞的数量乘以直径=1.1 104 * 10 10-6 m = 110 mm)。
进入通道和腔室的内表面优选地是亲水性的。这可通过选择制造该装置的材料或者通过诸如等离子体或电晕处理过程或者涂覆亲水性涂层而实现。
可存在另一组相交叉的中空指状件用于通风通道。通风通道优选地适于形成液体挡止件，但允许气体流过，不阻碍液体流动阻滞或至少造成液体流动阻滞。例如，通风通道的表面可为疏水性的或者通风通道宽度可突然变得更宽以使得流体样品阻塞(pin)。分析区可位于上述指状件之间。分析区可被布置为具有与分析系统的显微镜的视场相当的尺寸。
在图1中，示出呈盒形式的设备实例的顶视图，且在图2中为相同实例的截面图。显著地，如图1所示的总分析区被分成小基本分析区使得塑料盒具有小分析区阵列，每个小分析区具有基本上等于薄涂片(大约数μm)所需高度的高度(间隙)。在某些情况下，小分析区对应于在该系统中所用的诸如显微镜这样的光学检测器的视场。这种划分显著地解决了制造期间塑料过程变化的问题。在分析腔室上方或下方材料中的至少一种优选地是透明的或是光通透的以便允许光学检查方法。
图1还显著地示出分析区之间的密封区75，如将在下文中更详细地描述。
图1还示出呈填充通道25形式的入口通道、呈通风通道35形式的排出通道以及呈分析区45形式的大致平面形分析腔室的具体布置。在进入通道、小分析区与排出通道(例如，通风通道)之间存在流动连通，进入通道的高度显著地大于小分析区的高度(流动是细小的，因为进入通道的间隙更厚，且因为尽管分析区具有薄间隙，但其截面积较小)。可选地，可存在单个样品端口用于流体进入，该样品端口流体地连接到进入通道。在图1中由不同的箭头示出盒中流体的典型流动。
在另一实施例中，通风通道(用于空气压力控制)包括用于基本上将血液保持到小分析区内的器件(例如，使用位于通风通道与每个分析区的界面处小台阶)。本发明的另一方面为，在排出通道或通风口处或邻近处引入流体挡止件。
通过在通道壁中引入急剧的过渡部以便在所有方向改变通道宽度，如在图3中由箭头明显示出的那样，液体与壁的接触线被破坏，因为该角度不能突然变化。这导致在所谓的接触线阻塞之后的流体阻滞。弯月面在该表面处被冻结。如果通道为方形的且具有4个壁，那么加宽在相同点位在所有4个壁处进行，阻塞可很稳定。壁过渡部优选地增加角计数，即，它们可优选地逐步扩展。对于如血液的流体，水蒸发可通过弯月面处液体的玻璃化而导致永久阻塞。
应当指出的是在特定情况下，在两个方向的突然加宽（而不是如上文所提到的四个方向）可足以用于阻塞稳定性。这显著地可取决于液体湿润该表面的能力有多强。
盒可被设计用于利用诸如血液的样品进行快速且可再现的填充，以获得例如具有严格层厚度公差的红细胞单层。图1的实施例具有耦接到分析区的相交叉进入通道与通风通道的树型图案。这些区具有所需间隙高度且由间隔件分开，这有助于控制流动方向以及设置间隙高度。分析区可被布置为匹配图像分析设备的光场且具有最大宽度来限制间隙变化。间隔件被形成为基底的整体部分，其可通过从具有相反结构的主体复制而产生。盒的覆盖物可例如由平坦薄塑料片或玻璃片制成，若需要，其内表面上可用一种或多种试剂涂覆，这取决于所用的分析类型。基底与覆盖物可例如通过激光或热结合来接合。优选地，盒由上覆盖部件与下部件制成。通道和分析腔室可形成于下部件中且覆盖部件密封到顶部，这例如是通过胶合、焊接、声波焊接、激光焊接、热结合等来进行的。覆盖部件优选地比下部件柔性更强使得下部件中分析腔室的尺寸稳定性和平面度不受到上部件的连接的影响。由于相同原因，如果覆盖物和下部件具有类似热膨胀系数（例如小于25%的差异，更优选地小于10%的差异）以使腔室高度并不由于覆盖部件下垂到分析腔室内而随着温度变化而改变，则是优选的。
进入通道是有分支的且具有比分析区更大的通道高度。进入通道可连接到单个样品进入端口。流动阻力较低使得能快速地填充分析区，从而分析区的填充几乎同时开始。在分析区中的流动路径可具有较窄间隙，诸如5μm且优选地较短，这保证了直到通风通道的完全且快速的填充。通风通道连接到单个排出口(废料腔室)。由于在从分析区到通风区的过渡部处的高度台阶，因此血液将停在那里，这是因为毛细作用将减小，且通风通道将不填充(至少不填充直到所有分析区被填充)。
分析区的尺寸可与成像光学器件的场相关(例如，使得至少一个边缘在该场内)。本发明的装置优选地具有大量腔室，其与梳状或分形填充通道和通风通道的使用相结合。根据本发明的实施例的装置具有大量腔室。在一优选实施例中，总表面将为20mm2且视场为0.2×0.2=0.04 mm2，这意味着500个反应腔室。用于本发明的实施例中任何实施例的腔室数量可在100个腔室与1000个腔室之间。
该设备具有排出通道的图案，其中一个或多个排出通道耦接到分析腔室中的每一个。进入通道和排出通道的图案可分别包括梳状图案，梳状图案的指状件相交叉，且分析腔室布置于梳状图案的相交叉指状件之间。
分析系统可具有成像光学器件和图像分析软件，图像分析软件可识别分析区的方位且使用它作为步进控制的控制输入来在分析期间控制盒的相对移动和成像方案。特征可添加到将分析区分开的壁上，或者替代地在分析区内可存在用于提供关于分析区相对于整个盒的位置信息的特征。这可为由图像分析软件解释的代码或符号。
图2，截面图
限定通道的基底表面可具有至少三个不同层级：(i)流体样品的进入通道的层级，(ii)分析区的层级，以及(iii)分析区之间间隔件的密封区。
通风区可具有与入口相同的层级或者在入口层级与分析区层级之间的层级。入口区可表示为一种梳状结构，其与通风结构相交叉使得大量相等的分析区被限定为二者之间的连接。图1仅表示出一小部分以图示相交叉的布置。这只是指示。可在一种分形结构中设计出更多通道拆分以有效地覆盖总表面积。分析区由密封区分开。在分析区与密封区之间的台阶高度限定分析区的间隙高度。个别分析区的大小可优选地在0.01mm2与1mm2之间，更优选地在0.03mm2与0.2mm2之间。分析区的间隙高度可在1μm与10μm之间，更优选地在3μm与6μm之间。总分析面积优选地在1mm2与500mm2之间，更优选地在5mm2与250mm2之间。
密封区具有优选地在50μm与500μm之间的宽度。
填充通道与通风通道具有优选地10-200μm，更优选地50-100μm的深度和50-1000μm，更优选地100-300μm的宽度。
可用于基底以及覆盖物的材料优选地为聚合物，例如透明，特别是光通透的聚合物，如聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、环烯烃(co)聚合物、聚酯、聚氨基甲酸酯 等。可处理进入通道以减小接触角从而增加毛细填充力，分析区可被预处理以增强细胞粘性和/或细胞染色。这种处理可为等离子体或电晕放电或利用亲水性涂层来涂覆。另一方面，本发明的一方面为引入流体挡止件以防止流体通过通风通道排放同时允许通气。通风通道被预处理以增加接触角，优选地超过90度以避免由流体样品湿润。这种处理可为利用疏水性涂层来涂覆。另一方法是在所有方向突然增加排出通道的宽度以便使得流体样品的弯月面阻塞。
覆盖物和基底可通过结合技术，诸如激光焊接或其它技术而永久地接合，或者替代地仅与每个接触而不永久地结合。接触区可被预处理以增强覆盖物到基底的粘结性。优选地，覆盖物的柔性比基底更强使得当接合时，基底的尺寸和平面度不受影响。
用于填充血液的进入口区域可被设计成能进行方便填充，这例如通过提供诸如通孔的样品端口和可选地可在填充后闭合帽来进行。试剂可以干的形式提供于进入口区域中。在通风通道的端部，可包括废料储集器以避免诸如血液的流体的可能过量溢出。
图5和图6示出根据本发明的盒，其包括在进入通道(25)与分析腔室(45)之间的额外区域(55)，其中此区域高度小于进入通道(25)且大于分析腔室(45)。额外区域(55)的高度优选地小于6微米。此额外区具有若干优点。为了加速对血液中疟疾寄生物的检测，在盒中形成此额外区，其中富集成熟的疟疾寄生物。
作为具体实例，带有成熟寄生物的红细胞不能进入小于3微米的分析腔室但它们容易地流入到4微米区。这种差别较小但易于通过蚀刻额外扫描区来做出，参看图5和图6中的示意图。此额外区是有利的，因为原本白细胞也将集中于扫描区边缘且阻碍成熟寄生物。白细胞太大而不能进入4微米间隙，因此仅具有成熟寄生物的厚红细胞将富集于此区内。
在一优选实施例中，向盒添加较大血液体积腔室以从手指扎刺快速地储存血液。如果此腔室被填充，则从手指扎刺取得足量血液以确保可靠测量。较大体积腔室也可为盒上的额外通道。
一般而言，可通过用例如在有机溶剂中的染料溶液来预填充分析腔室来向分析腔室添加染料。这些溶剂迅速蒸发且在分析腔室中留下所需量的干燥染料。染料将由进入的生物流体（优选血液）(再)溶解。
盒的制造步骤：
可通过注射模制或其它复制技术来制造结构化基底。可借助于光刻、电镀和/或蚀刻来产生作为模具的所需的主体结构。一种合适方法需要两个光刻掩膜。第一个包含用于分析区的图案。在第二步，使用表示进入通道和排出通道的通道结构的掩膜以便形成抗蚀剂图案以对基底(例如，二氧化硅)进行选择性蚀刻。在蚀刻之后，剥离抗蚀剂且分析区上的光致聚合物留在基底上。以此方式，可在基底上形成三个层级。替代方法是使用多层抗蚀剂，诸如SU-8。此基底然后可例如以光盘制造(例如，DVD、CD-ROM盘)中得到很好确认的方式通过电镀而拷贝到金属（例如Ni）垫片内。金属，例如Ni垫片然后用作模具中的插件以通过模制在塑料中复制。复制方法可包括通过使用主体的复制方法来制造基底下部件，之后通过任何合适方法附着该覆盖层，例如，焊接、声波焊接、激光焊接、胶合、热结合等。
图3，分析系统
图4示出包括上文所述设备的分析系统。在该视图的下半部示出微流体部分130，且在上半部示出软件50和计算硬件60。微流体部分可呈可移除的盒的形式，或者如果它们在各个使用之间能够洗净（wash out）的话，可合并于该系统中。此系统具有至少一个样品腔室70以用于控制到分支进入通道和分析腔室110的准入。若需要，可提供可选项目，诸如阀80或者诸如泵的致动器，但优选地通过毛细作用使流体进入到分析腔室。取决于特定应用，在分析区的排出通道之后，可包括任何其它级120。可根据需要存在许多分析区用于进行许多并行的评估。可进行一种或多种评估，例如，若干腔室可专用于一种评估，所有腔室可专用于一种评估或者许多评估可并行地进行。合适的反应物（例如合适染色剂）可预先装于分析腔室中。光学检测器100观看分析腔室且将图像信号馈送给软件50中的部件40以分析图像来确定样品性质，通常通过显示屏幕55向使用者展示。
软件部件还包括控制器10，用于控制分析部件40和控制流量控制部件30。流量控制部件控制阀或泵来控制样品供应。可选地，控制器可耦接到位置调整器65以移动盒和检测器的相对位置。可选地，控制器可耦接到样品的环境控制器20。软件的另外的部分可被布置成提供使用者介面和对结果进行进一步分析。所有软件可使用常规编程语言且可在诸如通用微处理器、个人计算机或其它硬件的常规计算硬件60上运行。
控制器可为任何合适的控制器或微控制器，例如，可包括微处理器或诸如FPGA的可编程的逻辑装置。
实例：
在本实例中描述根据本发明的装置。该装置可包括长度为55 mm的一个进入通道和在此通道旁边的宽度为55mm且长度为4mm的两个分析腔室。第二种预想到的更紧凑的方案是，具有28mm长的两个或三个进入通道和四个分析腔室。每个腔室具有28mm宽的进入口且为4mm长。填充时间取决于进入通道的填充特征和供应血液给进入通道的通道长度。具有这些大进入口宽度且具有仅4mm长度的分析腔室填充很快，小于数秒。仅利用毛细力和30mm供应通道来填充1mm宽度，28mm长度和18微米间隙的进入通道的必需时间为13秒，其满足低于1分钟的填充时间要求。最有益地是，所有进入通道尽可能小，因为这最小化从手指扎刺所需的血液总量。
利用原型的实验表明，根据本发明的装置利用全血在40秒内填充。
应用：
应用可至少包括基于细胞的诊断，诸如疟疾诊断、HIV、HCV、FBC等。基于细胞表示细胞在流体样品中。但是，本发明的实施例的方法中的任何方法都不是限于作为诊断方法的部分来识别细胞方面的诊断方法。举例而言，红细胞并不包含DNA或RNA，且因此检测血液样品中的DNA或RNA为根据本发明的诊断测试，这是因为检测DNA或RNA指示血液样品中可存在外来物质。对于快速分布式测试而言，该设备可呈盒的形式。该设备可形成生物传感器或任何其它类型的医疗诊断装置的部分。在权利要求内可设想到其它应用、变型和添加。

Claims (15)

1.一种用于产生含细胞的流体层的设备，每一流体层具有单层细胞以供分析，所述设备具有分析腔室（45）的二维阵列和耦接到所述阵列中的分析腔室中的每一个以能并行填充所述分析腔室的进入通道（25）的分支图案，所述分析腔室分别具有大致平面形状，该平面形状具有小于进入通道高度的高度以便当所述腔室被填充流体样品时产生含细胞的流体层，每一流体层具有单层细胞。
2.根据权利要求1所述的设备，还包括在所述进入通道（25）与分析腔室（45）之间的额外区域（55），其中此区域高度小于所述进入通道（25）且大于所述分析腔室（45）。
3.根据权利要求2所述的设备，其中所述额外区域（55）的高度小于6微米。
4.根据权利要求1或2所述的设备，具有耦接到分析腔室阵列的排出通道（35）的图案。
5.根据权利要求3所述的设备，还包括液体挡止件，其阻止液体通过所述排出通道流动但允许气体通过。
6.根据权利要求3或4所述的设备，所述引入通道和排出通道的图案分别包括梳状图案，所述梳状图案的指状件相交叉，且所述分析腔室布置于所述梳状图案的相交叉的指状件之间。
7.根据前述权利要求中任一项所述的设备，所述分析腔室中每一个的总面积在100mm2与2000mm2之间，和/或所述分析腔室的高度在1μm与10μm之间。
8.根据前述权利要求中任一项所述的设备，所述进入通道具有10μm至200μm的深度和50μm至1000μm的宽度。
9.一种用于制备含细胞的流体层以供分析的方法，每一流体层具有单层细胞，该方法使用具有分析腔室（45）的二维阵列和进入通道（25）的分支图案的设备，所述进入通道（25）的分支图案耦接到所述阵列中的所述分析腔室中的每一个以能并行填充所述分析腔室，所述分析腔室分别具有大致平面形状，该平面形状具有小于进入通道高度的高度以便当所述腔室被填充流体样品时产生含细胞的流体层，每一流体层具有单层细胞，所述方法具有以下步骤：提供所述流体样品，以及将所述流体样品供应到所述进入通道的图案以使得所述流体样品填充所述分析腔室。
10.一种用于产生含细胞的流体层以供分析的设备的制造方法，每一流体层具有单层细胞，所述方法具有以下步骤：形成分析腔室（45）的二维阵列；和形成耦接到所述阵列中的所述分析腔室中的每一个以能并行填充所述分析腔室的进入通道（25）的分支图案，所述分析腔室被形成为具有大致平面形状，该平面形状具有小于所述进入通道高度的高度。
11.一种分析系统，其包括：用于分析含细胞的流体层的光学检测器(10, 100, 40)，每一流体层具有单层细胞；和用于产生含细胞的流体层的设备（110），每一流体层具有单层细胞，所述设备具有分析腔室（45）的二维阵列和进入通道（25）的分支图案，所述进入通道的分支图案耦接到所述阵列中的分析腔室中的每一个以使得能并行填充所述分析腔室，所述分析腔室分别具有大致平面形状，该平面形状具有小于进入通道高度的高度以便当所述腔室被填充流体样品时产生含细胞的流体层，每一流体层具有单层细胞。
12.根据权利要求11所述的系统，具有耦接到所述分析腔室的阵列的排出通道（35）的图案。
13.根据权利要求12所述的系统，所述进入通道和排出通道的图案各包括梳状图案，所述梳状图案的指状件相交叉，且所述分析腔室布置于所述梳状图案的相交叉的指状件之间。
14.根据前述权利要求10至12中任一项所述的系统，其中所述分析腔室中每一个的面积在0.02mm2与1mm2之间，和/或所述分析腔室的高度在1μm与10μm之间，和/或所述进入通道具有10μm至200μm的深度和50μm至1000μm的宽度。
15.一种分析含细胞的流体层的方法，每一流体层具有单层细胞，使用具有分析腔室（45）的二维阵列和进入通道（25）的分支图案的设备来制备该流体层，所述进入通道的分支图案耦接到所述阵列中的分析腔室中的每一个以能并行填充所述分析腔室，所述分析腔室分别具有大致平面形状，该平面形状具有小于进入通道高度的高度以便当所述腔室被填充流体样品时产生含细胞的流体层，每一流体层具有单层细胞，所述方法具有以下步骤：提供光学检测器(10, 100, 40)，且在所述分析腔室中使用所述光学检测器来分析所述含细胞的流体层，每一流体层具有细胞单层。
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