CN114632147B - 人类受试者心肌病的治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明的药物能够靶向心肌细胞中SERCA2，正向调节SERCA2的活性；特别地能够正向调节心肌细胞中SERCA2的SR Ca2+再摄入。本发明的药物能够预防和治疗人受试者或其他脊柱动物的心肌病或心脏衰竭。
Description
技术领域
本发明涉及一种人类受试者的心肌病的治疗，特别地涉及一种利用RalGAPα-RalA信号模型正向调节心肌细胞中SERCA2的活性，从而对心脏提供保护。
背景技术
高血压及其相关的心血管和心脏疾病是世界范围内最主要的导致死亡的原因之一。高血压引起的压力超负荷能引起心脏功能障碍并导致心脏衰竭(Heart Failing)。发生心脏衰竭的计算终生风险预期随年龄增加将会增加。从60岁以下人群的低于2％到75岁以上人群的超过10％(Metra M,Teerlink JR,Lancet 2017；390:1981-1995)。而且，患有高血压的人处于心脏衰竭的较高风险中(Lloyd-Jones DM等，Circulation 2002；106:3068–3072)。心脏衰竭的患者具有不良预后，住院率和死亡率都较高。然而，高血压引起心脏衰竭的病理机制尚不清楚。
钙离子(Ca2+)在肌浆网(Sarcoplasmic Reticulum,SR)和心肌细胞胞液之间的循环决定了心脏收缩活动。压力超负荷影响心脏中Ca2+的循环并导致胞液中Ca2+增加，减弱了心脏的伸缩力。因此，无论心脏衰竭的触发机制是什么，细胞内SR的Ca2+摄取减少所引起的细胞内Ca2+的异常分布都是一个基础因素(Schwinger RH等，J Mol Cell Cardiol.1999；31(3):479-91；Bers D等，Ann N.Y.Acad Sci 2006；1080:165-177)。
肌浆网/内质网Ca2+ATP酶2(SERCA2)是一种ATP依赖的Ca2+转运泵，是调节从胞液中Ca2+的再摄取关键的酶。SERCA2的功能障碍在心脏衰竭中非常明显。已知SERCA2的功能受到多种机制的正向和负向调控。这些调控机制包括磷蛋白结合、磷酸化和类泛素化修饰。例如，磷蛋白的结合能够对SERCA2的活性产生抑制作用，减慢SR中Ca2+的再摄取。作为对照的，通过横纹肌优先表达的蛋白激酶(SPEG)的SERCA2 Thr484磷酸化则能增强Ca2+转运活性。类似地，SERCA2的类泛素化修饰能够维持ATPase的活性和稳定性，而其在衰竭的心脏中则明显减少。
由RalA和RalB组成的Ral-GTP酶是多种细胞过程的关键调控因子。虽然RalA和RalB有些重复，但是二者在许多过程中具有不同的功能。RalA和RalB的内在活性由其上游的调控因子Ral-GTP酶激活蛋白(RalGAP)复合物调控。RalGAP复合物将这两个小G蛋白RalA和RalB从GTP结合状态转换到GDP结合形式。已知两种催化作用的RalGAPα1和RalGAPα2能够分别与调控作用的RalGAPβ结合形成RalGAP复合物-1(或者RalGAPα1复合物，二者具有相同含义)和RalGAP复合物-2(或者RalGAPα2复合物，二者具有相同含义)。虽然RalGAP复合物-1和RalGAP复合物-2都在心脏中表达，但它们在心脏中的功能仍然是未知的。
发明内容
本发明涉及预防和治疗心肌病或心脏衰竭药物。在一些实施例中，本发明的药物能够靶向心肌细胞中SERCA2，正向调节SERCA2的活性；特别地能够正向调节心肌细胞中SERCA2的SR Ca2+再摄入。在一些实施例中，本发明的药物本身或者与其他药物联合通过调节SERCA2的功能调控心肌细胞中Ca2+的胞内平衡。在一些实施例中，本发明的药物能够正向调节SERCA2a寡聚化。在一些实施例中，本发明的药物能够预防和治疗人受试者或其他脊柱动物的心肌病或心脏衰竭。在一些实施例中，本发明的药物可以是生物制品，包括：蛋白、蛋白复合物、多肽和抗体。
在本发明的一个方面，本申请涉及一种药物组合物在制备预防或治疗心肌病方面药物的应用，其中所述药物组合物可以包括：RalGAPα1、RalGAPα2、RalGAPα1/β复合物、RalGAPα2/β复合物、RalA、GDP结合形式的RalA，或者它们的剪接变体，截短、片段、取代、添加或删除突变体，重组突变体，基序序列，融合蛋白和同系物、同源基因中的一者或多者。
特别地，所述心肌病由SERCA2介导的钙离子转运异常表征，例如心脏衰竭，特别是慢性心脏衰竭。
在本发明的另一个方面，本申请涉及一种药物组合物在制备正向调节SERCA2a寡聚化药物的应用，其中所述药物组合物包括：RalGAPα1、RalGAPα2、RalGAPα1/β复合物、RalGAPα2/β复合物、RalA、GDP结合形式的RalA，或者它们的剪接变体，截短、片段、取代、添加或删除突变体，重组突变体，基序序列，融合蛋白和同系物、同源基因中的一者或多者。
在本发明的另一个方面，本申请涉及一种药物组合物在制备正向调节SERCA2活性药物的应用，其中所述药物组合物包括：其中所述药物组合物包括：RalGAPα1、、RalGAPα2、RalGAPα1/β复合物、RalGAPα2/β复合物、RalA、GDP结合形式的RalA，或者它们的剪接变体，截短、片段、取代、添加或删除突变体，重组突变体，基序序列，融合蛋白和同系物、同源基因中的一者或多者。
本发明还提供了包含本发明生物制品或编码本发明生物制品的核酸分子组合物。这些组合物可适用于药物用途和对患者的给药。该组合物通常含有一种或多种本发明生物制品和药学上可接受的赋形剂。本文所用短语“药学上可接受的赋形剂”包括与药物给药相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是已知的。本发明生物制品的组合物还可包含提供补充，附加或增强治疗功能的其它活性化合物。
在一些实施例中，本发明的生物制品或者编码本发明生物制品的核酸分子可以包括在载体中，所述载体将保护生物制品或编码这些生物制品的核酸分子免于从体内迅速消除，和/或将生物制品递送至指定组织、器官。
在本发明的一个方面，本申请涉及一种药物组合物，包括：第一递送载体以及以下活性物质中的一种或多种：(1)RalGAPα1；(2)RalGAPα1/β复合物；(3)RalGAPα2；(4)RalGAPα2/β复合物；(5)RalA、GDP结合形式的RalA、或者(1)-(5)的剪接变体，截短、片段、取代、添加或删除突变体，重组突变体，基序序列，融合蛋白和同系物、同源基因中的一者或多者。
特别地，第一递送载体可以为例如控释制剂，包括植入物和脂质体、纳米粒、水凝胶、微球、微囊化递送系统等。第一递送载体可以使用可生物降解的，生物相容的聚合物，例如聚酯类、聚丙烯酸酯类及其共聚物，如聚乳酸及其共聚物、聚-β-羟基羧酸酯、乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、由甲基丙烯酸、丙烯酸盐及丙烯酸酯如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸丙二醇酯等单体聚合而成的聚丙烯酸等。制备这种制剂的方法对于本领域技术人员来说是已知的。在一些实施例中，第一递送载体为壳聚糖及其他多糖、藻酸盐、胶原、明胶、纤维蛋白、糖胺多糖、琼脂糖等。在一些实施例中，含有生物制品的脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载体。在一些实施例中，第一递送载体为纳米生物医学载体。
在本发明的另一个方面，本申请涉及一种药物组合物，包括：第二递送载体以及编码并能够在心肌细胞中表达以下活性物质中的一种或多种的核酸分子：(1)RalGAPα1；(2)RalGAPα1/β复合物；(3)RalGAPα2；(4)RalGAPα2/β复合物；(5)RalA、GDP结合形式的RalA；或者(1)-(5)的剪接变体，截短、片段、取代、添加或删除突变体，重组突变体，基序序列，融合蛋白和同系物、同源基因中的一者或多者。
如上所述的药物组合物可将编码本发明生物制品的DNA导入细胞，然后在细胞中表达由核酸分子编码的本发明的生物制品。特别地，本发明的生物制品的递送可使用第二递送载体实现。第二递送载体为重组表达载体如嵌合病毒或胶体分散系统或纳米生物医学载体、可用于将DNA导入细胞的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒或RNA病毒如逆转录病毒。在一些实施例中，胶体分散体系包括高分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和脂质基体系。脂质基体系包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。脂质体是可用作递送载体的人工膜囊泡。RNA、DNA或者完整的病毒粒子可以包封在含水的内部，并以生物活性形式递送到细胞。使用脂质体载体将基因有效转移到细胞中的方法是本领域已知的。脂质体的组合物通常包括磷脂的组合(典型地与类固醇，特别是胆固醇组合)，也可以使用其它磷脂或脂质。
特别地，在某些实施例中，本发明的生物制品为RalAS28N重组蛋白或者编码RalAS28N重组蛋白的核酸分子，其用于在心肌细胞中表达或过表达RalAS28N重组蛋白。
特别地，在某些实施例中，本发明的生物制品为腺相关病毒(AAV)系统中使用Ctnt启动子驱动的用于表达RalAS28N突变体的表达盒。通过静脉注射用于表达RalAS28N突变体的AAV病毒，能够在心脏中特异性表达RalAS28N突变体。
在一些实施例中，本发明提供正向调节心肌细胞中SERCA2活性的方法和用途；特别地，正向调节心肌细胞中SERCA2的SR Ca2+再摄入的方法和用途。进一步地，在一些实施例中，本发明还提供通过调节SERCA2的功能调控心肌细胞中Ca2+的胞内平衡。在一些实施例中，本发明还提供了正向调节SERCA2a寡聚化的方法和用途。在一些实施例中，本发明提供利用预防和治疗心肌病或心脏衰竭的方法和用途。
在一些实施例中，本申请涉及一种正向调节SERCA2a寡聚化的方法，包括：给予受试者有效量的如上任一所述的药物组合物。在一些实施例中，本申请涉及一种正向调节SERCA2活性的方法，包括：给予受试者有效量的如上任一所述的药物组合物。在一些实施例中，本申请涉及一种预防和治疗受试者心肌病的方法，包括：给予受试者有效量的如上任一所述的药物组合物。
本申请还涉及一种鉴定能够影响RalGAPα-RalA信号通路的物质的方法，包括：提供RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质的多肽或其片段、衍生物、同源物或突变体；在允许5’-ATP、5’-GTP和/或5’-GDP与所述多肽结合的条件下，将所述多肽或其片段、衍生物、同源物或突变体与测试物质接触；以及确定所述测试物质是否与所述多肽或其片段、衍生物、同源物或突变体结合。其中所述RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质包括RalGAPα1、RalGAPα1/β复合物、RalGAPα2、RalGAPα2/β复合物、RalA、GDP结合形式的RalA、以及SERCA2。
特别地，上述方法进一步包括将已被确定为能够结合所述多肽的物质施用于所述信号通路的任一多肽或其片段、衍生物、同源物或突变体。特别地，上述方法中所述任一多肽或其片段、衍生物、同源物或突变体已经重组产生。特别地，上述方法进一步包括：确定所述测试物质是否能够替换Ral-GDP信号通路上的所述任一多肽或其片段，而不影响原信号通路的活性。
本申请还涉及一种定量或定性检测受试者SERCA2活性的方法，包括：提供与RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质相互作用的物质；将所述与RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质相互作用的物质受试者的细胞，体液或组织接触；以及评估受试者RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质的含量。
特别地，本发明还提供可用作定量或定性检测SERCA2活性的诊断工具。例如，提供与RalGAPα1和/或RalGAPα1/β复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2/β复合物和/或GDP结合形式RalA相互作用的生物制品，例如抗原。这些生物制品可以是荧光标记的。样品可以与标记的生物制品一起孵育，过量的未结合的蛋白可以被洗去，然后可以评估该组织的荧光活性，其将指示存在RalGAPα1和/或RalGAPα1/β复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2/β复合物和/或GDP结合形式RalA。由此，与RalGAPα1和/或RalGAPα1/β复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2/β复合物和/或GDP结合形式RalA相互作用的生物制品可以用于检测细胞，体液，组织或生物体中是否存在RalGAPα1和/或RalGAPα1/β复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2/β复合物和/或GDP结合形式RalA及其含量。检测到的RalGAPα1和/或RalGAPα1/β复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2/β复合物和/或GDP结合形式RalA量可以与SERCA2的活性相关。
特别地，本发明还包括用于检测样品中RalGAPα1和/或RalGAPα1/β复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2/β复合物和/或GDP结合形式RalA的水平的试剂盒，其包括至少一种与RalGAPα1和/或RalGAPα1/β复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2/β复合物和/或GDP结合形式RalA相互作用的生物制品，例如抗原，无论它是标记的还是未标记的，和至少一种与该生物制品结合的试剂，例如标记的抗体。试剂盒还可以包括适当的生物标准品和对照样品，可以将实验检测的结果与之进行比较。
本申请还涉及一种检测受试者RalGAPα-RalA信号通路活性的方法，包括：获取受试者的体液或组织；以及检测体液或组织的第一细胞的转运Ca2+能力。特别地，上述方法还包括：获取RalGAPα-RalA信号通路相关基因的核酸；将获取的核酸表达在第二细胞中；以及检测第二细胞的转运Ca2+能力。特别地，所述第二细胞为非洲爪蟾卵母细胞。
本申请还涉及一种诊断受试者心肌病的方法，包括：提供与RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质相互作用的物质；将所述与RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质相互作用的物质受试者的细胞，体液或组织接触；以及评估受试者RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质的含量。
本申请还涉及一种诊断受试者心肌病的方法，包括：通过如上任一所述方法检测第一细胞或者第二细胞转运Ca2+能力。
附图说明
下面，将结合附图对本发明的优选实施方式进行进一步详细的说明，其中：
图1A-I显示根据本发明的一个实施例的压力超负荷心脏中RalGAPα1复合物的表达趋势；
图2A-H显示根据本发明的一个实施例的RalGAPα1缺陷导致小鼠心脏功能障碍并加剧TAC诱导的心肌病；
图3A-J显示根据本发明的一个实施例的SERCA2为与RalGAPα1复合物相互作用的靶标，并且RalGAPα1复合物调节心肌细胞中的SR Ca2+再摄取；
图4A-D显示根据本发明的一个实施例的GDP结合形式的RalA在RalGAPα1的下游调节SERCA2；
图5A-L显示根据本发明的一个实施例的RalGAPα1和RalA-GDP促进SERCA2a的寡聚化；
图6A-D显示根据本发明的一个实施例的GDP结合形式的RalAS28N突变体的表达针对TAC诱发的心肌病的保护；
图7显示根据本发明的一个实施例的RalGAPα1-RalA信号通路模型；以及
图8显示根据本发明的一个实施例的RalGAPα2缺陷导致新生大鼠原代心肌细胞中的SR Ca2+再摄取障碍。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下的详细描述中，可以参看作为本申请一部分用来说明本申请的特定实施例的各个说明书附图。在附图中，相似的附图标记在不同图式中描述大体上类似的组件。本申请的各个特定实施例在以下进行了足够详细的描述，使得具备本领域相关知识和技术的普通技术人员能够实施本申请的技术方案。应当理解，还可以利用其它实施例或者对本申请的实施例进行结构、逻辑或者电性的改变。
术语“约”是指由用于获得测量的设备的典型错误率而造成的测量例如体积、时间、压力、浓度等的数值的变化。在一个实施方式中，术语“约”意味着在所记载数值的5％-10％以内；优选地，术语“约”意味着在所记载数值的3％-5％以内。
术语“心脏衰竭”是指以典型症状(例如呼吸困难、踝关节肿胀和疲劳)为特征的临床综合征。在某些情况下，心脏衰竭可能伴有由结构性和功能性心脏异常引起的表现(例如颈静脉压升高、肺裂音和外周性水肿)，导致心输出量降低和/或休息时或应激期间心脏内压力升高。
术语“急性心脏衰竭”或“AHF”在本文可互换使用，并且通常是指心脏衰竭的症状和/或征兆的快速发作或恶化，需要立即治疗和住院。
术语“慢性心脏衰竭”或“CHF”在本文中可互换使用，并且是指当前基于心脏衰竭征兆和症状的存在以及左心室射血分数(LVEF)的慢性心脏衰竭的临床分类。CHF可分为三类：“射血分数降低的心脏衰竭”或“HFrEF”，其特征是LVEF小于约40％；“具有中程射血分数的心脏衰竭”或“HFmEF”或“HFmrEF”，其特征是LVEF为约40％至约49％；和“射血分数保留的心脏衰竭”或“HFpEF”，其特征是LVEF等于或大于约50％。术语“HFmrEF”和“HFpEF”包括两个附加标准，即利尿钠肽水平升高(BNP>35pg/ml和/或NT-proBNP>125pg/mL)并伴有结构和/或功能性心脏病的证据(左心室肥大和/或左心房增大和/或舒张功能障碍的证据)。
术语“治疗”是指在疾病或病症的治疗或改善中成功的任何标志。治疗可以包括例如降低或减轻疾病或病症的一种或多种症状的严重性，或者可以包括降低个体例如人类患者所经历的疾病、缺陷、障碍或不利病症等的症状出现的频率。
术语“预防”是指在个体例如人类患者中预防疾病或病症。例如，如果具有发生心脏衰竭的风险的个体应用本发明的方法治疗后不发生心脏衰竭，则在该个体中所述疾病已得到预防。
术语“治疗或预防”有时在本文中用于指称导致疾病或病症的某种程度的治疗或改善的方法，并且设想了指向该目的的各种结果，包括但不限于所述病症的完全阻止。
术语“活性成分”是指物质被施用到的个体提供有益效果的物质。“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是组合物或活性成分的足以为所述组合物或活性成分被施用到的个体提供有益效果的量。
术语“可药用载体”意味着可以与活性成分或包括活性成分的混合物组合并且在组合后可用于将所述化合物施用到哺乳动物的化学组合物。
术语“载体”将保护生物制品免于从体内迅速消除，以及将生物制品运送至功能区域。在本申请中，载体可将RalGAPα1、RalGAPα2、RalGAPα1/β复合物、、RalGAPα2/β复合物、RalA、GDP结合形式的RalA、RalAS28N或者GDP结合形式RalAS28N、SERCA2、SERCA2a寡聚体以及上述蛋白或核酸的剪接变体，截短、片段、取代、添加或删除突变体，重组突变体，基序序列，融合蛋白和同系物、同源基因运载至受试者体内。在本申请中，载体可以具有药物系统控缓释的特性，具有理想的释药速度和良好的缓控释效果。在本申请中，载体可以具有良好的生物相容性。生物降解性和生理性能。
术语“第一递送载体”主要为高分子生物材料，用于将蛋白质或多肽形式的生物制品，如包含RalGAPα1、RalGAPα2、RalGAPα1/β复合物、RalGAPα2/β复合物、RalA、GDP结合形式的RalA、RalAS28N或者GDP结合形式RalAS28N、SERCA2、SERCA2a寡聚体以及上述蛋白的剪接变体，截短、片段、取代、添加或删除突变体，重组突变体，基序序列，融合蛋白和同系物、同源基因运载至受试者体内。其中，第一递送载体包括：植入物，脂质体、纳米粒、水凝胶、微球、微囊化递送系统，以及纳米生物医学载体等。
术语“第二递送载体”主要用于将核酸分子，如包含RalGAPα1、RalGAPα2、RalGAPα1/β复合物、RalGAPα2/β复合物、RalA、GDP结合形式的RalA、RalAS28N或者GDP结合形式RalAS28N、SERCA2、SERCA2a以及上述核酸的剪接变体，截短、片段、取代、添加或删除突变体，重组突变体，基序序列和同系物、同源基因的DNA、RNA等运载至受试者体内，并在受试者体内表达或表达后释放至受试者体内。其中，第二递送载体包括：腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、牛痘病毒、RNA病毒如逆转录病毒，胶体分散体系以及纳米生物医学载体等。
所述载体在一些实施例中，本发明的生物制品可以包括在第一递送载体和/或第二递送载体中。
在一些实施例中，第一递送载体为例如控释制剂，包括植入物和脂质体、纳米粒、水凝胶、微球、微囊化递送系统等。第一递送载体可以使用可生物降解的，生物相容的聚合物，例如聚酯类、聚丙烯酸酯类及其共聚物，如聚乳酸及其共聚物、聚-β-羟基羧酸酯、乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、由甲基丙烯酸、丙烯酸盐及丙烯酸酯如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸丙二醇酯等单体聚合而成的聚丙烯酸等。制备这种制剂的方法对于本领域技术人员来说是已知的。在一些实施例中，第一递送载体为壳聚糖及其他多糖、藻酸盐、胶原、明胶、纤维蛋白、糖胺多糖、琼脂糖等。在一些实施例中，含有生物制品的脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载体。在一些实施例中，第一递送载体为纳米生物医学载体。
在一些实施例中，可将编码本发明生物制品的DNA导入细胞，然后在细胞中表达由DNA编码的本发明的生物制品。在一些实施例中，本发明的生物制品的递送可使用第二递送载体实现。在一些实施例中，第二递送载体为重组表达载体如嵌合病毒或胶体分散系统或纳米生物医学载体。可用于将DNA导入细胞的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒或RNA病毒如逆转录病毒。在一些实施例中，胶体分散体系包括高分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和脂质基体系。脂质基体系包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。脂质体是可用作递送载体的人工膜囊泡。RNA、DNA或者完整的病毒粒子可以包封在含水的内部，并以生物活性形式递送到细胞。使用脂质体载体将基因有效转移到细胞中的方法是本领域已知的。脂质体的组合物通常包括磷脂的组合(典型地与类固醇，特别是胆固醇组合)，也可以使用其它磷脂或脂质。
术语“RalGAPα-RalA信号通路”是指RalGAPα蛋白通过与小G蛋白RalA相互作用，进而调控心肌细胞SERCA2的Ca2+转导活性的信号通路。其中，RalGAPα蛋白可以是RalGAPα1或RalGAPα2。RalGAPα-RalA信号通路的蛋白质包括RalGAPα1、RalGAPα1/β复合物、RalGAPα2、RalGAPα2/β复合物、RalA、GDP结合形式的RalA、以及SERCA2。”
术语“RalGAPα1-RalA信号通路”是指RalGAPα1通过与小G蛋白RalA相互作用，进而调节心肌细胞SERCA2的Ca2+转导活性的信号通路。其中，GDP结合形式的RalA可直接调节SERCA2的Ca2+转导活性，而RalGAPα1与RalGAPβ结合而成的复合体可调节RalA的内在活性，进而调节SERCA2的Ca2+转导活性。
术语“基序序列”是指是指DNA、蛋白质等生物大分子中的保守序列，介于二级和三级结构之间的另一种结构层次。
术语“同系物”是指结构相似、分子组成相差若干个"CH2"原子团的有机化合物。
术语“同源基因”是指一类含有同源框的基因。
术语“融合蛋白”有两种不同的含义，一种是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。另一种含义就是介导两个细胞质膜融合的一组蛋白，
术语“表达盒”是指包含启动子，可以使得RalS28N特异在心肌细胞中表达的盒子。其中除启动子及RalS28N基因外，还包括运载该启动子和基因的载体等。
术语“复合物”是指两种或多种蛋白质的结合。这种结合可以是共价的或非共价的，包括例如复合物中两种蛋白质之间的离子、亲水性和疏水性相互作用。典型地，形成复合物的蛋白质彼此相互作用，使得鉴定或检测复合物中的第一蛋白质导致鉴定或检测与第一蛋白质形成复合物的一种或多种其它蛋白质。蛋白质复合物可以在体内鉴定，其中两种或多种蛋白质例如在细胞中自然地彼此结合以形成复合物。或者，可以在体外形成复合物，其中当将这些蛋白加入到相同的反应混合物中时，在两种或多种蛋白之间发生相互作用。
术语“RalGAPα1”、“RalGAPα2”、“RalGAPβ”、“RalA”、“RalB”、“GDP”以及“SERCA2”、“SERCA2a”均为序列已知且部分功能已知的基因，或基因表达的多肽、蛋白。其中，“RalGAPα1”序列见NCBI网站Gene ID:253959；“RalGAPα2”序列见NCBI网站Gene ID:5718；“RalGAPβ”序列见NCBI网站Gene ID:57148；“RalA”序列见NCBI网站Gene ID:5898；“RalB”序列见NCBI网站Gene ID:5899；以及“SERCA2”序列见NCBI网站Gene ID:488；“SERCA2a”序列见NCBI网站Gene ID:11938。SERCA2功能障碍是心脏衰竭的标志。因此，SERCA2功能的恢复是治疗这种疾病的有吸引力的策略。本发明基于发明人发现的RalGAPα1-RalA信号模型(参考图7)。RalGAPα1复合物与SERCA2相互作用，正向调节SERCA2的活性和SR Ca2+再摄取。RalGAPα1复合物的下游调节因子，GDP结合状态RalA决定了与SERCA2动态的相互作用。这一信号模型对于保护心脏功能至关重要。
由此，本发明提出利用RalGAPα1-RalA信号模型提供的调控SERCA2活性的方式预防和治疗心肌病或心脏衰竭药物。在一些实施例中，这样的药物可以是生物制品，包括：蛋白、蛋白复合物、多肽和抗体。如上所述，本发明的生物制品靶向心肌细胞中包含SERCA2的RalGAPα1-RalA信号通路。
在一些实施例中，这些药物包括RalGAP蛋白复合物，特别是催化亚基RalGAPα1与调控亚基RalGAPβ形成的复合物RalGAPα1/β，即RalGAPα1复合物，催化亚基RalGAPα2与调控亚基RalGAPβ形成的复合物RalGAPα2/β，即RalGAPα2复合物，以及RalGAPα1复合物的剪接变体，RalGAPα2复合物的剪接变体，截短，片段，取代，添加和删除突变，重组突变，基序序列，融合蛋白，同系物、同源基因等。在一些实施例中，这些药物包括RalGAPα1、RalGAPα2、RalGAPα1或RalGAPα2的剪接变体，截短，片段，取代，添加和删除突变，重组突变，基序序列，融合蛋白，同系物、同源基因等。在一些实施例中，这些药物包括RalA、GDP结合形式的RalA，以及RalA、GDP结合形式的RalA的剪接变体，截短，片段，取代，添加和删除突变，重组突变，基序序列，融合蛋白，同系物、同源基因等。例如：RalAS28N突变体。
在一些实施例中，本发明提供了包含本发明生物制品的组合物。这些组合物可适用于药物用途和对患者的给药。该组合物通常含有一种或多种本发明生物制品和药学上可接受的赋形剂。本文所用短语“药学上可接受的赋形剂”包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是已知的。本发明生物制品的组合物还可包含提供补充，附加或增强治疗功能的其它活性化合物。
在一些实施例中，本发明的生物制品可以包括在载体中，所述载体将保护生物制品免于从体内迅速消除，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的，生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原蛋白，聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的方法对于本领域技术人员来说是已知的。在一些实施例中，含有生物制品的脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载体。
在一些实施例中，可将编码本发明生物制品的DNA导入细胞，然后在细胞中表达由DNA编码的本发明的生物制品。在一些实施例中，本发明的生物制品的递送可使用重组表达载体如嵌合病毒或胶体分散系统来实现。可用于将DNA导入细胞的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒或RNA病毒如逆转录病毒。在一些实施例中，胶体分散体系包括高分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和脂质基体系。脂质基体系包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。脂质体是可用作递送载体的人工膜囊泡。RNA、DNA或者完整的病毒粒子可以包封在含水的内部，并以生物活性形式递送到细胞。使用脂质体载体将基因有效转移到细胞中的方法是本领域已知的。脂质体的组合物通常包括磷脂的组合(典型地与类固醇，特别是胆固醇组合)，也可以使用其它磷脂或脂质。
特别地，在某些实施例中，本发明的生物制品为RalAS28N重组蛋白或者编码RalAS28N重组蛋白的DNA分子，其用于在心肌细胞中表达或过表达RalAS28N重组蛋白。
特别地，在某些实施例中，本发明的生物制品为腺相关病毒(AAV)系统中使用Ctnt启动子驱动的用于表达RalAS28N突变体的表达盒。通过静脉注射用于表达RalAS28N突变体的AAV病毒，能够在心脏中特异性表达RalAS28N突变体。
RalGAPα1复合物/RalGAPα2复合物在压力超负荷引起的心肌病或心脏衰竭中发挥保护作用。RalGAPα1复合物/RalGAPα2复合物能够正向调节SERCA2活性，加速SR Ca2+再摄入。同样地，作为RalGAPα1复合物的下游调控因子，GDP结合形式的RalA也具有相同的功能。本申请所说的心肌病或心脏衰竭是由SERCA2介导的钙离子转运异常表征。在一些实施例中，其中心肌病是心脏衰竭。在一些实施例中，其中心肌病是慢性心脏衰竭。
进一步地，本发明提出了正向调节心肌细胞中SERCA2活性的方法和用途，特别是，正向调节心肌细胞中SERCA2的SR Ca2+再摄入的方法和用途。在一些实施例中，这些方法和用途包括给予人受试者有效量的本发明的生物制剂，例如RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2复合物和/或GDP结合形式的RalA或者其剪接变体，截短，片段，取代，添加和删除突变，重组突变，基序序列，融合蛋白，同系物、同源基因和/或GDP结合形式的RalA或者其剪接变体，截短，片段，取代，添加和删除突变，重组突变，基序序列，融合蛋白，同系物、同源基因等。在一些实施例中，以上这些方法和用途还包括将编码本发明的生物制品，例如RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2复合物和/或GDP结合形式RalA或其剪接变体，截短，片段，取代，添加和删除突变，重组突变，基序序列，融合蛋白，同系物、同源基因等的DNA分子，导入心肌细胞中。
受磷蛋白是众所周知的SERCA2调节剂，与Ca2+泵结合并施加抑制作用。与受磷蛋白的负向调节相反，RalA在与Ca2+泵结合后对SERCA2施加正向调节。受磷蛋白和RalA都受到严格调控，并表现出与SERCA2的动态相互作用。
由此，本发明还提出通过调节SERCA2的功能调控心肌细胞中Ca2+的胞内平衡的方法和用途。通过给予心肌细胞有效量的GDP结合形式的RalA或者受磷蛋白，能够通过与SERCA2的相互作用动态地正向或反向调节Ca2+的胞内平衡。在一些实施例中，以上的方法和用途包括给予人受试者有效量的本发明的生物制剂，例如RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2复合物和/或RalA和/或GDP结合形式的RalA或者其剪接变体，截短，片段，取代，添加和删除突变，重组突变，基序序列，融合蛋白，同系物、同源基因等。在一些实施例中，以上这些方法和用途还包括将编码本发明的生物制品，例如RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2复合物和/或RalA和/或GDP结合形式RalA或其剪接变体，截短，片段，取代，添加和删除突变，重组突变，基序序列，融合蛋白，同系物、同源基因等的DNA分子，如RalAS28N或者GDP结合形式RalAS28N，导入心肌细胞中。
GDP结合形式的RalA引起SERCA2的寡聚化，增加SERCA2的Ca2+转运活性但不增加其ATPase活性。然而，这种与GDP结合形式RalA的相互作用改变SERCA2配置以促进Ca2+泵的寡聚化并不依赖于Thr484的磷酸化。
由此，本发明还涉及正向调节SERCA2a寡聚化的方法和用途。通过给予心肌细胞有效量的GDP结合形式的RalA正向调节SERCA2a寡聚化。在一些实施例中，这些方法和用途包括给予人受试者有效量的式I化合物或含有式I化合物的组合物；或者给予人受试者有效量的本发明的生物制剂，例如RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2复合物和/或GDP结合形式的RalA或者其剪接变体，截短，片段，取代，添加和删除突变，重组突变，基序序列，融合蛋白，同系物、同源基因等。在一些实施例中，以上这些方法和用途还包括将编码本发明的生物制品，例如RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或GDP结合形式RalA或其剪接变体，截短，片段，取代，添加和删除突变，重组突变，基序序列，融合蛋白，同系物、同源基因等的DNA分子，如RalAS28N或者GDP结合形式RalAS28N，导入心肌细胞中。
RalGAPα-RalA信号通道模型通过调节SERCA2发挥作用，对Ca2+胞内平衡和维护心脏的功能至关重要，其不但在压力超负荷引起的心脏衰竭中发挥保护作用，对治疗继发的心脏衰竭也具有预防和治疗意义。由此，本发明还提出利用RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2复合物和/或GDP结合形式的RalA预防和治疗心肌病或心脏衰竭的方法和用途。在一些实施例中，这些方法和用途包括给予人受试者有效量的本发明的生物制剂，例如RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2复合物和/或GDP结合形式的RalA或者其剪接变体，截短，片段，取代，添加和删除突变，重组突变，基序序列，融合蛋白，同系物、同源基因等。在一些实施例中，以上这些方法和用途还包括将编码本发明的生物制品，例如RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2复合物和/或GDP结合形式RalA或其剪接变体，截短，片段，取代，添加和删除突变，重组突变，基序序列，融合蛋白，同系物、同源基因等的DNA分子，导入心肌细胞中。
在一些实施例中，本发明提供正向调节心肌细胞中SERCA2活性的方法和用途；特别地，正向调节心肌细胞中SERCA2的SR Ca2+再摄入的方法和用途。进一步地，在一些实施例中，本发明还提供通过调节SERCA2的功能调控心肌细胞中Ca2+的胞内平衡。在一些实施例中，本发明还提供了正向调节SERCA2a寡聚化的方法和用途。在一些实施例中，本发明提供利用预防和治疗心肌病或心脏衰竭的方法和用途。
在一些实施例中，本申请正向调节SERCA2a寡聚化的方法，包括：给予受试者有效量的如上任一药物组合物。在一些实施例中，本申请正向调节SERCA2活性的方法，包括：给予受试者有效量的如上任一药物组合物。在一些实施例中，本申请预防和治疗受试者心肌病的方法，包括：给予受试者有效量的如上任一药物组合物。在一些实施例中，其中心肌病是SERCA2介导的钙离子转运异常引起。其中所述心肌病是心脏衰竭，进一步地，心肌病是慢性心脏衰竭。
本发明还提供可用作定量或定性检测SERCA2活性的诊断工具。例如，提供与RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2复合物和/或RalAGDP和/或结合形式RalA相互作用的生物制品，例如抗原。这些生物制品可以是荧光标记的。样品可以与标记的生物制品一起孵育，过量的未结合的蛋白可以被洗去，然后可以评估该组织的荧光活性，其将指示存在RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2复合物和/或GDP结合形式RalA。由此，与RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2复合物和/或GDP结合形式RalA相互作用的生物制品可以用于检测细胞，体液，组织或生物体中是否存在RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2复合物和/或GDP结合形式RalA及其含量。检测到的RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2复合物和/或GDP结合形式RalA量可以与SERCA2的活性相关。
本发明还包括用于检测样品中RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2复合物和/或GDP结合形式RalA的水平的试剂盒，其包括至少一种与RalGAPα1和/或RalGAPα1复合物和/或RalGAPα2和/或RalGAPα2复合物和/或GDP结合形式RalA相互作用的生物制品，例如抗原，无论它是标记的还是未标记的，和至少一种与该生物制品结合的试剂，例如标记的抗体。试剂盒还可以包括适当的生物标准品和对照样品，可以将实验检测的结果与之进行比较。
在一些实施例中，定量或定性检测受试者SERCA2活性的方法，包括：提供与RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质相互作用的物质，该物质可以是基因、蛋白质、多肽，也可以是有机化合物、化合物组合物等。将该物质受试者的细胞，体液或组织接触，触发该物质与RalGAPα-RalA信号通路中任何一个蛋白、多肽或基因的互作。评估受试者RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质的含量。其中被评估的蛋白质可以是RalGAPα-RalA信号通路上的任何一种蛋白。
在一些实施例中，检测受试者RalGAPα-RalA信号通路活性的方法，包括：获取受试者的体液或组织，该体液或组织中包括RalGAPα-RalA信号通路中的全部组成部分。若该受试者心肌健康，则获取的体液或组织的细胞具有正常的钙离子转运活性；或该受试者患有心肌疾病，如心衰，则获取的体液或组织的细胞不能正常转运钙离子。检测体液或组织的第一细胞的转运Ca2+能力。其中，第一细胞为获取的受试者体液或者组织中的细胞。
在一些实施例中，检测受试者RalGAPα-RalA信号通路活性，还包括获取RalGAPα-RalA信号通路相关基因的核酸；并将获取的核酸表达在第二细胞中。其中第二细胞为可以体外表达基因的活细胞，如非洲爪蟾卵母细胞。检测第二细胞的转运Ca2+能力。
在一些实施例中，可以使用电生理技术检测第一细胞或第二细胞转运钙离子的能力。在一些实施例中，可以使用膜片钳技术检测第一细胞或第二细胞转运钙离子的能力。
在一些实施例中，诊断受试者心肌病的方法，包括：提供与RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质相互作用的物质；将该物质受试者的细胞，体液或组织接触；评估受试者RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质的含量。
在一些实施例中，可以通过检测、评估RalGAPα-RalA信号通路在第一细胞或者第二细胞中转运Ca2+能力诊断受试者是否患有心肌病。
实施例1：压力超负荷心脏中RalGAPα1复合物的表达增加
本实施例中通过观察两种RalGAP复合物及其下游的Ral小G蛋白在压力超负荷心脏中的表达，发现它们在高血压诱发的心肌病中所起的作用。
本实施例及以后实施例中所进行的蛋白组学方法可以按照如下的步骤进行。本实施例及以后实施例中使用的商业抗体参见如下表1：
| 抗体名称 | 公司名称 | 试剂盒 |
| anti-RalA | CST | #4799 |
| anti-HA | CST | #3724 |
| anti-RalB | Abclonal | WH079944 |
| anti-β-MHC | Sigma | t9283 |
| anti-Flag | Sigma | F9291 |
| anti-cTnT | Thermo Fisher | MA5-12960 |
| anti-DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8989 |
| anti-GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 |
| anti-GST | Abclonal | AE001 |
| anti-SERCA2a | Proteintech | 13985-1-AP |
| GAPDH | Proteintech | 60004-1 |
本实施例及以后实施例中用于目标基因的QPCR的引物参见如下表2：
| 基因名称 | 正向引物 | 反向引物 |
| RalGAPα1-Mus | 5′-AGATCAGACGGGAAGGTGTT-3′ | 5′-CTTGAAGGCTGAGTGGAGGA-3′ |
| RalGAPα2-Mus | 5′-CAGGAGTGGAGAAGGCAAGA-3′ | 5′-TGGGGCTGTAACCTTGAGAG-3′ |
| RalGAPβ-Mus | 5`-AAATCCAAGGAGCCACTGGA-3′ | 5′-GGCTCCAACTGCTTATTCCG-3′ |
| RalGAPα1-Rat | 5′-CCAGCACCACTTAGAGCCAA-3′ | 5′-GCGGCTTTTGCTAGTTCGAG-3′ |
| RalGAPa2-Rat | 5′-GTTCAGGTGAAATGGATCCTGC-3′ | 5′-TTCGGATGAGACCTCCTTGG-3′ |
| RalGAPβ-Rat | 5′-CCAGCTTATTTATCCAGCGTTATTC-3′ | 5′-ATGAGGGAGGGGCAACAAAG-3′ |
| RalA | 5′-ACAGGATGGCTGCAAACAAG-3′ | 5′-TGAACTGCAGAGTCAGAGCA-3′ |
| RalB | 5′-CTTTCCCTCCTCAACACCCT-3′ | 5′-AGCCTTCCCTTCATCTGCTT-3′ |
| β-MHC | 5`-ACCCCTACGATTATGCG-3′ | 5`-GTGACGTACTCGTTGCC-3′ |
| Rcan1.4 | 5`-GTGTGGCAAACGATGATGTC-3′ | 5`-AGGAACTCGGTCTTGTGCAG3′ |
| ANP | 5′-TCGTCTTGGCCTTTTGGCT-3′ | 5′-TCCAGGTGGTCTAGCAGGTTCT-3′ |
| BNP | 5′-AAGCTGCTGGAGCTGATAAGA-3′ | 5′-GTTACAGCCCAAACGACTGAC-3′ |
| CollAl | 5′-GGAGAGAGCATGACCGATGG-3′ | 5′-AAGTTCCGGTGTGACTCGTG-3′ |
| Col3A1 | 5′-CCCAGAACATTACATACCA-3′ | 5′-GATTAAAACAAGATGAACAC-3′ |
| Serca2a | 5′-ACTTCTTGATCCTCTACGTG-3′ | 5′-AAATGGTTTAGGAAGCGGTT-3′ |
| Pmcal | 5′-TTAGTCTGGGAAGCATTACAAGATGTCAC-3′ | 5′-CTTCTTCCCCAACAGAAACTTCTCC-3′ |
| Pmca4 | 5′-ACGTCTTCCCACCCAAGGTTC-3′ | 5′-CCAGCAGCCCACACTCTGTC-3′ |
| Ncx | 5′-GATCATCCGATTCCCTCTACTG-3′ | 5′-GTCAGTGGCTGCTTGTCATC-3′ |
| Ryr2 | 5′-TCAAACCACGAACACATTGAGG-3′ | 5′-AGGCGGTAAAACATGATGTCAG-3′ |
| Ltcc | 5′-CAATGGTCAATGAAAACACGA-3′ | 5′-GGCTCCCATAGTTGGAACCT-3′ |
| RalA-AAV | 5′-TACGATGAGTTTGTGGAGGACT-3′ | 5′-CTCCTGCCCAGCTGTATCTAAG-3′ |
| 36B4-Mus | 5′-TAAAGACTGGAGACAAGGTG-3′ | 5′-GTGTACTCAGTCTCCACAGA-3′ |
| 36B4-Rat | 5′-TCCAGAGGTACCATTGAAATCC-3′ | 5′-GTAGATGCTGCCATTGTCAAAC-3′ |
本实施例和其后实施例中使用的所有小鼠都在特定的无病原体条件下，以光/暗周期为12小时饲喂。除非特别说明，小鼠可以在笼子里自由获取食物和水。通过对麻醉的雄性小鼠(2-3个月大)进行TAC手术构建压力超负荷的心脏。具体而言，在小鼠腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)。对于实验组，通过手术暴露足弓主动脉并使用27号针头用6-0缝线结扎以产生一个直径为0.413毫米的收缩。对于作为对照的假手术组，小鼠接受相同的外科手术而只是不进行结扎。
随后，小鼠被处死以分离心脏组织。在裂解前，将小鼠心脏组织在液氮中速冻并储存在零下80℃。然后，在裂解缓冲液进行均质化再在冰上裂解30分钟，通过离心去除组织碎片获得组织裂解物。
通过用抗体偶联蛋白G-Sepharose或GFP结合剂在4℃下保持16小时进行目标蛋白的免疫沉淀。清洗树脂以去除非特异性结合蛋白，然后在SDS样品缓冲液中洗脱免疫沉淀复合物。
裂解物或免疫沉淀物被电泳分离。电泳后，分离的蛋白质被免疫印迹到硝酸纤维素膜与一抗孵育。在使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗进一步探测后，膜与HRP底物一起孵育以增强化学发光。
免疫沉淀复合物通过SDS-PAGE分离并通过考马斯蓝染色进行可视化。然后，在凝胶上切下感兴趣的蛋白质条带，并使用胰蛋白酶作为消化酶进行凝胶内消化，然后通过LC-MS/MS分析每个凝胶条带。
使用试剂从中提取总RNA，并使用/>RT试剂盒逆转录成cDNA。使用Roche Lightcycler Real-Time PCR系统和表2中列出的引物对感兴趣的基因进行QPCR分析。使用Prism软件通过两组的t检验或通过单向或双向方差分析对多组进行数据分析。在p<0.05时，差异被认为具有统计学意义。
本申请的发明人发现，压力超负荷心脏中在蛋白质水平上βMHC增加(参见图1A)。在假手术和TAC手术的心脏中Ralgapα1和Ralgapβ的mRNA水平相当而在接受TAC手术的心脏中二者的蛋白质水平显着增加(参见图1A-C)。相反，在TAC手术的心脏中，RalGAPα2的mRNA和蛋白质水平都没有变化(参见图1A-C)。在TAC手术的心脏中，RalGAP复合物下游的RalA和RalB在mRNA和蛋白质水平上都保持正常(参见图1A-C)。
血管紧张素II(Ang-II)和去甲肾上腺素(NE)是压力超负荷诱导的心肌病的神经激素的两个关键调节因子。NE治疗增加了原代新生大鼠心室心肌细胞(NRVC)中的RalGAPα1蛋白，但不增加其mRNA水平(参见图1D-F)。类似地，Ang-II刺激会增加其在初级NRVC中的蛋白质水平(参见图1G-I)。总之，这些数据表明RalGAPα1复合物在压力超负荷诱导的心肌病中起重要作用。
实施例2：RalGAPα1缺陷导致心脏功能障碍并加剧TAC诱导的心肌病
心肌细胞和成纤维细胞是心脏中的两个细胞群。尽管都存在于心脏中，RalGAPα1和α2都优先在心肌细胞中表达，而不是在心脏的成纤维细胞中表达(参见图2A)。在本实施例中，为了发现RalGAPα1在调节心脏功能中的作用，发明人生成了RalGAPα1心肌细胞特异性缺失小鼠模型(RalGAPα1-cKO)。
RalGAPα1f/f小鼠(其获得可参考文献：Chen Q,Rong P,Zhu S,Yang X,Ouyang Q,Wang HY,Chen S.Targeting ralgapalpha1 in skeletal muscle to simultaneouslyimprove postprandial glucose and lipid control.Sci Adv.2019；5:eaav4116)与αMHC-Cre小鼠(其获得可参考文献：Agah R,Frenkel PA,French BA,Michael LH,OverbeekPA,Schneider MD.Gene recombination in postmitotic cells.Targeted expressionof cre recombinase provokes cardiac-restricted,site-specific rearrangement inadult ventricular muscle in vivo.J Clin Invest.1997；100:169-179)用于产生心肌细胞特异性RalGAPα1敲除小鼠(RalGAPα1-cKO)。RalGAPα1f/f X RalGAPα1f/f-Cre交配被设置为产生RalGAPα1f/f(对照小鼠)和RalGAPα1f/f-Cre(RalGAPα1-cKO小鼠)。RalGAPα1f/f小鼠使用以下引物进行基因分型：
5’-GAGATGGCGCAACGCAATTAATG-3’和
5’-GGCTGCAAAGAGTAGGTAAAGTGCC-3’。
Cre小鼠使用以下引物进行基因分型：
5’-GCCTGCATTACCGGTCGATGC-3’和
5’-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC-3’。
同样地，对于上述小鼠心肌细胞进行蛋白质组学分析。进一步地，采用以下方式以获得小鼠心脏切片的图像：小鼠被处死以分离心脏。然后，在4℃下将心脏固定在4％PFA中过夜，并嵌入石蜡中。然后，使用Leica RM2016切片机将心脏切成5μm厚的切片。对心脏切片进行苏木精-伊红染色，并使用Olympus BX53F显微镜拍照。
正如预期的那样，通过将RalGAPα1f/f与αMHC-Cre小鼠交配，RalGAPα1在心脏中减少，但在其他组织(包括骨骼肌、肝脏、棕色脂肪组织和白色脂肪组织)并未改变(参见图2B)。心肌细胞的RalGAPα1特异性缺失不影响RalGAPα2的表达(参见图2B)。由于RalGAPβ的稳定性取决于RalGAPα，RalGAPβ在心脏中表现出适度减少，但在其他组织中保持正常(参见图2B)。这些数据表明，RalGAPα1-cKO小鼠及其衍生的心肌细胞适合研究RalGAPα1在心脏中的功能。
有趣的是，发明人发现心脏中RalGAPα1的缺陷会损害小鼠的心脏功能。RalGAPα1-cKO小鼠的射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)均显著低于RalGAPα1f/f同窝小鼠(参见图2C)。将RalGAPα1-cKO和RalGAPα1f/f小鼠进行TAC手术。非常重要的发现是手术后RalGAPα1-cKO小鼠的死亡率明显高于RalGAPα1f/f同窝小鼠(参见图2D)；同样，RalGAPα1-cKO小鼠的EF和FS也均低于对照小鼠(参见图2E-F)。随着心脏纤维化水平上升和心脏衰竭标志物(如Anp、Bnp、Col1a1和Col3a1)在RalGAPα1-cKO心脏中表达的增加(参见图2G-H)，与对照心脏相比，RalGAPα1的缺陷加剧了TAC诱导的心脏重构。这些数据表明RalGAPα1复合物的上调在压力超负荷的心脏中起着重要的保护作用。
实施例3：SERCA2为与RalGAPα1复合物相互作用的靶标，并且RalGAPα1复合物调节心肌细胞中的SR Ca2+再摄取
在本实施例中，采用蛋白质组学方法来鉴定RalGAPα1复合物相互作用的蛋白质，以明确RalGAPα1复合物调节心脏功能的机制。在HEK293细胞中表达GFP-RalGAPα1和HA-RalGAPβ，随后使用GFP-Trap珠对其进行免疫沉淀。通过质谱法鉴定与GFP-RalGAPα1免疫共沉淀的蛋白质。
人胚肾HEK293细胞购自中国医学科学院和北京协和医学院细胞资源中心(中国)，维持在含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基中，定期检测支原体。使用脂质体3000试剂(Thermo Fisher Scientific)进行细胞转染。
使用基于胶原酶方法分离原代小鼠心肌细胞。用胶原酶灌注肝素处理小鼠的心脏。胶原酶消化后，通过细胞过滤器(100μm筛孔)过滤细胞悬液以去除组织碎片。所得心肌细胞在Krebs-Henseleit缓冲液B中冲洗3次。
原代新生大鼠心肌细胞获自新生Sprague Dawley大鼠(出生后第0-3天)的心室。从新生大鼠中分离出心室并切成方块。用胰蛋白酶对心室方块进行顺序消化。通过细胞过滤器(70μm网孔大小)过滤细胞悬液以去除组织碎片。将得到的细胞接种在含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM中1小时以允许成纤维细胞沉降以去除。然后，将心肌细胞在新鲜的补充有10％(v/v)胎牛血清的DMEM中制片。原代新生心肌细胞使用脂质体3000试剂(ThermoFisher Scientific)转染。
基于Fluo-4-AM的方法测量心肌细胞中的钙瞬变。将心肌细胞培养在含有1mM的Hanks缓冲液中。加载Fluo-4-AM，利用GRASS S48刺激器使心肌细胞受到电刺激。使用蔡司LSM880共聚焦显微镜拍摄线扫描图像，并用IDL5.5(哈里斯地理空间解决方案)分析；其中，从钙瞬变峰值到衰落阶段从峰值到基础水平的63％的时间定义为衰减时间。
采用以下方法获得HEK293细胞中的钙成像：针对表达SERCA2a的HEK293细胞加载5μM Fluo-4-AM，然后用100μM ATP刺激。使用Olympus拍摄细胞的帧扫描图像。使用基于Di-8-ANEPPS的成像方法分析心肌细胞中t小管(TT)组织。将分离的原代心肌细胞用Di-8-ANEPPS染色。使用Carl Zeiss 880共聚焦显微镜获得细胞图像，并且对获得的图像进行快速傅立叶变换。在细胞图像的傅立叶光谱中使用ImageJ软件确定TT功率(峰值振幅)。
进一步地，分离含有粗制SR膜囊泡的微粒体以用于检测微粒体中SERCA2-ATPase活性。通过在含有100mM KCl、10mM HEPES(pH 7.4)、5mM MgCl2、100μM CaCl2、1.5mM ATP、2μM A23187和5mM叠氮化钠的测定缓冲液孵育微粒体(50μg蛋白质)进行ATP水解反应。在30℃下保持30分钟，并通过加入冰冷的10％TCA终止。水解反应是在不存在或存在5μM毒胡萝卜素的情况下进行，以分别确定总的和对毒胡萝卜素不敏感的钙泵数量。通过在总活性中减去毒胡萝卜素不敏感的Ca2+-ATPase活性来确定对毒胡萝卜素敏感的活性Ca2+-ATPase(SERCA2-ATPase)。
进一步地，分离含有粗制SR膜囊泡的微粒体以检测微粒体中Ca2+的摄取。使用基于Fura-2的方法测量Ca2+摄取。微粒体在含有2μM Fura-2游离酸的测定缓冲液(100mM KCl、10mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM草酸盐、5mM MgCl2和10μM钌红)中被重新悬浮。添加ATP(5mM)和Ca2+(2μM)以启动将Fura-2摄取到微粒体中。在340nM和380nM进行双激发，并使用荧光酶标仪在510nM记录发射的荧光。使用Clampfit 10.4(Molecular Devices)对游离Ca2+作图，并使用开始吸收后曲线的线性部分计算Ca2+摄取速率。
正如预期的那样，在免疫沉淀物中发现作为RalGAPα1的已知结合物RalGAPβ(参见图3A)。有趣的是，心脏Ca2+胞内平衡的关键调节因子SERCA2也被确定为RalGAPα1的潜在相互作用标靶(参见图3A)。通过蛋白质印迹免疫沉淀进一步验证了GFP-RalGAPα1免疫沉淀物中SERCA2的存在(参见图3B)。并且，内源性SERCA2与来自心脏裂解物免疫沉淀的内源性RalGAPα1免疫共沉淀(参见图3C)。
在HEK293细胞中过表达RalGAPα1，并测量了由添加ATP引起的Ca2+瞬变。Ca2+瞬变的半峰全持续时间(FDHM)和时间常数Tau是反映Ca2+重新摄取到ER中速率的两个量度，峰值是细胞溶质中Ca2+的量度。RalGAPα1的过表达导致HEK293细胞中Ca2+瞬变的FDHM和Tau显着降低，表明Ca2+加速重新摄取进入ER(参见图3D)。在过表达RalGAPα1的细胞中，Ca2+瞬变的峰值显着增加，表明细胞溶质中Ca2+的减少(参见图3D)。然后，使用小干扰RNA(siRNA)敲低NRVC中的RalGAPα1，并检查RalGAPα1减少对Ca2+瞬变的影响。结果发现，Ca2+瞬变的FDHM和Tau显着增加，而它们的峰值在RalGAPα1减少的NRVC中被压低(参见图3E)。因此，发明人发现，RalGAPα1复合物与SERCA2的相互作用表明其通过控制SR Ca2+再摄取来调节Ca2+胞内平衡。
心肌细胞RalGAPα1的特异性缺陷不影响心脏中Ltcc、Ncx和Ryr2的mRNA水平。在RalGAPα1-cKO小鼠的心脏中，SERCA2a的表达在mRNA和蛋白质水平上也都是正常的。分离原代心肌细胞并分析这些细胞中的Ca2+胞内平衡。t小管(TT)是心肌细胞中的内陷肌膜，其中含有富含离子通道和转运蛋白的膜微区。TT形成一个分支和互连的网络，它们的规律性在RalGAPα1缺陷细胞和对照细胞之间大体相当。测量由电刺激引起的原代心肌细胞中的Ca2+瞬变时发现，在RalGAPα1缺陷的心肌细胞中，Ca2+瞬变的FDHM和Tau显着增加(参见图3F-G)。如Ca2+瞬变幅度的减小所证明的，这种Ca2+重新摄取到SR的延长导致细胞溶质Ca2+升高(参见图3F-G)。细胞溶质Ca2+是通过钙调神经磷酸酶-NAFT途径表达Rcan1.4的诱导剂。与细胞溶质Ca2+升高一致，与RalGAPα1f/f对照心脏相比，RalGAPα1-cKO心脏中的Rcan1.4表达显着增加(参见图3H)。与对照细胞相比，RalGAPα1缺陷的心肌细胞中Ca2+的循环频率基本没有变化，这表明RalGAPα1缺陷可能不会影响从SR中自发的Ca2+释放。与Ca2+瞬时测定中延长的Ca2 +再摄取一致，与对照相比，SERCA2-ATPase活性和SR Ca2+转运在从RalGAPα1缺陷的心脏分离出来微粒体中均显着降低(参见图3I-J)。
这些数据表明RalGAPα1通过调节SERCA2介导的SR Ca2+再摄取来调控心肌细胞中的Ca2+胞内平衡。RalGAPα1的缺陷延长了心肌细胞中SR Ca2+的再摄取，这是RalGAPα1-cKO小鼠心脏功能障碍的基础。
实施例4：GDP结合形式的RalA在RalGAPα1的下游调节SERCA2
在本实施例中，进一步还分析了GDP结合的RalA与SERCA2的相互作用。RalGAPα1包括具有Asn1949为活性关键残基的功能性GAP结构域。当引入Asn1949Lys突变以使其GAP活性失活时，RalGAPα1在Ca2+瞬态分析中失去了加速Ca2+再摄取到ER中的能力。与野生型RalGAPα1相比，RalGAPα1的Asn1949Lys突变体既不能降低FDHM和Tau，也不能增加Ca2+瞬变的幅度(参见图3D)。对于RalA和RalB，RalGAPα1将这两种小G蛋白从GTP结合形式转化为GDP结合形式。发明人发现，当在HEK293细胞中共表达时，RalA而不是RalB与SERCA2相互作用(参见图4A)。令人惊奇的是，当在细胞中共表达时，GDP结合的RalAS28N突变体而不是GTP结合的RalAG23V突变体能够与SERCA2相互作用(参见图4A)。RalA的表达在RalGAPα1-cKO和RalGAPα1f/f小鼠的心脏之间大致相当，而RalA的GTP结合形式在RalGAPα1缺陷的心脏中如所预期地增加(参见图4B)。
因此，RalA的GDP结合形式在RalGAPα1缺陷的心脏中可能减少。更重要的是，RalAS28N突变体的表达，而非RalAG23V突变体的表达，降低了FDHM和Tau，并增加了HEK293细胞(图4C)或原代新生大鼠心肌细胞(图4D)中Ca2+瞬变的幅度。这表明RalA的GDP形式能够加速Ca2+重新摄取到SR。这些数据表明RalGAPα1通过RalA的GDP结合形式调节SERCA2a。
实施例5：RalGAPα1和RalA-GDP促进SERCA2a的寡聚化
在本实施例中，进一步研究了SERCA2a的寡聚化。如本领域技术人员所知，SERCA2a在单体和寡聚体之间切换，寡聚化能够增强其转运Ca2+的活性。有趣的是，SDS凝胶的可视化印迹显示，当其与HEK293细胞中的RalGAPα1/β复合物共表达时，SERCA2a的寡聚化显著增加(参见图5A)。SERCA2a的寡聚化在RalGAPα1-cKO心脏中则显著降低(参见图5B)。SERCA2a寡聚化的减少不是由于Thr484磷酸化引起的。在RalGAPα1-cKO心脏中，上游激酶SPEG也正常表达而并未改变。RalGAPα1对SERCA2a和寡聚化的影响由下游靶标RalA介导。当通过shRNA敲低细胞中的RalA时，RalGAPα1与SERCA2a的相互作用和RalGAPα1诱导的SERCA2a寡聚化均被阻止(参见图5C-D)。RalAS28N突变体的表达，而不是RalAG23V突变体的表达，提高了高分子量SERCA2a(～300kDa)的比例和促进了两个SERCA2a单体之间的相互作用(参见图5E-F)。
与RalGAPα1-cKO心脏中SERCA2a的功能受损(参见图3I-J)相一致，RalGAPα1的过表达增强了HEK293细胞中Ca2+泵的ATP酶水平和转运活性(参见图5G-H)。与RalAG23V突变体相比，RalAS28N突变体的表达显著增加了HEK293细胞中SERCA2a的Ca2+转运活性，但不影响其ATPase活性(参见图5I-J)。
进一步地，本实施例研究了RalA是否对SERCA2a产生直接影响以调节其Ca2+转运活性。在本实施例中，从大肠杆菌中表达并纯化了GST-RalAS28N重组蛋白，并发现它可以在GST-折叠测定中与Flag-SERCA2a相互作用(参见图5K)。重要的是，当将这种GST-RalAS28N重组蛋白添加到从表达Flag-SERCA2a的HEK293细胞纯化的微粒体中时，该GST-RalAS28N重组蛋白增加了SERCA2a的Ca2+转运活性(参见图5L)。这表明RalA直接激活SERCA2a的Ca2+转运。
这些数据表明RalGAPα1通过与GDP结合的RalA促进SERCA2寡聚化，以增强Ca2+泵的转运活动。RalGAPα1还可以通过与Ca2+泵的直接相互作用来调节SERCA2a的ATPase活性。
实施例6：GDP结合形式的RalAS28N突变体的表达针对TAC诱发的心肌病的保护
在本实施例中，通过实例证明了GDP结合形式的RalA的升高对治疗压力超负荷诱发的心肌病具有明确的治疗价值。在本实施例发现，RalAS28N突变体的表达恢复RalGAPα1减少的NRVC中的Ca2+胞内平衡。事实上，RalAS28N突变蛋白的表达逆转了RalGAPα1减少诱导的FDHM和Tau的增加，并缓解了由NRVC中的RalGAPα1缺陷引起Ca2+瞬态峰的压低(图6A)。
进一步地，在本实施例中构建了在腺相关病毒(AAV)系统中使用Ctnt启动子驱动的表达盒以在心脏中特异性表达RalAS28N突变体。通过骨骼肌和肝脏中mRNA和蛋白质水平上的分析，本实施例证实RalAS28N突变体仅在心脏中表达，而不在其他组织中表达(参见图6B)。在野生型小鼠中进行TAC手术和假手术。然后，在手术后2天通过静脉注射将作为对照的AAV(rAAV9-GFP)和表达RalAS28N的AAV(rAAV9-GFP/Flag-RalAS28N)针对小鼠给药(参见图6C)。对照组的AAV感染并没有改善TAC手术引起的心脏功能障碍。在手术后6周与假手术组对比，TAC组中感染AAV对照组的EF和FS两个都显著降低(参见图6D)。重要的是，TAC组中感染表达RalAS28N突变体的AAV的实验组阻止了TAC诱导的EF和FS下降(参见图6D)。这表明RalAS28N的表达有助于维持压力超负荷小鼠心脏的心脏功能。
实施例7：RalGAPα2缺陷导致新生大鼠原代心肌细胞中的SR Ca2+再摄取障碍
在本实施例中，在RalGAPα2的免疫沉淀物中发现SERCA2(参见图8A)。为了发现RalGAPα2在调节心脏功能中的作用，发明人使用小干扰RNA(siRNA)敲低NRVC中的RalGAPα2，并检查RalGAPα2减少对Ca2+瞬变的影响。结果发现，Ca2+瞬变的FDHM和Tau显著增加，而它们的峰值在RalGAPα2减少的NRVC中被压低(参见图8B)。RalGAPα2减少造成的Ca2+瞬变FDHM和Tau的增加可被RalAS28N逆转(参见图8C)。因此，发明人发现，RalGAPα2复合物与SERCA2的相互作用表明其通过RalA控制SR Ca2+再摄取来调节Ca2+胞内平衡。其实验过程已在前文阐释，此处不再赘述。
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本发明公开的范畴。
Claims (17)
1.一种药物组合物在制备治疗心肌病方面药物中的应用，其中所述药物组合物包括：RalGAPα1、RalGAPα2中的一者或多者。
2.一种药物组合物在制备治疗心肌病方面药物中的应用，其中所述药物组合物包括：RalGAPa1/β复合物、RalGAPa2/β复合物中的一者或多者。
3.一种药物组合物在制备治疗心肌病方面药物中的应用，其中所述药物组合物包括：GDP结合形式的RalA或GDP结合形式的RalAS28N中的一者或多者。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其中所述心肌病由SERCA2介导的钙离子转运异常表征。
5.根据权利要求4所述的应用，其中所述心肌病是心脏衰竭。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述心肌病是慢性心脏衰竭。
7.一种用于治疗心肌病的药物组合物，包括：第一递送载体以及以下活性物质：GDP结合形式的RalA。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中第一递送载体包括：植入物、水凝胶、微球、微囊化递送系统、以及纳米生物医学载体中的一者或多者。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其中第一递送载体包括：脂质体和/或纳米粒。
10.一种用于治疗心肌病的药物组合物，包括：第二递送载体以及编码并能够在心肌细胞中表达以下活性物质中的核酸分子：GDP结合形式的RalA。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中第二递送载体包括： RNA病毒和/或纳米生物医学载体。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中第二递送载体包括：腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒以及胶体分散体系中的一者或者多者。
13.根据权利要求11或12所述的药物组合物，其包括：使用 Ctnt 启动子驱动的用于表达RalAS28N 突变体的表达盒。
14.一种鉴定能够影响心肌细胞中RalGAPα-RalA信号通路的物质的方法，包括：
提供RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质的多肽；
在允许5’-ATP、5’-GTP和/或5’-GDP与所述多肽结合的条件下，将所述多肽与测试物质接触；以及
确定所述测试物质是否与所述多肽结合；
其中所述RalGAPα-RalA信号通路中蛋白质为GDP结合形式的RalA。
15.根据权利要求14所述的方法，进一步包括将已被确定为能够结合所述多肽的物质施用于所述信号通路的任一多肽。
16.根据权利要求14所述的方法，所述任一多肽已经重组产生。
17.根据权利要求14所述的方法，进一步包括：确定所述测试物质是否能够替换Ral-GDP信号通路上的所述任一多肽，而不影响原信号通路的活性。
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