JP6931218B2 - 細胞膜の損傷修復促進剤 - Google Patents
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Description
1−1 細胞株及び培養液
1)HEK293T細胞株(SV40 large T antigenを発現するヒト腎臓上皮由来細胞株)、及びC2C12細胞株(マウス筋芽細胞株)を、ATCC(American Type Culture Collection)より入手した。HEK293T細胞株及びC2C12細胞株は、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン/L−グルタミン、及び必須アミノ酸液を含むRPMI1640培養液(Wako社製、189−02025)を用い、5%CO2/20%O2、37℃条件下で培養した(以下、かかる培養液を単に「DMEM培養液」という)。
2)RH−30細胞株(不活性型p53を発現するヒト横紋筋肉腫細胞株)は、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン/L−グルタミン、及び必須アミノ酸液を含むRPMI1640培養液(GIBCO社製)を用い、5%CO2/20%O2、37℃条件下で培養した(以下、かかる培養液を単に「RPMI1640培養液」という)。
3)line107細胞(ディスフェルリン異常症患者由来の筋芽細胞株)、及びKM155細胞(健常者由来の筋芽細胞株)は、Jain Foundationより供与された(文献「Philippi, S., et al. Dysferlin deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr 4, RRN1298 (2012).」参照)。line107細胞及びKM155細胞は、20%ウシ胎児血清、2.5ng/mL HGF(Hepatocyte Growth Factor、Invitrogen社製)0.1μMデキサメタゾン(Sigma-Aldrich社製)、及び50μg/mlゲンタマイシンを含む1 vol 199培地(Invitrogen社製)/4 vol DMEMを用いて、5%CO2/20%O2、37℃条件下で培養した。なお、以下の表1に示す通り、line107細胞では、1つのアレルはスプライシング異常により、もう1つのアレルはミスセンスによりDYSF遺伝子の機能異常が引き起こされる。これらの変異により、line107細胞では、ディスフェルリンの299番目のグリシン(G)がアルギニン(R)に置換された変異ディスフェルリンタンパク質(G299R)が発現する。
ヒトディスフェルリンタンパク質アイソフォーム1(配列番号19)の第481〜第1140番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド(以下、「ディスフェルリン第II領域」ということがある)、前記第II領域中のN末端側の領域である第481〜第780番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド(以下、便宜上「ディスフェルリン第II−1領域」ということがある)、又は前記第II領域中のC末端側の領域である第661〜第1140番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド(以下、便宜上「ディスフェルリン第II−2領域」ということがある)をそれぞれコードする遺伝子領域を、ヒト臓器30種のcDNAクローン(Human Universal QUICK-Clone cDNA II、Clonetech社製)を鋳型としたPCRにより増幅した(図2参照)。得られた増幅産物を、制限酵素ZhoI又はSalIと、NotIとで処理し、MBPベクター(Clontech社製)のマルチクローニングサイト(MCS)に挿入することにより、MBPタグを付加したディスフェルリン第II領域、第II−1領域、及び第II−2領域ポリペプチドを発現する3種の発現ベクターを構築した。上記PCRに用いたプライマーセットは表2に示す。
定法に従って、上記「1−2」で構築した3種の発現ベクターを大腸菌(E. coli)に導入し、MBPタグを付加したディスフェルリン第II、第II−1、及び第II−2領域ポリペプチドを発現させた。得られた大腸菌の細胞抽出液に、抗MBP抗体結合ビーズ(Anti-MBP Magnetic Beads、NEW ENGLAND Biolabs社製)を加え、ローテーターを使用して4℃で2時間インキュベートした。インキュベート後のビーズを、NE緩衝液(50mM HEPES[pH7.5]、0.35M 塩化ナトリウム、0.1% NP−40、Protease inhibitor cocktail)で2回洗浄し(4℃、2,000rpm、2分間遠心)、次に、1.2M 塩化ナトリウム洗浄緩衝液(50mM HEPES[pH7.5]、1.2M 塩化ナトリウム)で2回洗浄した(4℃、2,000rpm、2分間遠心)。さらに、PBSで1回洗浄して(4℃、2,000rpm、2分間遠心)、3種のビーズ(ディスフェルリン第II結合ビーズ、ディスフェルリン第II−1結合ビーズ、及びディスフェルリン第II−2領域結合ビーズ)を作製した。
HEK293T細胞を15cmディッシュで70〜80%コンフルエントになるまで培養し、NE緩衝液で一度洗浄した後に回収した。回収した細胞を遠心して上清を除去し、得られたペレットにNE緩衝液を3〜4mL加えた後に、超音波破砕した。破砕したHEK293T細胞を、12,000rpmで30分間遠心し、上清を回収した。回収した上清に、RNaseI(10mg/mL)、DNaseI(10mg/mL)、及びBenzonase(50U/mL)を加え、タンパク質低吸着性フィルター(Φ0.45μm)で濾過し、HEK293T細胞抽出液を調製した。
上記「1−4」で調製した細胞抽出液に、上記「1−3」で作製した3種のビーズをそれぞれ加え、ローテーターを使用して4℃で3〜4時間インキュベートした。インキュベート後のビーズを1,200rpmで2分間遠心した後に、0.15M 塩化ナトリウム洗浄緩衝液(50mM HEPES[pH7.5]、0.15M 塩化ナトリウム、0.1% NP−40)で3回洗浄した(4℃、1,800rpm、2分間)。上清を除去した後に、さらに、PBSを加えて2回洗浄した(4℃、1,800rpm、2分間)。
洗浄後の各ビーズに溶出緩衝液(50mM HEPES[pH.7.5]、1.2M NaCl)を加え、チューブを3〜4回転倒攪拌した後に、遠心して(4℃、15,000rpm、2分間)、それぞれの上清を回収した。次に、得られた上清を、遠心式限外ろ過フィルター(アミコンウルトラ4、MERCK MILLIPORE社製)を用いて脱塩・濃縮し、ディスフェルリン第II、第II−1、又は第II−2領域に結合するタンパク質を含む溶液を調製した。
上記「1−6」で調製した溶液に、SDS−PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)用サンプルバッファー(2X)を等量混合して95℃で3分間加熱し、SDS−PAGE用サンプルを作製した。SDS−PAGE用サンプルをポリアミドゲル(5−20%SuperSep Ace、Wako社製)にアプライし、200V定電圧、60分間条件下でSDS−PAGEを行った。
上記「1−7」のSDS−PAGE後のポリアミドゲルを、Silver Stain MS Kit(Wako社製)を用いた銀染色した。銀染色により検出されたバンドを含むゲルを切り出し、定法に従って、脱色、システイン残基の還元処理、及びアルキル化処理を行った後、トリプシンによりゲル内消化を行った。消化されたペプチド断片を抽出して脱塩処理し、質量分析用試料を調製した。続いて、定法に従って、nanoLC−MS/MS装置(DiNa HPLC system、KYA TECH Corporation社製、QSTAR XL、Applied Biosystems社製)による上記質量分析用試料の解析を行った。得られた質量分析データからMascot search(MS/MS Ion Search)によりタンパク質を同定した。
また、上記「1−7」のSDS−PAGEの後のポリアミドゲルを、PVDFメンブレン(Polyvinylidene difluoride、Millipore社製)にセミドライ法により転写させ、5%BSA/PBS溶液(50mM Tris[pH7.6]、0.15M 塩化ナトリウム、0.05% Tween20)、又は5% スキムミルク/TBST溶液を用いてブロッキングした。次に、4種類の一次抗体(抗AMPKγ1ウサギポリクローナル抗体[ab32508、1:200倍希釈、abcam社製]、抗AMPKαウサギポリクローナル抗体[#2532、1:1,000倍希釈、CST社製]、抗リン酸化AMPKα[Thr172]ウサギポリクローナル抗体[#2531、1:1,000倍希釈、CST社製]、及び抗ディスフェルリンマウスモノクローナル抗体[NCL-Hamlet、1:500倍希釈、Novocastra社製])存在下、4℃で一晩インキュベートした。メンブレンをTBST溶液で3回洗浄した後、HRP標識抗ウサギIgG抗体(♯7074、1:2,000倍希釈、CST社製)、又はHRP標識抗マウスIgG抗体(♯7076、1:2,000倍希釈、CST社製)存在下、室温で1時間インキュベートした。メンブレンをTBST溶液で3回洗浄した後、ECL(enhanced chemiluminescence)prime試薬(GE Healthcare社製)による化学発光を行った。当該発光の検出は、LAS−3000イメージリーダー(富士フィルム社製)を用いて行った。
摘出した腓腹筋を、コルクの上にトラガントガム固定し、液体窒素で冷却したメチルブタン内で瞬間凍結させた。10μmの厚さの凍結切片を作製し、染色まで−80℃で冷凍保存した。凍結切片サンプルを、4%パラホルムアルデヒド溶液中で20分固定し、PBSで3回洗浄した後、ブロッキング溶液(5%ウシ血清アルブミン含有PBS)を用いて室内で1時間ブロッキングを行った。次いで、2種類の一次抗体(抗ディスフェルリンマウスモノクローナル抗体[NCL-Hamlet、1:500倍希釈、Novocastra社製]、及び抗AMPKγ1ウサギモノクローナル抗体[ab32382、1:500倍希釈、abcam社製])存在下、4℃で一晩インキュベートした。凍結切片サンプルを、PBSで3回洗浄した後、Alexa Fluor 488標識抗マウスIgG抗体(Life Technologies社製)及びAlexa Fluor 555標識抗ウサギIgG抗体(Life Technologies社製)存在下、室温で1時間インキュベートした。凍結切片サンプルをPBSで3回洗浄し、Vectashieldマウンティングメディウム(Vector Labs社製)を用いて封入した。蛍光画像は、蛍光顕微鏡(BZ-X700、キーエンス社製)を用いて40倍の倍率で取得した。
カルシウムイオノフォア(イオノマイシン、Wako社製)をDMSO中に溶解し、1mmoL/Lのイオノマイシンストック溶液を調整した。かかるストック溶液を、DMEM培養液を用いて10μmoL/Lの濃度に調整し、イオノマイシンの濃度が最終的に1μmとなるように、培養プレートに加えた。37℃で3分間培養した後、培養細胞からのタンパク質の抽出を行った。
以下の表3に示すSilencer Select siRNAs(Life Technologies社製)を、リポフェクション試薬(lipofectamine RNAiMAX、Life Technologies社製)を用いて、C2C12細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションは、リポフェクション試薬に添付の使用説明書に従って行った。
AMPKを構成する3種のサブユニットをコードする遺伝子(AMPKγ1、AMPKα1、及びAMPKα2遺伝子;加齢学研究所の菅野新一郎先生より供与された)を、pEGFP−C1(Clonetech社製)のMCSに挿入することにより、GFP融合AMPKサブユニット発現ベクター(GFP融合AMPKγ1発現ベクター、GFP融合AMPKα1発現ベクター、及びGFP融合AMPKα2発現ベクター)を作製した。
上記「1−13」で作製した3種のGFP融合AMPKサブユニット発現ベクターを、エレクトロポレーション(ニードル幅 3mm、86V、50msパルス幅、パルス3回×2、0.01−0.04A、Pulse Generator、CUY21EDIT、Bex社製)により、4週齢のC57BL6/Jマウス(日本クレア社製)の短趾屈筋に導入した。導入から7日後のマウスを頸椎脱臼により安楽死させ、短趾屈筋を採取し、細胞膜損傷修復アッセイを行った。アッセイは、以前の報告に従って行った(文献「Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature 423, 168-172 (2003).」参照)。2種類の損傷マーカー試薬(FM1−43試薬及びFM4−64試薬[Life Technologies社製])をD−PBSで希釈した。FM1−43試薬又はFM4−64試薬存在下で、短趾屈筋を二光子レーザー(Sa-Ti/820nm、Chameleon、30W、Coherent社製)により損傷させ、488、594又は820nmの波長の光による励起を行った。高感度拡張検出器ユニット(LSM BiG、Zeiss社製)を取り付けた正立型多光子レーザー顕微鏡(NL0710、Zeiss社製)を用いて、筋束内の筋細胞のライブイメージングを行った。
ディスフェルリン異常症由来の不死化骨格筋細胞株を、AMPK活性化剤であるAICAR(Sigma-Aldrich社製)存在下で培養し、膜修復に対する影響を確認した。AICARの使用濃度は、文献「Lanner, J.T., et al. AICAR prevents heat-induced sudden death in RyR1 mutant mice independent of AMPK activation. Nat Med 18, 244-251 (2012).」、「Ljubicic, V., Khogali, S., Renaud, J.M. & Jasmin, B.J. Chronic AMPK stimulation attenuates adaptive signaling in dystrophic skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol 302, C110-121 (2012).」、及び「Pernicova, I. & Korbonits, M. Metformin--mode of action and clinical implications for diabetes and cancer. Nat Rev Endocrinol 10, 143-156 (2014).」を参考にして、1mMとした。また、AICARのAMPK活性効果を最大限に引き出すため、ディスフェルリン異常症由来の不死化骨格筋細胞株を、血清非存在下のDMEM培養液中で一晩培養した後、AICARを添加し、その後1〜9時間の間に、二光子レーザー(Sa-Ti/820nm、Chameleon、30W、Coherent社製)によるレーザー膜損傷を行った。
AMPKの細胞内局在を確認するために、ディスフェルリンを欠損するSJL/Jマウス(DYSF遺伝子の4つ目のC2ドメイン部位コード領域に171塩基長のインフレーム欠失を有するマウス、日本クレア社製)の免疫組織染色を、上記「1−10」の方法に従って行った。また、コントロールとしてSWR/Jマウス(日本クレア社製)を用いた。なお、以前の報告(文献「Suzuki, N., et al. Expression profiling with progression of dystrophic change in dysferlin deficient mice (SJL). Neurosci Res 52, 47-60 (2005).」参照)に基づいて、実験には組織学的変化の乏しい3ヶ月齢のSJL/Jマウスを用いた。
データは平均値±標準誤差で示した。一元又は二元配置分散分析(ANOVA)後、多群の比較にはノンパラメトリック検定(Wilcoxon検定)を行った。P<0.05を有意とした。すべての解析は統計解析ソフト(JMP、SAS Institute社製)を用いた。
2−1 ディスフェルリン結合タンパク質の同定
ディスフェルリンの第II領域は、2つのFerドメイン(FerA及びFerB)と、2つのDysFドメイン(DysFC及びDysFN)を有するが、これまでこの領域の機能については全く注目されていなかった。本発明者らは、骨格筋細胞の膜修復機構において、ディスフェルリンが、その第II領域と他の機能性タンパク質との結合を介して、巨大な足場タンパク質として働いているという独自の仮説を立てた。そして、本研究では、ディスフェルリン第II領域を結合させたアフィニティビーズを作製し、このビーズを用いてディスフェルリン結合タンパク質の同定を試みた。
かかるアフィニティビーズを作製するために、MBPタグを付加したディスフェルリン第II領域、第II−1領域、及び第II−2領域ポリペプチドを大腸菌に発現させ、想定される分子量の位置にバンドが検出されることを確認した(図3aの矢印参照)。これらのポリペプチドを用いて作製した3種のアフィニティビーズ(ディスフェルリン第II結合ビーズ、第II−1結合ビーズ、及び第II−2領域結合ビーズ)に、HEK293T細胞(ヒト腎細胞)抽出液を加えて、ディスフェルリン第II、第II−1、及び第II−2領域と相互作用する分子を抽出し、質量分析を行った。ここで本発明者らは、以下のように考えた結果、ディスフェルリンを発現する筋細胞ではなく、ディスフェルリンを発現しない腎細胞を用いてスクリーニングを行うこととした。
1)筋細胞以外の細胞種を使用することによって、これまでに知られていなかったより多くのディスフェルリン結合タンパク質候補をスクリーニングできる可能性があること:
2)筋細胞においては、微量のディスフェルリン結合タンパク質は既にディスフェルリンとの複合体を形成しているために、上記ビーズとは結合できない可能性があること:
3)ディスフェルリンを発現しない腎細胞では、そのような微量のディスフェルリン結合タンパク質がフリーの状態で存在しており、より効率的に上記ビーズと結合することができる可能性があること:
以上の実験の結果、新規ディスフェルリン結合タンパク質として、AMPKγ1及びPPP1CAを同定した(図3b参照)。
AMPKは、エネルギー代謝を担うタンパク質キナーゼである(文献「Hardie, D.G. AMPK--sensing energy while talking to other signaling pathways. Cell Metab 20, 939-952 (2014).」参照)。AMPKは、触媒作用を有するαサブユニットと、調節作用を有するβ及びγサブユニットから構成されるヘテロ三量体である。また、それぞれのサブユニットには異なる遺伝子によってコードされる7種のアイソフォーム(α1、α2、β1、β2、γ1、γ2、及びγ3)が存在する。AMPKαは、PP1(PPP1CA、PPP1CB)、PPP2CAによる脱リン酸化によって、酵素活性が調節されることが知られている。また、本研究においても、AMPKγ1とPPP1CAとがともにディスフェルリンと結合することが明らかとなった。さらに、筋萎縮の病態において、AMPKシグナリングの関与を示唆する複数の報告がある(文献「Ljubicic, V., Burt, M. & Jasmin, B.J. The therapeutic potential of skeletal muscle plasticity in Duchenne muscular dystrophy: phenotypic modifiers as pharmacologic targets. FASEB J 28, 548-568 (2014).」、及び「Ljubicic, V. & Jasmin, B.J. AMP-activated protein kinase at the nexus of therapeutic skeletal muscle plasticity in Duchenne muscular dystrophy. Trends Mol Med 19, 614-624 (2013).」参照)。以上のことから、ディスフェルリン異常症の病態にAMPK複合体とその活性化が関わっている可能性が考えられた。そこで、本発明者らは、ディスフェルリンとAMPK複合体の関係、及び膜修復機構におけるAMPK複合体の役割について、さらに解析を進めた。
最初に、ディスフェルリン遺伝子異常がAMPKファミリーの局在に及ぼす影響を、SJL/Jマウスを用いて検討した。SJL/Jマウスは、ディスフェルリン遺伝子の4つ目のC2ドメイン部位に171bpのインフレーム欠失を有しており、ディスフェルリンタンパク質の発現量が低下することが確認されている(文献「Suzuki, N., et al. Expression profiling with progression of dystrophic change in dysferlin deficient mice (SJL). Neurosci Res 52, 47-60 (2005).」参照)。本研究では、組織学的な変化が乏しい3ヶ月齢のSJL/JマウスにおけるAMPK複合体の局在を調べた。また、コントロールとしてディスフェルリン変異が無く、遺伝的バックグラウンドが近いSWR/Jマウスを用いた。図4に免疫染色の結果を示す。SJL/Jマウスにおけるディスフェルリンの染色像は、SWR/Jマウスと比較して減弱していた。また、SWR/Jマウスでは、AMPKγ1は主に細胞質に局在するが、一部細胞膜にも存在していた(図4a)。一方、SJL/Jマウスでは、SWR/Jマウスと比較して、AMPKγ1を発現する筋線維が減少していた。また、SJL/JマウスにおけるAMPKαの局在は主に細胞質で認められたが、一部細胞膜にも局在が認められた。AMPKαはAMPKγ1と同様の分布を示した(図4b)。
次に、骨格筋におけるAMPKγ1の膜修復機能を調べるために、エレクトロポレーションによりC57/BL6Jマウスの短趾屈筋にAMPKγ1−GFPを導入し、FM4−64試薬の存在下で筋束内の筋細胞のライブイメージングを行った。この結果、定常時には、AMPKγ1は、骨格筋の細胞質に存在していることが明らかとなった(図5)。これは、図4の結果を裏付けるものである。一方、レーザー膜損傷を行った場合には、損傷部位(赤線)にFM4−64が集積したことから、膜損傷が起こっていることが確認された。また、レーザー膜損傷を行った場合、損傷部位を取り囲むようにAMPKγ1−GFPが集積することが観察された(図5下段)。AMPKγ1−GFPの集積は、損傷後10秒以内に起こり、その後3分以上維持されることが分かった(図5)。
上述のように、AMPK複合体においてAMPKγ1は調節因子として働いている。このため、本発明者らは、AMPK複合体において触媒サブユニットとして機能しているAMPKα1又はα2が膜修復機能に関わっている可能性があると考えた。そこで、AMPKγ1と同様の実験により、AMPKα1及びα2の膜修復機能を検討した。C57/B6Jマウス分離筋束内にAMPKα−GFPを発現させて、レーザー膜損傷を行い、ライブイメージングで蛍光を観察した。その結果、AMPKα1及びα2はともに膜損傷部位に集積することが分かった。また、AMPKγ1と同様に、AMPKα1及びα2の集積は損傷後10秒以内に起こり、3分以上続くことが分かった(図7)。次に、C2C12細胞において、AMPKα1及びα2をそれぞれノックダウンし(図8a、b、e、及びf)、FM1−43試薬存在下で、レーザー膜損傷を行った。その結果、AMPKα1ノックダウン細胞では、コントロール細胞と比較して、有意な膜修復機能の低下が確認された(図8c及びd)。一方、AMPKα2ノックダウン細胞では、一部の時間帯で有意差がみられるにとどまった(図8g)。これらの結果から、触媒サブユニットとしては、AMPKα1がより強く膜修復機能に関わっていることが示された。
以上の結果から、AMPK複合体が骨格筋細胞膜修復に関与することが明らかになった。そこでディスフェルリン異常症患者由来細胞で見られる膜修復異常が、AMPKの活性調節により改善するか否かを検討した。まず、line107細胞及びKM155細胞におけるディスフェルリンタンパク質発現量を評価した結果、line107細胞では、KM155細胞と比較して、ディスフェルリンタンパク質発現量が著しく少ないことが確認された(図10a及びb)。次に、line107細胞では、KM155と比較して、レーザー膜損傷後の蛍光タンパク質流入量が有意に増加していることが確認された(図10c)。
筋細胞膜の修復機構に関与する分子の全容は解明されておらず、同定されていないディスフェルリン結合タンパク質が存在していると考えられる。TRIM72に関する論文(文献「Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol 11, 56-64 (2009).」、「Weisleder, N., et al. Recombinant MG53 protein modulates therapeutic cell membrane repair in treatment of muscular dystrophy. Sci Transl Med 4, 139ra185 (2012).」、及び「Alloush, J. & Weisleder, N. TRIM proteins in therapeutic membrane repair of muscular dystrophy. JAMA Neurol 70, 928-931 (2013).」)が示すように、ディスフェルリン結合タンパク質の同定がディスフェルリン異常症の治療に結びつく可能性がある。ある特定のタンパク質と結合する別のタンパク質を同定する方法としては、タグ付きタンパク質を用いた免疫沈降法による解析方法が一般的であり、このような方法を用いて、既にいくつかのディスフェルリン結合タンパク質が同定されている。しかしながら、結合タンパク質の存在量が少ない場合や、ディスフェルリンのように非常に大きな膜タンパク質と結合するタンパク質を探索する場合には、このような方法による同定は困難である。
本研究により、AMPK複合体がディスフェルリンとともに骨格筋の膜修復機構において重要な働きを担っていることが明らかになった。そして、AMPK活性化剤の投与実験の結果から、AMPKを活性化することでディスフェルリン変異を有する細胞における膜修復機能が改善することが示された。本研究では、AMPK活性化剤としてAICAR(アカデシンとも呼ばれる)を使用したが、A−769662(6,7-Dihydro-4-hydroxy-3-(2'-hydroxy[1,1'-biphenyl]-4-yl)-6-oxo-thieno[2,3-b]pyridine-5-carbonitrile)、メトホルミン等の他の公知のAMPK活性化剤も同様に、ディスフェルリン変異症における膜修復機能の改善に有効であると推測される。なかでも、メトホルミンは2型糖尿病治療の第一選択として長年使用されていること、さらに、経口投与によりヒト骨格筋のAMPKを活性化することが報告されていることから(文献「Musi, N., et al. Metformin increases AMP-activated protein kinase activity in skeletal muscle of subjects with type 2 diabetes. Diabetes 51, 2074-2081 (2002).」参照)、ディスフェルリン異常症の治療・改善のための利用が強く期待できる。
Claims (11)
- AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)活性化剤を有効成分として含有する、ディスフェルリン異常症における骨格筋細胞の細胞膜の損傷修復促進剤であって、前記AMPK活性化剤が、アカデシン、メトホルミン、A−769662(6,7-Dihydro-4-hydroxy-3-(2'-hydroxy[1,1'-biphenyl]-4-yl)-6-oxo-thieno[2,3-b]pyridine-5-carbonitrile)、フェンホルミン、ブホルミン、チエノピリドン、レスベラトロール、ヌートカトン、アディポネクチン、及びそれらの塩からなる群より選択される1又は2以上の物質である、前記損傷修復促進剤。
- AMPK活性化剤がアカデシンである、請求項1に記載の損傷修復促進剤。
- 以下の工程(i)及び(ii)を含む、ディスフェルリン異常症の診断のためのデータを収集する方法。
(i)被験者の骨格筋から採取された生体試料におけるAMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)のサブユニットの発現を検出する工程であって、前記サブユニットが、AMPKのα1サブユニット、α2サブユニット、β1サブユニット、β2サブユニット、γ1サブユニット、γ2サブユニット、及びγ3サブユニットからなる群より選択される1又は2以上のサブユニットである、工程;
(ii)前記工程(i)により検出されたサブユニットの発現と、ディスフェルリン異常症でないヒトの骨格筋から採取された生体試料におけるサブユニットの発現とを比較・評価する工程; - サブユニットが、AMPKのγ1サブユニットである、請求項3記載の方法。
- ディスフェルリン異常症が、三好型遠位型ミオパチー又は肢帯型筋ジストロフィー2B型である、請求項3又は4に記載の方法。
- AMPKのα1サブユニット、α2サブユニット、β1サブユニット、β2サブユニット、γ1サブユニット、γ2サブユニット、及びγ3サブユニットからなる群より選択される1又は2以上のサブユニットに特異的に結合する抗体、又はその標識物を含む、ディスフェルリン異常症を診断するためのキット。
- サブユニットが、AMPKのγ1サブユニットである、請求項6に記載のキット。
- ディスフェルリン異常症が、三好型遠位型ミオパチー又は肢帯型筋ジストロフィー2B型である、請求項6又は7に記載のキット。
- AMPKのα1サブユニット、α2サブユニット、β1サブユニット、β2サブユニット、γ1サブユニット、γ2サブユニット、及びγ3サブユニットからなる群より選択される1又は2以上のサブユニットをコードするmRNAを特異的に検出するプライマー又はプローブ、若しくはそれらの標識物を含む、ディスフェルリン異常症を診断するためのキット。
- サブユニットが、AMPKのγ1サブユニットである、請求項9に記載のキット。
- ディスフェルリン異常症が、三好型遠位型ミオパチー又は肢帯型筋ジストロフィー2B型である、請求項9又は10に記載のキット。
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