CN106604731A - 靶向ral gtp酶的抗癌化合物和使用它的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过抑制受试者中的Ral GTP酶抑制受试者中癌症的生长或转移的方法，以及可用于本发明方法的Ral GTP酶的小分子抑制剂。本发明还涉及包含本发明化合物的药物组合物及其使用方法。

Description

靶向RAL GTP酶的抗癌化合物和使用它的方法
政府利益
本发明是由政府支持在美国国家卫生研究院基金号CA091846、CA075115和CA104106的资助下完成的。美国政府对本发明中拥有一些权利。
技术领域
本发明涉及治疗化合物、含有其的药物组合物以及它们在治疗癌症中的用途。
背景技术
在癌症中Ras相较于任何其它的癌基因更频繁地发生突变。因此，Ras已成为发展合理设计的抗癌药物的焦点，然而到目前为止尚未成功研发出任何成果。在1989年，一些研究组表明法尼基脂质对Ras蛋白的翻译后修饰对于Ras膜结合和转化必需的。然后纯化并表征法尼基转移酶(FT酶)，随后不久，发现了使用香叶基香叶基脂质修饰Ras的第二种异戊烯基转移酶，香叶基香叶基转移酶I型(geranylgeranyltransferase type I,GGT酶-I)。对GGT酶-I抑制剂(GGTI)进行了研究，并且表明至少一种此类抑制剂GGTI-2417抑制MiaPaCa2胰腺细胞系在体内增长和存活。但是，这种抑制作用是有限的(modest)，并且没有关于GGTIs的临床试验随后进行。
Ral(Ras样)GTP酶是GTP酶的Ras超家族的成员，并且作为分子开关，其在活性GTP结合状态和非活性GDP结合状态之间循环，当与Ral特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子(Ral-GEF)家族之一相互作用时变为活化的，其促进GDP从Ral释放，允许GTP结合在其位置。Ral-GEF以及Raf和磷酸肌醇-3-激酶(PI3-K)构成三种已知类型的蛋白质，其活性通过与细胞中的Ras蛋白结合来调节。Ral-GTP酶与人Ras具有46％-51％的同一性，是Ras信号传导和Ras肿瘤发生的重要组分，并且是肿瘤中突变型Ras的重要效应子(Genes&Cancer 2011 2(3):275-287)。Ral GTP酶也与肿瘤转移高度相关，肿瘤转移是癌症患者死亡的主要原因。因此，Ral蛋白是与Ras类似的治疗性干预的临床重要靶标。但是未能获得临床上有用的Ras或任何其他GTP酶的抑制剂表明该靶点家族是治疗挑战。其一个原因是不能直接靶向小G蛋白的活性位点用于抑制，因为它们对鸟嘌呤核苷酸GDP/GTP的高亲和力和细胞中这些核苷酸的毫摩尔浓度。然而，与Ras和其它GTP酶不同，RalA或RalB突变在人类癌症或癌细胞系中是罕见的(<1％)，使得靶向Ral作为开发有效的抗癌治疗剂是可行方法。
因此，Ral GTP酶展示了一个令人瞩目的预防和治疗实体瘤和这些癌症的转移的治疗靶点且存在对抑制Ral GTP酶从而治疗癌症的有效方法的需求。
发明内容
本发明提供了结合并有效抑制Ral GTP酶的小分子，以及使用其的治疗方法。本发明人的发现基于计算分析，其鉴定了在非活性蛋白质构象中可获得(在活性的蛋白质构象中不可获得)且不同于核苷酸结合口袋的位点。接着进行实验验证小分子对该口袋的分子对接，产生了至少三种化合物，其在体外抑制Ral与其效应物RalBP1的结合，抑制Ral介导的细胞在鼠成纤维细胞中的铺展和抑制人癌细胞系的非贴壁依赖性生长。两种化学相关化合物的递送已显示有利的体内药代动力学和肿瘤药物摄取。这些化合物的衍生物的合成产生了本发明的化合物，通过表面等离子体共振和15N-HSQC NMR证实了其与RalB的结合。这些化合物以与siRNA Ral耗竭相似的程度抑制异种移植物生长。
本发明的化合物在人肿瘤异种移植物中同等地抑制RalA和RalB的活性。尽管已经提出了RalA和RalB在肿瘤发生和转移中的不同和有时甚至相反作用，但遗传小鼠模型已经显示出在发育和肿瘤发生中的大量相同。这些研究支持抑制RalA和RalB GTP酶的化合物的重要性和临床效用。
本发明的化合物对Ral具有选择性，具有很小的脱靶效应，模拟了由Ral siRNA诱导的生长抑制作用，并抑制了RalA和RalB的活性，但不抑制异种移植肿瘤样品中密切相关的GTP酶Ras或RhoA的活性。NMR滴定实验显示这些化合物仅结合RalB-GDP而不结合RalB-GTP，从而防止被Ral特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子(Ral-GEF)的活化和GDP从Ral释放，其中GTP结合在其位置，且抑制Ral活性依赖的表型。
这种基于计算的筛选，随后是生物化学、细胞和体内测定，鉴定了结合并有效抑制Ral蛋白活性的本发明的小分子，其用于癌症治疗中的临床应用。因此，本发明提供了可以抑制Ral GTP酶的分子，以及这些分子在受试者中预防或减缓癌症的生长和转移的治疗用途。本发明还提供了含有这些化合物的药物组合物和使用这些化合物和药物组合物治疗或预防癌症的方法。
本发明的一个方面为具有Ral GTP酶抑制活性且具有以下化学结构的本发明的化合物：
及其药学上可接受的对映异构体、非对映异构体、外消旋体和盐，其中：
R1选自氢、卤素、-OH、-O-R8、C1-C12烷基、C3-C12烯基、C4-C12二烯基、C6-C12三烯基、C8-C12四烯基、C6-C12芳基、取代的C6-C12芳基、C1-C12-烷氧基、羧基、氰基、C1-C12烷酰基氧基、C1-C12烷基硫基、C1-C12烷基磺酰基、C2-C12烷氧基羰基、C2-C12烷酰基氨基、S-R8、-SO2-R8、-NHSO2R8和-NHCO2R8；
R2选自氢、卤素、-OH、-O-R8、C1-C12烷基、C3-C12烯基、C4-C12二烯基、C6-C12三烯基、C8-C12四烯基、C6-C12芳基、取代的C6-C12芳基、C1-C12-烷氧基、羧基、氰基、C1-C12烷酰基氧基、C1-C12烷基硫基、C1-C12烷基磺酰基、C2-C12烷氧基羰基、C2-C12烷酰基氨基、S-R8、-SO2-R8、-NHSO2R8和-NHCO2R8；
R3、R4、R5、R6和R7独立地选自氢、卤素、-OH、-O-R8、C1-C12烷基、C3-C12烯基、C4-C12二烯基、C6-C12三烯基、C8-C12四烯基、咪唑、C6-C12芳基、C1-C12-烷氧基、羧基、氰基、C1-C12烷酰基氧基、C1-C12烷基硫基、C1-C12烷基磺酰基、C2-C12烷氧基羰基、C2-C12烷酰基氨基、S-R8、-SO2-R8、-NHSO2-R8、-NHCO2-R8、任选取代有1至3个选自以下的基团的C1-C12烷基：卤素、氧、C1-C6烷基、C6-C10芳基和C1-C6烷氧基，和任选取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素、C1-C6烷基、C6-C10芳基和C1-C6烷氧基；或
R3和R4一起形成环己烷、1,4-二噁烷或苯基；且
R8为任选取代有1至3个选自以下的基团的C1-C12烷基：卤素、氧、C1-C6烷基、C6-C10芳基和C1-C6烷氧基，或任选取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素、C1-C6烷基、C6-C10芳基和C1-C6烷氧基。
在具体实施方案中，该化合物的R1取代基选自氢、甲基、苯基、甲基-苯基、甲氧基、取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基。
在具体实施方案中，该化合物的R2取代基选自氢、甲基、苯基、甲基-苯基、甲氧基、取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基。
在具体实施方案中，该化合物的R3取代基选自氢、卤素、甲氧基、任选取代有选自以下的基团的C1-C6烷基：卤素、氰基和咪唑，和取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素和C1-C6烷氧基。
在具体实施方案中，该化合物具有选自以下的化学结构：
6-氨基-1,3-二甲基-4-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-20甲腈，
6-氨基-1-甲基-3-苯基-4-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈，
6-氨基-4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己二烯-6-基)-1,3-二甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈，和,
6-氨基-4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己二烯-6-基)-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈。
本发明的另一方面是通过向需要这种治疗的受试者给药治疗有效量的抑制RalGTP酶酶活性的化合物来治疗癌症的方法。在该实施方案的一个方面，该化合物抑制RalGTP酶的至少一种种内同源基因(paralog)(RalA或RalB)，从而抑制癌症的生长或转移。在该实施方案的优选方面，所述化合物抑制RalA和RalB种内同源基因。
在这些治疗或预防受试者中癌症的方法的一项具体实施方案中，向受试者给药在本发明药物组合物中的所述化合物。
因此，本发明的另一个方面是含有一种或多种本发明的化合物和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明的另一项实施方案是预防或治疗转移癌，尤其是转移性胰腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、皮肤癌和/或者结肠癌的方法，所述方法通过向有此治疗需要或者怀疑患有癌症或癌症转移的受试者给药治疗有效量的至少一种本发明的化合物进行。
本发明的另一项实施方案是治疗癌症的方法，其通过给药至少一种本发明的化合物和一种或多种其它已知的抗癌或抗炎治疗的治疗有效的组合进行。例如，其他的抗癌治疗可包括异戊烯转移酶抑制剂，包括香叶基香叶基转移酶I型(GGT酶-I)抑制剂、手术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法以及它们的组合。
本文也提供了预防(prevent)、治疗或防止(prophylaxis)受试者癌症的方法，其包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的本发明任一药物组合物。
本文也提供了预防受试者癌症转移的方法，其包括向所述受试者给药治疗有效量的至少一种本发明的化合物，包括例如，含有至少一种本发明化合物的药物组合物。
本文也提供了药物包装，其包括在药物组合物内的治疗有效量的至少一种本发明的化合物。所述药物组合物可单独给药，或者与其它用于预防、治疗或改善受试者癌症的化合物或疗法同时、依次给药。这些包装也可包括处方信息和/或容器。如果有的话，该处方信息可描述这些药物组合物单独给药和/或使用，或者与其它预防、治疗或缓解受试者癌症的疗法组合给药和/或使用。
本发明的另一项实施方案是测试患有肺癌的受试者对Ral GTP酶活性的假定抑制剂治疗的敏感性的方法，所述方法通过测试受试者对给药假定抑制剂的应答，其指示受试者癌细胞或肿瘤体积生长抑制或癌细胞数目或肿瘤体积减小。
本发明的其它方面将会在本发明随后的实施方案的描述中提到，根据以下描述是显而易见的或可通过本发明的实施知悉。然而，我们应当理解以下实施方案的描述仅仅是为了解释，因为在本发明的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员是显而易见的且涵盖在本发明的范围内。
附图简述
图1A和1B显示了Ral蛋白上的靶位的分子建模。RalA-GDP的结构模型表示为飘带图(图1A)或表面图(图1B)。变构结合位点由开关II、螺旋α2和螺旋α3形成。(C-D)RalA-GNP与exo84复合的表面图(图1C，exo84未显示)，和RalA-GNP与sec5复合的表面图(图1D，sec5未显示)。在图1B和1C中，球面/表面指示结合腔中的亲水区域(water-accessible area)。所有模型均使用公开的结构在Accelrys Discovery Studio软件中生成。
图2A显示了化合物BQU57和BQU85的化学合成方案。图3B-D显示了BQU57与Ral结合的表征。图2B显示在100μM BQU57存在下RalB-GNP(100μM)的化学位移变化。图2C显示了随着BQU57浓度的增加，RalB-GDP中所选残基的1H-15N-HSQC NMR化学位移变化图。用于BQU57与RalB-GDP之间结合的KD的表面等离子体共振测定显示，拟合的结合曲线给出了4.7μM的KD值。
图3A-3E显示与Ral结合的化合物的表征。图3A显示了BQU57(RBC8的衍生物)的结构。图3B是在100μM BQU57存在下100μM Ral-GDP的15N-HSQC谱的叠加图。图3C显示在不存在和存在增加浓度(40μM和100μM)的BQU57的情况下RalB-GDP的所选残基。图3D显示了比较RalB-GDP(100μM)本身和存在100μM BQU57时化学位移变化对比残基号的图。图3E显示了使用等温滴定量热法(ITC)测定的BQU57与RalB-GDP的结合。
图4A-4J显示了Ral抑制剂在人癌细胞系中的生长抑制活性。BUQ57(图4A)和BQU85(图4B)处理对四种人肺癌细胞系的非贴壁依赖性生长的影响。将细胞接种在含有各种浓度的药物的软琼脂中；2-4周后计数在软琼脂中形成的集落。对Ral siRNA敲除敏感的细胞系(H2122和H358)为灰色，且抗Ral siRNA敲除(H460和Calu6)的细胞系为黑色。数据表示三次独立实验的平均值。在H2122(图4C，4D)和H358(图4E，4F)细胞中RalA和RalB的siRNA敲除对软琼脂中药物诱导的生长抑制的影响。用10/30/50nM siRNA转染细胞48小时，收集细胞，并进行软琼脂集落形成测定。siRNA单独对软琼脂集落数的影响显示在图4C(H2122)和图4E(H358)中；siRNA加药物处理对集落形成的作用显示为图4D(H2122)和图4F(H358)中，作为DMSO处理的对照的百分比。在H2122(图4G，4H)和H358(图4I，4J)细胞中组成型活化的RalAG23V和RalBG23V的过表达对软琼脂中药物诱导的生长抑制的影响。在软琼脂集落形成测定之前，用FLAG-RalAG23V或FLAG-RalBG23V瞬时转染H2122细胞48小时。用FLAG-RalAG23V或FLAG-RalBG23V稳定转染H358细胞。通过免疫印迹证实过表达，并显示在图7F中。所有显示的结果代表三次独立实验的平均值±SD。*表示指定组之间具有统计学显著性差异。
图5A-5H显示了Ral抑制剂对肺癌的人异种移植物模型的作用。在以50mg/Kg单次腹膜内给药3小时后，裸小鼠中RBC8(图5A)和BQU57(图5B)的组织分布；数据表示为3只小鼠的平均值±SD。(图5C和图5D)接种24小时后开始的50mg/kg/天的RBC8抑制人肺癌细胞系H2122的异种移植肿瘤生长。数据表示为6只小鼠的平均值±SEM。如通过Dunnett检验确定的，治疗组中的肿瘤体积与对照具有统计学差异(*p<0.05)。典型的肿瘤外观如图5D所示。图5E显示RalA和RalB的siRNA耗竭抑制H2122细胞的异种移植肿瘤生长。用针对RalA和RalB的siRNA瞬时转染细胞24小时；细胞然后接种到裸小鼠中；如上所述监测和测量肿瘤。数据表示为6只小鼠的平均值±SEM。通过Dunnett检验确定治疗组中的肿瘤体积与对照具有统计学差异(*p<0.05)。图5F显示接种后24小时开始的BQU57处理(10/20/50mg/kg/天)抑制H2122细胞的异种移植肿瘤生长。数据表示为6只小鼠的平均值±SEM。通过Dunnett检验确定治疗组中的肿瘤体积与对照具有统计学差异(*p<0.05)。图5G显示了在以50mg/Kg单次腹膜内给药3小时后，裸小鼠中BQU85的组织分布。数据表示为3只小鼠的平均值±SD。图5H显示了BQU85处理对肺癌的人异种移植物模型的作用。接种后24小时开始的BQU85处理(5/10/20/50mg/kg/天)抑制H2122细胞的异种移植肿瘤生长。数据表示为6只小鼠的平均值±SEM。
图6A-6E显示体外Ral抑制剂的细胞摄取。用10μM的RBC8(图6A)、BQU57(图6B)、BQU85(图6C)和RBC5(图6D)处理H2122人肺癌细胞。在不同的时间点(1、5、15、30和60分钟)收集细胞，并且使用LC/MS-MS方法(每个时间点n＝3)测定细胞中的药物浓度。图6E显示RBC5、RBC8和BQU57对H2122和H358细胞中Ral活性的抑制。细胞在非贴壁依赖性条件下生长，并用10μM化合物处理3小时。然后使用RalBP1琼脂糖珠的下拉测定法测定细胞裂解物中的Ral活性。数据表示三个独立实验。
图7A-7F显示了K-Ras或Ral敲除或过表达对四种人肺癌细胞系的非贴壁依赖性生长的影响。图7A显示siRNA转染后48小时的H2122、H358、H460和Calu6细胞系中K-Ras的siRNA敲除的免疫印迹。图7B显示使用软琼脂集落形成测定法，所有四个细胞系对K-Ras敲除敏感。通过用针对RalA、RalB或RalA/B的siRNA转染细胞48小时，然后将细胞进行软琼脂集落形成测定来研究Ral敲除对四种人肺癌细胞系的非贴壁依赖性生长的影响。图7C显示细胞系H2122/H358对Ral敲除敏感。图7D显示细胞系H460/Calu6对Ral敲除不敏感。图7E显示用不同浓度的siRNA处理48小时后H2122和H358细胞系中RalA和RalB的敲除的免疫印迹。图7F显示在H2122和H358细胞中组成性活化的RalAG23V和RalBG23V的成功过表达的免疫印迹。用FLAG、FLAG-RalAG23V和FLAG-RalBG23V瞬时转染H2122细胞48小时。通过G418选择产生稳定过表达FLAG、FLAG-RalAG23V和FLAG-RalBG23V的H358细胞。
具体实施方案的描述
基于在肿瘤建立和转移中令人瞩目的临床意义，本发明的发明人已经鉴定并且使用Ral GTP酶作为分子靶点。正如所有的GTP酶一样，Ral的活性依赖于非活性构象(GDP-结合)和活性构象(GTP-结合)之间的循环。活性的Ral蛋白通过他们自己的一套效应器，包括Ral结合蛋白1(RalBP1、RLIP76或RIP1(37))、Sec5/Exo85、细丝蛋白和磷脂酶D1，调节下游过程。因此，结合Ral-GDP而不结合Ral-GTP的化合物可用于空间上抑制效应器结合和/或阻断与GTP结合状态相关的构象变化，从而导致信号传递的阻断以及随之的Ral依赖性癌细胞生长下降和凋亡。这些化合物使用Ral GTP酶抑制剂的虚拟和物理筛选二者来鉴定。
如上所述，Ral在非活性(GDP-结合)形式和活性(GTP-结合)形式之间循环。为了找到优先结合Ral-GDP(非活性)而不是Ral-GTP(活性)并由此稳定非活性状态的Ral的化合物，本发明人检查了活性和非活性形式的RalA的三维结构。该分析揭示了在核苷酸结合位点附近但并非核苷酸结合位点的口袋的形状差异(图1)。该口袋(变构位点)与先前描述的C3bot结合位点类似，并且由开关-II区(Ral70-Ral77)、螺旋α2(Ral78-Ral85)和螺旋α3的一个面构成(图1A)。用于比较的晶体结构包括RalA-GDP(PDB代码2BOV(图1B)，和与exo84(PDB代码1ZC4，图1C)或sec5(PDB代码1UAD，图1D)复合的RalA-GNP(GTP的不可水解形式)。对于每个结合位点计算的体积为RalA-GDP的(图1B)，RalA-GNP-exo84的(图1C)，和RalA-GNP-sec5的(图1D)。RalB-GDP晶体结构没有公开，但是在RalB-GNP结构(PDB代码2KE5，图1)中，该结合口袋几乎不存在。使用基于结构的虚拟筛选方法鉴定结合RalA-GDP的变构位点的小分子，将500,000个化合物对接至RalA-GDP口袋中。基于计算的相互作用能量对蛋白质-配体复合物进行评分和分选，然后目视检查最佳候选物，选出88种化合物。基于活性RalA-GTP与其效应蛋白RalBP1的选择性结合，使用Ral活性的ELISA，评价88种选择的化合物抑制培养的活细胞中RalA活化的能力。
还在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)在纤连蛋白包被的盖玻片上铺展期间，通过测量脂筏胞吐作用独立地测定RalA活性。在这些细胞中，RalA的siRNA耗竭抑制铺展，而小窝蛋白(Cav1)-/-MEF对RalA耗竭有抗性。
TROSY 15N-HSQC(横向弛豫优化的异核单量子相干，Transverse Relaxation-Optimized Heteronuclear Single Quantum Coherence)NMR用于证实化合物与Ral靶位点的直接结合。本发明人聚焦于与GNP复合的RalB的NMR结构(此时已经解析的唯一结构)。首先测定RalB-GDP和RalB-GNP的15N-HSQC NMR谱，并分析化学位移差异。然后在RBC8或DMSO对照的存在下记录NMR谱。通过15N-HSQC蛋白酰胺峰的扰动来监测小分子与蛋白质的结合。在不存在和存在100μM RBC8下的RalB-GDP(100μM)的15N-HSQC谱显示位于变构位点中的代表性残基的峰位置的变化。RBC8在相同条件下不结合RalB-GNP，如NMR谱上的最小化学位移变化所指示。此外，在基于细胞的ELISA测定中不影响活化Ral水平的RBC5也不诱导RalB-GDP中的化学位移变化，因此用作额外的阴性对照。
基于包括结构特征的所有数据，合成一系列RBC8衍生物并在体外测试结合。选择BQU57用于进一步评价，因为其与RBC8相比优异的性能及其成药性质。进行BQU57和RalB-GDP之间结合的详细NMR分析。以结合BQU57时化学位移变化和序列作图，显示具有显著变化的残基位于开关-II(氨基酸残基70-77)和螺旋α2(氨基酸残基78-85)区域。因为没有RalB-GDP晶体结构可用，所以基于与RalA-GDP的相似性产生同源性模型，并且显示响应化合物的化学位移变化的残基被映射到该模型上。大部分化学位移变化定位于变构位点，符合建模中BQU57结合到该位点的归属。与RBC8的结果类似，BMR57不结合RalB-GNP(100μM)，如NMR谱上的最小化学位移变化所示。NMR化学位移滴定的分析显示BQU57的结合是化学计量的，直到药物的表观极限溶解度。还使用等温滴定量热法(ITC)测定BQU57与RalB-GDP的结合，结果与表面等离子体共振(SPR)的结果相似。
评价RBC8和BQU57对人肺癌细胞生长的影响。因为众所周知Ral在贴壁独立性中的作用，所以本发明人在软琼脂中进行了生长抑制测定。人肺癌细胞用于一系列实验以确定药物摄取、生物学特异性和效果。
检查RBC8、BQU57、BQU85和RBC5的细胞摄取，发现所有化合物容易进入细胞。发现所有细胞系对K-Ras siRNA耗竭敏感，但只有H2122和H358对Ral敲除敏感。使用该特征来确定化合物对Ral相比于Ras(一种密切相关的GTP酶)的特异性，本发明人评估了软琼脂中集落形成的抑制，发现Ral依赖性细胞系H2122和H358是敏感的。另外，使用RalBP1琼脂糖珠的Ral下拉测定显示RBC8和BQU57(而不是RBC5)在H2122和H358细胞系中抑制RalA和RalB二者的活化。进行化学基因组实验以进一步确定药物对Ral的特异性。用RBC8或BQU57处理具有siRNA敲除RalA和RalB的H2122和H358细胞不会导致显著的进一步抑制。总之，这些数据表明RBC8和BQU57通过Ral抑制减少非贴壁依赖性生长。
通过在H2122和H358细胞中组成性过表达RalAG23V或RalBG23V的活性形式来评价化合物对Ral的GDP形式相比于GTP形式的特异性。(G23V突变阻止RalGAP介导的GTP水解的活化，因此将Ral锁定在其活性状态)。RalAG23V和RalBG23V都可以挽救RBC8和BQU57化合物的生长抑制作用。
在人肺癌小鼠模型中评价了Ral活性和肿瘤生长的抑制。首先在小鼠中分析RBC8和BQU57的药代动力学以测试生物利用度，其中RBC8和BQU57显示定义良好药物候选物的有利性质，如表1所示。
表1.所选化合物的药代动力学特征
确定化合物进入肿瘤组织，并且在给药后3小时在肿瘤组织中检测到大量的化合物。
然后在裸小鼠中测试Ral抑制剂对异种移植物肿瘤生长的影响。RBC8以与RalA和RalB的双重敲除相同的数量级抑制肿瘤生长，并且第二肺癌细胞系H358产生类似的结果。还在体内测试BQU57和BQU85，观察到剂量依赖性生长抑制作用。
在H2122异种移植物中体内评价Ral GTP酶活性。Ral活性的RalBP1下拉测量显示RBC8和BQU57对RalA和RalB的显著抑制。重要的是，BQU57诱导的Ral活性的剂量依赖性抑制与抑制肿瘤生长相关。另外，在BQU57处理的肿瘤中测量Ras和RhoA活性，没有观察到显著的抑制，进一步证明了本发明的Ral抑制剂的选择性。
因此，本发明提供了抑制Ral GTP酶的化合物。这些化合物可以结合到非活性形式的Ral蛋白，并且防止GEF诱导的活化或GTP交换，并且对Ral具有选择性，具有很小的脱靶效应。因此，本申请的Ral GTP酶抑制剂可用于阻断Ral蛋白结合GTP后的相关构象变化，从而阻止效应子结合和下游信号传导。
因此，本发明还提供了通过抑制受试者中的Ral GTP酶来抑制受试者中癌症的生长和/或转移的方法。在优选的实施方案中，Ral GTP酶是RalA和RalB种内同源基因中的至少一种。术语“种内同源基因”在本公开中用于表示生物体中已被复制以占据相同基因组中的不同位置的基因。
在另一方面，本发明提供了通过向受试者给药至少一种本发明的化合物或其药学上可接受的盐来抑制受试者中癌症的生长和/或转移的方法。
本文所用的术语“化合物”是指化学或者生物分子，如简单的或者复杂的有机分子、肽、蛋白或者寡核苷酸。
本文所用的短语“药学上可接受的”指的是那些在正确的医学判断范围内，适于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的受益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
“药学上可接受的盐”指的是所公开化合物的衍生物，其中通过制备其酸或碱的盐来修饰所述母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括，但不限于碱性残基如胺的矿物酸或有机酸盐，或酸性残基如羧酸的碱盐或有机盐。药学上可接受的盐包括所述母体化合物的常规非毒性盐或季铵盐，其形成自例如非毒性无机酸或有机酸。此类常规非毒性盐包括那些衍生自无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的盐；和那些制备自有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、帕莫酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙磺酸等的盐。药学上可接受的盐类是指那些适于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的受益/风险比相称的化合物形式。
本文提供的化合物的药学上可接受的盐形式通过常规化学方法合成自含有碱性或酸性部分的本发明的化合物。一般来说，例如通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当的碱或酸在水或有机溶剂或在这两者的混合物中反应来制备此类盐；一般地，优选非水的介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。适宜盐的列表在Remington’sPharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985的1418页。
术语“受试者”是指哺乳动物，例如人或灵长类动物，例如猿、猴、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩。术语“受试者”还可以指伴侣动物，例如狗和猫；动物园动物；马科动物，例如马；食用动物，例如牛、猪和绵羊；和疾病模型动物，例如兔、小鼠和大鼠。受试者可以是人或非人。受试者可以是任何年龄。例如，在一些实施方案中，受试者是人类婴儿，即出生后至约1岁；人类儿童，即约1岁至12岁的人；青春期人，即约12岁至18岁的人；或成年人，即年龄大于约18岁的人。在一些实施方案中，受试者是成年男性或女性。
术语“治疗有效量”和“治疗剂量”的本发明的化合物是指在向患有癌症的受试者给药后，有效抑制癌症形成或进展的量。
术语“溶剂合物”指的是由溶剂和化合物相互作用形成的化合物。适合的溶剂合物是药学上可接受的溶剂合物，如水合物，包括包括一水合物和半水合物。
本领域技术人员应当理解具有手性中心的本发明的化合物可以光学活性或外消旋形式存在，且可以光学活性或外消旋形式分离。应当理解，本发明的化合物涵盖任何的具有本文所述的治疗上有用性质的外消旋、光学活性、区域异构或立体异构形式，或其混合物。如果本发明的化合物具有至少一个手性中心，它们可以以对映异构体存在。如果所述化合物具有两个或多个手性中心，它们可另外以非对映体存在。如果根据本发明制备所述化合物的方法产生立体异构体的混合物，则这些异构体可通过常规技术如制备型色谱分离。这些化合物可以外消旋式的形式制备，也可以单独的对映体或非对映体的形式通过立体特异性合成或拆分制备。例如，可通过标准技术，如通过与光学活性酸形成盐而形成立体异构体对，如(-)-二-对甲苯酰基-D-酒石酸和/或(+)-二-对甲苯酰基-L-酒石酸，随后进行分级结晶和游离碱的再生，将所述化合物拆分成它们的组成对映体或非对映体。所述化合物也可通过形成立体异构的酯或酰胺，随后进行手性助剂的色谱分离和除去进行拆分。或者，所述化合物可以使用手性HPLC柱来拆分。应当理解，其所有的立体异构体、外消旋混合物、非对映体和对映异构体都涵盖在本发明范围内。
如何制备光学活性形式是本领域众所周知的(例如，通过用重结晶技术拆分外消旋形式，通过从光学活性起始原料合成，通过手性合成，或通过使用手性固定相的色谱分离)。也应当理解，本发明的范围不仅涵盖可能存在的多种异构体而且涵盖可能形成的异构体的多种混合物。可通过已知的操作(例如，four volume compendium OpticalResolution Procedures for Chemical Compounds:Optical Resolution InformationCenter,Manhattan College,Riverdale,N.Y.,and in Enantiomers,Racemates andResolutions,Jean Jacques,Andre Collet and Samuel H.Wilen；John Wiley&Sons,Inc.,New York,1981中所描述的那些，其整体引入本文作为参考)进行本发明的化合物、它们的起始原料和/或中间产物的拆分。基本上，化合物的拆分基于非对映体物理性质的不同通过化学或酶促连接对映异构体纯的部分得到可通过分级结晶、蒸馏或色谱法分离的形式进行。
与本发明的化合物组合使用以制备本发明的药物组合物的化学品可以购得。本发明的化合物，包括这些化合物的盐，也可以通过有机合成领域的技术人员熟知的方法制备得到。本发明的化合物可以通过在对所使用的试剂和原料适当并且适于产生转化的溶剂中进行的反应制备得到。有机合成领域的技术人员应当理解该分子各部分存在的功能性必须与计划使用的试剂和反应相容。这种对取代基的限制和对反应条件的限制是相容的，对于本领域的技术人员而言是显而易见的，因而必须使用交错的方法。
本发明的药物组合物包含一种或多种本发明的化合物和药学上可接受的载体(其是本领域通常接受的用于递送生物活性剂至动物，尤其是受试者的介质)。药学上可接受的载体是根据一些本领域普通技术人员熟知的范围内的因素来决定和调节配制的。这些因素包括但不限于以下几点：所配制的活性剂的类型和性质；被给药含该活性剂的组合物的患者；该组合物的预期给药途径；和靶向治疗的适应症。药学上可接受的载体包括水性和非水性液体介质，以及各种固体和半固体剂型。除了该活性剂以外，这类载体可包括多种不同的成分和添加剂，这些额外的成分由于本领域普通技术人员熟知的多种原因而包含在该制剂中，例如，活性剂的稳定性。对适合的药学上可接受的载体的描述以及选择它们的原因，可在多种现成的来源中找到，如Remington's Pharmaceutical Sciences,17th ed.,MackPublishing Company,Easton,Pa.,1985。
本发明进一步提供了治疗罹患癌症的受试者或预防受试者中此类癌症转移的方法，其包括向受试者给药本文所提供的药物组合物。这些组合物通常包含治疗有效量的本发明的化合物，其量可有效地预防、改善、减轻或抑制癌症。这类量通常包括每千克被给药该组合物的受试者体重约0.1mg至约100mg该化合物。治疗有效量可根据任何符合本领域普通技术人员的给药方案进行给药。
例如，可以通过各种胃肠外途径给药。适用于肠胃外给药的药物组合物包括各种含水介质，如葡萄糖水溶液和盐溶液；乙二醇溶液也是有用的载体，优选含有活性成分的水溶性盐，适合的稳定剂，并且如果需要，可含有缓冲剂。抗氧化剂，如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸，单独或组合使用都是适合的稳定剂；也使用柠檬酸及其盐和EDTA。此外，胃肠外溶液可含有防腐剂如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯以及三氯叔丁醇。
或者，组合物可以以固体剂型如胶囊、片剂和散剂口服给药；或以液体形式如酏剂、糖浆和/或悬浮液口服给药。明胶胶囊可用于包含活性成分和适合的载体，例如但不限于，乳糖、淀粉、硬脂酸镁、硬脂酸或纤维素衍生物。类似的稀释剂可用于压制片。片剂和胶囊都可以被制造成缓释产品以在一段时间持续释放药物。压制片可以是糖包衣或薄膜包衣的，从而掩盖任何不愉快的味道，或保护活性成分免遭大气损害，或使片剂在胃肠道中选择性崩解。
本发明的优选制剂是适合胃肠外或者口服给药的单相药物组合物，以用于阻止、治疗和预防癌症，其基本上由治疗有效量的本发明的化合物和药学上可接受的载体组成。
可用于本发明药物组合物的适合的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，和其适合的混合物，植物油，如橄榄油；和可注射的有机酯，如油酸乙酯。可通过以下方法维持适当的流动性：使用包衣材料，如卵磷脂；维持分散剂所需的粒径；以及使用表面活性剂。
这些组合物也可含有佐剂，例如润湿剂、乳化剂和分散剂。药物组合物中也可能需要包含等张剂，如糖、氯化钠等。此外，通过包含延迟吸收的药剂(agent)，如单硬脂酸铝和明胶可使得可注射药物形式延长吸收。
在某些情况下，为了延长药物的作用，需要延缓药物从皮下或肌内注射的吸收。这可通过使用结晶或具有不良水溶性的无定形材料的液体悬浮液来实现。该药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率依次可能取决于晶体大小和晶型。或者，可通过将该药物溶解或悬浮于油载体中来实现胃肠外给药的药物的延迟吸收。
可注射的贮存形式(depot form)通过在生物可降解聚合物如聚乳酸-聚乙醇酸交酯中形成该药物的微囊化基质制得。药物的释放速率是可控的，其取决于药物与聚合物的比例以及所使用的特定聚合物的性质。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可注射的贮存制剂也可通过将药物截留在与机体组织相容的脂质体或微乳剂中制备。可注射的材料可通过细菌保留滤器(bacterial-retaining filter)过滤进行灭菌。
为制备固体组合物如片剂，将主要的活性成分与药物赋形剂混合，以形成含有本发明化合物的均匀混合的固体预制剂组合物。当提及这些预制剂混合物为均匀的时，是指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地细分成等效的单位剂型如片剂，丸剂和胶囊剂。然后该固体预制剂被分成上述类型的单位剂量形式，其含有，例如，0.1mg至约500mg的本发明的治疗化合物。
适合于口服给药的本发明制剂可为胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、散剂、颗粒剂或在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或水包油或油包水形式的液体乳剂，或作为酏剂或糖浆剂，或作为软锭剂(使用惰性基质，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)等，每个含有预定量的一种或多种本发明化合物作为活性成分。一种或多种本发明化合物可以以大丸剂、药糖剂或糊剂形式给药。
在本发明用于口服给药的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣锭、散剂、颗粒剂等)中，将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体，如柠檬酸钠或磷酸氢钙，和/或以下任何一项相混合：(1)填充剂或增容剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵化合物；(7)润湿剂，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，以及它们的混合物；(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂情况中，药物组合物还可包含缓冲剂。使用此类赋形剂如乳糖(lactose,milk sugar)及高分子量聚乙二醇等，类似类型的固体组合物可以用作软-或硬-填充明胶胶囊剂的填充剂。
片剂可通过任选与一种或多种辅助成分进行压制或模制而制得。压制片可使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)，表面活性剂或分散剂来制备。模压片可通过在适合的机器中将被惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物模制来制备。
片剂，和本专利的药物组合物的其它固体剂型，如糖衣锭、胶囊、丸剂和颗粒剂，可任选使用包衣和壳，如肠溶包衣和制药领域众所周知的其它包衣来得到或制备。也可使用例如各种比例的羟基丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、脂质体和/或微球来配制它们从而使得其中的活性成分缓释或控释，以提供所需的释放性质。它们可通过例如经细胞保留滤器过滤而灭菌。这些组合物也可任选含有遮光剂，也可以是仅仅或优先在胃肠道的某一部分任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可使用的植入组合物的实例包括多聚合物质和蜡。活性成分也可以是微囊形式。
本发明的片剂或丸剂可以进行包衣或者混合成具有长效作用优势的剂型。例如，所述片剂或丸剂可包括内部剂量和外部剂量组分，后者可以是包封前者的形式。这两种组分可被肠溶层分开，肠溶层用于抵抗在胃中崩解并允许内部成分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于这类肠溶层或包衣，这些材料包括许多聚合物酸以及聚合物酸与虫胶、鲸蜡醇、乙酸纤维素的混合物。
用于口服给药的本发明化合物的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。除活性成分外，所述液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类(尤其是，棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和去水山梨醇的脂肪酸酯，以及它们的混合物。
除惰性稀释剂外，所述口服组合物也可包括佐剂，如润湿剂、乳化和混悬剂、甜味剂、调味剂、着色剂、香味剂和防腐剂。
除活性成分外，悬浮液可含有混悬剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和去水山梨醇酯、微晶纤维素、偏铝酸(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂和黄蓍胶，以及它们混合物。
适于直肠或阴道给药的本发明药物组合物的制剂可以栓剂呈现，其可通过将一种或多种本发明的化合物与一种或多种适合的非刺激性的赋形剂或载体(包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐/酯)混合而制得，且所述赋形剂或载体在室温为固体，但在体温为液体，因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。适于阴道给药的本发明的制剂还包括含有这类本领域已知的适当的载体的阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。
用于局部或透皮给药的本发明化合物的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂、滴剂和吸入剂。所述活性成分可在无菌条件下与药学上可接受的载体，以及可能需要的缓冲剂或抛射剂混合。
除活性成分外，所述软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂可含有赋形剂如动物或植物脂肪、油类、蜡、石蜡油、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石粉和氧化锌，或它们的混合物。
除活性成分外，散剂和喷雾剂可含有赋形剂，如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可另外含有常用的抛射剂如氟氯烃和挥发性未取代的烃如丁烷和丙烷。
透皮贴剂具有将本发明的化合物控制性地递送至机体的附加优势。这类剂型可通过将一种或多种本发明的化合物溶解、分散或合并至适当的基质如人造橡胶基质材料中制得。可通过提供控速膜或将该化合物分散至聚合物基质或明胶中来控制这类贴剂的流量速率。
药物制剂包括那些适于通过吸入(inhalation，insufflation)给药或者用于鼻内或眼内给药的制剂。对于通过吸入给药至上(鼻内)或下呼吸道，本发明的化合物方便地从吸入器、雾化器或加压包中或其它方便的递送气雾喷雾的手段来递送。加压包可包含适合的抛射剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合的气体。在加压气雾剂的情况中，可通过提供阀门测定剂量单位以递送计量量。
或者，对于通过吸入给药，所述组合物可以是干粉形式，例如，一种或多种本发明抗癌化合物和适合的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。所述粉末混合物可以以单位剂型如胶囊或药筒，或者，例如明胶或发泡包装呈现，可在吸入器或计量药量的吸入器辅助下从这些单位剂型给药所述粉末。
对于鼻内给药，本发明的化合物可通过滴鼻剂或液体喷雾剂，如通过塑料瓶雾化器或计量药量的吸入器给药。典型的雾化器为Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。
滴剂，如滴眼剂或滴鼻剂，可使用水性或非水性基质配制，也包含一种或多种分散剂、增溶剂或混悬剂。液体喷雾剂方便地从加压包中递送。滴剂可通过简单的盖有滴眼管的小瓶或通过适于利用球形闭合逐滴递送液体内容物的塑料瓶来递送。
制剂可以以单位剂量或多剂量封装的容器，例如，安瓿和小瓶呈现，并且可以储存于冻干条件中，在使用前只需加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液或悬浮液可从上述类型的无菌散剂、颗粒剂和片剂制备。
本发明提供的制剂可单独含有本发明的治疗化合物，或与其它治疗活性成分和药学上可接受的惰性赋形剂的组合。术语“药学上可接受的惰性赋形剂”包括稀释剂、粘合剂、润滑剂/助流剂、着色剂和释放调节聚合物中的至少一种。
合适的抗氧化剂可选自本领域已知的一种或多种药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：丁基羟基茴香醚(BHA)、抗坏血酸钠、丁基化羟基甲苯(BHT)、亚硫酸钠、柠檬酸、苹果酸和抗坏血酸。抗氧化剂可存在于本发明的制剂中，浓度为所述制剂重量的约0.001％的至约5％。
适合的螯合剂可选自选本领域已知的一种或多种螯合剂。适合的螯合剂实例包括：乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、乙二胺四乙酸、柠檬酸和它们的组合。所述螯合剂存在的浓度为所述制剂重量的约0.001％至约5％。
所述剂型中可包括一种或多种稀释剂，如乳糖、糖、玉米淀粉、改性玉米淀粉、甘露醇、山梨醇和/或纤维素衍生物，如木质纤维素和微晶纤维素，一般含量范围为20％到80％，按重量计。
所述剂型可包含高达约60％重量/重量的量的一种或多种粘合剂。适合的粘合剂的实例包括甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸树脂(eudragits)、乙基纤维素、明胶、阿拉伯树胶、聚乙烯醇、支链淀粉(pullulan)、卡波姆，预胶化淀粉、琼脂、黄蓍胶、藻酸钠、微晶纤维素等。
适合的崩解剂的实例包括：羟乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、低取代羟丙基纤维素等。浓度在所述剂型重量的0.1％至15％内变动。
适合的润滑剂/助流剂的实例包括：胶态二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、氢化蓖麻油、脂肪酸蔗糖酯、微晶蜡、黄蜂蜡、白蜂蜡等。浓度在所述剂型重量的0.1％至15％内变动。
释放调节聚合物可用来形成含有本发明的治疗化合物的延释制剂。释放调节聚合物可以是水溶性聚合物或水不溶性聚合物。水溶性聚合物的实例包括聚乙烯基吡咯烷酮、羟基丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、醋酸乙烯酯共聚物、聚环氧乙烷、多糖(如藻酸盐、黄原胶等)、甲基纤维素和它们的混合物。水不溶性聚合物的实例包括：丙烯酸酯，如甲基丙烯酸酯、丙烯酸共聚物；纤维素衍生物，如乙基纤维素或醋酸纤维素；聚乙烯和高分子量聚乙烯醇。
本发明还涵盖了筛选潜在治疗剂的方法，所述治疗剂通过抑制Ral GTP酶可预防、治疗或抑制肺癌的转移，所述方法包括：(a)将Ral GTP酶和潜在的治疗化合物在它们相互作用的条件下混合；和(b)监测Ral GTP酶的酶活性；其中当与未添加潜在的治疗化合物的对照样品相比，该潜在的治疗化合物抑制了酶活性时，则选择所述潜在的治疗化合物用于进一步研究。在一项实施方案中，所述潜在的治疗化合物选自：药剂、细胞因子、小分子药物、细胞渗透性的小分子药物、激素、多种白细胞介素的组合、凝集素、双特异性抗体和肽模拟物。
本发明的一项实施方案涉及本发明的化合物在治疗或预防受试者癌症或癌症转移中的用途。本发明的一项相关的实施方案涉及本发明的组合物在治疗或预防受试者癌症或癌症转移中的用途。
本发明的另一项实施方案涉及任一本发明的化合物或组合物在制备用于抑制受试者癌症的生长或转移的药物中的用途。
本文所引用的每一篇专利公开和专利均整体引入本文作为参考。
实施例
提供下面的实施例是为了阐明本发明公开内容的具体方面、实施方案和构成，并且不应当被解释为对如随附利要求所述的公开内容的限制。
实施例1–Ral抑制剂的分子建模
使用分子建模来发现优先结合Ral-GDP(非活性)而不是Ral-GTP(活性)的化合物，期望这样的分子将稳定该非活性状态。检查活性和非活性形式的RalA的三维结构揭示了，在邻近但不同于核苷酸结合位点的口袋的形状差异(图1)。该口袋(变构位点)与先前描述的C3bot结合位点类似，并且由开关-II区(Ral70-Ral77)、螺旋α2(Ral78-Ral85)和螺旋α3的一个面构成(图1A)。用于比较的晶体结构包括RalA-GDP(PDB代码2BOV，图1B)，和与exo84(PDB代码1ZC4，图1C)或sec5(PDB代码1UAD，图1D)复合的RalA-GNP(GTP的不可水解形式)。对于每个结合位点计算的体积对于RalA-GDP为(图1B)，对于RalA-GNP-exo84为(图1C)，并且对于RalA-GNP-sec5为(图1D)。RalB-GDP晶体结构没有公开，但是在RalB-GNP结构(PDB代码2KE5，图1)中，该结合口袋几乎不存在。
我们遵循基于结构的虚拟筛选方法来鉴定与RalA-GDP的变构位点结合的小分子。从RCSB蛋白数据库(rcsb.org)获得人RalA-GDP(PDB：2BOV)、与exo84复合的RalA-GNP(PDB：1ZC4)、与sec5复合的RalA-GNP(PDB：1UAD)的晶体结构的晶体学坐标。AutoDock4用于初始库筛选。从ZINC数据库下载ChemDiv库[v2006.5，500,000种化合物，不包括那些在pH 7时具有反应性基团、已知ADME/毒性、物理化学性质位于“药物相似性”参数之外的化合物(Lipinski的5规则和Veber的2规则)数据库，并使用刚性对接方案对接在RalA-GDP上识别的位点。通过AutoDockTools中提供的配体制备模块将配体分子分配为Gasteiger电荷和极性氢原子。使用AutoDock4中的Lamarckian遗传算法来评估构象搜索空间上的配体结合能量。基于计算的相互作用能量对蛋白质-配体复合物进行评分和分选，随后目测检查最佳候选物，从而导致选择出88种化合物。
实施例2–基于细胞的功能测试
评价88种选择的化合物在培养的活细胞中抑制RalA活化的能力。
人膀胱癌细胞系J82和肺癌细胞系H2122、H358、H460和Calu6获自ATCC。所使用的抗体针对人RalA(BD Biosciences，#610222)、RalB(Millipore#04-037)和FLAG标签(Novagen#71097)。从Cytoskeleton(Denver，CO)获得Ras(#BK008)和RhoA(#BK036)的活性测定试剂盒。基于活性RalA-GTP与其效应蛋白RalBP1的选择性结合，我们使用用于Ral活性的ELISA。
将稳定过表达FLAG-RalA的J82细胞以每孔800,000个细胞接种在6孔板中，并允许孵育16小时。用500μl含有测试化合物(50μM)或DMSO对照(1小时；37℃)的新鲜培养基处理细胞。然后用冰冷的PBS洗涤细胞，并收集到冰冷的裂解缓冲液(750μl，含有50mM Tris(pH7.5),200mM NaCl，1％Igepal ca-630,10mM MgCl2，和蛋白酶抑制剂)中。通过离心将裂解物澄清，然后将上清液快速冷冻并储存在-80℃直至测试。对于ELISA测定，将HisGrab镍包被的96孔板条(Pierce，#15142)用ELISA缓冲液(200μl，由50mM Tris(pH 8.0),150mMNaCl，0.5％Tween 20和10mM MgCl2组成)洗涤三次。然后将RalBP1(0.5μg/100μl)加入孔中并在摇动下(2小时室温)温育。然后将板用200μl ELISA缓冲液洗涤三次。将平板置于冰上，将裂解物或裂解缓冲液对照(100μl)一式四份加入孔中。然后将平板在4℃摇动下培养过夜，随后用冰冷的ELISA缓冲液洗涤两次。然后以每孔100μl加入小鼠抗FLAG(Sigma，F1804)抗体(在ELISA缓冲液中1:20,000稀释)并孵育(1小时，4℃)。在三次洗涤后，以每孔100μl加入与HRP缀合的山羊抗小鼠抗体(Pierce，#31430)(1:2,500)并孵育(1小时，4℃)。在三次洗涤后将HRP底物(Vector Laboratories，#SK-4400)以100μl加入每个孔中，并在室温温育1小时。通过加入硫酸(100μl，2N)终止反应。在Biotek Synergy H1读板器(BioTekInstruments，Inc.，Winooski，VT)上在OD450读取吸光度；通过减去相同孔在OD540处的读数来将吸光度校正背景吸光度。
稳定表达FLAG标记的RalA的J82人膀胱癌细胞比由抗Ral抗体提供的蛋白检测改进了蛋白检测。这为测定提供了增强的动态范围。结合的RalA的量与相对活化状态成比例。
使用独立的方法来评估RalA活性，其是在鼠胚胎成纤维细胞(MEF)在纤连蛋白包被的盖玻片上扩散期间脂质筏胞吐所需的。简言之，将野生型或小窝蛋白-/-小鼠胚胎成纤维细胞饥饿24小时，用Accutase(Innovative Cell Technologies Inc.，San Diego，CA)从培养板分离，重悬于具有0.2％血清和0.5％甲基纤维素的DMEM中，并保持悬浮(90分钟，37℃)。在悬浮时，用抑制剂(50μM或DMSO对照，1小时)处理细胞。处理后，用含有0.2％血清的DMEM冲洗细胞一次，并将所有处理的等量细胞加入已经包被过夜(4℃，2μg/mL人纤连蛋白)的24孔板中。使细胞扩散30分钟，然后使用标准方案用甲醛固定。为了实现可视化，用Lava细胞(Active Motif)标记细胞，并在Nikon TE300荧光显微镜上显现。将每个孔的三个不同区域成像，并使用ImageJ(NIH)定量细胞扩散面积。
在这些细胞中，RalA的siRNA耗竭抑制扩散，而小窝蛋白(Cav1)-/-MEF对RalA耗竭有抗性。使用公开的序列从Dharmacon(Boulder，CO)获得针对人RalA和RalB或两者的siRNA。
实施例3-体外结合测试
为了证实化合物与靶标的直接结合，我们使用TROSY 15N-HSQC(TransverseRelaxation-Optimized Heteronuclear Single Quantum Coherence)NMR。在pET16b(Novagen)质粒中的RalB(Q72L突变体)是来自Dr.Darerca Owen(Cambridge University)的赠品。RalB用额外步骤纯化以负载GDP或不可水解形式的GTP(GMPNPP(GNP，Sigma-Aldrich))。在补充有15N-NH4Cl和13C-葡萄糖的M9培养基中产生均一的13C15N-双标记的蛋白质。在50mM磷酸钠(pH 7.6)、100mM NaCl和1mM MgCl2中制备用于NMR的样品。所有NMR实验在Agilent 900MHz系统上在25℃记录。RalB-GNP复合物的共振归属从先前公开的保藏在Biological Magnetic Resonance Bank(BMRB，代码：15230)的研究中获得。使用HNCACB、CBCA(CO)NH和COCNH-TOCSY实验独立地获得RalB-GDP复合物的化学位移归属。使用NMRPipe处理所有NMR数据，并使用CCPNMR分析程序分析。使用PINE通过自动分配然后手动验证来获得归属。在添加在氘化DMSO中重构的化合物后，使用15N-HSQC实验来监测来自RalB蛋白(100μM)的酰胺位移。最终样品中的DMSO浓度为0.5％或1％；对照样品用0.5％或1％氘化DMSO制备，并且将包含化合物的所有样品与其相应的DMSO对照进行比较。
因为只有与GNP复合的RalB的NMR结构已被解析(PDB代码2KE5，BMRB号15230)，所以我们集中于这种同工型(isoform)。首先确定RalB-GDP和RalB-GNP的15N-HSQC NMR谱，并分析化学位移差异。然后在RBC8或DMSO对照的存在下记录NMR谱。通过15N-HSQC蛋白酰胺峰的扰动来监测小分子与蛋白质的结合。在不存在和存在100μM RBC8下的RalB-GDP(100μM)的15N-HSQC谱显示位于变构位点中的代表性残基的峰位置的变化。另一方面，如NMR谱上的最小化学位移变化所指示，在相同条件下，RBC8不结合RalB-GNP。
基于包括结构特征的所有数据，合成一系列RBC8衍生物并在体外测试结合。我们选择BQU57和BQU85进行进一步评估，因为其具有与RBC8相比优异的性能和成药性质(图3A，图2)。
化合物BQU57和BQU85的合成方案示于图2A。
A.6-氨基-1,3-二甲基-4-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(BQU57)：将4-(三氟甲基)苯甲醛(500mg，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和三乙胺(400μL mL，2.87mmol)在乙醇(10mL)中搅拌1.0分钟，然后添加1H-吡唑-5(4H)-酮(321mg，2.87mmol)，加盖且在室温搅拌(22hr)，然后浓缩和通过色谱法纯化(SiO2；二氯甲烷中的2％MeOH)以得到BQU57(445mg，1.33mmol，46％产率)，其为黄色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO-D6：7.28(s，4H)，7.10(brs，2H)，4.64(s，1H)，3.57(s，3H)，1.64(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO-D6：160.1，147.6，144.7，143.9，142.9，129.9，122.3，121.4，120.6，96.2，58.2，36.8，33.9，12.8。
B.6-氨基-1-甲基-3-苯基-4-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(BQU085)：将4-(三氟甲氧基)苯甲醛(0.327g，1.72mmol，1.0当量)、丙二腈(0.114g，1.72mmol，1.0当量)和三乙胺(0.240mL，1.72mmol，1.0当量)在乙醇(6.0mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加1H-吡唑-5(4H)-酮(0.300g，1.72mmol)。22h后将反应混合物浓缩且通过硅胶柱色谱法纯化(2％甲醇在二氯甲烷中)以得到BQU_03_85(174mg，0.421mmol，25％)，其为黄色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.47-7.45(d，2H)，7.26-7.24(d，2H)，7.20-7.14(m，7H)，5.08(s，1H)，3.76(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.3，147.4，146.0，144.7，144.1，133.1，129.8，128.6，128.0，126.5，121.7，121.2，120.4，95.3，59.3，37.4，34.5。
进行BQU57和RalB-GDP之间结合的详细NMR滴定。在不存在(黑色)和存在100μMBQU57(品红色)下的RalB-GDP(100μM)的NMR谱示于图3B。经历剂量依赖性化学位移变化的代表性残基示于图3C。产生具有100μM BQU57的化学位移变化图(图3D)，并且表现出显著化学位移变化的大多数残基(突出的条)位于开关-II(aa 70-77)和螺旋α2(aa 78-85)区。在不存在RalB-GDP的晶体结构的情况下，基于与RalA-GDP的序列相似性产生同源性模型，并且在药物存在下经历化学位移变化的残基被映射到该模型上(图3E)。这表明大多数化学位移变化定位于变构位点，并确认BQU57与预测位点结合。与RBC8相似，BMR57(100μM)不结合RalB-GNP(100μM)，如NMR谱上的最小化学位移变化所示(图2B)。
NMR化学位移滴定的分析揭示了BQU57的结合是化学计量的，直到药物的表观极限溶解度(在没有蛋白质的对照实验中估计为约75μM)(图2C)。因此，然后使用等温滴定量热法(ITC)测定BQU57与RalB-GDP的结合。使用MicroCal iTC200系统进行ITC实验。蛋白质和药物都在50mM磷酸钠(pH 7.6),100mM NaCl和1mM MgCl2中制备。将最终DMSO浓度调节至1％。将RalB-GDP蛋白(500μM)装载到注射器中并滴定至药物(25μM)或作为对照的单独缓冲液中。所有实验在25℃进行。ITC产生KD＝7.7±0.6μM(图3F)。该结果由表面等离子体共振(SPR)证实。使用Biacore 3000系统进行SPR实验。运行缓冲液：PBS(pH7.4),1μM GDP，2mMMgCl2，3％DMSO。再生缓冲液：PBS(pH 7.4),1μM GDP，2mM MgCl2。RalB蛋白固定在CM5芯片上；将该运行缓冲液中的化合物BQU57的样品以30μL/min注射，共60秒接触时间，然后再生5分钟。SPR给出的KD为4.7±1.5μM，尽管测定的灵敏度低。
差示扫描荧光测定(DSF)用于评价化合物和RalB-GDP之间的结合。通过监测与蛋白质的疏水区域结合的SYPRO橙的增加来测量解链温度。通过制备在20mM Tris pH 8.0,200mM NaCl，2.5mM MgCl2和1mM DTT缓冲液中含有10μM RalB-GDP和10μM RalB-GPNPP、4xSYPRO橙的板来进行DSF。将测试化合物加入每个孔中，确保所有样品中DMSO的最终浓度为1％。热解链曲线在Light cycler 480(Roche)上获得。通过使曲线标准化并获得过渡曲线中点处的温度来获得解链温度。DSF证实BQU57和RalB-GDP之间的剂量依赖性结合，并且还证明了核苷酸依赖性。
实施例4–对体外人癌细胞生长的作用
评价RBC8和BQU57对人肺癌细胞生长的影响。因为众所周知Ral在不依赖贴壁中的作用，我们在软琼脂中进行生长抑制测定。四种人肺癌细胞H2122、H358、H460和Calu6用于一系列实验以确定药物摄取、生物学特异性和效果。为了在软琼脂中在非贴壁依赖性条件下测量人肺癌细胞的生长抑制，将细胞以每孔15,000个细胞接种到6孔板(用2ml的1％低熔点琼脂糖制成的基层包被)中，所述细胞在3ml含有各种浓度药物的0.4％低熔点琼脂糖中。在孵育后两至四周(取决于细胞系)，将细胞用1mg/ml MTT染色，并在显微镜下计数集落。IC50值定义为与DMSO处理的对照相比导致集落数减少50％的药物浓度。
对于siRNA处理诱导的生长效应，使用10所述的方法和序列用50nM针对RalA、RalB或两者(RalA/B)的siRNA转染细胞。72小时后，将细胞进行软琼脂集落形成测定。
对于化学遗传实验，将siRNA处理的细胞在各种浓度的药物存在下接种到软琼脂中。对于过表达实验，产生稳定过表达FLAG、FLAG-RalAG23V或FLAG-RalBG23V的H358细胞，并将细胞在药物存在下进行软琼脂集落形成测定。在H2122细胞中稳定过表达FLAG-RalAG23V或FLAG-RalBG23V的尝试不成功，并且在用FLAG、FLAG-RalAG23V或FLAG-RalBG23V瞬时转染72hrs后使用H2122进行拯救实验，其在药物的存在下使用软琼脂集落形成测定法。
为了定量测试化合物进入细胞的程度，将H2122人肺癌细胞以3×105个细胞/孔接种在6孔板中并静置16小时。分别给予化合物(10μM)，一式三份；然后在不同的时间点(1、5、15、30和60分钟)将细胞收集到500μl冰冷的ACN:MeOH:H2O(1:1:1)中。然后使用关于小鼠中的药代动力学和药效学研究所述的LC/MS-MS方法测定细胞裂解物中的药物浓度，在下文实施例5中详细描述。
测试RBC8、BQU57和BQU85的细胞摄取显示所有药物容易进入细胞(图6)。为了证实Ral活性在H2122和H358细胞中通过药物处理被抑制，我们进行了Ral活性下拉测定。细胞用药物处理3小时，收集并使用RalBP1下拉测定试剂盒(Millipore#14-415)测量Ral活性。RBC8和BQU57而不是RBC5抑制两种细胞系中的RalA和RalB活性(图6E)。
此外，发现所有细胞系对K-Ras siRNA耗竭敏感(图7A，7B)，但只有H2122和H358对Ral敲除敏感(图7C，7D)。使用这个特性来确定化合物对Ral相比Ras(一种密切相关的GTP酶)的特异性，我们评估了软琼脂中集落形成的抑制，注意到Ral依赖性细胞系H2122和H358敏感，而H460或Calu6细胞不敏感(图4A、B、K)。RBC8的IC50在H2122中为3.5μM，而在H358中为3.4μM；BQU57的IC50在H2122中为2.0μM且在H358中为1.3μM。接下来，进行化学基因组实验以进一步确定对Ral的药物特异性。用RBC8或BQU57处理具有siRNA敲除RalA和RalB的H2122和H358细胞不会导致显著的进一步抑制(图4C-4F，图7E)。总之，这个数据表明RBC8、BQU57和BQU85通过Ral抑制减少贴壁非依赖性生长。
为了解决与Ral的GTP形式相比，化合物对GDP形式的特异性，我们在H2122和H358细胞中过表达RalAG23V或RalBG23V的组成性活化形式。G23V突变阻止RalGAP介导的GTP水解的活化，因此将Ral锁定在其活性状态30。我们发现RalAG23V和RalBG23V都可以拯救化合物的生长抑制作用(图4G-4J，图7F)。
实施例5-体内药代动力学、药效学和肿瘤生长
在人肺癌小鼠模型中评价了Ral活性和肿瘤生长的抑制。首先在裸小鼠中分析RBC8和BQU57的药代动力学(PK)，以测试生物利用度。在单次腹膜内注射(50mg/Kg)后，在给药后0至5小时以时间间隔(9个时间点)收集血液样品。使用非隔室方法通过LC-MS/MS评估包括曲线下面积(AUC)、Cmax和t1/2的药代动力学参数，并显示定义良好药物候选物的有利性质(参见上文表1)。
我们接下来确定化合物进入肿瘤组织。为此，接受5至6周龄的无胸腺裸小鼠(Ncrnu/nu；National Cancer Institute，Fredrick，MD)，并使其在恒温和恒湿的无菌小隔离笼中适应2周。小鼠自由获得食物和水。在使用当天收获对数期生长的H2122细胞。将细胞悬浮于未补充的RPMI 1640培养基中，并将0.1mL(2×105个细胞)皮下注射，每个小鼠四个位点。对于H358异种移植物，将细胞(5×106个)与基质胶(最终浓度为20％)混合，并将0.1mL皮下接种于每个位点。细胞接种后，每天监测小鼠，每周称重两次，当肿瘤可见时开始测径器测量。通过(L×W2)/2计算肿瘤体积，其中L是肿瘤的较长测量值，W是肿瘤的较短测量值。药物治疗从接种后的第二天开始。将化合物溶解于DMSO中并以10/20/50mg/kg每天腹膜内注射(除了周末)。在对照(DMSO)或药物处理的动物中没有观察到明显的毒性，通过考虑肿瘤大小在内的对照和药物处理的动物之间的体重差异来评估。如图5A、B、G所示，在给药后3小时在肿瘤组织中检测到大量化合物。然后在裸小鼠中测试Ral抑制剂对异种移植物肿瘤生长的影响。小鼠皮下接种H2122人肺癌细胞，并在接种后24小时腹膜内用50mg/kg/d(除了周末)RBC8进行处理。RBC8以与RalA和RalB(图5E)的双敲除相同的数量级抑制肿瘤生长(图5C-D)，并且第二肺癌细胞系H358产生类似的结果。还在几种不同剂量(5、10、20和50mg/kg/d)体内测试BQU57和BQU85，观察到剂量依赖性生长抑制作用(图5F，5H)。
最后，我们在H2122异种移植物中评估体内Ral GTP酶活性。裸小鼠皮下接种5×106个H2122细胞，每个小鼠四个部位。肿瘤大小在10天内达到平均250mm3，此时小鼠被单次腹膜内给予不同浓度的RBC8或BQU57。然后在注射RBC8或BQU57 3小时后收集肿瘤。然后使用RalBP1下拉测定试剂盒(Millipore#14-415)测量肿瘤样品中的RalA和RalB活性。使用各自的下拉测定试剂盒测量肿瘤样品中的Ras和RhoA活性。所有活性测定使用蛋白印迹作为最终读数。为了定量免疫印迹，首先将每个印迹上的条带归一化为它们各自的内标(在最后一泳道中运行的10ng重组Ral、Ras或Ral蛋白)，然后比较不同印迹的数值，其中每一个表示一种处理条件。给予携带H2122肿瘤(中值大小250mm3)的小鼠单次腹膜内剂量的RBC8(50mg/kg)或BQU57(10/20/50mg/kg)，并且在给药后3小时收集肿瘤。Ral活性的RalBP1下拉测量显示RBC8和BQU57对RalA和RalB的显著抑制。重要的是，BQU57诱导的Ral活性的剂量依赖性抑制与肿瘤生长的抑制相关，并且还在BQU57处理的肿瘤中测量Ras和RhoA活性，没有观察到显著的抑制，进一步证明这些Ral抑制剂的选择性。
实施例6–本发明的化合物的合成
本发明的化合物根据以下合成方案和原料合成。
化合物合成方案
原料和方法
茴香醛、苯甲醛、1,4-苯并二氧杂环己二烯-6-甲醛、苄基-肼、6-溴-2-吡啶甲醛、氘代氯仿(CDCl3)、氘化二甲基亚砜(DMSO-d6)、3,5-二氟苯甲醛、乙酰乙酸乙酯、苯甲酰乙酸乙酯、3,4-二甲氧基苯甲酰基乙酸乙酯、乙基-氢化叩卟啉盐酸盐、4-甲氧基苯甲酰基乙酸乙酯、4-氟苯甲醛、3-氟-4-甲氧基苯甲醛、4-甲酰基苄腈、4-异丙基苯甲醛、4-(1H-咪唑-1-基)苯甲醛、丙二腈、甲基-肼、苯基-肼、3-吡啶甲醛、乙醇钠、三甲基胺(TEA)、2,4,6-三甲氧基苯甲醛和4-(三氟甲氧基)苯甲醛购自Sigma-Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO)。乙酸乙酯(EtOAc)、HPLC级甲醇(MeOH)、HPLC级乙腈(ACN)、HPLC级水(H2O)、甲酸、乙酸铵、己烷和二氯甲烷(DCM)获自Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)。乙醇购自DeconLaboratories，Inc.(King of Prussia，PA)。硅胶40-63μm购自SorbentTechnologies(Norcross，GA)。
使用400MHz Bruker NMR、Avance III 400记录1H和13C NMR谱。化学位移以ppm报告。使用配备有Shimadzu HPLC(Shimadzu Scientific Instruments，Inc.；Columbia，MD)和Leap自动进样器(LEAP Technologies；Carrboro，NC)的Applied Biosystems Sciex4000(Applied Biosystems；Foster City，CA)。液相色谱采用Agilent Technologies，Zorbax extended-C18 50×4.6mm，5微米柱，在40℃，流速为0.4mL/min。流动相由A：10mM(NH4OAc)于0.1％甲酸水溶液中和B：50:50ACN:MeOH组成。所用的色谱法为95％A 1.0分钟；在3.0分钟时上升至95％B并保持4.5分钟，最后，在8.5分钟时恢复至95％A并保持1.0分钟(总运行时间9.5分钟)。使用以下条件通过电喷雾电离正离子模式(ESI+)监测合成的化合物：i)5500V的离子喷雾电压；ii)温度，450℃；iii)气帘气(CUR；设定为10)和碰撞活化解离(CAD；设定为5)气体是氮气；iv)离子源气体一(GS1)和二(GS2)；v)入口电位设定为10V；vi)四极杆一(Q1)和(Q3)设置为单位分辨；vii)停留时间设定为200毫秒；和viii)去簇电压(declustering potential，DP)、碰撞能(CE)和碰撞池出口电位(CXP)是电压(V)。通过LC/MS-MS分析样品(10μL)。如通过NMR和LC/MS-MS分析判断，所有纯化的化合物纯度>97％。
合成:
3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5(4H)-酮(1)：将乙酰乙酸乙酯(9.02mL，71.2mmol)在EtOH(130mL)中的溶液在0℃用苯基-肼(7.00g，64.7mmol)处理。将混合物缓慢温热至室温，然后加热至60℃(3h)。真空去除溶剂且残余物通过硅胶柱色谱法纯化(EtOAc:己烷；1:1)以得到1(7.60g，43.6mmol，67％产率)，其为淡黄色粉末。1H-NMR(400MHz)CDCl3：7.87-7.85(d，2H)，7.41-7.37(t，2H)，7.19-7.16(t，1H)，3.42(s，2H)，2.19(s，3H)，13C-NMR(100MHz)CDCl3：170.5，156.2，138.0，128.8，125.0，118.8，43.0，17.0；LC/MS-MS：175.0→77.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝56，CE＝25，CXP＝4，tR＝3.52分钟。
1,3-二甲基-1H-吡唑-5(4H)-酮(2)：将乙酰乙酸乙酯(15.1mL，119mmol)在EtOH(200mL)中的溶液在0℃用甲基-肼(5.00g，109mmol)处理。将混合物缓慢温热至室温，然后加热至60℃(3h)。真空去除溶剂且残余物通过硅胶柱色谱法纯化(EtOAc:己烷；1:1)以在通过结晶(DCM和己烷)纯化后得到2(8.02g，71.5mmol，66％产率)，其为灰白色固体。1H-NMR(400MHz)CDCl3：3.25(s，3H)，3.16(s，2H)，2.08(s，3H)，13C-NMR(100MHz)CDCl3：172.2，155.4，138.0，41.3，31.0，16.8.LC/MS-MS：113.2→82.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝61，CE＝25，CXP＝4，tR＝2.9分钟。
1-甲基-3-苯基-1H-吡唑-5(4H)-酮(3)：将苯甲酰乙酸乙酯(18.4mL，95.5mmol)在EtOH(180mL)中的溶液在0℃用甲基-肼(4.57mL，86.8mmol.)处理。将混合物缓慢温热至室温，然后加热至60℃(3h)。真空去除溶剂且残余物通过硅胶柱色谱法纯化(EtOAc:己烷；1:1)以在通过结晶(乙醇)纯化后得到3(11.0g 63.1mmol，73％产率)，其为淡黄色固体。1H-NMR(400MHz)CDCl3：7.67-7.65(m，2H)，7.42-7.41(m，3H)，3.60(s，2H)，3.41(s，3H)，13C-NMR(100MHz)CDCl3：171.8，154.2，131.0，130.3，128.8，125.6，37.9，31.4.LC/MS-MS：175.0→77.2m/z；GS1和GS2在30，DP＝66，CE＝43，CXP＝4，tR＝3.45分钟。
1,3-二苯基-1H-吡唑-5(4H)-酮(4)：将苯甲酰乙酸乙酯(12.2mL，71.2mmol)在EtOH(130mL)中的溶液在0℃用苯基-肼(7.00g，71.2mmol.)处理。将混合物缓慢温热至室温且加热至60℃(3h)。真空去除溶剂且残余物通过硅胶柱色谱法纯化(EtOAc:己烷；1:4)且结晶(EtOH)以得到4，其为灰白色固体(6.75g，28.6mmol，44％产率)。1H-NMR(400MHz)DMSO：11.8(s，1H)，7.84-7.82(d，4H)，7.50-7.40(m，4H)，7.34-7.27(m，2H)，6.02(s，1H)，13C-NMR(100MHz)DMSO：154.2，150.0，139.3，133.8，129.3，129.0，128.2，126.1，125.5，121.5，85.5；LC/MS-MS：237.0→77.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝81，CE＝68，CXP＝4，tR＝4.15分钟。
1-苄基-3-苯基-1H-吡唑-5(4H)-酮(5)：将苯甲酰乙酸乙酯(4.80mL，28.2mmol)在EtOH(60mL)中的溶液在0℃用苄基-肼(5.00g，25.6mmol)处理。将混合物缓慢温热至室温且加热至60℃(16h)。将反应混合物浓缩且用EtOH(100mL)稀释，然后添加3.0g乙醇钠且搅拌(40h)。将固体过滤且真空去除溶剂。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(4:1己烷:EtOAc至100％EtOAc)以得到5(25.5mg，1.02mmol，4％产率)，其为浅橙色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：11.2(s，1H)，7.71-7.70(d，2H)，7.37-7.31(m，4H)，7.27-7.20(m，4H)，5.85(s，1H)，5.13(s，2H)，13C-NMR(100MHz)DMSO：153.6，148.6，138.3，134.4，128.8，128.7，127.6，127.5，125.1，83.7，50.0；LC/MS-MS：251.1→91.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝2，CE＝33，CXP＝14，tR＝4.01分钟。
3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5(4H)-酮(6)：将3,4-二甲氧基苯甲酰乙酸乙酯(5.00g，19.8mmol)在EtOH(60mL)中的溶液在0℃用甲基-肼(0.95mL,19.8mmol，1.0当量)处理。将混合物缓慢温热至室温且加热至60℃(3h)。真空去除溶剂且残余物通过硅胶色谱法纯化(己烷:EtOAc；4:1至1:1)以得到6(1.86g，7.94mmol，44％产率)，其为淡黄色粉末。1H-NMR(400MHz)CDCl3：7.35-7.35(d，1H)，7.06-7.04(dd，1H)，6.87-6.85(d，1H)，3.94(s，3H)，3.92(s，3H)，3.57(s，2H)，3.39(s，3H)；13C-NMR(100MHz)CDCl3：171.6，154.1，151.1，149.4，124.1，119.6，110.7，107.3，55.9，55.9，38.0，31.3；LC/MS-MS：235.1→219.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝66，CE＝33，CXP＝14，tR＝3.26分钟。
3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-苯基-1H-吡唑-5(4H)-酮：(7)：将3,4-二甲氧基苯甲酰乙酸乙酯(3.00g，11.9mmol.)在EtOH(60mL)中的溶液在0℃用苯基-肼(1.17mL，10.8mmol.)处理。将混合物缓慢温热至室温且加热至60℃(3h)。真空去除溶剂且残余物通过硅胶色谱法纯化(己烷:EtOAc；4:1至1:1)以在通过结晶(EtOH)纯化后得到7(920mg，2.32mmol，22％产率)，其为黄色粉末。1H-NMR(400MHz)CDCl3：8.00-7.97(d，1H)，7.48-7.42(m，3H)，7.25-7.21(t，1H)，7.17-7.14(dd，1H)，6.91-6.89(d，1H)，3.98(s，3H)，3.95(s，3H)，3.83(s，2H)；13C-NMR(100MHz)CDCl3：170.1，154.4，151.4，149.4，138.1，128.8，125.2，123.8，120.1，119.1，110.7，107.6，56.0，56.0，39.7；LC/MS-MS：297.0→218.2m/z；GS1和GS2在30，DP＝96，CE＝37，CXP＝18，tR＝3.98分钟。
3-(4-甲氧基苯基)-1-苯基-1H-吡唑-5(4H)-酮(8)：将4-甲氧基苯甲酰基乙酸乙酯(7.00g，27.8mmol)在EtOH(100mL)中的溶液在0℃用苯基-肼(2.50mL，25.3mmol)处理。将混合物缓慢温热至室温且加热至60℃(3h)。真空去除溶剂且残余物通过硅胶色谱法纯化(己烷:EtOAc；4:1至1:1)以在结晶(EtOH)后得到3-(4-甲氧基苯基)-1-苯基-1H-吡唑-5(4H)-酮(8；5.21g，19.6mmol，78％产率)，其为淡黄色固体。1H-NMR(400MHz)CDCl3：7.99-7.97(d，1H)，7.66-7.64(d，2H)，7.44-7.40(t，2H)，7.22-7.18(t，1H)，6.94-6.92(d，2H)，3.82(s，3H)，3.68(s，3H)；13C-NMR(100MHz)CDCl3：170.1，161.5，154.4，138.2，128.8，127.5，125.0，123.5，118.8，114.2，55.3，39.6；LC/MS-MS：267.0→77.2m/z；GS1和GS2在30，DP＝81，CE＝65，CXP＝4，tR＝4.15分钟。
3-(4-甲氧基苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5(4H)-酮(9)：将4-甲氧基苯甲酰基乙酸乙酯(7.00g，27.8mmol)在EtOH(100mL)中的溶液在0℃用甲基-肼(1.30mL，25.2mmol)处理。将混合物缓慢温热至室温且加热至60℃(3h)。真空去除溶剂且残余物通过硅胶色谱法纯化(己烷:EtOAc；4:1至1:1)以在从EtOH结晶后得到9(3.00g，14.7mmol，58％产率)，其为淡黄色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：10.9(s，1H)，7.63-7.60(d，2H)，6.92-6.90(d，2H)，5.70(s，1H)，3.76(s，3H)，3.54(s，3H)；13C-NMR(100MHz)CDCl3：161.1，153.4，147.9，126.3，114.6，114.4，83.1，59.7，31.3；LC/MS-MS：205.0→190.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝51，CE＝29，CXP＝12，tR＝3.44分钟。
6-氨基-1,3-二甲基-4-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(10)：将苯甲醛(290μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和TEA(400μL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加2(322mg，2.87mmol)。19h后将反应混合物浓缩且用EtOH和己烷洗涤。粗物质通过硅胶柱色谱法纯化(25％EtOAc的己烷溶液至100％EtOAc)，然后从EtOH重结晶以得到10(263mg，0.988mmol，34％产率)，其为黄色粉末。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.34-7.32(m，2H)，7.25-7.23(t，1H)，7.19-7.17(d，2H)，7.05(s，2H)，4.57(s，1H)，3.60(s，3H)，1.66(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.9，144.6，144.4，142.9，128.8，128.0，127.3，120.6，96.5，58.7，37.5，33.8，12.8；LC/MS-MS：267.0→201.3m/z；GS1和GS2在30，DP＝61，CE＝29，CXP＝12，tR＝3.74分钟。
6-氨基-1-甲基-3,4-二苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(11)：将由苯甲醛(290μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol,)和TEA(400μL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中组成的混合物搅拌1.0分钟，然后添加3(500mg，2.87mmol)。21h后将反应混合物浓缩且用EtOH和己烷洗涤；从EtOH重结晶以得到11(282mg，8.58mmol，30％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.41-7.38(m，2H)，7.28-7.24(m，2H)，7.21-7.18(m，6H)，4.88(s，1H)，4.77(s，2H)，3.83(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：158.1，146.0，144.8，144.6，133.2，128.7，128.5，127.9，127.8，127.1，126.4，120.5，95.7，59.9，38.2，34.5；LC/MS-MS：329.1→263.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝71，CE＝31，CXP＝18，tR＝4.00分钟。
6-氨基-3-甲基-1,4-二苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(12)：向苯甲醛(290μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和1(500mg，2.87mmol)在无水DCM(60mL)中的搅拌溶液中添加无水Na2SO4(407mg，2.87mmol)和乙基-氢化叩卟啉盐酸盐(46mg，0.122mmol)。将反应混合物在室温搅拌(25h)。过滤且用DCM洗涤后，在减压下去除溶剂。将粗混合物在进行快速硅胶柱色谱法(己烷:EtOAc；1:1)以得到12(270mg，0.822mmol，29％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)CDCl3：7.69-7.66(d，2H)，7.50-7.46(t，2H)，7.39-7.26(m，6H)，4.68(s，1H)，4.67(s，2H)，1.91(s，3H)，13C-NMR(100MHz)CDCl3：158.1，146.4，143.8，141.9，137.5，129.2，128.8，127.8，127.5，126.7，121.2，119.0，98.3，64.0，37.4，12.8；LC/MS-MS：329.1→263.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝56，CE＝31，CXP＝18，tR＝4.18分钟。
6-氨基-1,3,4-三苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(13)：将苯甲醛(290μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和TEA(400μL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加4(678mg，2.87mmol)。将沉淀过滤且用EtOH和己烷洗涤，且从EtOH重结晶以得到13(330mg，0.845mmol，29％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)CDCl3：7.82-7.80(d，2H)，7.55-7.50(m，4H)，7.41-7.37(t，1H)，7.32-7.22(m，8H)，4.96(s，1H)，4.68(s，2H)；13C-NMR(100MHz)CDCl3：157.5，147.7，144.9，142.6，137.5，132.2，129.3，128.8，128.2，128.1，127.5，127.4，127.1，126.9，121.6，118.9，97.5，64.8，38.2；LC/MS-MS：391.1→325.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝91，CE＝33，CXP＝22，tR＝4.33分钟。
6-氨基-3-(4-甲氧基苯基)-1,4-二苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(14)：将苯甲醛(290μL，2.87mmol，1.0当量)、丙二腈(190mg，2.87mmol，1.0当量)和TEA(400μL，2.87mmol，1.0当量)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加8(764mg，2.87mmol)。19h后将反应混合物浓缩且用EtOH和己烷洗涤，从EtOH重结晶以得到14(695mg，1.65mmol，58％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.94-7.92(d，2H)，7.58-7.53(m，4H)，7.41-7.37(t，1H)，7.27-7.16(m，7H)，6.83-6.81(d，2H)，5.04(s，1H)，3.71(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.5，159.0，146.6，145.6，144.5，137.9，129.8，128.9，128.3，128.0，127.3，127.1，125.1，121.1，120.3，114.1，97.5，59.8，55.5，37.9；LC/MS-MS：421.2→355.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝71，CE＝33，CXP＝24，tR＝4.3分钟。
6-氨基-3-(4-甲氧基苯基)-1-甲基-4-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(15)：将苯甲醛(290μL，2.87mmol，1.0当量)、丙二腈(190mg，2.87mmol，1.0当量)和TEA(400μL，2.87mmol，1.0当量)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加9(583mg，2.87mmol)。24h后将反应混合物浓缩。粗物质通过柱色谱法纯化(25％EtOAc的己烷溶液至100％EtOAc)，然后从EtOH重结晶以得到15(80.9mg，8％产率，0.226mmol)，其为黄色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.42-7.40(d，2H)，7.23-7.21(m，2H)，7.15-7.13(d，3H)，7.06(s，2H)，6.77-6.75(d，2H)，4.93(s，1H)，3.76(s，3H)，3.69(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.1，159.0，145.9，144.8，144.5，128.8，127.8，127.7，127.1，125.8，120.5，113.9，95.0，59.9，55.4，38.2，34.4；LC/MS-MS：359.1→293.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝76，CE＝31，CXP＝20，tR＝4.0分钟。
6-氨基-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-甲基-4-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(16)：将苯甲醛(145μL，1.44mmol)、丙二腈(90.0mg，1.44mmol)和TEA(200μL，1.44mmol)在EtOH(5.0mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加6(336mg，1.44mmol)。24h后将反应混合物浓缩。粗物质通过柱色谱法纯化(25％EtOAc的己烷溶液至100％EtOAc)，然后从EtOH重结晶以得到16(48.5mg，9％产率，0.124mmol)，其为黄色固体。1H-NMR(400MHz)CDCl3：7.29-7.28(d，2H)，7.23-7.21(d，2H)，7.00-6.98(d，1H)，6.88(s，1H)，6.72-6.70(d，2H)，4.84(s，1H)，4.75(s，2H)，3.82(s，6H)，3.60(s，3H)；13C-NMR(100MHz)CDCl3：157.6，148.7，148.6，146.1，145.7，143.1，128.9，127.5，127.4，125.6，119.3，119.2，110.9，109.7，94.7，64.4，55.7，55.6，38.3，34.1；LC/MS-MS：389.1→323.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝66，CE＝31，CXP＝22，tR＝3.82分钟。
6-氨基-4-(4-氟苯基)-1,3-二甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(17)：将4-氟苯甲醛(300μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和TEA(400mL，2.87mmol)在EtOH(8.0mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加2(322mg，2.87mmol)。24h后将反应混合物浓缩且用EtOH和己烷洗涤，且从EtOH重结晶以得到17(335mg，41％产率，1.17mmol)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.23-7.20(m，2H)，7.16-7.12(m，2H)，7.07(s，2H)，4.61(s，1H)，3.60(s，3H)，1.67(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：162.7，159.9(d)，144.6，142.9，140.7，129.9，120.6，115.5(d)，96.3，56.4，36.7，33.8，12.8；LC/MS-MS：285.1→219.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝61，CE＝27，CXP＝14，tR＝3.8分钟。
6-氨基-4-(4-氟苯基)-3-甲基-1-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(18)：将4-氟苯甲醛(356mg，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol，1.0当量)和TEA(400μL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加1(500mg，2.87mmol)。18h后将反应混合物浓缩且过滤沉淀并从EtOH重结晶以得到18(85.0mg，0.245mmol，9％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)CDCl3：7.68-7.66(d，2H)，7.50-7.46(t，2H)，7.34-7.32(t，1H)，7.28-7.22(m，2H)7.08-7.04(t，2H)，4.68(s，3H)，1.91(s，3H)；13C-NMR(100MHz)CDCl3：158.0，146.2，143.7，137.8，137.5，129.4，129.2，126.8，121.2，118.8，115.8，115.6，98.1，63.8，36.7，12.8；LC/MS-MS：347.1→281.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝11，CE＝31，CXP＝18，tR＝4.16分钟。
6-氨基-4-(4-氟苯基)-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(19)：将4-氟苯甲醛(300μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和TEA(400μL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加3(500mg，2.87mmol)。20h后将反应混合物真空浓缩且用EtOH和己烷洗涤，且从EtOH重结晶以得到19(182mg，0.525mmol，18％产率)，其为淡黄色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.50-7.48(d，2H)，7.22-7.18(m，5H)，7.11(s，2H)，7.05-6.98(t，2H)5.04(s，1H)，3.78(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：162.5，159.1，146.0，144.6，140.9，133.1，129.8(d)，128.5，127.9，126.5，120.4，115.4(d)，95.5，59.7，37.4，34.5；LC/MS-MS：347.1→281.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝66，CE＝31，CXP＝14，tR＝4.0分钟。
6-氨基-4-(4-氟苯基)-1,3-二苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(20)：将4-氟苯甲醛(300μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和TEA(400μL，2.87mmol)在乙醇(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加4(678mg，2.87mmol)。18h后，且形成的沉淀过滤出来且用EtOH和己烷洗涤，且从EtOH重结晶以得到20(240mg，0.588mmol，20％产率)，其为白色粉末。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.94-7.92(d，2H)，7.61-7.55(m，4H)，7.42-7.38(t，1H)，7.28-7.24(m，7H)，7.06-7.02(t，2H)，5.15(s，1H)，13C-NMR(100MHz)DMSO：162.6，159.0，146.8，145.6，140.6，137.8，132.5，130.0，129.9(d)，128.6，128.6，127.3，127.0，121.3，120.2，115.5(d)，97.9，59.6，37.0；LC/MS-MS：410.4→242.2m/z；GS1和GS2在30，DP＝21，CE＝47，CXP＝16，tR＝4.6分钟。
6-氨基-3-(3,4-二甲氧基苯基)-4-(4-氟苯基)-1-甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(21)：将4-氟苯甲醛(300μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol，1.0当量)和TEA(400μL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加6(672mg，2.87mmol)。17h后，形成的沉淀过滤出来且用EtOH和己烷洗涤，且从EtOH重结晶以得到21(782mg，1.93mmol，67％产率)，其为白色粉末。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.20-7.18(m，2H)，7.09-7.03(m，5H)，6.96-6.95(d，1H)，6.80-6.78(d，1H)，5.02(s，1H)，3.77(s，3H)，3.69(s，3H)，3.62(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：162.6，159.0，148.7，146.0，144.6，141.0，129.8，129.7，125.9，120.4，119.0，115.7，115.4，111.8，109.8，94.7，55.8，55.7，37.3，34.4；LC/MS-MS：407.1→341.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝71，CE＝33，CXP＝22，tR＝3.9分钟。
6-氨基-4-(4-氟苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-1-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(22)：将4-氟苯甲醛(300μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和TEA(400μL，2.87mmol，1.0当量)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加8(764mg，2.87mmol)。17h后，形成的沉淀过滤出来且用EtOH和己烷洗涤，且从EtOH重结晶以得到22(800mg，1.83mmol，64％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.93-7.91(d，2H)，7.55-7.53(m，4H)，7.41-7.37(t，1H)，7.26-7.23(m，4H)，7.07-7.05(t，2H)，6.84-6.82(d，2H)，5.11(s，1H)，3.72(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：162.6，159.0，146.6，145.5，140.7，140.6，137.9，130.0，129.9(d)，128.3，127.1，125.0，121.1，120.2，115.5(d)，114.1，97.3，59.6，55.5，37.0；LC/MS-MS：439.2→373.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝61，CE＝35，CXP＝24，tR＝4.3分钟。
6-氨基-3-(3,4-二甲氧基苯基)-4-(4-氟苯基)-1-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(23)：将4-氟苯甲醛(70.0μL，0.675mmol)、丙二腈(45.0mg，0.675mmol)和TEA(90.0μL，0.675mmol)在EtOH(3.0mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加7(200mg，0.675mmol)。19h后将反应混合物浓缩且粗物质通过柱色谱法纯化(25％EtOAc的己烷溶液至100％EtOAc)。该黄色固体进一步通过从EtOH重结晶而纯化以得到23(164mg，0.350mmol，12％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)CDCl3：7.80-7.78(d，2H)，7.52-7.48(t，2H)，7.38-7.35(t，1H)，7.25-7.21(m，2H)，7.05-6.95(m，4H)，6.75-6.73(d，1H)，4.91(s，1H)，4.84(s，2H)，3.84(s，3H)，3.71(s，3H)；13C-NMR(100MHz)CDCl3：163.2，157.8，149.2，148.7，147.5，144.9，138.6，137.4，129.3，129.1(d)，127.1，125.0，121.5，119.8，119.0，115.8(d)，110.8，109.9，96.6，64.0，55.8，55.7，37.5；LC/MS-MS：469.3→403.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝6，CE＝35，CXP＝26，tR＝4.2分钟。
6-氨基-4-(4-氟苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-1-甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(24)：将4-氟苯甲醛(300μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和TEA(400μL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加9(586mg，2.87mmol)。19h后将反应混合物浓缩且形成的沉淀用EtOH和己烷洗涤，从EtOH重结晶得到24(350mg，0.930mmol，32％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.43-7.40(d，2H)，7.20-7.16(m，2H)，7.10(s，2H)，7.06-7.02(t，2H)，6.78-6.76(d，2H)，4.99(s，1H)，3.75(s，3H)，3.69(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：162.5，159.1，145.8，144.6，141.0，141.0，129.8(d)，127.8，125.7，120.5，115.5(d)，113.9，94.9，59.7，55.4，37.4，34.4；LC/MS-MS：377.1→311.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝66，CE＝33，CXP＝20，tR＝4.0分钟。
6-氨基-4-(3,5-二氟苯基)-1,3-二甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(25)：将3,5-二氟苯甲醛(0.408g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌5分钟，然后添加2(0.321g，2.87mmol)。23h后将反应混合物浓缩且粗物质从EtOH重结晶且用EtOH和正己烷洗涤以得到25(291mg，0.963mmol，34％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.15(br-s，2H)，7.09-7.05(t，1H)，6.92-6.89(m，2H)，4.66(s，1H)，3.57(s，3H)，1.68(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：163.9(d，CF)，163.8(d，CF)，160.2，149.2(t)，144.8，142.9，120.4，111.2(m)，102.9(t)，95.4，57.5，37.1，33.9，12.8.LC/MS-MS：303.9→236.9m/z；GS1和GS2在30，DP＝11，CE＝31，CXP＝16，tR＝4.19分钟。
6-氨基-4-(3,5-二氟苯基)-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(26)：将3,5-二氟苯甲醛(0.408g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加3(0.500g，2.87mmol，1当量)。23h后将反应混合物浓缩且粗物质从EtOH重结晶以得到26(282mg，0.77mmol，27％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.48-7.47(d，2H)，7.24-7.17(m，5H)，6.97-6.92(m，1H)，6.87-6.85(d，2H)，5.11(s，1H)，3.74(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：163.5(d，CF)，163.5(d，CF)，159.5，146.1，144.7，133.0，128.6，128.1，126.6，126.5，120.2，111.3(d)，102.8，95.5，58.5，37.6，34.6.LC/MS-MS：365.1→299.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝86，CE＝27，CXP＝20，tR＝4.38分钟。
6-氨基-4-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-1-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(27)：将茴香醛(350μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和TEA(400μL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加1(500mg，2.87mmol)。24h后将反应混合物浓缩且沉淀物用EtOH和己烷洗涤，且从EtOH重结晶以得到27(800mg，78％产率，2.23mmol)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.80-7.78(d，2H)，7.51-7.47(t，2H)，7.32-7.28(t，1H)，7.18-7.16(m，4H)，6.91-6.89(d，2H)，4.62(s，1H)，3.74(s，3H)，1.79(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.7，158.6，145.7，144.2，138.0，136.0，129.7，129.2，126.5，120.5，120.3，114.3，99.3，59.0，55.4，36.4，13.0；LC/MS-MS：359.2→293.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝71，CE＝29，CXP＝20，tR＝4.14分钟。
6-氨基-4-(4-甲氧基苯基)-1,3-二甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(28)：将茴香醛(350μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和TEA(400μL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加2(321mg，2.87mmol)。24h后将反应混合物浓缩且粗物质通过柱色谱法纯化(25％EtOAc的己烷溶液至100％EtOAc)。黄色固体用EtOH和己烷洗涤，且从EtOH重结晶以得到28(370mg，1.25mmol，44％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)CDCl3：7.12-7.10(d，2H)，6.85-6.83(d，2H)，4.61(s，2H)，4.55(s，1H)，3.79(s，3H)，3.69(s，3H)，1.80(s，3H)；13C-NMR(100MHz)CDCl3：158.8，157.9，144.5，144.4，134.5，128.8，119.3，114.0，96.4，64.2，55.2，36.7，33.7，12.7；LC/MS-MS：297.0→231.2m/z；GS1和GS2在30，DP＝61，CE＝27，CXP＝16，tR＝3.71分钟。
6-氨基-4-(4-甲氧基苯基)-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(29)：将茴香醛(350μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和TEA(400μL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加3(500mg，2.87mmol)。24h后将反应混合物浓缩且沉淀物用EtOH和己烷洗涤，且产物从EtOH重结晶以得到29(210mg，20％产率，0.586mmol)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.50-7.48(d，2H)，7.21-7.17(m，3H)，7.05-7.02(m，4H)，6.76-6.74(d，2H)，4.91(s，1H)，3.76(s，3H)，3.64(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：158.9，158.3，146.0，144.6，136.9，133.2，128.9，128.5，127.8，126.4，120.6，114.1，95.9，60.3，55.3，37.5，34.5；LC/MS-MS：359.2→293.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝66，CE＝29，CXP＝20，tR＝3.98分钟。
6-氨基-4-(4-甲氧基苯基)-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(30)：将茴香醛(350μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和TEA(400μL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加4(678mg，2.87mmol)。24h后将反应混合物浓缩且沉淀物用EtOH和己烷洗涤。产物从EtOH重结晶以得到30(1.05g，87％产率，2.50mmol)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.94-7.92(d，2H)，7.63-7.61(d，2H)，7.57-7.53(t，2H)，7.40-7.36(t，1H)，7.29-7.23(m，3H)7.15(s，2H)，7.13-7.11(d，2H)，6.78-6.76(d，2H)，5.02(s，1H)，3.65(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：158.9，158.4，146.7，145.6，137.9，136.5，132.6，129.8，129.0，128.7，128.5，127.2，127.0，121.2，120.3，114.2，98.3，60.2，55.3，37.1；LC/MS-MS：421.2→355.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝81，CE＝35，CXP＝24，tR＝4.32分钟。
6-氨基-3,4-二(4-甲氧基苯基)-1-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(31)：将茴香醛(350μL，2.87mmol，1.0当量)、丙二腈(190mg，2.87mmol，1.0当量)和TEA(400μL，2.87mmol，1.0当量)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加8(764mg，2.87mmol)。24h后将反应混合物浓缩且沉淀物用EtOH和己烷洗涤，然后从EtOH重结晶以得到31(1.06g，2.35mmol，82％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.93-7.91(d，2H)，7.56-7.52(m，4H)，7.38-7.35(t，1H)，7.15-7.11(m，4H)，6.83-6.78(m，4H)，4.98(s，1H)，3.70(s，3H)，3.66(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.5，158.9，158.4，146.6，145.5，137.9，136.6，129.8，129.0，128.3，127.0，125.2，121.0，120.4，114.2，114.1，97.7，60.3，55.5，55.3，37.1；LC/MS-MS：452.3→89.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝36，CE＝39，CXP＝4，tR＝3.47分钟。
6-氨基-3,4-二(4-甲氧基苯基)-1-甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(32)：将茴香醛(350μL，2.87mmol)、丙二腈(190mg，2.87mmol)和TEA(400μL，2.87mmol)在乙醇(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加9(689mg，2.87mmol)。24h后将反应混合物浓缩且沉淀物用EtOH和己烷洗涤，然后从EtOH重结晶以得到32(690mg，1.78mmol，62％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.42-7.40(d，2H)，7.05-7.03(d，2H)，7.00(s，2H)，6.78-6.75(dd，4H)，4.86(s，1H)，3.73(s，3H)，3.68(s，3H)，3.66(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.0，158.9，158.3，145.9，144.5，136.9，128.9，127.7，125.9，120.6，114.1，113.9，95.3，60.3，55.4，55.3，37.5，34.3；LC/MS-MS：389.2→323.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝66，CE＝29，CXP＝22，tR＝3.94分钟。
6-氨基-4-(3-氟-4-甲氧基苯基)-1,3-二甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(33)：将3-氟-4-甲氧基苯甲醛(0.442g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌5分钟，然后添加2(0.321g，2.87mmol)。18h后将反应混合物浓缩且粗物质从EtOH重结晶且固体用EtOH和正己烷洗涤以得到31(475mg，1.51mmol，53％产率)，其为浅橙色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.10-7.04(m，3H)，6.95-6.93(m，2H)，4.53(s，1H)，3.79(s，3H)，3.56(s，3H)，1.65(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.9，153.0(d，CF)，146.4(d)，144.6，142.9，137.6(d)，124.1，120.6，115.4(d)，114.0，96.2，58.5，56.4，36.6，33.9，12.8.LC/MS-MS：315.0→248.9m/z；GS1和GS2在30，DP＝66，CE＝27，CXP＝16，tR＝4.05分钟。
6-氨基-1,3-二甲基-4-(2,4,6-三甲氧基苯基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(34)：将2,4,6-三甲氧基苯甲醛(0.563g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加2(0.321g，2.87mmol)。26h后将反应混合物浓缩。粗物质通过硅胶柱色谱法纯化(2％MeOH的DCM溶液)。黄色固体从EtOH重结晶且用EtOH和正己烷洗涤以得到34(60mg，0.168mmol，6％产率)，其为黄色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：6.72(s，2H)，6.20(brs，2H)，4.97(s，1H)，3.72(s，6H)，3.53(s，6H)，1.65(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：161.3，160.1，145.4，142.1，121.3，111.7，96.5，93.1，91.2，57.0，56.6，55.5，33.7，26.1，12.2.LC/MS-MS：357.1→189.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝56，CE＝29，CXP＝12，tR＝4.07分钟。
6-氨基-4-(3-氟-4-甲氧基苯基)-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(35)：将3-氟-4-甲氧基苯甲醛(0.442g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加3(0.500g，2.87mmol)。18h后将反应混合物浓缩且粗物质从EtOH重结晶以得到35(348mg，0.927mmol，33％产率)，其为浅白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.50-48(d，2H)，7.22-7.15(m，3H)，7.07(brs，2H)，6.97-6.89(m，3H)，4.96(s，1H)，3.74(s，3H)，3.71(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.1，152,8(d，CF)，146.1(d)，146.0，144.6，137.9(d)，133.2，128.6，127.9，126.5，124.0，120.5，115.2(d)，113.9，95.4，59.7，56.3，37.2，34.5.LC/MS-MS：377.1→311.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝66，CE＝31，CXP＝20，tR＝4.27分钟。
6-氨基-1,3-二甲基-4-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(36)：将4-(三氟甲基)苯甲醛(0.500g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加2(0.321g，2.87mmol)。22h后将反应混合物浓缩且通过硅胶柱色谱法纯化(2％MeOH的DCM溶液)以得到36(445mg，1.33mmol，46％产率)，其为黄色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.28(s，4H)，7.10(brs，2H)，4.64(s，1H)，3.57(s，3H)，1.64(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：160.1，147.6，144.7，143.9，142.9，129.9，122.3，121.4，120.6，96.2，58.2，36.8，33.9，12.8.LC/MS-MS：337.2→59.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝26，CE＝31，CXP＝10，tR＝5.10分钟。
6-氨基-1-甲基-3-苯基-4-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(37)：将4-(三氟甲基)苯甲醛(0.300g，1.72mmol)、丙二腈(0.114g，1.72mmol)和TEA(0.240mL，1.72mmol)在EtOH(6mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加3(300mg，1.72mmol)。22h后将反应混合物浓缩且通过硅胶柱色谱法纯化两次(2％MeOH的DCM溶液，然后EtOAc:己烷(1:1))，以得到37(120mg，0.301mmol，18％产率)，其为淡黄色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.58-7.56(d，2H)，7.49-7.47(d，2H)，7.37-7.35(d，2H)，7.20-7.17(m，5H)，5.17(s，1H)，3.77(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.4，149.3，146.1，144.7，133.0，128.8，128.6，128.0，126.4，126.0，125.7(d)，123.3，120.3，94.9，59.0，37.9，34.6.LC/MS-MS：397.1→331.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝96，CE＝33，CXP＝22，tR＝4.44分钟。
6-氨基-1,3-二甲基-4-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(38)：将4-(三氟甲氧基)苯甲醛(0.546g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加2(0.321g，2.87mmol)。22h后将反应混合物浓缩且通过硅胶柱色谱法纯化(2％MeOH的DCM溶液)以得到38(359mg，1.03mmol，36％产率)，其为橙色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.68-7.66(d，2H)，7.40-7.38(d，2H)，7.14(brs，2H)，4.71(s，1H)，3.58(s，3H)，1.64(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：160.2，149.2，144.7，142.9，129.0，127.2，125.9，124.1，120.5，95.8，57.8，37.2，33.9，12.8.LC/MS-MS：352.0→335.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝26，CE＝9，CXP＝24，tR＝4.31分钟。
6-氨基-1-甲基-3-苯基-4-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(39)：将4-(三氟甲氧基)苯甲醛(0.327g，1.72mmol)、丙二腈(0.114g，1.72mmol)和TEA(0.240mL，1.72mmol)在EtOH(6mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加3(300mg，1.72mmol)。22h后将反应混合物浓缩且通过硅胶柱色谱法纯化(2％MeOH的DCM溶液)以得到39(174mg，0.421mmol，25％产率)，其为黄色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.47-7.45(d，2H)，7.26-7.24(d，2H)，7.20-7.14(m，7H)，5.08(s，1H)，3.76(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.3，147.4，146.0，144.7，144.1，133.1，129.8，128.6，128.0，126.5，121.7，121.2，120.4，95.3，59.3，37.4，34.5.LC/MS-MS：413.1→346.9m/z；GS1和GS2在30，DP＝86，CE＝33，CXP＝24，tR＝4.49分钟。
6-氨基-4-(4-氰基苯基)-1,3-二甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(40)：将4-甲酰基苄腈(0.376g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加2(0.321g，2.87mmol)。18h后将反应混合物浓缩且粗物质通过硅胶柱色谱法纯化(2％MeOH的DCM溶液)。黄色固体用EtOH和正己烷洗涤，且从EtOH重结晶以得到40(484mg，1.66mmol，58％产率)，其为灰白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.78-7.76(d，2H)，7.38-7.36(d，2H)，7.17(brs，2H)，4.70(s，1H)，3.57(s，3H)，1.63(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：160.2，150.1，144.7，142.9，133.0，129.2，120.4，119.2，110.2，95.6，57.5，37.4，33.9，12.8.LC/MS-MS：292.0→226.2m/z；GS1和GS2在30，DP＝51，CE＝31，CXP＝14，tR＝3.90分钟。
6-氨基-4-(4-氰基苯基)-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(41)：将4-甲酰基苄腈(0.376g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加3(500mg，2.87mmol)。18h后将反应混合物浓缩且粗物质通过从EtOH和正己烷重结晶而纯化以得到41(160mg，0.453mmol，16％产率)，其为灰白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.68-7.66(d，2H)，7.48-7.46(d，2H)，7.35-7.33(d，2H)，7.22-7.19(m，5H)，5.17(s，1H)，3.77(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.4，150.2，146.1，144.7，133.0，132.8，129.1，128.7，128.1，126.5，120.2，119.1，110.0，94.7，58.6，38.0，34.6.LC/MS-MS：354.2→288.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝66，CE＝33，CXP＝20，tR＝4.21分钟。
6-氨基-4-(4-异丙基苯基)-1,3-二甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(42)：将4-异丙基苯甲醛(0.425g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加2(0.321g，2.87mmol)。22h后将反应混合物浓缩且过滤出沉淀物且用EtOH洗涤以得到42(163mg，0.528mmol，18％产率)，其为淡黄色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.16-7.14(d，2H)，7.05-7.03(d，2H)，6.99(s，2H)，4.50(s，1H)，3.56(s，3H)，2.85-2.79(m，1H)，1.64(s，3H)，1.17-1.15(d，6H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：160.0，147.2，144.6，142.9，141.9，127.9，126.7，120.8，96.7，58.8，37.1，33.9，33.4，24.3，12.9.LC/MS-MS：309.1→243.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝71，CE＝31，CXP＝16，tR＝4.44分钟。
6-氨基-4-(4-异丙基苯基)-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(43)：将4-异丙基苯甲醛(0.254g，1.72mmol)、丙二腈(0.114g，1.72mmol)和TEA(0.240mL，1.72mmol)在乙醇(6mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加3(0.300g，1.72mmol)。22h后将反应混合物浓缩且通过硅胶柱色谱法纯化两次(2％MeOH的DCM溶液，然后EtOAc:己烷；1:1))以得到43(207mg，0.559mmol，33％产率)，其为黄色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.50-7.48(d，2H)，7.22-7.16(m，3H)，7.09-7.02(m，6H)，4.92(s，1H)，3.76(s，3H)，2.80-2.73(m，1H)，1.12-1.10(d，6H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.2，147.1，146.1，144.5，142.3，133.3，128.6，127.9，127.7，126.7，126.4，120.7，95.9，60.1，37.9，34.5，33.3，24.2.LC/MS-MS：371.1→305.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝106，CE＝29，CXP＝20，tR＝4.60分钟。
6-氨基-4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己二烯-6-基)-1,3-二甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(44)：将1,4-苯并二氧杂环己二烯-6-甲醛(0.471g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌5分钟，然后添加2(0.321g，2.87mmol)。23h后将反应混合物浓缩且粗物质从EtOH重结晶且用EtOH和正己烷洗涤以得到44(131mg，0.404mmol，14％产率)，其为黄色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：6.98(brs，2H)，6.76-6.74(d，1H)，6.59-6.57(m，2H)，4.43(s，1H)，4.18(s，4H)，3.56(s，3H)，1.67(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.9，144.6，143.5，143.0，142.6，137.7，120.7，120.7，117.3，116.5，96.6，64.5，64.4，58.9，36.8，33.9，12.9.LC/MS-MS：325.0→259.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝51，CE＝29，CXP＝18，tR＝3.98分钟。
6-氨基-4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己二烯-6-基)-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(45)：将1,4-苯并二氧杂环己二烯-6-甲醛(0.471g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加3(0.500g，2.87mmol)。23h后将反应混合物浓缩且粗物质通过硅胶柱色谱法纯化(2％MeOH的DCM溶液)，然后从EtOH重结晶以得到45(93mg，0.240mmol，8％产率)，其为黄色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.53-7.51(d，2H)，7.25-7.18(m，3H)，7.03(brs，2H)，6.98-6.66(d，1H)，6.60-6.57(m，2H)，4.86(s，1H)，4.13(s，4H)，3.75(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.1，146.0，144.5，143.5，142.5，138.1，133.3，128.7，127.9，126.5，120.6，120.5，117.2，116.3，95.8，64.4，64.3，60.2，37.5，34.5.LC/MS-MS：387.1→321.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝66，CE＝31，CXP＝22，tR＝4.25分钟。
6-氨基-1,3-二甲基-4-(吡啶-4-基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(46)：将3-吡啶甲醛(0.307g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在乙醇(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加2(0.321g，2.87mmol)。22h后将反应混合物浓缩且通过硅胶柱色谱法纯化(2％MeOH的DCM溶液)且用EtOH洗涤以得到46(132mg，0.493mmol，17％产率)，其为浅橙色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：8.49-8.48(d，2H)，7.18-7.18(m，4H)，4.61(s，1H)，3.58(s，3H)，1.66(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：160.4，152.9，150.3，144.8，142.9，123.4，120.4，95.2，57.1，36.8，33.9，12.8.LC/MS-MS：268.0→189.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝56，CE＝25，CXP＝12，tR＝3.38分钟。
6-氨基-1-甲基-3-苯基-4-(吡啶-4-基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(47)：将3-吡啶甲醛(0.307g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加3(500mg，2.87mmol)。22h后将沉淀过滤且用EtOH和己烷洗涤以得到47(340mg，1.03mmol，36％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：8.38-8.36(dd，2H)，7.48-7.46(d，2H)，7.22-7.13(m，7H)，5.08(s，1H)，3.77(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.6，153.0，150.1，146.1，144.7，133.0，128.7，128.1，126.5，123.2，120.2，94.3，58.2，37.4，34.6.LC/MS-MS：330.1→80.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝76，CE＝63，CXP＝4，tR＝3.94分钟。
6-氨基-1,3-二甲基-4-(吡啶-3-基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(48)：将3-吡啶甲醛(0.307g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在乙醇(10mL)中的混合物搅拌5分钟，然后添加2(0.321g，2.87mmol)。22h后将反应混合物浓缩且将沉淀过滤并用EtOH洗涤以得到48(463mg，1.73mmol，60％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：8.43-8.43(d，2H)，7.53-7.51(d，1H)，7.34-7.31(m，1H)，7.14(brs，2H)，4.63(s，1H)，3.57(s，3H)，1.64(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：160.2，149.4，148.8，144.8，142.8，139.7，135.8，124.2，120.5，95.7，57.8，35.0，33.9，12.8.LC/MS-MS：268.0→189.2m/z；GS1和GS2在30，DP＝71，CE＝34，CXP＝12，tR＝3.5分钟。
6-氨基-1-甲基-3-苯基-4-(吡啶-3-基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(49)：将3-吡啶甲醛(0.307g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加3(500mg g，2.87mmol)。22h后形成白色沉淀且过滤。形成的沉淀用EtOH重结晶以得到49(389mg，1.19mmol，41％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：8.41-8.40(d，1H)，8.30-8.29(dd，1H)，7.49-7.47(d，3H)，7.23-7.16(m，6H)，5.12(s，1H)，3.77(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.4，149.3，148.5，146.1，144.7，139.9，135.6，133.0，128.6，128.0，126.5，124.0，120.4，94.8，58.9，35.6，34.6.LC/MS-MS：330.1→80.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝56，CE＝57，CXP＝14，tR＝3.96分钟。
6-氨基-4-(6-溴吡啶-2-基)-1,3-二甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(50)：将6-溴-2-吡啶甲醛(0.307g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加2(0.321g，2.87mmol)。22h后将反应混合物过滤且将沉淀过滤并用EtOH洗涤以得到50(427mg，1.23mmol，43％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.73-7.69(t，1H)，7.50-7.48(d，1H)，7.32-7.30(d，1H)，7.19(brs，2H)，4.69(s，1H)，3.56(s，3H)，1.71(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：164.4，160.7，144.7，142.9，141.4，140.8，127.0，122.0，120.5，95.3，56.3，39.3，33.9，12.8.LC/MS-MS：348.0→283.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝66，CE＝25，CXP＝18，tR＝4.00分钟。
6-氨基-4-(6-溴吡啶-2-基)-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(51)：将6-溴-2-吡啶甲醛(0.307g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加3(500g，2.87mmol)。22h后将反应混合物过滤且将沉淀过滤并用EtOH洗涤以得到51(971mg，2.38mmol，83％产率)，其为白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.59-7.53(t，1H)，7.52-7.50(d，2H)，7.38-7.35(d，1H)，7.30-7.26(d，1H)，7.24-7.21(m，5H)，5.12(s，1H)，3.76(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：164.4，160.0，146.0，144.7，141.2，140.5，133.0，128.6，128.1，126.9，126.4，122.2，120.2，94.6，57.5，39.3，34.5.LC/MS-MS：408.0→175.1m/z；GS1和GS2在30，DP＝86，CE＝31，CXP＝10，tR＝4.28分钟。
4-(4-(1H-咪唑-1-基)苯基)-6-氨基-1,3-二甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(52)：将4-(1H-咪唑-1-基)苯甲醛(0.494g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和TEA(0.40mL，2.87mmol)在EtOH(10mL)中的混合物搅拌1.0分钟，然后添加2(0.321g，2.87mmol)。22h后将反应混合物浓缩且通过硅胶柱色谱法纯化(2％MeOH的DCM溶液)以得到52(322mg，0.967mmol，34％产率)，其为浅棕色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：8.20(s，1H)，7.69(s，1H)，7.58-7.56(d，2H)，7.29-7.27(d，2H)，7.09-7.07(d，3H)，4.64(s，1H)，3.58(s，3H)，1.68(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：160.1，144.7，143.2，143.0，136.1，136.0，130.3，129.5，121.0，120.7，118.5，95.3，58.4，36.9，33.9，12.9.LC/MS-MS：333.3→266.9m/z；GS1和GS2在30，DP＝61，CE＝41，CXP＝18，tR＝3.4分钟。
4-(4-(1H-咪唑-1-基)苯基)-6-氨基-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(53)：将4-(1H-咪唑-1-基)苯甲醛(0.296g，1.72mmol)、丙二腈(0.114g，1.72mmol)和TEA(0.240mL，1.72mmol)在EtOH(6mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加3(0.300g，1.72mmol)。22h后将反应混合物浓缩且通过硅胶柱色谱法纯化(2％MeOH的DCM溶液)以得到53(308mg，0.780mmol，45％产率)，其为灰白色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：8.15(s，1H)，7.64(s，1H)，7.54-7.52(d，2H)，7.49-7.47(d，2H)，7.28-7.13(m，7H)，7.04(s，1H)，5.09(s，1H)，3.78(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.2145.1，144.6，143.5，135.9，135.9，133.2，130.2，129.3，128.7，128.0，126.5，120.7，120.5，118.4，95.4，59.6，37.6，34.6.LC/MS-MS：395.2→144.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝101，CE＝59，CXP＝8，tR＝3.89分钟。
化合物54
6-氨基-4-(5-溴噻吩-2-基)-1,3-二甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(54)：将5-溴噻吩-2-甲醛(0.548g，2.87mmol)、丙二腈(0.190g，2.87mmol)和三乙胺(0.40mL，2.87mmol)在乙醇(10mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加2(0.321g，2.87mmol)。22h后将反应混合物过滤且沉淀物用乙醇重结晶以得到54(221mg，0.628mmol，22％产率)，其为浅橙色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.18(s，2H)，7.02-7.02(d，1H)，6.86-6.85(d，1H)，4.93(s，1H)，3.56(s，3H)，1.81(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.9，151.9，144.2，143.1，130.3，126.0，120.3，110.8，95.8，58.3，33.9，33.2，12.8.LC/MS-MS：352.9→287.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝66，CE＝29，CXP＝18，tR＝4.3分钟。
化合物55
6-氨基-4-(5-溴噻吩-2-基)-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈(55)：将5-溴噻吩-2-甲醛(0.328g，1.72mmol)、丙二腈(0.114g，1.72mmol)和三乙胺(0.240mL，1.72mmol)在乙醇(6mL)中的混合物搅拌10分钟，然后添加3(0.300g，1.72mmol)。22h后将反应混合物浓缩且通过硅胶柱色谱法纯化(2％MeOH的DCM溶液)以得到55(80mg，0.194mmol，11％产率)，其为橙色固体。1H-NMR(400MHz)DMSO：7.61-7.59(d，2H)，7.30-7.23(m，5H)，6.92-6.91(d，1H)，6.78-6.77(d，1H)，5.41(s，1H)，3.74(s，3H)；13C-NMR(100MHz)DMSO：159.3，151.9，145.4，144.8，133.0，130.3，128.8，128.2，126.6，125.8，120.2，110.4，95.2，59.1，34.5，33.9.LC/MS-MS：415.1→348.0m/z；GS1和GS2在30，DP＝81，CE＝31，CXP＝22，tR＝4.5分钟。
本发明中已经呈现的前述实施例目的在于解释和说明。此外，这些实施例并不意欲将本发明限制为本文所公开的形式。因此，与本发明的说明书的教导以及相关领域的技术和知识相称的变型和修改，均在本发明的范围内。本文所提供的实施例中描述的具体实施方案意欲进一步解释已知的实施本发明的最佳方式并使得本领域的其它技术人员能够以这些或其它实施方案以及本发明的特定应用或使用所需的各种修改利用本发明。应将所附权利要求理解为包括现有技术所允许的限度内的替代实施方案。

Claims (18)

1.具有以下化学结构的化合物，及其药学上可接受的对映异构体、非对映异构体、外消旋体和盐：
其中：
R1选自氢、卤素、-OH、-O-R8、C1-C12烷基、C3-C12烯基、C4-C12二烯基、C6-C12三烯基、C8-C12四烯基、C6-C12芳基、取代的C6-C12芳基、C1-C12-烷氧基、羧基、氰基、C1-C12烷酰基氧基、C1-C12烷基硫基、C1-C12烷基磺酰基、C2-C12烷氧基羰基、C2-C12烷酰基氨基、S-R8、-SO2-R8、-NHSO2R8和-NHCO2R8；
R2选自氢、卤素、-OH、-O-R8、C1-C12烷基、C3-C12烯基、C4-C12二烯基、C6-C12三烯基、C8-C12四烯基、C6-C12芳基、取代的C6-C12芳基、C1-C12-烷氧基、羧基、氰基、C1-C12烷酰基氧基、C1-C12烷基硫基、C1-C12烷基磺酰基、C2-C12烷氧基羰基、C2-C12烷酰基氨基、S-R8、-SO2-R8、-NHSO2R8和-NHCO2R8；
R3、R4、R5、R6和R7独立地选自氢、卤素、-OH、-O-R8、C1-C12烷基、C3-C12烯基、C4-C12二烯基、C6-C12三烯基、C8-C12四烯基、咪唑、C6-C12芳基、C1-C12-烷氧基、羧基、氰基、C1-C12烷酰基氧基、C1-C12烷基硫基、C1-C12烷基磺酰基、C2-C12烷氧基羰基、C2-C12烷酰基氨基、S-R8、-SO2-R8、-NHSO2-R8、-NHCO2-R8、任选取代有1至3个选自以下的基团的C1-C12烷基：卤素、氧、C1-C6烷基、C6-C10芳基和C1-C6烷氧基，和任选取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素、C1-C6烷基、C6-C10芳基和C1-C6烷氧基；或
R3和R4一起形成环己烷、1,4-二噁烷或苯基；且
R8为任选取代有1至3个选自以下的基团的C1-C12烷基：卤素、氧、C1-C6烷基、C6-C10芳基、和C1-C6烷氧基，或任选取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素、C1-C6烷基、C6-C10芳基、和C1-C6烷氧基。
2.权利要求1所述的化合物，其中R1选自氢、甲基、苯基、甲基-苯基、甲氧基、取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基。
3.权利要求1所述的化合物，其中R2选自氢、甲基、苯基、甲基-苯基、甲氧基、取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基。
4.权利要求1所述的化合物，其中R3选自氢、卤素、甲氧基、任选取代有选自以下的基团的C1-C6烷基：卤素、氰基和咪唑，和取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素和C1-C6烷氧基。
5.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有以下化学结构：
6-氨基-1,3-二甲基-4-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈，
6-氨基-1-甲基-3-苯基-4-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈，
6-氨基-4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己二烯-6-基)-1,3-二甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈，和
6-氨基-4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己二烯-6-基)-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈。
6.药物组合物，其包含至少一种权利要求1的化合物和至少一种药物赋形剂。
7.药物包装，其包含权利要求6的药物组合物。
8.药物试剂盒，其包含权利要求6的药物组合物、该组合物的处方信息和容器。
9.在受试者中预防、治疗、改善癌症或预防癌症转移的方法，包括向需要的受试者给药治疗有效量的抑制Ral GTP酶的化合物及其药学上可接受的对映异构体、非对映异构体、外消旋体和盐，其中所述化合物具有以下化学结构：
其中：
R1选自氢、卤素、-OH、-O-R8、C1-C12烷基、C3-C12烯基、C4-C12二烯基、C6-C12三烯基、C8-C12四烯基、C6-C12芳基、取代的C6-C12芳基、C1-C12-烷氧基、羧基、氰基、C1-C12烷酰基氧基、C1-C12烷基硫基、C1-C12烷基磺酰基、C2-C12烷氧基羰基、C2-C12烷酰基氨基、S-R8、-SO2-R8、-NHSO2R8和-NHCO2R8；
R2选自氢、卤素、-OH、-O-R8、C1-C12烷基、C3-C12烯基、C4-C12二烯基、C6-C12三烯基、C8-C12四烯基、C6-C12芳基、取代的C6-C12芳基、C1-C12-烷氧基、羧基、氰基、C1-C12烷酰基氧基、C1-C12烷基硫基、C1-C12烷基磺酰基、C2-C12烷氧基羰基、C2-C12烷酰基氨基、S-R8、-SO2-R8、-NHSO2R8和-NHCO2R8；
R3、R4、R5、R6和R7独立地选自氢、卤素、-OH、-O-R8、C1-C12烷基、C3-C12烯基、C4-C12二烯基、C6-C12三烯基、C8-C12四烯基、咪唑、C6-C12芳基、C1-C12-烷氧基、羧基、氰基、C1-C12烷酰基氧基、C1-C12烷基硫基、C1-C12烷基磺酰基、C2-C12烷氧基羰基、C2-C12烷酰基氨基、S-R8、-SO2-R8、-NHSO2-R8、-NHCO2-R8、任选取代有1至3个选自以下的基团的C1-C12烷基：卤素、氧、C1-C6烷基、C6-C10芳基和C1-C6烷氧基，和任选取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素、C1-C6烷基、C6-C10芳基和C1-C6烷氧基；或
R3和R4一起形成环己烷、1,4-二噁烷或苯基；且,
R8为任选取代有1至3个选自以下的基团的C1-C12烷基：卤素、氧、C1-C6烷基、C6-C10芳基和C1-C6烷氧基，或任选取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素、C1-C6烷基、C6-C10芳基和C1-C6烷氧基。
10.权利要求9所述的方法，其中R1选自氢、甲基、苯基、甲基-苯基、甲氧基、取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基。
11.权利要求9所述的方法，其中R2选自氢、甲基、苯基、甲基-苯基、甲氧基、取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基。
12.权利要求9所述的方法，其中R3选自氢、卤素、甲氧基、任选取代有选自以下的基团的C1-C6烷基：卤素、氰基和咪唑，和取代有1至3个选自以下的基团的C6-C12芳基：卤素和C1-C6烷氧基。
13.权利要求9所述的方法，其中所述化合物具有以下化学结构：
6-氨基-1,3-二甲基-4-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈，
6-氨基-1-甲基-3-苯基-4-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈，
6-氨基-4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己二烯-6-基)-1,3-二甲基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈，和
6-氨基-4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己二烯-6-基)-1-甲基-3-苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈。
14.权利要求9所述的方法，其中所述化合物在药物组合物中给药于受试者。
15.权利要求14所述的方法，其中该药物组合物为适合肠胃外或口服给药的单相药物组合物，其基本上由治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体组成。
16.权利要求14所述的方法，其中该药物组合物与一种或多种香叶基香叶基转移酶I型(GGT酶-I)抑制剂、外科手术、化疗、放射、免疫治疗、或其组合联合给药。
17.具有选自以下的化学结构的化合物：
18.在受试者中预防、治疗、改善癌症或预防癌症转移的方法，包括向需要的受试者给药治疗有效量的抑制Ral GTP酶的化合物，其中所述化合物具有选自以下的化学结构：
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