KR101714766B1 - 분석용 세포들을 포함하는 유체의 얇은 층들의 준비 - Google Patents

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Abstract

분석을 위한 유체 샘플의 얇은 층들을 생성하는 장치는 분석 체임버들(45)의 이차원 어레이와, 상기 분석 체임버들이 병렬로 충전될 수 있게 하도록 상기 어레이에 결합된 입구 채널들(25)의 분기부 패턴을 가진다. 분석 체임버들은 유체 샘플로 충전될 때 얇은 층들을 생성하도록 입구 채널들의 것보다 작은 높이를 갖는 평면형이다. 어레이는 체임버들의 신속한 충전을 여전히 가능하게 하면서 체임버들의 높이의 변동들이 감소될 수 있도록 주어진 영역에서 체임버들 사이에 더 많은 스페이서들을 가능하게 한다. 분석 체임버들은 혈액 같은 특정 유체 샘플에 의한 모세관 충전에 적합할 수 있다. 출구 채널들(35)의 패턴은 어레이에 결합될 수 있다. 입구 및 출구 채널들은 빗살 패턴들을 형성할 수 있으며, 빗살 패턴들의 수지부들은 서로맞물려지며, 분석 체임버들은 빗살 패턴들의 서로맞물린 수지부들 사이에 배열된다.

Description

분석용 세포들을 포함하는 유체의 얇은 층들의 준비 {PREPARATION OF THIN LAYERS OF A FLUID CONTAINING CELLS FOR ANALYSIS}
본 발명은 분석을 위한 유체의 얇은 층들을 준비하기 위한 장치 및 방법들과, 이런 얇은 층들을 분석하기 위한 시스템들 및 방법들에 관한 것이며, 특히, 카트리지 내의 샘플들의 자동 분석을 위한 방법들 및 장치에 관한 것이다. 본 발명은 특히 얇은 층들, 특히, 예를 들어, 분석을 위해 중첩하는 적혈구들을 갖지 않는 적혈구들 같은 세포들의 단층들을 준비하기 위한 장치 및 방법들 및 세포들의 이런 얇은 층들 또는 단층들을 분석하기 위한 시스템 및 방법들, 특히 카트리지 내의 샘플들의 자동 분석을 위한 방법들 및 장치에 관한 것이다.
세포 기반 분석은 특정 시약으로 세포들을 착색하고, 현미경에서 세포 개체수를 검사함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 이미지 분석 및 진단을 위한 현미경, 카메라 및 소프트웨어 애플리케이션을 사용하는, 이미징 기반 세포 진단들을 위해, 세포 중첩에 기인한 잘못된 해석을 피하기 위해 분리된 세포들의 단층을 생성하는 것이 중요하다. 한 가지 이런 방법은 다년간 알려져 있으며, 손으로 유리 슬라이드 위에 관련 유체, 예를 들어, 혈액의 체적을 문지르는 단계를 포함한다(도말표본). 통합된 폐쇄된 카트리지를 위해, 이 프로세스는 사용되지 않을 수 있다. 대신, 좁은 채널들의 모세관 충전이 사용될 수 있다.
미국 특허 제6,599,475 B1호로부터 현미경 분석을 위해 적혈구들의 얇은 단층을 생성하기 위해 플라스틱 광학 쿠베트(cuvette)를 제공하는 것이 알려져 있다. 직렬로 연결되고 분리 벽들에 의해 분리되어 있는 다수의 격실들이 제공되어 있다. 이들 벽들 각각은 격리된 적혈구들의 단층이 격실들 중의 최종 격실에서 달성되도록 적혈구 희석을 달성하기 위해 적혈구들 중 단지 일부만의 유동을 가능하게 한다. 전체 큐베트를 가로질러 일정한 두께를 달성하기 위해, 분리 벽들은 용접 형상부들을 가지며, 투과성 덮개가 상단부에 용접되어 있다. 격실은 600 x 600 x 3 마이크로미터의 치수들을 가질 수 있다. 말라리아 기생충을 위한 혈액 샘플들의 분석 같은 용례들을 위해, 필요한 검출 한계를 달성하기 위해 큰 체적의 혈액이 분석될 필요가 있다. 적혈구들의 치수들(5 ㎛) 정도의 층 두께들에서, 이는 큰 표면적(cm2)이 검사될 필요가 있다는 것을 의미한다.
US 6,165,739 A1호는 다수의 모세관 간극 체임버들을 갖는 레이저 혈구계산을 위한 유리 또는 플라스틱 슬라이드를 개시한다. 유체 샘플은 저장조로부터 동시에 모든 체임버들에 진입할 수 있다. 다수의 동시적 반응들을 가능하게 하기 위해 상이한 시약이 각 체임버 내에 제공된다.
US 2002/0106786 A1은 미세분석 및 절차, 특히 소형화된 세포 기반 분석을 실행하기 위한 방법 및 장치를 공개하고 있다. 상기 장치는 분석을 위해 세포들을 포함하는 유체의 층들을 제조하는데 적합하고, 상기 장치는 분석 체임버들의 이차원 어레이와 상기 분석 체임버들이 병렬로 충전될 수 있게 하도록 상기 어레이 내의 상기 분석 체임버들 각각에 결합된 입구 채널들의 분기부 패턴을 가지며, 상기 분석 체임버들 각각은 실질적 평면형 형상을 가진다.
본 발명의 목적은 분석을 위해 유체의 얇은 층들을 준비하기 위한 대안적 장치 및 방법들 및/또는 이런 얇은 층들을 분석하기 위한 시스템들 및 방법들, 특히, 카트리지 내의 샘플들의 자동 분석을 위한 장치를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 층들이 예를 들어, 분석을 위한 적혈구들 같은 중첩하는 세포들을 갖지 않는 적혈구들 같은 세포들의 단층들을 가지는, 세포들을 갖는 유체들로부터 층들을 준비하기 위한 장치 및 방법들을 제공하는 것이며, 이런 세포들의 단층들을 분석하기 위한 시스템들 및 방법들, 특히, 카트리지 내의 샘플들의 자동 분석을 위한 방법들 및 장치를 제공하는 것이다.
제1 양태에 따라서, 본 발명은 유체 샘플의 얇은 층들을 생성하기 위한 또는 세포들, 특히, 적혈구들을 포함하는 유체의 층들을 생성하기 위한 장치를 제공하며, 각 층은 세포들, 특히, 분석을 위한 적혈구들을 가지며, 이 장치는 분석 체임버들의 이차원 어레이와, 분석 체임버들이 병렬로 충전될 수 있게 하도록 어레이 내의 분석 체임버들 각각에 결합된 입구 채널들의 분기부 패턴을 가지며, 분석 체임버들 각각은 유체 샘플의 얇은 층들을 생성하도록 또는 세포들, 특히, 적혈구들을 포함하는 유체의 층들을 생성하도록 입구 채널들의 높이보다 작은 높이를 가지는 실질적으로 평면형 형상을 가지며, 각 층은 체임버가 유체 샘플로 충전되어 있을 때 세포들의 단층을 갖는다.
분석 체임버들의 이차원 어레이와, 체임버들을 병렬로 결합시키기 위한 입구 채널들의 패턴을 제공함으로써, 주어진 영역에서 체임버들 사이에 더 많은 스페이서들이 제공될 수 있으며, 그래서, 체임버들의 신속한 충전을 여전히 가능하게 하면서 체임버들의 높이의 변동들이 감소될 수 있다.
실시예들은 임의의 추가적 특징들을 가질 수 있으며, 이런 추가적 특징들 중 일부가 이하에 더 상세히 설명된다.
본 발명에 따른 장치는 바람직하게는 입구 채널들(25)과 분석 체임버들(45) 사이에서 추가적 영역(55)을 더 포함하며, 이 영역의 높이는 입구 채널들(25)보다 작고, 분석 체임버들(45)보다 크다. 더 양호한 실시예에서, 추가적 영역(55)의 높이는 6 미크론 미만이다. 이 추가적 영역(55)의 장점은 성숙한 기생충을 갖는 적혈구들이 이 영역에서 농후해진다는 것이다. 이는 스캔 영역의 가장자리(rim)에 백혈구들이 집중되어 적절한 분석을 방해하는 것을 방지한다.
체임버들 및/또는 채널들은 특정 유체 샘플, 예를 들어, 세포들을 포함하는 유체, 특히, 혈액에 의한 모세관 충전에 적합한 치수를 가질 수 있다. 본 발명의 실시예들에서, 모세관 충전을 위해 적합한 치수들은 예로서, PBS 또는 순수 물 같은 표준 수성 용액에 의한 모세관 충전에 의거하여 규정될 수 있다. 이는 본 발명에 따른 모세관 충전이 가능하며 그에 적합한 채널들이 표준으로서, 예를 들어, 표준 온도 및 압력에서 PBS(포스페이트 버퍼 염수)를 사용한, 또는 선택적으로 예로서 표준 온도 및 압력에서 순수 물에 의한, 모세관 작용에 의해 충전된다는 것을 의미한다.
본 발명의 장치들은 바람직하게는 빗살형 또는 프랙탈(fractal) 충전 및 통기 채널들을 사용하는 것과 조합된 다수의 체임버들을 갖는다. 양호한 실시예에서, 총 표면은 20 mm2이고, 시계는 0.2 x 0.2 = 0.04 mm2이며, 이는 500개 반응 체임버들을 의미한다. 본 발명의 실시예들 중 임의의 실시예를 위한 체임버들의 수는 1과 1000 체임버들 사이일 수 있다. 분석 체임버들 각각의 총 면적은 100 내지 2000 mm2이며, 그리고/또는 분석 체임버들의 높이는 1 내지 10 ㎛이다.
장치는 분석 체임버들 각각에 결합된 하나 이상의 출구 채널들을 갖는 출구 채널들의 패턴을 갖는다. 입구 및 출구 채널들의 패턴들은 각각 빗살 패턴을 포함할 수 있으며, 빗살 패턴들의 수지부들은 서로맞물려있고, 분석 체임버들은 빗살 패턴들의 서로맞물린 수지부들 사이에 배열된다. 본 발명의 다른 양태는 출구 채널들 또는 통기부들에 있거나 그에 인접한 유체 정지부들의 도입이다. 모든 방향들로 채널의 폭을 변경하기 위한 것 같은 날카로운 전이부들을 채널 내에 도입함으로써, 각도가 갑작스럽게 변할 수 없기 때문에 액체와 벽의 접촉선은 절두형이 된다. 이는 유체의 정체(hesitation)를 초래하고 이 정체에는 소위 접촉선 속박(pinning)이 이어진다. 분리면(meniscus)은 표면에서 멈춰진다. 채널이 정방형이고, 4개 벽들을 가지는 경우, 이때, 모든 4개 벽들에서 확장이 이루어지며, 동일 스팟에서, 속박은 매우 안정적일 수 있다. 바람직하게는, 벽 전이부들은 각도 카운트를 증가시키며, 즉, 이들은 바람직하게는 단차식 확장부들일 수 있다. 혈액 같은 유체들에서, 물의 증발은 분리면에서의 액체의 유리화에 의해 영구적 속박을 초래할 수 있다.
장치는 세포들, 예를 들어, 혈액을 포함하는 유체 샘플 같은 유체 샘플을 수용하기에 적합한 단일 샘플 포트를 가질 수 있으며, 샘플 포트는 이들이 모세관 작용에 의해 충전되도록 입구 채널들의 분기부 패턴에 유체 연결된다. 입구 채널들의 양호한 최소 높이는 큰 백혈구 세포들, 단핵세포들에 의한 막힘을 방지하기 때문에 17 마이크로미터이다.
출구 채널들을 배제한 입구를 포함하는 채널들 및/또는 체임버들은 바람직하게는 친수성 표면을 갖는다. 이 친수성 표면은 이들을 형성하는 재료의 특성일 수 있거나, 다른 수단, 예를 들어, 코로나 방전, 플라즈마 방전에 의해 또는 친수성 코팅으로 코팅함으로써 유도될 수 있다. 바람직하게는, 통기 채널들은 바람직하게는 예를 들어 이들이 소수성 표면들을 갖게 함으로써 또는 폭 변경 지점에서 액체를 속박하도록 일 지점에서 통기 채널들의 폭을 변경함으로써 가스가 통과할 수 있게 하면서 액체들을 위한 유체 정지부를 제공하도록 배열된다. 체임버들의 위 또는 아래의 표면들 중 적어도 하나는 광학적 검사 및 측정을 가능하게 하기 위한 목적 등으로 바람직하게는 투과성이거나 광학적으로 투명하다. 분석 체임버들의 이차원 어레이 및 선택적으로 분석 체임버들이 병렬로 충전될 수 있게 하도록 어레이 내의 분석 체임버들 각각에 결합된 입구 채널들의 분기부 패턴은 바람직하게는 중합성 재료, 특히, 플라스틱 재료로 이루어질 수 있다. 양호한 실시예들에서, 실질적으로 평면형 형상을 각각 갖는 분석 체임버들은 내부에 체임버들이 형성되어 있는 하부 부분과 체임버들의 상단부를 형성하는 덮개 부분에 의해 형성되는 높이를 갖는다. 덮개 부분은 예를 들어, 접착, 용접, 특히, 초음파 용접, 솔벤트 결합, 용융 등에 의한 하부 부분에 대한 덮개 부분의 부착이 치수들, 특히, 하부 부분에 형성된 체임버들의 바닥부의 평탄성을 변경하지 않도록 하부 부분보다 더 유연한 것이 바람직하다.
개별 분석 체임버들의 크기는 0.02 내지 500 mm2 사이일 수 있다. 분석 체임버들의 높이는 1 내지 10 ㎛ 사이일 수 있다. 분석 체임버의 높이는 그 위에서 분석되는 세포들 또는 기생충들에 의존한다. 적혈구들에 대하여, 양호한 높이는 2와 4 마이크로미터 사이이며, 더욱 바람직하게는 3 마이크로미터이다. 더 작은 간극 높이는 모든 정상 혈구들을 제거할 것이며, 순수 혈장을 제공할 것이다. 더 큰 간극 높이는 적혈구들과, 예로서, 기생충들의 혼합물들을 초래할 것이다.
입구 채널들은 10 내지 200 ㎛의 깊이와 50 내지 1000 ㎛의 폭을 갖고 출구 채널들은 10 내지 200 ㎛의 깊이와 50 내지 1000 ㎛의 폭을 갖는다.
본 발명의 다른 양태는 유체 샘플의 얇은 층들을 준비하는, 또는, 세포들, 특히, 적혈구들을 포함하는 유체의 층들을 준비하기 위한 방법을 제공하며, 각 층은 분석 체임버들의 이차원 어레이 및 분석 채널들이 병렬로 충전될 수 있게 하도록 어레이 내의 분석 체임버들 각각에 결합된 입구 채널들의 분기부 패턴을 갖는 장치를 사용하여 분석을 위한 세포들, 특히, 적혈구들의 단층을 가지며, 분석 체임버들 각각은 세포들, 특히 적혈구들을 포함하는 유체의 층들 또는 얇은 층들을 생성하도록 입구 채널들의 것보다 작은 높이를 갖는 실질적으로 평면형 형상을 가지며, 각 층은 체임버들이 유체 샘플로 충전될 때 세포들 특히 적혈구들을 가지며, 이 방법은 유체 샘플을 제공하는 단계와, 유체 샘플이 분석 체임버들을 충전하게 하도록 입구 채널들의 패턴에 유체 샘플을 공급하는 단계를 구비한다. 바람직하게는, 충전은 모세관 작용에 의해 이루어진다. 본 발명의 실시예들에서, 모세관 작용에 의한 충전은 PBS 또는 선택적으로 순수 물 같은 표준 수성 용액에 의한 모세관 충전에 의해 형성될 수 있다. 이는 본 발명에 따른 모세관 작용에 의한 충전은 표준으로서, 예를 들어, 표준 온도 및 압력에서의 PBS(포스페이트 버퍼 염수)(또는 선택적으로 순수 물)를 사용한 모세관 작용에 의한 충전을 의미한다는 것을 의미한다. PBS는 나트륨 클로라이드, 나트륨 포스페이트 및 (일부 조성들에서) 포타슘 클로라이드 및 포타슘 포스페이트를 포함하는 염 버퍼 용액(salty buffer solution)이다. 용액의 삼투질농도 및 이온 농도들은 일반적으로 인체의 것들과 일치한다. PBS를 제조하는 한 가지 방법은 8 L의 증류수에 800 g NaCl, 20 g KCl, 144 g Na2HPO4·12H2O 및 24 g KH2PO4를 용해시키고, 10 L까지 토핑(topping)하는 것을 포함한다. pH는 약 6.8이지만, 그러나, 1 x PBS로 희석될 때, 이는 7.4까지 변하여야 한다. 희석시, 결과적인 1 x PBS는 137 mM NaCl, 10 mM 포스페이트, 2.7 mM KCl 및 7.4의 pH의 최종 농도를 가져야 한다. 다른 준비는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, volume 3, appendix B.12"에서 Sambrook, Fritsch 및 Maniatis(1989)에 의해 설명되었다. 증류된 800 ml H2O 내에 8g의 NaCl, 0.2g의 KCl, 1.44g의 Na2HPO4·12H2O 및 0.24g의 KH2PO4를 용해한다. HCl에 의해 pH를 7.4로 조절하고 1 liter까지 H2O를 추가한다.
본 발명의 일부 방법들에 따른 모세관 작용은 예를 들어, 표준 온도 및 압력에서의 상술한 PBS 준비들 또는 선택적으로 표준 온도 및 압력에서의 순수 물 중 어느 하나에 의해 충전할 수 있는 치수들을 갖는 체임버들 및/또는 채널들을 사용한다.
본 발명의 방법들은 바람직하게는 빗살형 또는 프랙탈 충전 및 통기 채널들의 사용과 조합하여 높은 수의 체임버들을 사용한다. 본 발명의 실시예들에 따른 장치들은 많은 수의 체임버들을 가질 수 있다. 양호한 실시예에서, 총 표면은 20 mm2이고, 시계는 0.2 x 0.2 = 0.04 mm2이며, 이는 500개 반응 체임버들을 의미한다. 본 발명의 실시예들 중 임의의 실시예를 위한 체임버들의 수는 100 내지 1000 체임버들 사이일 수 있다.
본 발명의 방법들은 분석 체임버들 각각에 결합된 하나 이상의 출구 채널들을 갖는 출구 채널들의 패턴을 갖는 장치와 함께 사용될 수 있다. 입구 및 출구 채널들의 패턴들은 각각 빗살 패턴을 포함하고, 빗살 패턴들의 수지부들은 서로 맞물리고, 분석 체임버들은 빗살 패턴들의 서로맞물린 수지부들 사이에 배열된다. 본 발명의 다른 양태는 출구 채널들 또는 통기부들에 또는 그에 인접하게 샘플 유체의 유체를 정지시키는 방법 단계이다. 모든 방향들에서 채널의 폭을 변경하는 것 같이 채널 벽에 날카로운 전이부들을 도입함으로써, 각도가 급격하게 변할 수 없기 때문에 액체와 벽의 접촉선은 절두형이 된다. 이는 유체의 정체를 초래하고 이 정체에는 소위 접촉선 속박이 이어진다. 분리면은 표면에서 멈춰진다. 채널이 정방형이고, 4개 벽들을 가지는 경우, 이때, 모든 4개 벽들에서 확장이 이루어지며, 동일 스팟에서, 속박은 매우 안정적일 수 있다. 바람직하게는, 벽 전이부들은 각도 카운트를 증가시키며, 즉, 이들은 바람직하게는 단차식 확장부들일 수 있다. 혈액 같은 유체들에서, 물의 증발은 분리면에서의 액체의 유리화에 의해 영구적 속박을 초래할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 이런 장치를 제조하는 대응하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 유체 샘플의 얇은 층들을 분석하기 위한 또는 세포들, 특히, 적혈구들을 포함하는 유체의 층들을 분석하기 위한 광학 검출기와, 유체 샘플의 얇은 층들 또는 세포들, 특히, 적혈구들을 포함하는 유체의 층들을 생성하기 위한 장치를 포함하는 분석 시스템을 제공하며, 각 층은 세포들의 단층을 가지고, 장치는 분석 체임버들의 이차원 어레이와 분석 체임버들이 병렬로 충전될 수 있도록 어레이 내의 분석 체임버들 각각에 결합된 입구 채널들의 분기부 패턴을 가지고, 분석 체임버들 각각은 얇은 층들 또는 세포들, 특히, 적혈구들을 포함하는 유체의 층들을 생성하도록 입구 채널의 것보다 작은 높이를 갖는 실질적 평면형 형상을 가지며, 각 층은 체임버들이 유체 샘플로 충전되어 있을 때 세포들의 단층을 가진다.
본 발명의 다른 양태는 유체 샘플의 얇은 층들을 분석하거나 세포들, 특히, 적혈구들을 포함하는 유체의 층들을 분석하는 방법을 제공하며, 각 층은 분석 체임버들의 이차원 어레이와 분석 체임버들이 병렬로 충전될 수 있게 하도록 어레이 내의 분석 체임버들 각각에 결합된 입구 채널들의 분기부 패턴을 가지는 장치를 사용하여 준비된, 세포들의 단층을 가지며, 분석 체임버들 각각은 얇은 층들 또는 세포들, 특히, 적혈구들을 포함하는 유체의 층들을 생성하도록 입구 채널들의 것보다 작은 높이를 갖는 실질적 평면형 형상을 가지며, 각 층은 체임버들이 유체 샘플로 충전될 때 세포들의 단층을 가지며, 이 방법은 광학 검출기를 제공하는 단계와, 얇은 층들 또는 세포들, 특히, 적혈구들을 포함하는 유체의 층들을 분석하기 위해 광학 검출기를 사용하는 단계를 구비하고, 각 층은 분석 체임버들 내에 세포들의 단층을 갖는다.
특히, 종래 기술에 비한 다른 장점들은 본 기술 분야의 숙련자들에게 명백할 것이다. 예로서, 본 발명은 단일 체임버를 사용하지 않으며, 병렬로 결합된 체임버들의 어레이를 사용한다. 어레이는 이차원 어레이일 수 있으며, 이 이차원 어레이는 따라서 축약적 디자인을 가능하게 한다. 체임버들의 이차원 어레이는 그들이 병렬로 충전될 수 있게 하도록 유체 결합된다. 특히, 본 발명의 장치들은 다수의 분석 체임버들을 가지며, 체임버들은 작은 높이, 예를 들어, 입구 채널들의 것보다 실질적으로 작은 높이를 갖는다.
본 발명의 청구범위로부터 벗어나지 않고 다수의 변형들 및 변형들이 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 형태는 단지 예시일 뿐이며, 본 발명의 범주를 한정하지 않는다는 것을 명백히 이해하여야 한다.
이제, 첨부 도면들을 참조로하는 예들에 의거하여 본 발명이 유효화되는 방식을 설명할 것이다.
도 1은 반복적으로 서로맞물린 채널 구조와 분석 영역들의 어레이를 도시하는 카트리지의 일부의 평면도이다.
도 2는 카트리지의 단면도이다.
도 3은 본 발명의 톤(tone) 실시예에 따른 분석 영역과 통기 채널 사이의 전이부의 확대 사시도이다.
도 4는 카트리지를 포함하는 분석 시스템의 개략도를 도시한다.
도 5는 성숙한 기생충들에 의해 감염되어 있는 적혈구들을 위한 추가적 분석 영역들을 포함하는 것을 보여주는 본 발명에 따른 카트리지의 부분 평면도를 도시한다.
도 6은 도 5에 따른 카트리지의 단면도이다.
본 발명은 특정 도면들을 참조로 특정 실시예들에 관하여 설명될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 단지 청구범위에 의해서만 한정된다. 설명된 도면들은 단지 개략적이며 비제한적인 것이다. 도면들에서, 요소들 중 일부의 크기는 과장될 수 있으며, 예시적 목적들을 위해 축척대로 도시되어 있는 것은 아니다. 용어 "포함하는"이 본 설명 및 청구범위에서 사용되는 경우, 이는 다른 요소들 또는 단계들을 배제하지 않는다. 단수형 명사를 참조할 때 정관사 또는 부정관사, 예를 들어, "일" 또는 "이"가 사용되는 경우, 이는 달리 명시적으로 언급되지 않은 한 복수의 이 명사를 포함한다.
청구범위에 사용되는 용어 "포함하는"은 그후 나열된 수단에 구속되는 것으로 해석되지 않아야 하며, 이는 다른 요소들 또는 단계들을 배제하지 않는다. 따라서, 표현 "수단 A 및 B를 포함하는 장치"의 범주는 단지 구성요소들 A 및 B를 포함하는 장치들에 한정되지 않아야 한다. 이는 본 발명에 관하여, 장치의 관련 구성요소들이 A 및 B라는 것만을 의미한다.
또한, 상세한 설명 및 청구범위에서 용어들 제1, 제2, 제3 등은 유사 요소들 사이를 구별하기 위해 사용된 것이며, 반드시 순차적 또는 연대적 순서를 설명하는 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어들은 적절한 환경들 하에서 상호교체가능하게 사용되며, 본 명세서에 설명된 본 발명의 실시예들은 본 명세서에서 설명된 또는 예시된 것과는 다른 순서들로 동작할 수 있다.
또한, 상세한 설명 및 청구범위에서 용어들 상단, 저부, 위, 아래 등은 설명의 목적들을 위해 사용되며, 반드시 관련 위치들을 설명하는 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어들은 적절한 환경들 하에서 상호교체가능하며, 본 명세서에 설명된 본 발명의 실시예들은 본 명세서에 설명된 또는 예시된 것 이외의 다른 배향들로 작동할 수 있다.
본 발명은 예로서, 카트리지 내의 샘플들의 자동 분석을 위한 장치 및 방법들에 관한 것이다. 카트리지 내의 샘플들의 자동 분석을 위해, 유체 샘플의 층 두께의 정확한 제어가 중요할 수 있다. 실시예들 중 적어도 일부는 얇은 세포 도말표본 준비 및 플라스틱으로 이루어진 새로운 카트리지의 디자인을 포함한다. 세포 도말표본 준비는 바람직하게는 세포들, 특히, 적혈구들을 포함하는 유체의 층들을 형성하는 것을 의미하며, 각 층은 세포들의 단층을 갖는다. 바람직하게는, 세포들은 중첩되지 않는다. 바람직하게는 세포들은 적혈구들이다. 이는 말라리아 현미경검사 진단이 일 예인, 기생충들 같은 혈액 보유 질환들의 의학적 진단을 위한 분석 시스템들을 위해 유리하게 적용될 수 있다. 적혈구들이 DNA를 포함하지 않기 때문에, 혈액 내의 외래 세포들의 존재는 임의의 방법, 예를 들어, 임의의 광학적 방법, 예를 들어, DNA의 존재를 보여주는 임의의 착색 방법에 의해 결정될 수 있다. 예로서, 본 발명의 장점은 분석을 위한 넓은 영역들의 제공 및/또는 주어진 성능을 위한 동작을 더 저렴한 비용으로 및/또는 더 신속하게 할 수 있다.
몰딩된 플라스틱의 것들 같은 저 비용 구성요소들은 일반적으로 넓은 영역들에 걸쳐 일정한 채널 높이를 달성하기 위해 필요한 평탄도가 결여되어 있는 것이 일반적이다. 이하에 더 상세히 설명될 바와 같이, 플라스틱으로 저 비용으로 제조될 수 있는 마이크로구조는 사용자 영향에 대한 민감성이 적은 마이크로미터 체제에서 더욱 정확한 층 두께를 제공할 수 있다. 본 발명의 일부 실시예들에서, 좁은 간극들을 갖는 영역들의 어레이는 더 큰 간극들을 갖는 채널들에 의해 연결되어 생성된다. 영역 크기 및 형상비는 일부 경우들에서 이미지 분석 요건들로 조절될 수 있다. 개별 면적들은 분석 대상 총 면적보다 실질적으로 더 작다. 이 방식으로, 세포들의 단층들의 신속하고 양호한 제어된 생성이 가능해질 수 있다.
실시예들에 대한 소개로서, 본 발명의 일부 실시예들에 의해 해결되는 일부 문제점들 또는 단점들을 간단히 설명할 것이다.
혈액의 얇은 도말표본(예를 들어, 세포들의 단층, 특히, 적혈구들의 단층, 특히, 비중첩 적혈구들의 단층)을 생성하기 위해, 넓은 표면 영역에 걸쳐 샘플을 도포할 필요가 있다. 그러나, 설계에 관련하여, 폐쇄된 카트리지, 그리고, 또한, 플라스틱제 카트리지(비용을 낮게 유지하기 위해)는 다양한 기술적 과제들을 부여한다. 카트리지는 일회용 카트리지일 수 있다. 카트리지는 카트리지의 내용물들의 분석을 가능하게 하기 위해, 측정 장치 내에 설치될 수 있는, 예를 들어, 슬롯형성될 수 있는 장치이다. 예로서, 작은 간극(도말표본의 얇은 높이 정도의 카트리지 내의 저부-상단부 거리)에 의해 부여되는 유동 저항은 큰 영역에 걸쳐 유체 샘플로 신속하게 분석 영역을 충전하는 것이 더 어려워지게 한다. 또한, 큰 프로세스 변동들이 존재하여 이제 더 상세히 설명될 바와 같이 넓은 표면 영역에 걸쳐 플라스틱으로 이런 얇은 간극을 제조할 때 간극 크기의 변동을 유발할 수 있다.
- 좁은 간극들을 갖는 넓은 영역들의 모세관 충전은 채널 내의 유체의 유동 저항(
Figure 112011087517295-pct00001
)에 의해 제한되며, 압력 강하는 △pν이고, 채널의 길이는 L이고, 평균 유동 속도는 V이고, 채널의 높이는 h이다. 세포들의 두께 정도의 채널 높이(h)에서, 세포들은 유동에 대한 강한 저항을 생성한다. 이는 극복할 수 있는 거리들이 제한되어 있다는 것을 의미한다.
- 충전될 수 있는 거리 및 유동 속도는 주로 헤마토크리트치(적혈구들의 농도)에 따라서, 혈액의 경우에 넓은 범위에서 변할 수 있는, 유체의 점도(η)에 의존한다.
- 모세관력은 간극 높이의 역수(△pc =
Figure 112011087517295-pct00002
)에 비례하며, 여기서 △pc는 모세관력이고, 표면 장력은 σ로 주어지고, 기판에 대한 유체의 접촉각은 Θ이고, 간극의 높이는 h이다.
- 작은 두께 변동들은 강한 유동 속도 변동들 및 결과적인 예측불가한 충전 패턴들, 불완전 충전 및 공기 포입물들을 초래한다.
- 저비용 카트리지들을 위해, 기판 및 덮개는 압출(포일) 또는 사출 성형(더 두꺼운 부분들 및 프레임) 중 어느 하나에 의해 처리되는 플라스틱으로 제조될 필요가 있다. 사출 성형은 프로세스에 고유한 비균질 냉각에 기인한 형상 편차들을 초래한다. 이는 국지적으로 10 미크론 정도의 평탄도 편차를 초래하며, 전체적으로는 더 많은 평탄도 편차들을 초래한다. 포일들은 긴밀한 두께 공차들 및 평탄도들로 처리될 수 있지만, 그러나, 굴곡 강성도는 매우 낮으며(1/d3에 비례) 그래서 비균질 및 비재현성 충전을 초래하면서 세포 적층을 유도하고 이미지 분석을 훼손시키는 너무 큰 간극들을 초래할 수 있는 간극의 큰 변동들이 예상될 수 있다. 착색의 유효 광학적 두께의 변동들이 이미지 분석의 변동들(임계치들 등)을 초래하고 따라서 잘못된 음의 값들 또는 양의 값들을 초래하기 때문에 이는 매우 중요하다.
모든 이들 이유들 때문에, 예로서 이미징 기반 말라리아 진단에 사용하기 위한 원하는 정밀도의 층 두께를 갖는 혈액 같은 유체 샘플들의 얇은 도말표본 준비를 위해 저 비용 카트리지들을 생성하는 것이 어렵다.
도 1, 제1 실시예에 따른 카트리지의 평면도
본 발명의 일부 실시예들은 마이크로유체 체임버들의 어레이의 형태의 분석 영역들을 갖는다. 이는 주어진 총면적을 위한 더 많은 스페이서들을 가능하게 할 수 있으며, 따라서, 특정 높이를 유지하는 것을 도울 수 있다. 이들 체임버들은 신속한 충전을 가능하게 하도록 입구 채널에 의해 병렬로 결합될 수 있다. 단일 샘플링 포트는 유체 샘플의 용이한 도입을 가능하게 하도록 입구 채널들에 유체 연결되어 배열될 수 있다. 또한, 통기 채널들도 배열된다. 채널들은 다수의 채널들의 병렬적인 더욱 신속한 충전을 가능하게 하도록 서로맞물린 패턴이 될 수 있다. 일부 경우들에서, 분석 영역들의 어레이를 향한 샘플의 모세관 유동을 위한 서로맞물린 수지부들의 세트가 존재한다. 충전은 바람직하게는 모세관 작용에 의해 이루어진다. 본 발명의 실시예들에서, 모세관 작용에 의한 충전은 예를 들어, 표준 온도 및 압력에서의 PBS 같은 표준 수성 용액에 의한 또는 선택적으로 표준 온도 및 압력에서의 순수 물에 의한 모세관 충전에 의해 형성될 수 있다. PBS는 나트륨 클로라이드, 나트륨 포스페이트 및 (일부 조성들에서) 포타슘 클로라이드 및 포타슘 포스페이트를 포함하는 염 버퍼 용액이다. 용액의 삼투질농도 및 이온 농도들은 일반적으로 인체의 것들과 일치한다. PBS를 제조하는 한 가지 방법은 8 L의 증류수에 800 g NaCl, 20 g KCl, 144 g Na2HPO4·12H2O 및 24 g KH2PO4를 용해시키고, 10 L까지 토핑하는 것을 포함한다. pH는 약 6.8이지만, 그러나, 1 x PBS로 희석될 때, 이는 7.4까지 변하여야 한다. 희석시, 결과적인 1 x PBS는 137 mM NaCl, 10 mM 포스페이트, 2.7 mM KCl 및 7.4의 pH의 최종 농도를 가져야 한다. 다른 준비는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, volume 3, appendix B.12"에서 Sambrook, Fritsch 및 Maniatis(1989)에 의해 설명되었다. 증류된 800 ml H2O 내에 8g의 NaCl, 0.2g의 KCl, 1.44g의 Na2HPO4·12H2O 및 0.24g의 KH2PO4를 용해한다. HCl에 의해 pH를 7.4로 조절하고 1 liter까지 H2O를 추가한다.
모세관 작용은 예를 들어, 표준 온도 및 압력에서의 상술한 PBS 용액들 중 임의의 하나의 사용시 또는 선택적으로 표준 온도 및 압력에서의 순수 물에 의한 모세관력들에 의한 충전에 의해 형성될 수 있다.
전체 혈액의 특정 양으로부터 적혈구들의 자동 판독가능한 단층을 생성하기 위해, 입구 채널들 및 분석 체임버들의 포멧 및 구성은 필수적이다. 입구 채널들 및 분석 채널들의 입구는 큰 백혈구들에 의해 쉽게 폐색된다. 모든 분석 체임버들의 총 입구 폭은 패색을 최소화하도록 커져야만 한다. 전체 혈액의 1 마이크로리터의 분석을 위해, 분석 체임버 입구의 최소 전체 폭은 적어도 110 mm이다(1 마이크로리터의 백혈구들의 수 x 직경 = 1.1 104 * 10 10-6 m = 110 mm).
입구 채널들 및 체임버들의 내부 표면들은 바람직하게는 친수성이다. 이는 장치를 제조하는 재료들의 선택에 의해 또는 플라즈마나 코로나 처리 같은 프로세스들에 의해 또는 친수성 코팅으로의 코팅에 의해 달성될 수 있다.
통기 채널들을 위한 서로맞물린 중공 수지부들의 다른 세트가 존재할 수 있다. 바람직하게는, 통기 채널들은 이들이 액체 정지부들을 형성할 수 있지만 가스의 관통 유동은 가능하게 하고, 액체 유동을 방지하거나 적어도 액체 유동의 해지테이션을 생성하도록 구성되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 통기 채널들의 표면은 소수성이 될 수 있거나, 통기 채널 폭은 유체 샘플을 속박하는 것 같이 급격하게 더 넓게 변할 수 있다. 분석 영역들은 상술한 수지부들 사이에 위치될 수 있다. 분석 영역들은 분석 시스템의 현미경의 시계에 비견할만한 치수들을 갖도록 배열될 수 있다.
도 1에서, 카트리지 형태의 장치의 일 예의 상면도가 도시되어 있으며, 도 2에는 동일한 예의 단면도가 있다. 특히, 도 1에 도시된 바와 같은 전체 분석 영역은 플라스틱 카트리지가 얇은 도말표본(㎛ 수준의)의 원하는 높이와 실질적으로 동일한 높이(간극)를 각각 갖는 작은 분석 영역들의 어레이를 갖도록 작은 기본적 분석 영역들로 분할된다. 일부 경우들에서, 작은 분석 영역은 시스템에 사용되는 현미경 같은 광학 검출기의 시계에 대응한다. 이런 분할은 특히 제조 동안 플라스틱 처리 변동의 문제점을 해결한다. 분석 체임버들 위 또는 아래의 재료들 중 적어도 하나는 광학적 검사 방법들을 가능하게 하도록 투과성이거나 광학적으로 투명한 것이 바람직하다.
또한, 도 1은 이후 더 상세히 설명될 바와 같이 특히 분석 영역들 사이의 밀봉 영역들(75)을 도시한다.
또한, 도 1은 충전 채널(25) 형태의 입구 채널, 통기 채널(35) 형태의 출구 채널 및 분석 영역(45) 형태의 실질적 평면형 분석 체임버의 특정 배열을 도시한다. 입구 채널들, 작은 분석 영역들 및 출구 채널(예로서, 통기 채널) 사이의 유체 연통이 이루어지며, 출구 채널의 높이는 작은 분석 영역들의 것보다 실질적으로 더 크다(입구 채널의 간극이 더 두꺼워지기 때문에, 그리고, 분석 영역의 얇은 간극에도 불구하고, 그 단면적이 작기 때문에 유동은 양호하다). 선택적으로, 유체의 도입을 위한 작은 샘플 포트가 존재할 수 있으며, 샘플 포트는 입구 채널들에 유체 연결되어 있다. 카트리지 내의 유체의 통상적 유동은 다양한 화살표들로 도 1에 예시되어 있다.
다른 실시예에서, 통기 채널(공기 압력 채널을 위한)은 실질적으로 혈액을 작은 분석 영역들 내에 보유하기 위한 수단을 포함한다(예로서, 각 분석 영역과 통기 채널의 계면에 작은 단차부의 사용). 본 발명의 다른 양태는 출구 채널들 또는 통기부들의 또는 그에 인접한 유체 정지부들의 도입이다.
특히, 도 3의 화살표들로 도시된 바와 같이 모든 방향들로 채널의 폭을 변경시키는 것 같이 채널 벽 내에 날카로운 전이부들을 도입시킴으로써, 액체와 벽의 접촉 라인은 각도가 급격히 변할 수 없기 때문에 절두형이 된다. 이는 소위 접촉선 속박이 이어지는 유체의 정체를 초래한다. 분리면은 표면에서 멈춰진다. 채널이 정방형이고 4개의 벽들을 갖는 경우, 이때, 확장은 동일 지점에서 모든 4개 벽들에서 이루어지며, 속박은 매우 안정적일 수 있다. 바람직하게는, 벽 전이부들은 각도 카운트를 증가시키며, 즉, 이들은 바람직하게는 단차식으로 팽창될 수 있다. 물의 유체 형 혈액에서, 물의 증발은 분리면에서 액체의 유리화에 의한 영구적 속박을 초래할 수 있다.
특정 경우들에서, 상술한 4개 방향 대신 2개 방향들로의 갑작스러운 확장은 속박 안정성을 위해 충분할 수 있다. 이는 특히 액체가 표면들을 강하게 습윤시키는 방식에 의존할 수 있다.
예로서, 엄격한 층 두께 공차를 갖는 적혈구들의 단층을 획득하기 위해 혈액 같은 유체 샘플로 신속하고 재현성있게 충전되도록 카트리지가 설계될 수 있다. 도 1의 실시예는 분석 영역들에 결합된 서로맞물린 입구 및 통기 채널들의 나무형 패턴을 갖는다. 이들 영역들은 필요한 간극 높이를 가지면서 스페이서들에 의해 분리되고, 이는 간극 높이의 설정 및 유동 방향의 제어를 돕는다. 분석 영역들은 이미지 분석 장비의 광학 필드를 정합시키고, 간극 변동을 제한하기 위한 최대 폭을 갖도록 배열될 수 있다. 스페이서들은 반전 구조체를 갖는 마스터로부터의 복제에 의해 생성될 수 있는 기판의 일체형 부분으로서 형성된다. 카트리지의 덮개는 사용되는 분석의 유형에 따라서, 필요시, 예로서, 하나 또는 다수의 시약들의 유형들로 내부 표면 상에 코팅될 수 있는 플라스틱 또는 유리의 평탄한 얇은 시트로 이루어질 수 있다. 기판 및 덮개는 예로서 레이저 또는 열적 결합에 의해 결합될 수 있다. 바람직하게는, 카트리지는 상부 덮개 부분과 하부 부분으로 이루어진다. 채널들 및 분석 체임버들은 하부 부분 내에 형성될 수 있고, 덮개 부분은 예를 들어, 접착, 용접, 음파 용접, 레이저 용접, 열적 결합 등에 의해 상단부에 밀봉된다. 바람직하게는, 덮개 부분은 하부 부분보다 더욱 유연하며, 그래서, 하부 부분의 분석 체임버들의 평탄도 및 치수 안정성은 상부 부분에 대한 연결에 의해 영향을 받지 않는다. 동일한 이유로, 체임버들의 높이가 덮개 부분의 분석 체임버들 내로의 처짐에 기인하여 온도 변화들에 따라 체임버들의 높이가 변하지 않도록 예를 들어, 25% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만의 편차의 유사한 열 팽창 계수들로 덮개 및 하부 부분이 이루어지는 것이 바람직하다.
입구 채널은 분기되어 있으며, 분석 영역보다 더 큰 채널 높이를 가진다. 입구 채널은 단일 샘플 입구 포트에 연결될 수 있다. 분석 영역들의 충전이 거의 동시에 시작되도록 분석 영역들의 신속한 충전을 가능하게 하기 위해 유동 저항이 낮다. 분석 영역들 내의 유동 경로는 5 ㎛ 같은 좁은 간극을 가질 수 있고, 바람직하게는 매우 짧으며, 이는 통기 채널까지의 완전하고 신속한 충전을 보증한다. 통기 채널은 단일 출구(폐기물 체임버)에 연결된다. 분석부로부터 통기 영역까지의 전이부에서 높이의 단차부에 기인하여, 모세관 작용이 감소하고 통기 채널이 충전되지 않기 때문에 혈액은 그곳에서 정지한다(적어도 모든 분석 영역들이 충전될 때까지는 그렇지 않음).
분석 영역의 치수는 이미징 광학장치의 필드에 관련될 수 있다(예를 들어, 적어도 하나의 에지가 필드 내에 있도록). 바람직하게는, 본 발명의 장치들이 빗살형 또는 프랙탈 충전 및 통기 채널들의 사용과 조합된 매우 많은 수의 체임버들을 갖는다. 본 발명의 실시예들에 따른 장치들은 많은 수의 체임버들을 갖는다. 양호한 실시예에서, 총 표면은 20 mm2이고, 시계는 0.2 x 0.2 = 0.04 mm2이며, 이는 500개 반응 체임버들을 의미한다. 본 발명의 실시예들 중 임의의 실시예를 위한 체임버들의 수는 100과 1000 체임버들 사이일 수 있다.
장치는 분석 체임버들 각각에 결합된 하나 이상의 추구 채널들을 갖는 출구 채널들의 패턴을 갖는다. 입구 및 출구 채널들의 패턴들은 각각 빗살 패턴을 포함할 수 있으며, 빗살 패턴들의 수지부들은 서로 맞물려지며, 분석 체임버들은 빗살 패턴들의 서로 맞물린 수지부들 사이에 배열되어 있다.
분석 시스템은 이미징 광학장치 및 이미지 분석 소프트웨어를 가질 수 있으며, 이는 분석 영역의 배향을 인지할 수 있고, 분석 동안 카트리지 및 이미징 접근법의 상대적 이동을 제어하기 위해 단차 제어부를 위한 제어 입력으로서 이를 사용한다. 특징부들은 분석 영역들을 분리시키는 벽들에 추가될 수 있거나 대안적으로, 특징부들은 총 카트리지에 관하여 분석 영역의 위치에 대한 정보를 제공하도록 분석 영역 내부에 존재할 수 있다. 이는 이미지 분석 소프트웨어에 의해 해석되는 코드 또는 심볼일 수 있다.
도 2, 단면도
채널들을 형성하는 기판 표면은 적어도 세 개의 서로 다른 레벨들, 즉, (i) 유체 샘플을 위한 입구 채널들의 레벨, (ii) 분석 영역들의 레벨 및 (iii) 분석 영역들 사이의 스페이서들을 위한 밀봉 영역을 가질 수 있다.
통기 영역은 입구의 것과 분석 영역의 것 사이의 레벨 또는 입구와 동일한 레벨을 가질 수 있다. 입구의 영역은 동일한 분석 영역들의 크기가 둘 사이의 연결부들로서 형성되도록 통기 구조체와 서로맞물린 일종의 빗살 구조로서 표현될 수 있다. 도 1은 서로맞물린 배열을 예시하기 위해 단지 작은 부분을 나타낸다. 이는 단지 지표이다. 더 많은 채널 분할은 전체 표면 영역을 효과적으로 덮도록 일종의 프랙탈 구조체로 설계될 수 있다. 분석 영역들은 밀봉 영역들에 의해 분리되어 있다. 분석부 및 밀봉 영역 사이의 단차부 높이는 분석 영역의 간극 높이를 형성한다. 개별 분석 영역들의 크기는 바람직하게는 0.01과 1 mm2 사이, 더욱 바람직하게는 0.03과 0.2 mm2 사이일 수 있다. 분석 영역 내의 간극 높이는 1과 10 ㎛ 사이, 더욱 바람직하게는 3과 6 ㎛ 사이일 수 있다. 바람직하게는, 총 분석 영역은 1과 500 mm2 사이, 더욱 바람직하게는 5와 250 mm2 사이이다.
밀봉 영역들은 바람직하게는 50과 500 ㎛ 사이의 폭을 갖는다.
충전 및 통기 채널들은 10 내지 200㎛, 바람직하게는 50 내지 100 ㎛의 깊이와, 50 내지 1000 ㎛, 더욱 바람직하게는 100 내지 300 ㎛의 폭을 갖는다.
기판 및 덮개를 위해 사용될 수 있는 재료들은 바람직하게는 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 사이클로-올레핀(코)폴리머, 폴리에스테르들, 폴리우레탄들 등 같은 폴리머들, 예를 들어, 투과성인, 특히, 광학적으로 투명한 폴리머들이다. 입구 채널들은 모세관 충전력들을 증가시키도록 접촉각을 감소시키도록 처리될 수 있으며, 분석 영역들은 세포 점착 및/또는 세포 착색을 개선시키도록 예비처리될 수 있다. 이런 처리는 플라즈마 또는 코로나 방전 또는 친수성 코팅으로의 코팅일 수 있다. 다른 한편, 본 발명의 양태는 가스 통기를 가능하게 하면서, 통기 채널들을 통해 액체가 방출되는 것을 방지하기 위한 유체 정지부의 도입이다. 통기 채널들은 유체 샘플에 의한 습윤을 회피하기 위해 바람직하게는 90도 이상까지 접촉 각도를 증가시키도록 예비처리될 수 있다. 이런 처리는 소수성 코팅을 사용한 코팅일 수 있다. 다른 방법은 유체 샘플의 분리면을 속박하기 위해 급작스럽게 모든 방향들로 출구 채널의 폭을 증가시키는 것이다.
덮개 및 기판은 레이저 용접 등 같은 결합 기술에 의해 영구적으로 결합될 수 있거나, 영구적 결합없이 각각과 바로 접촉될 수 있다. 접촉 영역들은 기판에 대한 덮개의 점착을 향상시키도록 예비처리될 수 있다. 바람직하게는, 결합시 기판의 치수 및 평탄도가 영향을 받지 않도록 덮개는 기판보다 더 유연할 수 있다.
혈액을 충전시키기 위한 도입 영역은 예를 들어, 관통 구멍 같은 샘플 포트를, 그리고, 선택적으로, 충전 이후 폐쇄될 수 있는 캡을 제공함으로써, 편리한 충전이 가능해지도록 설계될 수 있다. 시약들은 도입 영역에서 건조한 형태로 제공될 수 있다. 통기 채널의 단부에서, 혈액 같은 유체의 가능한 과도한 누설을 피하기 위해 폐기물 저장조가 포함될 수 있다.
도 5 및 도 6은 입구 채널들(25)과 분석 체임버들(45) 사이의 추가적 영역(55)을 포함하는 본 발명에 따른 카트리지를 도시하며, 이 구역의 높이는 입구 채널들(25)보다 작고, 분석 체임버들(45)보다 크다. 추가적 영역(55)의 높이는 바람직하게는 6 미크론 미만이다. 이 추가적 영역은 다수의 장점들을 갖는다. 혈액 내의 말라리아 기생충들의 검출을 가속시키기 위해서, 성숙한 말라리아 기생충들이 농후한, 카트리지 내의 추가적 영역이 생성된다.
특정 예로서, 성숙한 기생충을 갖는 적혈구들은 이들이 4 미크론 영역 내로는 쉽게 유동하는 반면 3 미크론보다 작은 분석 체임버에는 진입할 수 없다. 편차는 작지만, 추가적 스캔 영역을 에칭함으로써 쉽게 형성되며, 이에 대해서는 도 5 및 도 6의 개략도를 참조하라. 다른 경우에는 백혈구들이 또한 스캔 영역의 림에 농축되어 성숙한 기생충들을 방해하게 되기 때문에 이 추가적 영역은 바람직하다. 백혈구들은 4 미크론 간극에 진입하기에 너무 크고, 그래서, 성숙한 기생충을 갖는 두꺼운 적혈구들만이 이 영역에서 농후해진다.
양호한 실시예에서, 수지부 가시(finger prick)로부터 혈액을 신속하게 저장하기 위해 더 큰 혈액 용적의 체임버가 카트리지에 추가된다. 이 체임버가 충전되는 경우, 신뢰성있는 측정을 보증하기 위해 수지부 가시로부터 충분한 혈액이 취해진다. 또한, 더 큰 체적의 체임버가 카트리지 상에 추가적 채널들이 존재할 수 있다.
일반적으로, 염료들은 예를 들어 유기 용매들 내의 다이 용액으로 이들을 사전 충전함으로써 분석 체임버들에 추가될 수 있다. 이들 솔벤트들은 신속하게 증발하며, 분석 체임버들 내에 필요한 양의 건조한 염료들을 남긴다. 염료는 도입 생물학적 용액, 바람직하게는 혈액에 의해 (재)용해될 것이다.
카트리지를 위한 제조 단계들
구조화된 기판들은 사출 성형 또는 다른 복제 기술에 의해 제조될 수 있다. 포토리소그래피, 전해도금 및/또는 에칭의 도움으로 몰드가 제조될 때 마스터 구조체가 필요하다. 한가지 적절한 방법은 두 개의 리소그래픽 마스크들을 필요로 한다. 첫 번째 것은 분석 영역들을 위한 패턴을 포함한다. 제2 단계에서, 입구 및 통기 채널들의 채널 구조를 나타내는 마스크가 기판의 선택적 에칭을 위한 레지스트 패턴(예를 들어, 실리카)을 생성하기 위해 사용된다. 에칭 이후, 에칭 레지스트는 박리되며, 분석 영역들 상의 포토폴리머는 기판 상에 잔류된다. 이 방식에서, 세 개의 레벨들이 기판 상에 생성될 수 있다. 대안적 방법은 SU-8 같은 다층 레지스트들을 사용하는 것이다. 이 기판은 그후 예를 들어, 광학 디스크 제조시(예를 들어, DVD, CD-Rom 디스크들) 잘 정립되어 있는 방식으로 전해도금에 의해 금속, 예를 들어, Ni 심(shim) 내로 복사될 수 있다. 금속, 예를 들어, Ni 심은 그후 몰딩에 의한 플라스틱제 복제를 위해 몰드 내에서 삽입체로서 사용된다. 복제 방법은 마스터를 사용한 복제 방법에 의해 기판 또는 하부 부분을 제조하는 것과, 후속하는, 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 용접, 음파 용접, 레이저 용접, 접착, 열적 결합 등에 의해 덮개 층의 부착을 포함한다.
도 3, 분석 시스템
도 4는 상술한 장치를 포함하는 분석 시스템을 도시한다. 마이크로유체 부분들(130)은 도면의 하반부에 도시되어 있으며, 소프트웨어(50) 및 연산 하드웨어(60)는 상부 부분에 도시되어 있다. 마이크로유체 부분들은 제거가능한 카트리지의 형태일 수 있거나, 이들이 사용들 사이에서 세척제거되는 경우 시스템 내에 통합될 수 있다. 이 시스템은 분기 입구 채널들 및 분석 체임버들(110)에 대한 도입을 제어하기 위해 적어도 샘플 체임버(70)를 갖는다. 필요한 경우, 펌프들 같은 작동기들 또는 밸브들(80) 같은 선택적 아이템들이 제공될 수 있으며, 그러나, 분석 체임버들 내로의 유체 도입은 바람직하게는 모세관 작용에 의해 이루어진다. 용례에 따라서, 분석 영역들의 출구 채널들 이후 임의의 다른 스테이지들(120)이 포함될 수 있다. 필요에 따라 병렬로 다수의 평가들을 수행하기 위해 다수의 분석 영역들이 존재할 수 있다. 하나 이상의 평가들이 이루어질 수 있으며, 예로서, 다수의 체임버들이 하나의 평가를 위해 전용화될 수 있고, 모든 체임버들이 하나의 평가를 위해 전용화될 수 있거나 다수의 평가들이 병렬로 이루어질 수 있다. 예를 들어 착색제 같은 적절한 시약들이 분석 체임버들 내에 예비설치될 수 있다. 광학 검출기(100)는 분석 체임버들을 관찰하고, 통상적으로, 디스플레이 스크린(55)을 통해 사용자에게 인지되도록 샘플의 특성들을 결정하기 위해 이미지의 분석을 위한 소프트웨어(50)의 부분(40)에 이미지 신호를 공급한다.
또한, 소프트웨어 부분들은 분석 부분(40)을 제어하고 유동 제어 부분(30)을 제어하기 위한 제어기(10)를 포함한다. 유동 제어 부분은 샘플들의 공급을 제어하기 위해 밸브들 또는 펌프들을 제어한다. 선택적으로, 제어기는 카트리지와 검출기의 상대적 위치를 이동시키기 위해 위치 조절기(65)에 결합될 수 있다. 선택적으로, 제어기는 샘플들을 위한 환경 제어기(20)에 결합될 수 있다. 소프트웨어의 다른 부분들은 사용자 인터페이스 및 결과들의 추가적 분석을 제공하도록 배열될 수 있다. 모든 소프트웨어는 종래의 프로그래밍 언어들을 사용할 수 있으며, 범용 목적 마이크로프로세서, 퍼스널 컴퓨터 또는 다른 하드웨어 같은 종래의 연산 하드웨어(60) 상에서 구동될 수 있다.
제어기는 임의의 적절한 제어기 또는 마이크로제어기일 수 있으며, 예를 들어, FPGA 같은 마이크로프로세서 또는 프로그램가능한 로직 장치를 포함할 수 있다.
실시예 :
본 발명에 따른 장치는 본 실시예에 설명되어 있다. 장치는 55 mm의 길이를 갖는 하나의 입구 채널 및 이 채널을 따른 55 mm의 폭과 4 mm의 길이의 두 개의 분석 체임버들을 포함할 수 있다. 두 번째 고려되는 더 축약적인 접근법은 28 mm 길이의 둘 또는 세 개의 입구 채널들과 네 개의 분석 체임버들을 갖는 것이다. 각 체임버는 28 mm 폭 입구를 가지며, 4 mm 길이로 이루어진다. 충전 시간은 입구 채널들에 혈액을 공급하는 채널의 길이 및 입구 채널들의 충전 특성들에 의존한다. 이들 큰 입구 폭들 및 단지 4 mm의 길이를 갖는 분석 체임버는 수초 미만으로 매우 신속하게 충전된다. 1 mm 폭, 28 mm 길이 및 18 마이크로미터 간극의 입구 채널을 단지 모세관력 및 30 mm의 공급 채널로 충전하기 위해 필요한 시간은 13초이며, 이는 1분 미만의 충전 시간의 요건을 충족한다. 모든 입구 채널들이 가능한 작아지게 하는 것이 가장 유익하며, 이는 수지부 가시로부터 필요한 총 혈액 양을 최소화하기 때문이다.
원형들을 갖는 실시예들은 본 발명에 따른 장치들이 전체 혈액으로 40 초 이내에 충전된다는 것을 보여준다.
용례들:
용례들은 말라리아 진단, HIV, HCV, FBC 등 같은 적어도 세포-기반 진단들을 포함할 수 있다. 세포 기반이라는 것은 세포들이 유체 샘플들 내에 존재한다는 것을 의미한다. 그러나, 본 발명의 실시예들의 방법들 중 어떤 것도 진단 방법의 일부로서 세포들의 양태들을 식별하는 진단 방법에 한정되지 않는다. 예로서, 적혈구들은 DNA 또는 RNA를 포함하지 않으며, 따라서, 혈액 샘플 내의 DNA 또는 RNA 중어느 하나를 검출하는 것은 본 발명에 따른 진단 테스트이고, 그 이유는 DNA 또는 RNA를 검출하는 것은 혈액 샘플 내의 이물질이 존재할 수 있다는 것을 나타내기 때문이다. 장치는 급속 분배 테스트를 위한 카트리지들의 형태일 수 있다. 장치는 바이오센서의 일부나 임의의 다른 유형의 의료 진단 장치를 형성할 수 있다. 청구범위 내에서 다른 용례들, 변형들 및 추가들이 안출될 수 있다.

Claims (15)

  1. 세포들을 포함하는 유체의 층들을 제조하기 위한 장치에 있어서,
    각 층은 분석을 위한 세포들의 단층을 가지고, 상기 장치는 분석 체임버들(45)의 이차원 어레이와, 상기 분석 체임버들이 병렬로 충전될 수 있게 하도록 상기 어레이 내의 상기 분석 체임버들 각각에 결합되는 입구 채널들(25)의 분기부 패턴을 가지며, 상기 분석 체임버들 각각은 세포들을 포함하는 유체의 층들을 생성하도록 상기 입구 채널들의 높이보다 작은 높이를 갖는 실질적 평면형 형상을 가지고, 각 층은 상기 체임버들이 유체 샘플로 충전될 때 세포들의 단층을 갖고,
    상기 분석 체임버들 각각의 총 면적은 100 내지 2000 ㎟이거나, 또는 상기 분석 체임버들의 높이는 1 내지 10 ㎛이거나, 또는 상기 분석 체임버들 각각의 총 면적은 100 내지 2000 ㎟이며 상기 분석 체임버들의 높이는 1 내지 10 ㎛이고,
    상기 입구 채널들은 10 내지 200 ㎛의 깊이와 50 내지 1000 ㎛의 폭을 갖고,
    상기 장치는 상기 분석 체임버들의 어레이에 결합되는 통기 채널들의 패턴을 추가로 포함하고, 상기 통기 채널과 상기 분석 체임버 사이의 전이부는 접촉선 속박(contact line pinning)에 의해 상기 통기 채널을 통한 액체의 유동을 정지시키지만 가스는 통과할 수 있게 하는 액체 정지부를 제공하도록 배열되는, 세포들을 포함하는 유체의 층들을 제조하기 위한 장치.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 입구 채널들(25)과 분석 체임버들(45) 사이에 추가적 영역(55)을 더 포함하고, 상기 영역의 높이는 상기 입구 채널들(25)보다 작고 상기 분석 체임버들(45)보다 큰, 세포들을 포함하는 유체의 층들을 제조하기 위한 장치.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 추가적 영역(55)의 높이는 6 미크론 미만인, 세포들을 포함하는 유체의 층들을 제조하기 위한 장치.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입구 및 통기 채널들의 패턴들 각각은 빗살 패턴을 포함하고, 상기 빗살 패턴들의 수지부들(fingers)은 서로 맞물려지고, 상기 분석 체임버들은 상기 빗살 패턴들의 상기 서로 맞물린 수지부들 사이에 배열되는, 세포들을 포함하는 유체의 층들을 제조하기 위한 장치.
  7. 분석 체임버들(45)의 이차원 어레이와, 상기 분석 체임버들이 병렬로 충전될 수 있게 하도록 상기 어레이 내의 상기 분석 체임버들 각각에 결합되는 입구 채널들(25)의 분기부 패턴을 갖는 장치를 사용하여, 분석을 위해 세포들의 단층을 각각 가지는, 세포들을 포함하는 유체의 층들을 제조하는 방법에 있어서,
    상기 분석 체임버들 각각은 세포들을 포함하는 상기 유체의 층들을 생성하도록 상기 입구 채널들의 높이보다 작은 높이를 갖는 실질적 평면형 형상을 가지고, 각 층은 상기 체임버들이 유체 샘플로 충전될 때 세포들의 단층을 가지며,
    상기 분석 체임버들 각각의 총 면적은 100 내지 2000 ㎟이거나, 또는 상기 분석 체임버들의 높이는 1 내지 10 ㎛이거나, 또는 상기 분석 체임버들 각각의 총 면적은 100 내지 2000 ㎟이며 상기 분석 체임버들의 높이는 1 내지 10 ㎛이고,
    상기 입구 채널들은 10 내지 200 ㎛의 깊이와 50 내지 1000 ㎛의 폭을 갖고,
    상기 방법은 상기 유체 샘플을 제공하는 단계와, 상기 유체 샘플을 상기 입구 채널들의 패턴에 공급하여 상기 유체 샘플이 상기 분석 체임버들을 충전하게 하는 단계를 갖고,
    상기 장치는 상기 분석 체임버들의 어레이에 결합되는 통기 채널들의 패턴을 추가로 포함하고, 상기 통기 채널과 상기 분석 체임버 사이의 전이부는 접촉선 속박에 의해 상기 통기 채널을 통한 액체의 유동을 정지시키지만 가스는 통과할 수 있게 하는 액체 정지부를 제공하도록 배열되는, 세포들을 포함하는 유체의 층들을 제조하는 방법.
  8. 분석을 위해 세포들의 단층을 각각 가지는, 세포들을 포함하는 유체의 층들을 생성하기 위한 장치를 제조하는 방법에 있어서,
    상기 방법은 분석 체임버들(45)의 이차원 어레이를 형성하는 단계 및 상기 분석 체임버들이 병렬로 충전될 수 있게 하도록 상기 어레이 내의 상기 분석 체임버들 각각에 결합되는 입구 채널들(25)의 분기부 패턴을 형성하는 단계를 가지며,
    상기 분석 체임버들은 상기 입구 채널들의 높이보다 작은 높이를 갖는 실질적 평면형 형상을 갖도록 형성되고,
    상기 분석 체임버들 각각의 총 면적은 100 내지 2000 ㎟이거나, 또는 상기 분석 체임버들의 높이는 1 내지 10 ㎛이거나, 또는 상기 분석 체임버들 각각의 총 면적은 100 내지 2000 ㎟이며 상기 분석 체임버들의 높이는 1 내지 10 ㎛이고,
    상기 입구 채널들은 10 내지 200 ㎛의 깊이와 50 내지 1000 ㎛의 폭을 갖고,
    상기 방법은 상기 분석 체임버들의 어레이에 결합되는 통기 채널들의 패턴을 형성하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 통기 채널과 상기 분석 체임버 사이의 전이부는 접촉선 속박에 의해 상기 통기 채널을 통한 액체의 유동을 정지시키지만 가스는 통과할 수 있게 하는 액체 정지부를 제공하도록 배열되는, 세포들을 포함하는 유체의 층들을 생성하기 위한 장치를 제조하는 방법.
  9. 세포들의 단층을 각각 가지는, 세포들을 포함하는 유체의 층들을 분석하기 위한 광학 검출기(10, 100, 40)와, 세포들의 단층을 각각 가지는, 세포들을 포함하는 유체의 층들을 생성하기 위한 장치(110)를 포함하는 분석 시스템에 있어서,
    상기 장치는 분석 체임버들(45)의 이차원 어레이와, 상기 분석 체임버들이 병렬로 충전될 수 있게 하도록 상기 어레이 내의 상기 분석 체임버들 각각에 결합되는 입구 채널들(25)의 분기부 패턴을 가지며, 상기 분석 체임버들 각각은 상기 분석 체임버들이 유체 샘플로 충전될 때 세포들의 단층을 각각 갖는, 세포들을 포함하는 유체의 층들을 생성하도록 상기 입구 채널들의 높이보다 작은 높이를 갖는 실질적 평면형 형상을 갖고,
    상기 분석 체임버들 각각의 총 면적은 100 내지 2000 ㎟이거나, 또는 상기 분석 체임버들의 높이는 1 내지 10 ㎛이거나, 또는 상기 분석 체임버들 각각의 총 면적은 100 내지 2000 ㎟이며 상기 분석 체임버들의 높이는 1 내지 10 ㎛이고,
    상기 입구 채널들은 10 내지 200 ㎛의 깊이와 50 내지 1000 ㎛의 폭을 갖고,
    상기 장치는 상기 분석 체임버들의 어레이에 결합되는 통기 채널들의 패턴을 추가로 포함하고, 상기 통기 채널과 상기 분석 체임버 사이의 전이부는 접촉선 속박에 의해 상기 통기 채널을 통한 액체의 유동을 정지시키지만 가스는 통과할 수 있게 하는 액체 정지부를 제공하도록 배열되는, 분석 시스템.
  10. 삭제
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 입구 및 통기 채널들의 패턴들 각각은 빗살 패턴을 포함하고, 상기 빗살 패턴들의 수지부들은 서로 맞물려지며, 상기 분석 체임버들은 상기 빗살 패턴들의 상기 서로 맞물린 수지부들 사이에 배열되는, 분석 시스템.
  12. 제 9 항 또는 제 11 항에 있어서,
    상기 분석 체임버들 각각의 면적은 0.02와 1 ㎟ 사이인 것;
    상기 분석 체임버들의 높이는 1과 10 ㎛ 사이인 것; 및
    상기 입구 채널들은 10 내지 200 ㎛의 깊이와 50 내지 1000 ㎛의 폭을 갖는 것;
    중 하나 이상을 특징으로 하는 분석 시스템.
  13. 분석 체임버들(45)의 이차원 어레이와, 상기 분석 체임버들이 병렬로 충전될 수 있게 하도록 상기 어레이 내의 상기 분석 체임버들 각각에 결합되는 입구 채널들(25)의 분기부 패턴을 가지는 장치를 사용하여 제조되고, 세포들의 단층을 각각 가지는, 세포들을 포함하는 유체의 층들을 분석하는 방법에 있어서,
    상기 분석 체임버들 각각은 세포들을 포함하는 유체의 층들을 생성하도록 상기 입구 채널들의 높이보다 작은 높이를 갖는 실질적 평면형 형상을 가지며, 각 층은 상기 분석 체임버들이 유체 샘플로 충전될 때 세포들의 단층을 가지고,
    상기 분석 체임버들 각각의 총 면적은 100 내지 2000 ㎟이거나, 또는 상기 분석 체임버들의 높이는 1 내지 10 ㎛이거나, 또는 상기 분석 체임버들 각각의 총 면적은 100 내지 2000 ㎟이며 상기 분석 체임버들의 높이는 1 내지 10 ㎛이고,
    상기 입구 채널들은 10 내지 200 ㎛의 깊이와 50 내지 1000 ㎛의 폭을 갖고,
    상기 방법은 광학 검출기(10, 100, 40)를 제공하는 단계와, 상기 광학 검출기를 사용하여 상기 분석 체임버들 내에서 세포들을 포함하는 유체의 층들을 분석하는 단계를 가지고, 각 층은 세포들의 단층을 가지며,
    상기 방법은 상기 분석 체임버들의 어레이에 결합되는 통기 채널들의 패턴을 형성하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 통기 채널과 상기 분석 체임버 사이의 전이부는 접촉선 속박에 의해 상기 통기 채널을 통한 액체의 유동을 정지시키지만 가스는 통과할 수 있게 하는 액체 정지부를 제공하도록 배열되는, 세포들을 포함하는 유체의 층들을 분석하는 방법.
  14. 삭제
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