CN102382054A - 吡唑、异噁唑衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吡唑、异噁唑衍生物及其制备方法和应用，本发明公开的吡唑、异噁唑衍生物，存活性较高、特异性较强，为临床提供新的男性避孕后选药物，有较大的应用价值。所述吡唑、异噁唑衍生物，为具有结构通式I所示化合物。
Description
技术领域
本发明涉及药物化合物，具体涉及吡唑、异噁唑衍生物及其制备方法和应用。尤其涉及5-(4-取代芳基酰胺)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯类和5-(4-取代芳基酰胺)-异噁唑-3-甲酸乙酯类化合物及其合成和应用。
背景技术
目前临床上常用的避孕方法主要为甾体类避孕药物、避孕器具、外科手术阻断输卵管或输精管、外用避孕药具等。多年来应用最多的是女性使用的激素类避孕药，这类药物会干扰妇女正常的生理机能，副作用较多，而目前男性可用的避孕方法除避孕套和输精管结扎术外几乎没有其他有效的避孕手段。因此需加快男性抗生育药物的研发，以使男性、女性共同承担避孕的责任。
顶体酶是顶体反应后精子顶体释放的关键酶之一，不但能间接影响精子活力，促进精子运动，还能水解透明带，便于精卵结合受孕。顶体酶在受精过程中起到分散顶体基质以及作为次级配体维持精子结合在卵透明带上进行顶体反应的作用，因而抑制顶体酶可以达到避孕的目的。人精子顶体酶是目前公认的男性抗生育药物新作用靶点之一。
2005年G.Gupta等在《人类生殖学杂志》上报道了一种顶体酶抑制剂，但是，该文献报导的技术，存在活性较低、特异性不强等缺陷。
发明内容
本发明的目的是公开一种吡唑、异噁唑衍生物及其制备方法和应用，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足临床应用的需要。
本发明人通过同源模建的方法首次构建了人顶体酶的三维蛋白结构，又采用多拷贝同时搜寻(MCSS)方法进一步深入分析人顶体酶活性位点的空间特征、关键立场和关键功能残基的分布，确定重要的药物结合位点，在此基础上，基于人顶体酶活性位点设计合成了吡唑、异噁唑衍生物，具体为5-(4-取代芳基酰胺)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯类和5-(4-取代芳基酰胺)-异噁唑-3-甲酸乙酯类化合物。
本发明提供的吡唑、异噁唑衍生物，为具有结构通式I所示化合物：
其中：
X为NH或O；
R代表取代的或未取代的C1-4直链烷基、C1-4支链烷基、CF3、C3-4羧酸基、苄基、苯基、取代苯基、
对甲苯磺酸基或2-苯基丁基；
所述的取代苯基，其中，苯环上有1到2个取代基团，取代基团位于苯环的邻、间或对位，所述取代基团为除了碘以外的卤素、C1-2直链烷基、硝基、氯取代的C1～C2的烷基、三氟甲基或甲氧基；
优选的，R代表的取代苯基为：
4-氟苯基、2，6-二氟苯基、2-氯苯基、4-氯苯基、2，4-二氯苯基、2，6-二氯苯基、2-溴苯基、4-甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-氯甲基苯基、苯乙基、4-甲基苯磺基、2-苯基正丁基，3-氟苯基、2，5-二硝基苯基、4-乙基苯基、3-三氟甲基苯基、4-溴苯基、3-氯苯基或3-甲基苯基；
优选的，R代表的取代的C1-4直链烷基为CF3；
一种吡唑衍生物，为具有结构通式II所示化合物：
R代表C1-4直链烷基、C3-4直链羧酸基、CF3、对甲苯磺酸基、苄基、2-苯基丁基、取代苯基或苯基；
所述的取代苯基，其中，苯环上有1到2个取代基团，取代基团位于苯环的邻、间或对位，所述取代基团为除了碘以外的卤素、C1-2直链烷基、氯取代的C1～C3的烷基或甲氧基；
取代苯基为：4-氟苯基、2，6-二氟苯基、2-氯苯基、4-氯苯基、2，4-二氯苯基、2，6-二氯苯基、2-溴苯基、4-甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-氯甲基苯基、苯乙基、4-甲基苯磺基、2-苯基正丁基。
一种异噁唑衍生物，为具有结构通式III所示化合物：
其中：
R代表C1-4直链烷基、苄基、取代苯基或苯基；
所述的取代苯基，其中，苯环上有1到2个取代基团，取代基团位于苯环的邻、间或对位，所述取代基团为除了碘以外的卤素、C1-2直链烷基、硝基、三氟甲基、甲氧基或氯甲基；
优选的，所述的取代苯基为3-氟苯基、4-氟苯基、2-氯苯基、2，4-二氯苯基、4-甲氧基苯基、2，5-二硝基苯基、4-乙基苯基、苯乙基、4-氯苯基、4-氯甲基苯基、3-三氟甲基苯基、4-溴苯基、3-氯苯基或3-甲基苯基；
优选的，所述的吡唑、异噁唑衍生物为：
(II)类化合物
代号II-1：5-(4-乙酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-2：5-(4-丙酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-3：5-(4-丁酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-4：5-(4-戊酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-5：5-(4-三氟乙酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-6：5-(4-正丁酸基酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-7：5-(4-戊酸基酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-8：5-(4-苯甲酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-9：5-(4-(4-氟苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-10：5-(4-(2，6-二氟苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-11：5-(4-(2-氯苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-12：5-(4-(4-氯苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-13：5-(4-(2，4-二氯苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-14：5-(4-(2，6-二氯苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-15：5-(4-(2-溴苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-16：5-(4-(4-甲基苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-17：5-(4-(4-甲氧基苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-18：5-(4-(4-氯甲基苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-19：5-(4-(苯乙酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-20：5-(4-(2-苯基丁酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-21：5-(4-(4-甲基苯磺酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
(III)类化合物
代号III-1：5-(4-(3-氟苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-2：5-(4-(4-氟苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-3：5-(4-(2-氯苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-4：5-(4-(2，4-二氯苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-5：5-(4-(4-甲氧基苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-6：5-(4-(2，5-二硝基苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-7：5-(4-(4-乙基苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-8：5-(4-苯乙酰胺苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-9：5-(4-甲酰胺苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-10：5-(4-正丁酰胺苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-11：5-(4-苯甲酰胺苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-12：5-(4-(4-氯苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-13：5-(4-(4-氯甲基苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-14：5-(4-(3-三氟甲基苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-15：5-(4-(4-溴苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-16：5-(4-(3-氯苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯或
代号III-17：5-(4-(3-甲基苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯；
结构式如表1和表2。
表1 5-(4-取代芳基酰胺)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(II)类化合物
表2 5-(4-取代芳基酰胺)-异噁唑-3-甲酸乙酯(III)类化合物
本发明的所述的吡唑、异噁唑衍生物的制备方法，包括如下步骤：
以4-硝基苯乙酮为起始原料，与草酸二乙酯发生Claisn酯缩合反应得到2，再与水合肼发生关环反应得到3，经氯化亚锡还原得到4，最后与各类取代酰氯或酸酐反应得到吡唑类化合物II；
或将得到的中间体2与盐酸羟胺发生关环反应得到3’，经氯化亚锡还原得到4’，最后与各类取代酰氯或酸酐反应得到异噁唑类化合物III。
具体的，包括如下步骤：
(1)4-(4-硝基)苯基-2，4-二氧-丁酸乙酯(中间体2)的制备
在乙醇钠溶液中，加入对硝基苯乙酮，溶解后，加入草酸二乙酯室温反应5～7小时，加入醋酸调pH至5～7，抽滤，得中间体2；
所述乙醇钠溶液中，金属钠的含量为0.5～0.7g/100ml；对硝基苯乙酮的含量为2～3g/100ml；
草酸二乙酯与对硝基苯乙酮的摩尔比1∶1；
(2)5-(4-硝基苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(中间体3)的制备
将等摩尔的中间体2和水合肼加入400～500ml无水乙醇中，回流反应4～5小时，过滤收集中间体3；
无水乙醇中，中间体2的含量0.008～0.01摩尔/100ml；
(3)5-(4-氨基苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(中间体4)的制备
将中间体3、SnCl2.2H2O和无水乙醇溶于乙酸乙酯中，回流反应5～6小时，在冰浴条件下，于上述反应液中加入碳酸钾水溶液，反应1～2小时，静置，倒出上清液，浓缩柱层析得中间体4
中间体3、SnCl2.2H2O和无水乙醇的摩尔比(1∶4∶6)；
碳酸钾水溶液30％-40％，碳酸钾与SnCl2.2H2O的质量比为2～3；
(4)目标化合物的制备
将中间体4加入乙酸乙酯中，溶解，加入三乙胺，于冰浴条件下，滴加酰氯反应5～6小时，然后从反应产物中收集目标化合物；
乙酸乙酯中，中间体4的含量为0.02～0.04g/ml；
三乙胺与中间体4的摩尔比为1.5∶1；
酰氯与中间体的摩尔比为1∶1；
所述的酰氯包括正丁酰氯、正戊酰氯、苯甲酰氯、对氟苯甲酰氯、2，6-二氟苯甲酰氯、2-氯苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯、2，4-二氯苯甲酰氯、2，6-二氯苯甲酰氯、2-溴苯甲酰氯、4-甲基苯甲酰氯、4-甲氧基苯甲酰氯、4-氯甲基苯甲酰氯、苯乙酰氯、2-苯基丁酰氯或对甲苯磺酰氯；
采用上述的方法，可获得(II)类化合物，反应通式如下：
或包括如下步骤：
(1)4-(4-硝基)苯基-2，4-二氧-丁酸乙酯(中间体2)的制备
在乙醇钠溶液中加入，加入对硝基苯乙酮，溶解后，加入草酸二乙酯室温反应5～7小时，加入醋酸调pH至5～7，抽滤，得中间体2；
所述乙醇钠溶液中，金属钠的含量为0.5～0.7g/100mL；对硝基苯乙酮的含量为2～3g/100ml；
草酸二乙酯与对硝基苯乙酮的摩尔比1∶1；
(2)5-(4-硝基苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯(中间体3’)的合成：
将等摩尔的中间体2和盐酸羟胺加入无水乙醇中，回流反应6～7小时，过滤收集中间体3’；
无水乙醇中，中间体2的含量0.008～0.01摩尔/100ml；
(3)5-(4-氨基苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯(中间体4’)的合成
将中间体3’、SnCl2.2H2O和无水乙醇溶于乙酸乙酯中，回流反应6～8小时，在冰浴条件下，于上述反应液中加入碳酸钾水溶液反应1～2小时，然后从反应产物中收集中间体4’；
中间体3’、SnCl2.2H2O和无水乙醇的摩尔比为1∶4∶6；
碳酸钾水溶液30％-40％g/mL，碳酸钾与SnCl2.2H2O的质量比为2～3；
(4)目标化合物5-(4-取代芳基酰胺)-异噁唑-3-甲酸乙酯类化合物的合成
将化合物4’加入到乙酸乙酯溶液中，室温溶解，加入三乙胺，于冰浴条件下，滴加酰氯反应5～6小时，然后从反应产物中收集目标化合物；
乙酸乙酯中，中间体4的含量0.02～0.04g/ml；
三乙胺与中间体4的摩尔比为1.5∶1；
酰氯与中间体的摩尔比为1∶1；
所述的酰氯包括正丁酰氯、正戊酰氯、苯甲酰氯、对氟苯甲酰氯、2，6-二氟苯甲酰氯、2-氯苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯、2，4-二氯苯甲酰氯、2，6-二氯苯甲酰氯、2-溴苯甲酰氯、4-甲基苯甲酰氯、4-甲氧基苯甲酰氯、4-氯甲基苯甲酰氯、苯乙酰氯、2-苯基丁酰氯或对甲苯磺酰氯。
采用上述的方法，可获得III化合物，反应通式如下：
本发明人通过测试5-(4-取代芳基酰胺)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯类化合物和5-(4-取代芳基酰胺)-异噁唑-3-甲酸乙酯类化合物的生物体外抑制人精子顶体酶活性，通过改良的Kennedy法检测残余酶活性，并与经典的顶体酶抑制剂TLCK作比较。结果表明，本发明的II、III类化合物人精子顶体酶抑制活性均高于TLCK，其中结构通式II中化合物11、13、15、17、21，结构通式III中的化合物2、3、6、13、15具有较强抑制人精子顶体酶活性。因此，本发明的化合物可用于制备抗生育药物。
本发明还涉及一种组合物，包括抗生育有效量的所述的吡唑、异噁唑衍生物和医药学上可接受的载体，所述的载体如香料、甜味剂、液体或固体填料或稀释剂等常用载体物质，并采用本领域公知的方法，制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、粘胶剂、悬浮剂或针剂，制剂通常含有重量百分比为1-70％的有效成分，较佳重量含量为5-50％；
本发明的吡唑、异噁唑衍生物，可经口服或静脉注射或阴道给药，施加于需要抗生育的患者，剂量一般为0.02～0.05mg/kg体重天，具体可根据患者的年龄等，具体由医师决定。
本发明首次公开和合成了吡唑、异噁唑衍生物，存活性较高、特异性较强，为临床提供新的男性避孕后选药物，有较大的应用价值。
具体实施方式
实施例1～5
5-(4-取代芳基酰胺)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯II类化合物(化合物II-1)的合成；
(1)4-(4-硝基)苯基-2，4-二氧-丁酸乙酯(中间体2)的合成
在干燥的反应瓶中，加入400mL无水乙醇和2.3g金属钠制得乙醇钠溶液。于乙醇钠溶液中加入8.3g对硝基苯乙酮，室温搅拌至固体全溶后加入15.74g草酸二乙酯，反应6小时，，加入醋酸调至PH为6.5，抽滤得黄色固体，为中间体2，烘干得11.7g；
(2)5-(4-硝基苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(中间体3)的合成
中间体2(11.7g，0.044mol)和重量浓度为85％的水合肼(2.6mL，0.044mol)加入400无水乙醇溶液中，回流反应6小时，静置，过滤得中间体3，共8.6g；
(3)5-(4-氨基苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(中间体4)的合成
将中间体3(8.6g)、SnCl2.2H2O(29.7g)和无水乙醇(15mL)溶于400mL乙酸乙酯中，回流反应8小时，在冰浴条件下，于上述反应液中加入90g重量浓度为30％的碳酸钾水溶液，反应1.5小时，静置，倒出上清液，浓缩重结晶得黄色块状固体4(4.2g)。
(4)目标化合物5-(4-乙酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(1-1)的合成
将化合物4(0.58g，0.0025mol)加入到20mL(0.2mol)的乙酸酐中，回流3h，有固体析出，过滤，水洗，甲醇重结晶得白色固体0.37g。
化合物II-2，II-5，II-6，II-7按上述步骤合成制得，仅步骤(4)中用不同的酸酐，酸酐分别为丙酸酐、三氟醋酐、丁二酸酐和戊二酸酐。
实施例6～16
化合物II-8的制备：
中间体2-4均按实施例1中的(1)-(3)步骤制备获得，不同的是步骤(4)；
(4)目标化合物5-(4-苯甲酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(II-8)的合成
将化合物4(0.58g，2.5mol)加入到50mL无水处理后的乙酸乙酯溶液中，室温搅拌至固体全溶后加入1.5g三乙胺，于冰浴条件下滴加苯甲酰氯(2.5mol)反应6小时后，水洗，甲醇重结晶得白色固体0.25g。
本发明5-(4-取代芳基酰胺)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯类化合物中，II-3、II-4、II-8、II-9至II-21，均按照上述方式制备，仅步骤(4)中用不同的酰氯，酰氯分别为正丁酰氯、正戊酰氯、苯甲酰氯、对氟苯甲酰氯、2，6-二氟苯甲酰氯、2-氯苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯、2，4-二氯苯甲酰氯、2，6-二氯苯甲酰氯、2-溴苯甲酰氯、4-甲基苯甲酰氯、4-甲氧基苯甲酰氯、4-氯甲基苯甲酰氯、苯乙酰氯、2-苯基丁酰氯或对甲苯磺酰氯。
实施例17～33
5-(4-取代芳基酰胺)-异噁唑-3-甲酸乙酯III类化合物(III-1)的合成：
(1)4-(4-硝基)苯基-2，4-二氧-丁酸乙酯(中间体2)的合成
在干燥的反应瓶中，加入400mL无水乙醇和2.3g金属钠制得乙醇钠溶液。于乙醇钠溶液中加入8.3g对硝基苯乙酮，室温搅拌至固体全溶后加入15.74g草酸二乙酯，反应6小时，加入醋酸调至PH为6，抽滤得黄色固体，为中间体2，烘干得11.7g；
(2)5-(4-硝基苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(中间体31)的合成
中间体2(11.7g，0.044mol)和盐酸羟胺(3.1g，0.044mol)加入400mL无水乙醇中，回流反应6小时，过滤得中间体3’(7.2g)；
(3)5-(4-氨基苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(中间体4’)的合成
中间体3’(7.2g)、SnCl2.2H2O(24.5g)和无水乙醇(15mL)溶于400mL乙酸乙酯中，回流反应6小时，在冰浴条件下，于上述反应液中加入78g的重量浓度为31.2％的碳酸钾水溶液反应1.5小时，静置，倒出上清液，浓缩重结晶，中间体4’(2.6g)。
(4)目标物5-(4-(3-氟苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯(III-1)的合成
将中间体4’(0.58g，2.5mol)加入到50mL乙酸乙酯中，室温搅拌至固体全溶后，加入1.5g三乙胺，于冰浴条件下滴加3-氟苯甲酰氯(2.5mol)反应6小时，水洗，甲醇重结晶得白色固体0.36g。
III-1：白色固体；mp：176.4-177.1；1H NMR(DMSO，300MHz)δ：1.33(t，J＝6.9Hz，3H)，4.37(q，J＝6.9Hz，2H)，7.41(s，1H)，7.46-7.47(m，1H)，7.59-7.62(m，1H)，7.76-7.83(m，2H)，7.96(m，4H)，10.58(s，1H).MS：353.34[M-H]-
本发明中，化合物III1～III8，III10～III17均按上述方法，所述酰氯为间氟苯甲酰氯，对氟苯甲酰氯，磷氯苯甲酰氯，2，4-二氯苯甲酰氯，4-甲氧基苯甲酰氯，2，5-二硝基苯甲酰氯，4-乙基苯甲酰氯，苯乙酰氯，苯甲酰氯，4-氯苯甲酰氯，4-氯甲基苯甲酰氯，3-三氟甲基苯甲酰氯，4-溴苯甲酰氯，3-氯苯甲酰氯，3-甲基苯甲酰氯。其不同之处在于：III-9在第四步反应，将中间体4’(0.58g，2.5mol)加入到加入到20mL(0.2mol)的乙酸酐中，回流3h，有固体析出，过滤，水洗，甲醇重结晶得白色固体0.29g
表3化合物II-1～II-21的熔点和质谱
表4II-1～II-21的1H NMR数据
表5化合物III-1～III-17的熔点、质谱数据
表6化合物III-1～III-21的1H NMR数据
实施例34
抗生育活性试验
1、试验目的：测试本发明II类、III类化合物体外抑制人精子顶体酶活性。
2、检测原理
人精子顶体酶是受精过程中必不可少的蛋白水解酶，抑制该酶活性可达到避孕目的。
16个不同浓度的本发明II类、III类化合物与具有生育活性人精子作用，以N-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基苯甲酰胺盐(BAPNA)为底物，与去精子释放的顶体酶反应，显色，得到与不同浓度化合物作用后的顶体酶的活性值。并与公认的顶体酶抑制剂TLCK(N-tosy-L-lysine chloromethyl ketone)进行比较评价。
3、检测材料与仪器
精子顶体酶试剂盒购自江苏省南京欣迪生物药业工程有限公司。
试剂盒包括：分离剂、顶体酶激活剂、抑制剂、反应底物剂；
N-甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)购自Fluka公司；
人精子经医学伦理委员讨论通过，在知情同意情况下，采自健康一生育男性。由长海医院生殖医学中心提供，并提供分析检测报告；
精子、微生物动(静)态图像分析系统(荧光版5.0)，清华同方；
BB16UV/BB5060UV CO2培养箱，Heraeus；
XW-80A漩涡混合器；
Lanbda 25UV/VIS分光光度计；
BIOAD smartSpecTM3000分光光度计；
Hettich Uni 32R冷冻高速离心机；
THZ-C恒温振荡器。
4、检测步骤
4.1精子计数
新鲜精液液化后用精子、微生物动(静)态图像分析系统计数，以X百万/ml表示密度，
计数后，按每管7.5×106精子数计算每管所需精液量。
4.2化合物与精子作用
目标化合物以5％DMSO配成不同浓度梯度。将标为实验管(T1-Tn管)的试管中加入7.5×106个精子的精液后，加入一定摩尔数化合物，以生理盐水调整总量为1ml。
另配两管含7.5×106个精子的5％DMSO/生理盐水溶液，标为对照管(C1、C2管)。其中C1为试剂盒空白对照，C2为无抑制的正常精子顶体酶活性值对照。
将T1-Tn管，C1、C2管1000G/5min离心，小心吸除上清，保留沉淀精子。用1mL5％DMSO/生理盐水加入后震荡洗涤，1000G/5min再次离心，小心吸除上清，保留约200μL溶液。
5、测顶体酶活性
5.1取两组1.5mL eppondoff离心管，分别标记为TT1-TTn管；CC1、CC2管。各管加入分离剂0.5mL，将对应T1-Tn、C1、C2管内约200μL溶液吹打混匀后贴壁小心加到对应的T1-Tn、CC1、CC2管内的分离剂液面上，离心1500G/20min，仔细吸除上层液体，保留沉淀精子。
5.2T1-Tn、CC1、CC2管先加顶体酶激活剂各900μL，后加反应底物剂100μL，C1管再加抑制剂100μL。充分混匀，置于培养箱25-37℃孵育90min，期间取出震荡1-2次。90分钟后，各TT1-TTn管和C2管加抑制剂100μL，终止反应，震荡混匀，离心1500g/5min。
5.3顶体酶活性计算
每管取上清700μL，分光光度计λ＝410nm时OD值，以蒸馏水调零。
公式：精子顶体酶活性(IU/106精子)＝(T管OD值-C1管OD值)×329
正常对照组的酶活性参考值：
正常精子顶体酶活性(IU/106精子)＝(C2管OD值-C1管OD值)×329
抑酶比值＝(精子正常对照酶活性值-样品酶活性值)÷精子正常对照酶活性值。
6、正常参考值
当计算值＞36(IU/106精子)时认为所测精子活性在可生育正常范围。
7、实验结果见表7。
表7II类化合物抑酶活性结果
表8III类化合物抑酶活性结果
| Compd | IC50/(μmol/mL) | Compd | IC50/(μmol/mL) |
| III-1 | 0.34 | III-10 | 1.0 |
| III-2 | 0.14 | III-11 | 0.46 |
| III-3 | 0.06 | III-12 | 0.38 |
| III-4 | 0.24 | III-13 | 0.13 |
| III-5 | 0.20 | III-14 | 0.43 |
| III-6 | 0.19 | III-15 | 0.11 |
| III-7 | 2.8 | III-16 | 0.69 |
| III-8 | 0.52 | III-17 | 12.5 |
| III-9 | 4.15 |
8、结论
采用体外测活试验，检验了II类、III类化合物与具有生育活性的人精子顶体酶作用，通过改良的Kennedy法检测残余酶活性。并与经典的顶体酶抑制剂TLCK作比较。结果表明：所有测试的化合物对人精子顶体酶均具有抑制活性，且都比阳性对照品TLCK抑制活性强，其中结构通式II类化合物11、13、15、17、21，结构通式III中的化合物2、3、6、13、15具有较强抑制人精子顶体酶活性。
实施例36
片剂：
制备方法：按上述配方，将粉碎过筛后的实施例1的化合物、蔗糖、玉米淀粉均匀混合，然后与5％乙醇溶液混合，制粒、干燥，之后再与润滑剂硬脂酸钙混合，压片即可。其中，所述的实施例1的化合物粉碎过筛为过60目筛；所述的蔗糖、玉米淀粉和交联聚乙烯吡咯烷酮粉碎过筛为过80目筛；所述的制粒的颗粒粒径大小为20目；所述的干燥的温度较佳的为50℃控制水分质量百分比3％以内。将活性成分与蔗糖、玉米淀粉混合，加水湿润，搅拌均匀，干燥，粉碎过筛，加入硬脂酸钙，混合均匀，压片。每片重500mg，活性成分含量为50mg。
实施例37
针剂：本发明的化合物 20mg
注射用水 9.98g
制备方法：将活性成分溶解与注射用水，混合均匀，过滤，将所获得的溶液在无菌条件下分装与安瓿瓶中，每瓶1000mg，活性成分含量为20mg/瓶。
实施例38
泡腾凝胶剂：
将本发明的化合物粉碎过300目筛，与泊洛沙姆分别置25℃真空干燥10h；丙二醇以无水硫酸钠脱水；酒石酸、酒石酸氢钾粉碎过200目筛，于80℃烘5h后再置25℃真空干燥10h；碳酸氢钠过200目筛，于37℃烘3h后再置25℃真空干燥10h；主辅料经上述处理后待用；铝管洗净，160℃干热灭菌2h，放冷后待用，用前紫外线照射2h。
称取处方量泊洛沙姆于70℃加热熔融，将丙二醇加入搅匀，再加入本发明的化合物、酒石酸、酒石酸氢钾分散均匀，边加边冷却至适宜稠度时，加入碳酸氢钠快速搅匀，呈半固体态时灌装、轧口、双铝袋密封包装即可。活性成分含量为50mg/5000mg/支。
Claims (11)
1.吡唑、异噁唑衍生物，其特征在于，为具有结构通式I所示化合物：
其中：
X为NH或O；
R代表取代的或未取代的C1-4直链烷基、C1-4支链烷基、CF3、C3-4羧酸基、苄基、苯基、取代苯基、 
对甲苯磺酸基或2-苯基丁基；
所述的取代苯基，其中，苯环上有1到2个取代基团，取代基团位于苯环的邻、间或对位，所述取代基团为除了碘以外的卤素、C1-2直链烷基、硝基、氯取代的C1～C2的烷基、三氟甲基或甲氧基。
2.根据权利要求1所述的吡唑、异噁唑衍生物，其特征在于，优选的，R代表的取代苯基为：4-氟苯基、2，6-二氟苯基、2-氯苯基、4-氯苯基、2，4-二氯苯基、2，6-二氯苯基、2-溴苯基、4-甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-氯甲基苯基、苯乙基、4-甲基苯磺基、2-苯基正丁基，3-氟苯基、2，5-二硝基苯基、4-乙基苯基、3-三氟甲基苯基、4-溴苯基、3-氯苯基或3-甲基苯基。
3.根据权利要求1所述的吡唑、异噁唑衍生物，其特征在于，优选的，R代表的取代的C1-4直链烷基为CF3。
4.根据权利要求2所述的吡唑、异噁唑衍生物，其特征在于，优选的，R代表的取代的C1-4直链烷基为CF3。
5.一种吡唑衍生物，为具有结构通式II所示化合物：
其中：R代表C1-4直链烷基、C3-4直链羧酸基、CF3、对甲苯磺酸基、苄基、2-苯基丁基、取代苯基或苯基；
所述的取代苯基，其中，苯环上有1到2个取代基团，取代基团位于苯环的邻、间或对位，所述取代基团为除了碘以外的卤素、C1-2直链烷基、氯取代的C1～C3的烷基或甲氧基；
取代苯基为：4-氟苯基、2，6-二氟苯基、2-氯苯基、4-氯苯基、2，4-二氯苯基、2，6-二氯苯基、2-溴苯基、4-甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-氯甲基苯基、苯乙基、4-甲基苯磺基或2-苯基正丁基。
6.一种异噁唑衍生物，其特征在于，为具有结构通式III所示化合物：
其中：
R代表C1-4直链烷基、苄基、取代苯基或苯基；
所述的取代苯基，其中，苯环上有1到2个取代基团，取代基团位于苯环的邻、间或对位，所述取代基团为除了碘以外的卤素、C1-2直链烷基、硝基、三氟甲基、甲氧基或氯甲基；
所述的取代苯基为3-氟苯基、4-氟苯基、2-氯苯基、2，4-二氯苯基、4-甲氧基苯基、2，5-二硝基苯基、4-乙基苯基、苯乙基、4-氯苯基、4-氯甲基苯基、3-三氟甲基苯基、4-溴苯基、3-氯苯基或3-甲基苯基。
7.一种吡唑、异噁唑衍生物，其特征在于，为：
代号II-1：5-(4-乙酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-2：5-(4-丙酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-3：5-(4-丁酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-4：5-(4-戊酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-5：5-(4-三氟乙酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-6：5-(4-正丁酸基酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-7：5-(4-戊酸基酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-8：5-(4-苯甲酰胺苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-9：5-(4-(4-氟苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-10：5-(4-(2，6-二氟苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-11：5-(4-(2-氯苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-12：5-(4-(4-氯苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-13：5-(4-(2，4-二氯苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-14：5-(4-(2，6-二氯苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-15：5-(4-(2-溴苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-16：5-(4-(4-甲基苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-17：5-(4-(4-甲氧基苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-18：5-(4-(4-氯甲基苯甲酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-19：5-(4-(苯乙酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-20：5-(4-(2-苯基丁酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号II-21：5-(4-(4-甲基苯磺酰胺)苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯、
代号III-1：5-(4-(3-氟苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-2：5-(4-(4-氟苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-3：5-(4-(2-氯苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-4：5-(4-(2，4-二氯苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-5：5-(4-(4-甲氧基苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-6：5-(4-(2，5-二硝基苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-7：5-(4-(4-乙基苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-8：5-(4-苯乙酰胺苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-9：5-(4-甲酰胺苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-10：5-(4-正丁酰胺苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-11：5-(4-苯甲酰胺苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-12：5-(4-(4-氯苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-13：5-(4-(4-氯甲基苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-14：5-(4-(3-三氟甲基苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-15：5-(4-(4-溴苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯、
代号III-16：5-(4-(3-氯苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯或
代号III-17：5-(4-(3-甲基苯甲酰胺)苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯。
8.制备权利要求1～7任一项所述的吡唑、异噁唑衍生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：以4-硝基苯乙酮为起始原料，与草酸二乙酯发生Claisn酯缩合反应得到2，再与水合肼发生关环反应得到3，经氯化亚锡还原得到4，最后与各类取代酰氯或酸酐反应得到吡唑类化合物II；
或将得到的中间体2与盐酸羟胺发生关环反应得到3’，经氯化亚锡还原得到4’，最后与各类取代酰氯或酸酐反应得到异噁唑类化合物III。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)4-(4-硝基)苯基-2，4-二氧-丁酸乙酯(中间体2)的制备
在乙醇钠溶液中，加入对硝基苯乙酮，溶解后，加入草酸二乙酯室温反应5～7小时，加入醋酸调pH至5～7，抽滤，得中间体2；
所述乙醇钠溶液中，金属钠的含量为0.5～0.7g/100ml；对硝基苯乙酮的含量为2～3g/100ml；
草酸二乙酯与对硝基苯乙酮的摩尔比1∶1；
(2)5-(4-硝基苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(中间体3)的制备
将等摩尔的中间体2和水合肼加入400～500ml无水乙醇中，回流反应4～5小时，过滤收集中间体3；
无水乙醇中，中间体2的含量0.008～0.01摩尔/100ml；
(3)5-(4-氨基苯基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(中间体4)的制备
将中间体3、SnCl2.2H2O和无水乙醇溶于乙酸乙酯中，回流反应5～6小时，在冰浴条件下，于上述反应液中加入碳酸钾水溶液，反应1～2小时，静置，倒出上清液，浓缩柱层析得中间体4；
中间体3、SnCl2.2H2O和无水乙醇的摩尔比为1∶4∶6；
碳酸钾水溶液30％-40％，碳酸钾与SnCl2.2H2O的质量比为2～3；
(4)目标化合物的制备
将中间体4加入乙酸乙酯中，溶解，加入三乙胺，于冰浴条件下，滴加酰氯反应5～6小时，然后从反应产物中收集目标化合物；
乙酸乙酯中，中间体4的含量为0.02～0.04g/ml；
三乙胺与中间体4的摩尔比为1.5∶1；
酰氯与中间体的摩尔比为1∶1；
所述的酰氯包括正丁酰氯、正戊酰氯、苯甲酰氯、对氟苯甲酰氯、2，6-二氟苯甲酰氯、2-氯苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯、2，4-二氯苯甲酰氯、2，6-二氯苯甲酰氯、2-溴苯甲酰氯、4-甲基苯甲酰氯、4-甲氧基苯甲酰氯、4-氯甲基苯甲酰氯、苯乙酰氯、2-苯基丁酰氯或对甲苯磺酰氯；
或包括如下步骤：
(1)4-(4-硝基)苯基-2，4-二氧-丁酸乙酯(中间体2)的制备
在乙醇钠溶液中加入，加入对硝基苯乙酮，溶解后，加入草酸二乙酯室温反应5～7小时，加入醋酸调pH至5～7，抽滤，得中间体2；
所述乙醇钠溶液中，金属钠的含量为0.5～0.7g/100mL；对硝基苯乙酮的含量为2～3g/100ml；
草酸二乙酯与对硝基苯乙酮的摩尔比1∶1；
(2)5-(4-硝基苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯(中间体3’)的合成：
将等摩尔的中间体2和盐酸羟胺加入无水乙醇中，回流反应6～7小时，过滤收集中间体3’；
无水乙醇中，中间体2的含量0.008～0.01摩尔/100ml；
(3)5-(4-氨基苯基)-异噁唑-3-甲酸乙酯(中间体4’)的合成
将中间体3’、SnCl2.2H2O和无水乙醇溶于乙酸乙酯中，回流反应6～8小时，在冰浴条件下，于上述反应液中加入碳酸钾水溶液反应1～2小时，然后从反应产物中收集中间体4’；
中间体3’、SnCl2.2H2O和无水乙醇的摩尔比为1∶4∶6；
碳酸钾水溶液30％-40％g/mL，碳酸钾与SnCl2.2H2O的质量比为2～3；
(4)目标化合物5-(4-取代芳基酰胺)-异噁唑-3-甲酸乙酯类化合物的合成
将化合物4’加入到乙酸乙酯溶液中，室温溶解，加入三乙胺，于冰浴条件下，滴 加酰氯反应5～6小时，然后从反应产物中收集目标化合物；
乙酸乙酯中，中间体4的含量0.02～0.04g/ml；
三乙胺与中间体4的摩尔比为1.5∶1；
酰氯与中间体的摩尔比为1∶1；
所述的酰氯包括正丁酰氯、正戊酰氯、苯甲酰氯、对氟苯甲酰氯、2，6-二氟苯甲酰氯、2-氯苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯、2，4-二氯苯甲酰氯、2，6-二氯苯甲酰氯、2-溴苯甲酰氯、4-甲基苯甲酰氯、4-甲氧基苯甲酰氯、4-氯甲基苯甲酰氯、苯乙酰氯、2-苯基丁酰氯或对甲苯磺酰氯。
10.权利要求1～7任一项所述的吡唑、异噁唑衍生物在制备抗生育药物中的应用。
11.一种组合物，包括抗生育有效量的权利要求1～7任一项所述的吡唑、异噁唑衍生物和医药学上可接受的载体。
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