CN102369286A - 变体axmi-r1δ-内毒素基因和使用它们的方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于赋予杀虫活性至细菌、植物、植物细胞、组织和种子的组合物和方法。提供了包含杀虫多肽的编码序列的组合物。所述编码序列可以在用于植物和细菌中转化和表达的DNA构建体或表达盒中使用。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。尤其，提供了编码变体Cry3序列的核酸分子。另外，包括与所述多核苷酸相对应的氨基酸序列。

Description

变体AXMI-R1Δ-内毒素基因和使用它们的方法

发明领域

本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列在制备杀虫制剂中并且在产生转基因抗害虫植物中有用。

发明背景

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)(Bt)是形成孢子的革兰氏阳性土壤细菌，其特征在于它产生晶状包含体的能力，其中所述的晶状包含体特异性毒害某些目和种的昆虫，但是对植物和其他非靶向的生物无害。出于这个原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或其杀虫蛋白质的组合物可以作为环境可接受的杀虫剂用来控制农业昆虫害虫或多种人或动物疾病的昆虫媒介。

来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目、双翅目和鞘翅目幼虫的强力杀虫活性。这些蛋白质也显示出针对膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、虱目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蜱螨亚纲(Acari)害虫目以及其他无脊椎动物如线形动物门(Nemathelminthes)、扁形动物门(Platyhelminthes)和Sarcomastigorphora的活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree.  在Advanced Engineered Pesticides中，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.)。这些蛋白质起初主要基于它们的杀昆虫活性分类为CryI至CryV。主要类型是鳞翅目特异性(I)、鳞翅目与双翅目特异性(II)、鞘翅目特异性(III)、双翅目特异性(IV)和线虫特异性(V)与(VI)。所述蛋白质进一步划分成亚家族；赋予每个家族内部更高度相关的蛋白质区分字母如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。每个部分内部甚至更密切相关的蛋白质给予名字，如Cry1C1、Cry1C2等。

基于氨基酸序列同源性而非昆虫靶专一性，最近描述了Cry基因的一种新命名法(Crickmore等人.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813)。在这种新分类中，每种毒素赋予一个独特名称，包含初阶(阿拉伯数字)、次阶(大写字母)、三阶(小写字母)和四阶(另一个阿拉伯数字)。在这个新分类法中，罗马数字已经更换为初阶中的阿拉伯数字。序列同一性小于45％的蛋白质具有不同的初阶，并且次阶和三界的标准分别是78％和95％。

晶体蛋白不显示杀昆虫活性直至它在昆虫中肠中被摄取和溶解。摄取的前毒素由昆虫消化道中的蛋白酶水解成活性有毒分子。(和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53：242-255)。这种毒素与靶幼虫中肠中的顶部刷状缘受体结合并插入顶膜，产生离子通道或孔，从而导致幼虫死亡。

δ-内毒素通常具有5个保守的序列结构域和3个保守的结构性结构域(见，例如，de Maagd等人(2001)Trends Genetics 17：193-199)。第一个保守的结构性结构域由7个α螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由以希腊钥匙构型排列的3个β-片层组成，并且结构域III由“薄卷饼型”形式的2个反平行β-片层组成(de Maagd等人，2001，上文)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被视为毒素特异性的决定因素。

最初在二十世纪八十年代早期鉴定Cry3型δ内毒素。Cry3Aa1δ内毒素(以前也称作cryC和cryIIIA)先前已经从苏云金芽孢杆菌圣迭戈变种菌株(Bacillus thuringiensis var san diego)(Herrnstadt等人(1987)Gene.57：37-46)、苏云金芽孢杆菌拟步甲亚种(Bacillus thuringiensistenebrionis)(Hofte等人(1987)Nucleic acids Res.15：7183；McPherson等人(1988)Bio/Technology 6：61-66Sekar等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7036-7040)和EG2158(Donovan等人(1988)Mol Mol Gen Genet.214(3)：365-72)分离。

Cry3Aa常常在某种天然芽孢杆菌菌株中作为长斜方形晶体的主要组分观察到，并且作为72kDa蛋白质产生，该蛋白质随后由孢子形成相关蛋白酶通过蛋白酶解加工过程加工成66kDa毒素。这种66kDA蛋白质已知产生针对鞘翅目科罗拉多马铃薯甲虫的活性。

因为昆虫可能造成的毁坏和通过控制害虫改善产量，对于发现新形式的杀虫毒素存在持续需要。

发明概述

提供了用于赋予杀虫活性至细菌、植物、植物细胞、组织和种子的组合物和方法。组合物包括编码杀虫多肽和杀昆虫多肽的序列的核酸分子、包含这些核酸分子的载体和包含所述载体的宿主细胞。组合物也包括杀虫多肽序列和针对那些多肽的抗体。所述核苷酸序列可以在用于生物(包括微生物和植物)中转化和表达的DNA构建体或表达盒中使用。所述核苷酸或氨基酸序列可以是已经设计用于在生物中表达的合成序列，所述的生物包括，但不限于微生物或植物。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。

具体地，提供了编码杀虫蛋白的分离的核酸分子。另外，包括与该杀虫蛋白相对应的氨基酸序列。尤其，本发明提供了分离核酸分子，其包含编码变体CRY3的核苷酸序列。也包括与本发明核苷酸序列互补或本发明序列杂交的核苷酸序列。

提供了用于产生本发明多肽和用于使用这些多肽控制或杀死鳞翅目、鞘翅目、线虫或双翅目害虫的方法。也包括用于检测样品中本发明核酸和多肽的方法和试剂盒。

本发明的组合物和方法在产生具有增强的害虫抵抗性或耐受性的生物中有用。这些生物和包含所述生物的组合物对于农业目的而言是所希望的。本发明的组合物也用于产生具有杀虫活性的经改变或改良的蛋白质，或用于检测产品或生物中杀虫蛋白或核酸的的存在。

附图简述

图1显示注释的AXMI-R1序列(SEQ ID NO：2)。加下划线的区域代表环区域(L1、L2和L3)。直条形代表结构域I(DI)、结构域II(DII)和结构域III(DIII)之间的边界。箭头指示为产生变体所靶向的一些区域。

图2显示Axmi164(SEQ ID NO：13)、Axmi161(SEQ ID NO：44)、Axmi152(SEQ ID NO：45)、Axmi151(SEQ ID NO：26)、Axmi146(SEQ IDNO：27)、Axmi141(SEQ ID NO：28)、Axmi129(SEQ ID NO：29)、Axmi128(SEQ ID NO：30)、Axmi127(SEQ ID NO：31)、Axmi120(SEQ IDNO：32)、Axmi116(SEQ ID NO：33)、Axmi114(SEQ ID NO：34)、Axmi101(SEQ ID NO：35)、Axmi091(SEQ ID NO：36)、Axmi087(SEQ IDNO：37)、Axmi037(SEQ ID NO：38)、Axmi029(SEQ ID NO：39)、Axmi028(SEQ ID NO：40)、Cry8Bb1(SEQ ID NO：41)、Cry8Bc1(SEQ IDNO：42)、Cry7Aa(SEQ ID NO：43)、AxmiR1PermutP3c7(evo21)(SEQ IDNO：13)和Axmi-R1(SEQ ID NO：2)的比对。

发明详述

本发明涉及用于调节生物中、尤其植物或植物细胞中害虫抵抗性或耐受性的组合物和方法。“抵抗性”意指害虫(例如，昆虫)在摄取或接触本发明多肽时被杀死。“耐受性”意指损害或减少害虫的运动、采食、繁殖或其他功能。所述方法涉及用编码本发明杀虫蛋白的核苷酸序列转化生物。尤其，本发明的核苷酸序列用于制备拥有杀虫活性的植物和微生物。因而，提供转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。

本文中提供包含编码变体Cry3氨基酸序列的核酸序列的组合物，其中该变体具有杀虫活性，特别地是针对鞘翅目害虫的杀虫活性。“变体Cry3”氨基酸序列意指除天然存在的Cry3氨基酸序列之外的Cry3序列，其中该氨基酸序列具有与表16中所述的替换相对应的一个或多个氨基酸替换。对于Cry3序列表，见Crickmore等人(1998)，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813，并且对于定期更新，见在www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index处的Crickmore等人(2003)“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature”(苏云金芽孢杆菌毒素命名法)。

在一些实施方案中，天然存在的或“野生型”Cry3序列是SEQ ID NO：1中所述的Axmi-R1核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：2中所述的氨基酸序列。AXMI-R1序列对应于

检索号P0A379中描述的cry3Aa序列。然而，将会理解可以在任意Cry3蛋白如任意Cry3A、Cry3B或Cry3C蛋白的相应位置处产生表16中描述的替换。“相应位置”可以通过将靶序列与SEQ ID NO：2比对来确定。见，例如，图2中所示的比对结果。

cry3Aa蛋白的晶体结构先前已经测定(Li等人，1991，Nature353：815-821)。该晶体结构描述了多种环区域，并且相对于该蛋白质的三维结构显示蛋白酶解加工的位点。该种结构表明此毒素排列成与其他δ-内毒素序列的结构相一致的3个结构域(一般称作结构域I、II和III)。该毒素的每个结构域具有基于此晶体结构定义的环区域。在该晶体结构发表之前并且自此之后，已经存在众多尝试以描述与Bt内毒素并且尤其cry3-型内毒素的结构与毒性功能相关的广泛简单规则和蛋白酶解在这种活性中的作用。

例如，Van Rie等人，1997(美国专利5,659,123)提出通过鉴定不利影响毒性的位置，而后随机替换这些环内部某些位置处的氨基酸，在视为“环”的区域内进行结构域II的修饰而鉴定导致毒性改善的氨基酸。类似地，Wu和Dean(J.Mol.Biol.，1996，255：628-640)将丙氨酸随机插入环II残基减弱了蛋白质功能。Wu等人(Febs Letters，2000，473：227-232)对环I残基的随机诱变在大多数情况下产生不稳定的蛋白质和减弱的蛋白质功能，并且在两种情况下据报道产生具有增加的毒性和改变的结合特性的蛋白质。对于cry3Bb毒素(English等人，美国专利6,023,013，作为RE39,580再公布)，据报道在该毒素中的某些替换导致改善的玉米根虫活性，但在大多数情况下，这些改变在与Van Rie所提出或Wu和Dean所研究的残基不同的残基中出现。

此外，已经在正常由胰蛋白酶样或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶切割的cry3A毒素区域中做出修饰，试图改善对鞘翅目并且特别对西方玉米根虫的cry3A活性。Chen等人(美国专利7,030,295)报道在该蛋白质中特定位置处插入被描述为“组织蛋白酶G切割位点”(或“胰凝乳蛋白酶/组织蛋白酶G切割位点”；Walters等人，2008，Applied and Environ.Micro.74：367-374)的合成四肽AAPF(SEQ ID NO：20)可以导致改善的cry3A活性。

cry3A的胰蛋白酶切割是本领域熟知的，并且已经显示在天然cry3A肽中的大约R158-N159区域内天然发生(Carroll等人1989Biochem J.261：99-105)。另外，还已知胰凝乳蛋白酶在这个区域中的His161-Ser162接头处切割(Carroll等人1997J Invert.Biol.70：41-49)。Walters等人(2008)显示通过胰凝乳蛋白酶在该区域中其天然位置(His161-Ser162接头处)切割修饰的Cry3A(“mCry3A”，其含有胰凝乳蛋白酶/组织蛋白酶G蛋白酶识别位点)。没有报道Cry 3A的这个区域中的天然存在氨基酸序列的诱变导致对鞘翅目害虫改善的杀虫活性。

因而，本发明提供相对于相应的野生型序列具有改善的杀虫活性的变体Cry3序列。在多种实施方案中，与AXMI-R1的杀虫活性相比，变体Cry3杀虫序列具有改善的杀虫活性。“改善的活性”意指靶害虫的死亡率增加、采食减少或者生长减少。活性的改善是相对于野生型序列(例如，AXMI-R1)的活性而言活性增加至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或更大。在一些实施方案中，靶害虫是鞘翅目害虫。

在一些实施方案中，本文中所包括的杀虫序列包含SEQ ID NO：1中所述axmi-R1序列的变体。“axmi-R1的变体”意指与AXMI-R1相对应的核苷酸或氨基酸序列，其中已经在AXMI-R1序列的某些区域(即，“靶突变区域”)内部导入一个或多个突变。除非另外说明，在靶突变区域外部的氨基酸区域与AXMI-R1序列相同。相同的区域是相同的氨基酸序列或是编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。将会理解，核苷酸序列可以与野生型核苷酸序列不同，但是因遗传密码子的简并性仍编码野生型氨基酸序列。

在其他实施方案中，Cry3的靶突变区域对应于Li等人(1991，Nature353：815-821，通过引用的方式完整并入本文中，尤其就cry3Aa蛋白的结构描述方面)中描述的所提出的加工和孔形成区域。在多种实施方案中，靶突变区域对应于SEQ ID NO：2的第480至490位氨基酸位置和第510至530位。在一些实施方案中，变体Cry3序列含有表16中描述的一个或多个突变，包括表16中所列突变的任意组合，直至并且包括在表16中描述的每个位置处的突变。

在一些实施方案中，本发明的变体Cry3序列具有选自与SEQ ID NO：2的第158、482、483和519位相对应的氨基酸位置中的一个或多个替换。在另一个实施方案中，变体Cry3序列没有以下替换：P154H、V155H、R315W、R315D、R315M、R315L、G316K、G316N、G316V或G316A。在又一个实施方案中，本发明的变体Cry3序列没有美国专利6,023,013的表2中所列突变的任意组合。

在另一个实施方案中，变体Cry3序列选自由SEQ ID NO：6、8、10、13、15、17、19和21-43组成的组。在又一个实施方案中，本文中所包括的的变体Cry3序列由加工和孔形成区中的一个或多个突变和受体结合区中的一个或多个突变组成。本文中所包括的变体具有相对于野生型Cry3的杀虫活性而言改善的杀虫活性。在一些实施方案中，改善的杀虫活性针对鞘翅目害虫，例如，根虫害虫。

可以进一步修饰本发明的变体Cry3序列以导入本领域描述的一个或多个Cry3突变。例如，除美国专利5,659,123和6,023,013；Wu和Dean(J.Mol.Biol.，1996，255：628-640)；或Wu等人(Febs Letters，2000，473：227-232)中描述的一个或多个突变之外，本文中所包括的变体AXMI-R1序列可以包含表16中所列的一个或多个替换或其任意组合。额外地，变体AXMI-R1序列可以包含如上文讨论的一个或多个组织蛋白酶G切割位点的插入(例如，在天然胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶切割位点处或其附近)。

在本发明的又一个实施方案中，可以将表16中描述的突变导入与AXMI-R1具有同源性的任意氨基酸序列的相应位置以导入或改善针对目的害虫、尤其鞘翅目害虫如根虫害虫的毒性。见，例如，图2中与AXMI-R1比对的氨基酸序列，或例如

检索号P0A379.1、AAA22336.1、AAA22542.1、AAS79487.1、AAU29411.1、AAW82872.1、AAA73184.1、CAA51996.1、1DLC_A、Q45744.1、Q06117.1、AAA74198.1、P17969.1t中所述的同源氨基酸序列。可以使用本文中所述的比对程序之一比对同源氨基酸序列以鉴定用于突变的相应位置。备选地，同源氨基酸序列的晶体结构或其另外的三维表示可以叠加到(在Li等人1991，Nature 353：815-821中描述的)Cry3A的晶体结构上并且比对相应位置。Cry3B蛋白的晶体结构在美国专利6,023,013中描述。

所述序列用于构建随后转化至目的生物中的表达载体，作为探针用于分离其他同源(或部分同源的)基因，并且用于通过本领域已知方法(如结构域互换或DNA改组法)产生改变的杀虫蛋白。所述蛋白质用于控制或杀死鳞翅目、鞘翅目、双翅目和线虫害虫种群并且用于产生具有杀虫活性的组合物。

“杀虫毒素”或“杀虫蛋白”意指针对一种或多种害虫具有毒害活性的毒素，其中所述的害虫包括，但不限于鳞翅目、双翅目和鞘翅目或线虫纲的成员，或者与这种蛋白质具有同源性的蛋白质。杀虫蛋白已经从包括例如芽孢杆菌属物种、双酶梭状芽孢杆菌(Clostridium bifermentans)和Paenibacillus popilliae的生物分离。杀虫蛋白包括从本文中公开的全长核苷酸序列推导的氨基酸序列和因使用下游可变起始位点或因产生具有杀虫活性的更短蛋白质的加工作用而短于全长序列的氨基酸序列。加工可以在表达该蛋白质的生物中或在摄取该蛋白质后的害虫中发生。

分离的核酸分子及其变体和片段

本发明的一个方面涉及分离或重组的核酸分子，其包含编码杀虫蛋白和多肽或其生物学活性部分的核苷酸序列，以及这样的核酸分子，其足以用作杂交探针来鉴定编码具有序列同源性区域的蛋白质的核酸分子。如本文中所用，术语“核酸分子”意图包括DNA分子(例如，重组DNA、cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选是双链DNA。

“分离的”或“重组的”核酸序列(或DNA)在本文中用来指不再处于其天然环境(例如处于体外或处于重组细菌宿主或植物宿主细胞)中的核酸序列(或DNA)。在一些实施方案中，分离或重组的核酸不含在衍生该核酸的生物的基因组DNA中天然分布于该核酸侧翼的序列(即，位于该核酸的5′端和3′端处的序列)(优选地是蛋白质编码序列)。出于本发明的目的，用来指核酸分子时，“分离”排除分离的染色体。例如，在多种实施方案中，分离的编码δ-内毒素的核酸分子可以含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在衍生该核酸分子的细胞的基因组DNA中天然分布于该核酸分子侧翼。在多种实施方案中，基本上不含细胞物质的δ-内毒素蛋白包括具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的非δ-内毒素蛋白(本文中也称作“杂质蛋白”)的制备物。

编码本发明蛋白质的核苷酸序列包括编码Cry3变体的核苷酸序列以及其片段和互补序列。“互补序列”意指与给定核苷酸序列充分互补，从而它可以与给定核苷酸序列杂交以因而形成稳定双链体的核苷酸序列。

本发明也包括作为编码杀虫蛋白的这些核苷酸序列的片段的核酸分子。“片段”意指编码杀虫蛋白的核苷酸序列的部分。核苷酸序列的片段可以编码杀虫蛋白的生物学活性部分，或它可以是使用下文公开的方法时可以作为杂交探针或PCR引物使用的片段。取决于预期用途，作为编码杀虫蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400个连续核苷酸，或者直至本文中公开的编码杀虫蛋白的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数目。“连续”核苷酸意指彼此紧密相邻的核苷酸残基。本发明核苷酸序列的片段将会编码保留杀虫蛋白的生物学活性并且因而保留杀虫活性的蛋白质片段。“保留活性”意指该片段将具有参考杀虫蛋白(即，本文中公开的杀虫性变体Cry3序列)的至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀虫活性。在一个实施方案中，杀虫活性是杀鞘翅目活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology78：290-293；和美国专利号5,743,477，所述全部文献均通过引用方式完整地并入本文。

编码杀虫蛋白的核苷酸序列的片段(其编码本发明蛋白质的生物学活性部分)将编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450个连续氨基酸，或者直至本发明的全长杀虫蛋白中存在的氨基酸总数。在一些实施方案中，该片段是蛋白酶解切割片段。例如，该蛋白酶解切割片段可以相对于SEQ ID NO：2具有至少约100个氨基酸、约120个、约130个、约140个、约150个或约160个氨基酸的N端截短。在多种实施方案中，该蛋白酶解切割片段可以对应于分别与SEQID NO：2的氨基酸位置158-159或位置160-161相对应的天然胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶切割位点，或可以对应于任意人工插入的切割位点，如Walters等人，2008，Applied and Environ.Micro.74：367-374中所述的组织蛋白酶G切割位点。

本发明的优选杀虫蛋白由与本文所包括的变体Cry3序列充分相同的核苷酸序列编码。“充分相同”意指使用标准参数，使用本文中所述的比对程序之一，与参考序列(例如，天然或变体Cry3序列，包括天然或变体Cry3A、Cry3B或Cry3C序列，或者选自SEQ ID NO：2、6、8、10、13、15、17、19和21-43的序列，或者编码这些天然或变体Cry3蛋白序列任一者的核苷酸序列)相比，具有至少约60％或65％序列同一性、约70％或75％序列同一性、约80％或85％序列同一性、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员将会认识到通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、可读框定位等，可以适当调整这些值以确定两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，所述序列为最佳比较目的进行比对。这两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置数的函数(即，同一性百分数＝相同位置数/总位置数(例如，重叠位置)x 100)。在一个实施方案中，这两个序列具有相同的长度。在另一个实施方案中，贯穿整个参考序列(即，本文中所包括的变体Cry3序列)计算同一性百分数。可以使用与下文所述那些技术相似的技术，在容许或不容许空位的情况下确定两个序列之间的同一性百分数。在计算同一性百分数中，一般计数精确匹配。

使用数学算法，可以完成两个序列之间同一性百分数的确定。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264的算法，该算法如Karlin和Altschul，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中那样修改。这种算法被并入Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLASTN和BLASTX程序。BLAST核苷酸搜索可以在采用BLASTN程序，评分＝100、字长度＝12的情况下执行以获得与本发明的杀虫样核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以在采用BLASTX程序，评分＝5，字长度＝3的情况下执行以获得与本发明的杀虫蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的空位比对结果，空位BLAST(在BLAST 2.0中)可以如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述那样使用。备选地，PSI-Blast可以用来执行迭代搜索，其检测分子之间远缘关系。见上文Altschul等人，(1997)。当使用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。比对可以通过目测法手工地进行。

用来比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是ClustalW算法(Higgins等人(1994)Nucleic acids Res.22：4673-4680)。ClustalW比较序列和比对氨基酸或DNA序列的完整性，并且因而可以提供关于完整氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法在一些市售DNA/氨基酸分析软件包中使用，如Vector NTI软件包的ALIGNX模块(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)。在用ClustalW比对氨基酸序列后，可以评估氨基酸同一性百分数。用于分析ClustalW比对结果的软件程序的非限制实例是GENEDOC^TM。GENEDOC^TM(Karl Nicholas)允许评估多种蛋白质之间的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用来比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是是Myers和Miller，(1988)CABIOS 4：11-17的算法。此种算法被并入了ALIGN程序(版本2.0)，所述的ALIGN程序是GCGWisconsin Genetics软件包，第10版(从Accelrys，Inc.，9685 Scranton Rd.，San Diego，CA，USA可获得)的一部分。当使用ALIGN程序以比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。

除非另外说明，使用Needleman和Wunsch算法(1970)J.Mol.Biol.48(3)：443-453的GAP第10版将会用来确定序列同一性或相似性，使用以下参数：对于核苷酸序列的％同一性和％相似性，使用GAP权重50和长度权重3及nwsgapdna.cmp评分矩阵；对于氨基酸序列的％同一性或％相似性，使用GAP权重8和长度权重2及BLOSUM62评分程序。也可以使用等同程序。“等同程序”意指任何序列比较程序，其中对于所讨论的任意两个序列而言，与GAP第10版所产生的相应比对结果比较时，所述的序列比较程序产生具有相同核苷酸或残基匹配和相同序列同一性百分数的比对结果。

本发明也包括变体核酸分子。编码杀虫性变体Cry3蛋白的核苷酸序列的“变体”包括编码本文公开的变体杀虫蛋白，但是因为遗传密码简并性而保守地相异的那些序列，以及如上文所讨论那样充分相同的那些序列。变体核苷酸序列也包括合成方式衍生的核苷酸序列，所述核苷酸序列例如通过使用位点定向诱变法产生，但如下文所讨论仍编码本发明中所公开的杀虫蛋白。由本发明包括的变体蛋白是有生物活性的，即，它们继续拥有参考蛋白(即，本文中所包括的变体Cry3序列)的想要的生物学活性，即，杀虫活性。“保留活性”意指该变体将具有该参考蛋白的至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约80％的杀虫活性。在一些实施方案中，本文中所述的变体杀虫蛋白相对于SEQ ID NO：2中所述的AXMI-R1蛋白显示改善的活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology78：290-293；和美国专利号5,743,477，所述全部文献均通过引用方式完整地并入本文。

技术人员将会进一步理解，可以通过突变本发明的核苷酸序列引入变化，从而导致编码的杀虫蛋白的氨基酸序列变化，而不改变该蛋白质的生物学活性。因而，分离的变体核酸分子可以通过将一个或多个核苷酸替换、添加或缺失导入本文公开的相应核苷酸序列来产生，从而将一个或多个氨基酸替换、添加或缺失导入所编码蛋白质的靶突变区域中。突变可以通过标准技术如位点定向诱变法和PCR介导诱变法导入。此类变体核苷酸序列也由本发明包括。

例如，可以在一个或多个预测的、非必需氨基酸残基处产生保守性氨基酸替换。“非必需”氨基酸残基是可以从杀虫蛋白的参考序列改变，但是不实质地改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基为生物学活性所需要的。“保守性氨基酸替换”是其中氨基酸残基以具有相似侧链的氨基酸残基替换的替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支的侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

Δ-内毒素通常具有5个保守的序列结构域和3个保守的结构性结构域(见，例如，de Maagd等人.(2001)Trends Genetics 17：193-199)。第一个保守的结构性结构域由7个α螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由以希腊钥匙构型排列的3个β-片层组成，并且结构域III由“薄卷饼型”形式的2个反平行β-片层组成(de Maagd等人，2001，上文)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被视为毒素特异性的决定因素。

可以在保留功能的非保守区域做出氨基酸替换。通常，不对保守氨基酸残基或不对位于保守基序内部的氨基酸残基做出此类替换，其中此类残基对蛋白质活性是必需的。保守并且可能对蛋白质活性是必需的残基的实例包括例如，在相似或相关毒素与本发明序列的比对结果中所含的全部蛋白质之间相同的残基(例如，在同源蛋白的比对结果中相同的残基)。保守并且可以允许保守性氨基酸替换并仍保持活性的残基的实例例如包括，在相似或相关毒素与本发明序列的比对结果中所含的全部蛋白质之间仅具有保守性替换的残基(例如，在同源蛋白比对结果中所含的全部蛋白质之间仅具有保守性替换的残基)。然而，本领域技术人员将会理解，功能性变体可以在保守残基中具有少量保守或非保守的改变。

备选地，变体核苷酸序列可以通过沿着全部或部分的靶突变区域随机导入突变(如通过排列或饱和诱变法)产生，并且可以对得到的突变体筛选赋予杀虫活性的能力以鉴定保留活性或显示改善的活性的突变体。诱变后，可以重组地表达编码的蛋白质，并且可以使用标准测定法技术测定该蛋白质的活性。

使用如PCR、杂交等方法，可以鉴定相应的杀虫序列，此类序列与本发明的序列具有实质同一性。见，例如，Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，和Innis等人(1990)PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，NY)。

在杂交方法中，全部或部分的杀虫性核苷酸序列可以用来筛选cDNA或基因组文库。用于构建cDNA和基因组文库的方法通常是本领域已知的并且在上文Sambrook等人，2001中公开。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团如32p或任何其他可检测性标记物(如其他放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)标记。可以通过标记基于本文中公开的已知的编码杀虫蛋白的核苷酸序列的合成寡核苷酸产生用于杂交的探针。可以额外地使用基于核苷酸序列或编码的氨基酸序列中保守的核苷酸或氨基酸残基设计简并引物。探针一般包含核苷酸序列的区域，所述的区域在严格条件下与编码本发明杀虫蛋白的核苷酸序列或其片段或变体的至少约12个、至少约25个、至少约50个、75个、100个、125个、150个、175个或200个连续核苷酸杂交。用于制备杂交用探针的方法通常是本领域已知的并且在通过引用方式并入本文的上文Sambrook等人，2001中公开。

例如，本文中公开的完整杀虫蛋白序列或其一个或多个部分可以作为能够与相应的杀虫蛋白样序列和信使RNA特异性杂交的探针使用。为在多种条件下实现特异性杂交，此类探针包括下述序列，所述序列是独特的并且优选地具有至少约10个核苷酸长度或至少约20个核苷酸长度。此类探针可以用来通过PCR从所选的生物扩增相应的杀虫性序列。该项技术可以用来从想要的生物中分离额外的编码序列或作为诊断性测定法用来确定生物中编码序列的存在。杂交技术包括铺板DNA文库的杂交筛选法(蚀斑或菌落；见，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。

此类序列的杂交可以在严格性条件下实施。“严格条件”或“严格杂交条件”意指这样的条件，在所述条件下探针将会与其靶序列杂交至比其与其他序列杂交可检测性更大的程度(例如，高于背景至少2倍)。严格条件具有序列依赖性并且会在不同的环境中不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源性探测)。备选地，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针是小于约1000个核苷酸长度，优选地小于500个核苷酸长度。

一般而言，严格性条件将会是这些条件，其中盐浓度在pH 7.0至8.3上小于约1.5M Na离子，一般约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)，温度是至少约30℃，并且对于长探针(例如多于50个核苷酸)，是至少约60℃。也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现严格条件。示例性低严格性条件包括在37℃用30至35％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并且在50至55℃于1X至2XSSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中等严格性条件包括在37℃于40至45％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS中杂交，并且在55至60℃于0.5X至1XSC中洗涤。示例性高严格性条件包括在37℃于50％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS中杂交，并且在60至65℃于0.1XSSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交的持续时间一般是小于约24小时，通常约4至约12小时。

特异性一般是杂交后洗涤的函数，关键因素是终末洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂合体，T_m可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的等式：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L近似；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分数，并且L是该杂合体的长度(碱基对)。T_m是50％互补性靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH下)。T_m因每1％错配下降约1℃；因此，可以调节T_m、杂交和/或洗涤条件以杂交至具有想要的同一性的序列。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则T_m可以降低10℃。通常，选择严格性条件比在确定的离子强度和pH下特定序列及其互补序列的解链温度低约5℃。然而，极严格性条件可以利用比解链温度(T_m)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格性条件可以利用比解链温度(T_m)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格性条件可以利用比解链温度(T_m)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交与洗涤组合物和想要的T_m，普通技术人员将会理解杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化被内在地描述。如果想要的错配程度产生小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，则优选增加SSC浓度，从而可以使用更高的温度。在Tijssen(1993)Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic AcidProbes，I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing和Wiley-Interscience，New York)。见Sambrook等人(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual(2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)中存在对核酸杂交的广泛指导。

分离的蛋白质及其变体和片段

杀虫蛋白也包括在本发明内。“杀虫蛋白”意指本文中所包括的杀虫性变体Cry3序列。也提供其片段、生物学活性部分和变体，并且可以用来实施本发明的方法。“分离的蛋白质”或“重组蛋白”用来指不再处于其天然环境(例如在体外或处于重组细菌或植物宿主细胞)中的蛋白质。

“片段”或“生物学活性部分”包括本文中所包括变体Cry3序列并且显示杀虫活性的多肽片段。杀虫蛋白的生物学活性部分可以是例如10、25、50、100、150、200、250个或更多氨基酸长度的多肽。此类生物学活性部分可以通过重组技术制备并评价杀虫活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293；和美国专利号5,743,477，所述全部文献均通过引用方式完整地并入本文。如此处所用，片段包含参考蛋白的至少8个连续氨基酸。然而，本发明包括其他片段，如蛋白质中多于约10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650个或更多个氨基酸的任意片段。

“变体”意指具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少约60％、65％、约70％、75％、约80％、85％、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白质或多肽。变体也包括由下述核酸分子编码的多肽，其中所述核酸分子在严格条件下与编码本文中所包括的变体Cry3序列的核酸分子或其互补序列杂交。变体包括因诱变而在氨基酸序列上相异的多肽。由本发明包括的变体蛋白质是有生物活性的，即它们继续拥有变体Cry3蛋白的想要的生物学活性，即保留杀虫活性。在一些实施方案中，该变体相对于参考蛋白(例如，相对于SEQ IDNO：2或相对于特定的变体Cry3蛋白)具有改善的活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293；和美国专利号5,743,477，所述全部文献均通过引用方式完整地并入本文。

细菌基因，如本发明的axmi基因，相当经常地拥有靠近可读框起点的多个甲硫氨酸起始密码子。常常，在这些起始密码子中一个或多个密码子处的翻译起始将会导致功能性蛋白质的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，细菌(如芽孢杆菌属物种)也将密码子GTG识别为起始密码，并且在GTG密码子处启动翻译的蛋白质含有在第一氨基酸处的甲硫氨酸。在罕见情况下，细菌系统中的翻译可以在TTG密码子处起始，然而在这种情况下TTG编码甲硫氨酸。另外，常常不先验地确定在细菌中天然地使用这些密码子中的哪些。因而，可以理解备选甲硫氨酸密码子之一的使用可以也导致杀虫蛋白的产生。这些杀虫蛋白包含于本发明中并且可以在本发明的方法中使用。将会理解在植物中表达时，需要更改备选起始密码子至ATG以正确翻译。

本发明也包括针对本发明多肽或针对其变体或片段的抗体。用于产生抗体的方法是本领域熟知的(见，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY；美国专利号4,196,265)。

改变或改善的变体

认识到可以通过多种方法进一步改变杀虫蛋白的DNA序列，并且这些改变可以产生编码蛋白质的DNA序列，其中所述的蛋白质具有与本发明杀虫蛋白所编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列。这个蛋白质可以以多种方式改变，所述方式包括本文中所包括的变体Cry3序列的一个或多个氨基酸的氨基酸替换、缺失、截短和插入，包括在一个或多个靶突变区域内多达约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约15个、约20个、约25个、约30个、约35个、约40个、约45个、约50个、约55个、约60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约100个、约105个、约110个、约115个、约120个、约125个、约130个、约135个、约140个、约145个、约150个、约155个或更多个氨基酸替换、缺失或插入。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。例如，可以通过在DNA中突变来制备杀虫蛋白的氨基酸序列变体。这也可以通过几种形式的诱变法之一和/或在定向进化中完成。在一些方面中，氨基酸序列中所编码的变化将不会实质地影响蛋白质的功能。此类变体会拥有想要(或改善)的杀虫活性。然而，可以理解，杀虫蛋白赋予杀虫活性的能力可以将此类技术用于本发明的组合物而得到改善。例如，可以在DNA复制期间显示高碱基错误掺入率的宿主细胞如XL-1Red(Stratagene，La Jolla，CA)中表达杀虫蛋白。在此类菌株中增殖后，可以分离DNA(例如通过制备质粒DNA或通过PCR扩增并将所得的PCR片段克隆至载体中)，在非诱变性菌株中培养杀虫蛋白突变体，并且鉴定具有杀虫活性的突变基因，例如通过开展检测杀虫活性的测定法。一般而言，将所述蛋白质混合并用于饲喂测定法中。见，例如Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293。此类测定法可以包括使植物与一种或多种害虫接触并测定植物存活和/或造成害虫死亡的能力。导致毒性增加的突变的实例见Schnepf等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：775-806。

备选地，可以在氨基或羧基端对许多蛋白质的蛋白质序列做出改变，而不明显影响活性。这可以包括通过现代分子方法(如PCR)导入的插入、缺失或改变，所述的PCR包括通过在PCR扩增中所用的寡核苷酸中包括氨基酸编码序列而改变或延伸蛋白质编码序列的PCR扩增。备选地，添加的蛋白质序列可以包括完整的蛋白质编码序列，如本领域常见用来产生蛋白质融合物的那些序列。此类融合蛋白常常用来(1)增加目的蛋白的表达，(2)导入结合结构域、酶活性或表位以促进蛋白质纯化、蛋白质检测或本领域已知的其他实验用途，(3)将蛋白质定向分泌或翻译至亚细胞细胞器，如革兰阴性细菌的周质空间或真核细胞的内质网，后者常常导致蛋白质的糖基化。

本发明的变体核苷酸和氨基酸序列也包括从诱变性和重组生产方法如DNA改组法衍生的序列。采用这种方法，一种或多种不同的杀虫蛋白编码区可以用来产生拥有想要的特性的新杀虫蛋白。以这种方式，从包含具有实质序列同一性并且可以在体外或体内同源重组的序列区的相关序列多核苷酸群中产生重组多核苷酸的文库。例如，使用这种方法，可以在本发明的杀虫性基因和其他已知的杀虫性基因之间改组编码目的结构域的序列基序以获得编码蛋白质的新基因，其中所述蛋白质具有改善的目的特性，如增加的杀昆虫活性。用于此类DNA改组的策略是本领域已知的。见，例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature391：288-291；和美国专利号5,605,793和5,837,458。

结构域互换或改组是用于产生改变的杀虫蛋白的另一种机制。结构域可以在杀虫蛋白之间互换，从而产生具有改善的杀虫活性或靶谱的杂合或嵌合毒素。用于产生重组蛋白和测试其杀虫活性的方法是本领域熟知的(见，例如，Naimov等人(2001)Appl.Environ.Microbiol.67：5328-5330；de Maagd等人(1996)Appl.Environ.Microbiol.62：1537-1543；Ge等人(1991)J.Biol.Chem.266：17954-17958；Schnepf等人(1990)J.Biol.Chem.265：20923-20930；Rang等人91999)Appl.Environ.Microbiol.65：2918-2925)。

载体

可以在用于目的植物中表达的表达盒中提供本发明的杀虫序列。“植物表达盒”意指能够在植物细胞中导致蛋白质从可读框中表达的DNA构建体。一般，这些植物表达盒含有启动子和编码序列。常常地，此类构建体也会含有3′非翻译区。此类构建体可以含有促进该肽共翻译或翻译后运输至某些胞内结构如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体的“信号序列”或“前导序列”。

“信号序列”意指已知或怀疑导致跨细胞膜共翻译或翻译后肽运输的序列。在真核生物中，这一般涉及分泌至高尔基体中，伴有一定所得的糖基化。细菌的杀昆虫性毒素常常合成为前毒素，所述前毒素在靶害虫的肠中蛋白酶解地活化(Chang(1987)Methods Enzymol.153：507-516)。在本发明的一些实施方案中，信号序列位于天然序列中或可以从本发明的序列衍生。“前导序列”意指任意序列，其中所述的序列在翻译时产生足以触发肽链共翻译性运输至亚细胞细胞器的氨基酸序列。因而，这包括通过进入内质网中、进抵至液泡、质体(包括叶绿体)、线粒体等的前导序列靶向运输和/或糖基化。

“植物转化载体”意指为高效转化植物细胞必需的DNA分子。这种分子可以由一个或多个植物表达盒组成，并且可以组织成多于一个“载体”DNA分子。例如，双元载体是使用两个非连续DNA载体来编码用于转化植物细胞的全部必要顺式和反式作用功能的植物转化载体(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。“载体”指设计用于不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”指具有在外来细胞中掺入、整合和表达异源DNA序列或片段的能力的载体。该盒将会包括与本发明序列有效连接的5′和3′调节序列。“有效连接”意指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列启动并且介导与第二序列相对应的DNA序列的转录。通常，有效连接意指连接的核酸序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，是连续且处于相同的可读框中。该表达盒可以额外地含有至少一个待共转化入生物的额外基因。备选地，可以在多个表达盒上提供额外的基因。

“启动子”指发挥指导下游编码序列转录的功能的核酸序列。启动子，连同其他转录性和翻译性调节核酸序列(又称作“调控序列”)，对于目的DNA序列的表达是必需的。

这种表达盒提供有用于插入处在调节区转录性调控下的杀虫性序列的多个限制性位点。

所述表达盒将会在5’-3’转录方向包含在植物中有功能的转录与翻译起始区(即，启动子)、本发明的DNA序列和转录与翻译终止区(即，终止区)。启动子可以是天然的或类似的，或对植物宿主和/或对本发明的DNA序列是外来或异源的。另外，启动子可以是天然序列或备选地是合成性序列。在启动子相对于植物宿主是“天然”或“同源”的情况下，意指该启动子存在于导入该启动子的天然植物中。在启动子相对于本发明的DNA序列是“外来”或“异源”的情况下，意指该启动子对于有效连接的本发明DNA序列而言不是天然的或天然存在的启动子。

终止区可以相对于转录起始区是原有的，可以相对于有效连接的目的DNA序列是原有的，可以相对于植物宿主是原有的，或可以来自另一来源(即，相对于启动子、目的DNA序列、植物宿主或其任意组合是外来或异源的)。方便的终止区是从根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒可得到的，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

根据需要，基因可以为转化的宿主细胞中增加的表达进行优化。即，基因可以为改善的表达而使用宿主细胞优选的密码子合成，或可以按宿主细胞优选的密码子选择频率使用密码子进行合成。通常，基因的GC含量将会增加。见，例如，Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11对宿主优选密码子选择的讨论。用于合成植物优选基因的方法是本领域可获得的。见，例如，通过引用的方式并入本文的美国专利号5,380,831和5,436,391以及Murray等人，1989，Nucleic Acids Res.17：477-498。

在一个实施方案中，将杀虫蛋白靶向叶绿体用于表达。以这种方式，在不直接将杀虫蛋白插入叶绿体的情况下，表达盒将会额外地含有核酸，所述核酸编码引导杀虫蛋白至叶绿体的转运肽。此类转运肽是本领域已知的。见，例如，Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)PlantPhysiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233：478-481。

待靶向至叶绿体的杀虫基因可以为叶绿体中的表达进行优化以引起植物细胞核和这种细胞器之间密码子选择的差异。以这种方式，目的核酸可以使用叶绿体优选的密码子合成。见，例如，通过引用方式并入本文的美国专利号5,380,831。

植物转化

本发明的方法涉及导入核苷酸构建体至植物中。术语“导入”意指如此方式向植物呈递核苷酸构建体，从而该构建体进入该植物的细胞的内部。本发明的方法不要求使用用于导入核苷酸构建体至植物的特定方法，只要该核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞的内部即可。用于导入核苷酸构建体至植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导的方法。

“植物”意指完整植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其子代。植物细胞可以是分化或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

“转基因植物”或“转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织指已经使外源核酸序列或DNA片段掺入或整合入植物细胞中的植物。这些核酸序列包括为外源或在未转化的植物细胞中不存在的那些核酸序列以及可以为内源或在未转化的植物细胞中存在的那些核酸序列。“异源”通常指这些核酸序列，所述核酸序列相对于它们存在其中的细胞或天然基因组的部分而言不为内源并且已经通过感染、转染、显微注射法、电穿孔法、微量投射法添加至细胞。

本发明的转基因植物表达本文中公开的一种或多种变体Cry3序列。在多种实施方案中，转基因植物还包含一个或多个用于昆虫抵抗性的额外基因，例如，一个或多个用于控制鞘翅目害虫的额外基因(例如，Cry1，如Cry1A、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1E和Cry1F家族的成员；Cry2，如Cry2A家族的成员；Cry9，如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员；Cry34/35；VIP，如VIP3；或本领域已知针对鞘翅目害虫具有毒性的任何修饰的Cry3A或Cry3B序列。本领域技术人员将会理解该转基因植物可以包含赋予目的农学性状的任意基因。

植物细胞的转化可以通过本领域已知的几项技术之一完成。可以修饰本发明的杀虫基因以获得或增强在植物细胞中的表达。一般，表达这种蛋白质的构建体会含有驱动该基因转录的启动子以及允许转录终止和多腺苷酸化的3′非翻译区。此类构建体的组织是本领域熟知的。在一些情况下，可能有用的是使该基因工程化，从而所得的肽被分泌，或靶向在植物细胞内部。例如，该基因可以工程化以含有促进肽转移至内质网的信号肽。也可以优选使植物表达盒工程化以含有内含子，从而要求内含子的mRNA加工用于表达。

一般，这种“植物表达盒”将会插入“植物转化载体”中。该植物转化载体可以由实现植物转化所需要的一个或多个DNA载体组成。例如，本领域中的常规实践是使用由多于一个连续DNA区段组成的植物转化载体。这些载体常常在本领域中称作“双元载体”。双元载体以及带有辅助质粒的载体最经常地用于农杆菌介导的转化，其中为实现有效转化所需要的DNA区段的大小和复杂度是相当大的，并且有利的是将多项功能分离至单独的DNA分子上。双元载体一般含有这样的质粒载体，其含有为T-DNA转移所需的顺式作用序列(如左边界和右边界)、被工程化以能够在植物细胞中表达的选择标记和“目的基因”(被工程化以能够在对于产生转基因植物所需要的植物细胞中表达的基因)。这种质粒载体上也存在为细菌复制所需要的序列。顺式作用序列以允许有效转移至植物细胞并且在其中表达的的方式排列。例如，选择标记基因和杀虫基因位于左边界与右边界之间。第二种质粒载体常常含有介导T-DNA从农杆菌转移至植物细胞的反式作用因子。如本领域理解，这种质粒常常含有允许农杆菌感染植物细胞和通过在边界序列处切割来转移DNA和vir-介导的DNA转移的毒力功能(Vir基因)(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。一些类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可以用于植物转化。第二质粒载体对于通过其他方法如微量投射法、显微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法等转化植物不是必需的。

通常，植物转化方法涉及转移异源DNA至靶植物细胞中(例如不成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，随后施加最大阈水平的适宜选择(取决于选择标记基因)以从未转化细胞物质的群体中回收转化的植物细胞。外植体一般转移至相同培养基的新鲜补给物并例行地培养。随后，在补充有最大阈水平选择剂的再生培养基上放置后，转化的细胞分化成苗。苗随后转移至选择性生根培养基用于回收生根的苗或小植物。转基因小植物随后生长成成熟的植物并且产生能育性种子(例如Hiei等人(1994)The Plant Journal 6：271-282；Ishida等人(1996)NatureBiotechnology 14：745-750)。外植体一般转移至相同培养基的新鲜补给物并例行地培养。对用于产生转基因植物的技术和方法的一般描述见Ayres和Park(1994)Critical Critical Reviews in Plant Science 13：219-239和Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42：107-120。由于转化的材料含有许多细胞；转化的和未转化的细胞均存在任意一块的经处理的靶愈伤组织或组织或细胞群体中。杀死未转化的细胞并且允许转化的细胞增殖的能力产生转化的植物培养物。除去未转化细胞的能力常常是快速回收转化的植物细胞和成功产生转基因植物的限制条件。

转化方案以及用于导入核苷酸序列至植物中的方案可以根据为转化所靶向的植物或植物细胞的类型即单子叶植物或双子叶植物而变化。可以通过几种方法之一进行转基因植物的产生，所述的方法包括，但不限于显微注射法、电穿孔法、直接基因转移法、通过农杆菌导入异源DNA至植物细胞中(农杆菌介导的转化法)、用粘附至粒子的异源外来DNA轰击植物细胞、射弹粒子加速法、气溶胶束转化法(美国公开申请号20010026941；美国专利号4,945,050；国际公开号WO 91/00915；美国公开申请号2002015066)、Lec1转化法和转移DNA的多种其他的非粒子直接介导的方法。

用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。见，例如，Svab等人，(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga，(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga，(1993)，EMBO J.12：601-606。该方法依赖于基因枪送递含有选择性标记的DNA和通过同源重组将该DNA靶向质体基因组。另外，可以通过组织优选的表达胞核编码且质体定向的RNA聚合酶，反式激活沉默的质体携带的转基因来实现质体转化。这种系统已经在McBride等人，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中报道。

在整合异源外来DNA至植物细胞中之后，随后在培养基中施加最大阈水平的适宜选择以杀死未转化的细胞并且通过定期转移至新鲜培养基而分离和增殖从这种选择处理中存活的推定转化的细胞。通过连续传代并且用适宜的选择攻击，鉴定并且增殖用质粒载体转化的细胞。分子方法和生物化学方法随后可以用来证实整合至转基因植物的基因组中的目的异源基因的存在。

已经转化的细胞可以根据常规方法培育成植物。见，例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。这些植物随后可以进行培育，并且用相同的转化的株系或不同的株系授粉，并且鉴定具有所需表型特征的组成型表达的所得杂种。可以培育两个或多个世代以确保所需表型特征的表达是稳定维持并且遗传的，并且随后可以收获种子以确保所需表型特征的表达已经实现。以这种方式，本发明提供了转化种子(也称作“转基因种子”)，其具有稳定掺入其基因组的本发明核苷酸构建体，例如本发明的表达盒。

植物转化的评价

在导入异源外来DNA至植物细胞中之后，通过多种方法如分析与整合的基因相关的核酸、蛋白质和代谢物证实异源基因在植物基因组中的转化或整合。

PCR分析是在移植至土壤中之前早期对转化的细胞、组织或苗筛选所掺入基因的存在的快速方法(Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。使用对目的基因或农杆菌载体背景等特异的寡核苷酸引物实施PCR。

可以通过基因组DNA的DNA印迹分析证实植物转化(上文Sambrook和Russell，2001)。通常，从转化体提取总DNA，用适宜的限制酶消化，在琼脂糖胶中分离并且转移至硝化纤维素或尼龙膜。膜或“印迹物”随后根据标准技术(上文Sambrook和Russell，2001)用例如放射标记的32P靶DNA片段探测以证实导入的基因整合至植物基因组中。

在RNA印迹分析中，从转化体的特定组织分离RNA，在甲醛琼脂糖胶中分级分离并且根据本领域例行使用的标准方法(上文Sambrook和Russell，2001)印迹至尼龙滤膜上。随后通过本领域已知方法(上文Sambrook和Russell，2001)使该滤膜与从杀虫基因衍生的放射性探针杂交，检验由杀虫基因编码的RNA的表达。

可以对转基因植物实施蛋白质印迹法、生物化学测定法等以使用与杀虫蛋白上存在的一个或多个表位结合的抗体，通过标准方法(上文Sambrook和Russell，2001)证实由杀虫基因编码的蛋白质的存在。

在植物中的杀虫活性

在本发明的另一个方面，可以产生转基因植物，其表达具有杀虫活性的杀虫蛋白。上文通过例举方式描述的方法可以用来产生转基因植物，但是产生转基因植物细胞的方式对于本发明并非是关键的。本领域如已知或描述的方法，如农杆菌介导的转化法、生物射弹转化法和非粒子介导的方法，可以由实验员酌情使用。表达杀虫蛋白的植物可以通过本领域描述的常规方法分离，例如通过转化愈伤组织、选择转化的愈伤组织和从此类转基因愈伤组织再生能育植物。在此类方法中，可以使用任意基因作为选择标记，只要该选择标记在植物细胞中的表达赋予鉴定或选择转化细胞的能力。

已经开发了随植物细胞一起使用的众多标记，如氯霉素、氨基糖苷G418、潮霉素等耐药性。也可以使用编码参与叶绿体代谢的产物的其他基因作为选择标记。例如，提供针对植物除草剂如草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮的抗性的基因可以具有特殊用途。已经报道了此类基因(Stalker等人(1985)J.Biol.Chem.263：6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；和Sathasivan等人(1990)Nucl.Acids Res.18：2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。额外地，本文中公开的基因可用作标记以评估细菌细胞或植物细胞的转化。用于检测转基因在植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或它们的子代中存在的方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，通过测试杀虫活性检测该转基因的存在。

可以对表达杀虫蛋白的能育植物测试杀虫活性，并且选择显示最佳活性的植物用于进一步育种。测定杀虫活性的方法是本领域可获得的。一般而言，将所述蛋白质混合并用于饲喂测定法中。见，例如Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293。

本发明可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的实例包括，但是不限于谷物(玉米)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜、芸苔属物种(Brassica sp.)、苜蓿、黑麦、粟、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、凤梨、柑桔树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、扁桃、燕麦、蔬菜、观赏植物和松柏类。

蔬菜包括，但是不限于番茄、生菜、青豆、利马豆、豌豆和香瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜、罗马甜瓜和甜瓜。观赏植物包括，但是不限于杜鹃花、八仙花、木槿、玫瑰、郁金香、水仙、矮牵牛、康乃馨、一品红和菊花。优选地，本发明的植物是作物植物(例如，玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜等)。

杀虫控制中的用途

用于在杀虫剂控制中或工程化其他生物作为杀虫剂中使用包含本发明核苷酸序列或其变体的菌株的一般方法是本领域已知的。见，例如，美国专利号5,039,523和EP 0480762A2。

含有本发明核苷酸序列或其变体的芽孢杆菌菌株或已经被遗传地改变以含有杀虫性基因和蛋白质的微生物可以用于保护农业作物和产品免遭害虫影响。在本发明的一个方面，产生毒素(杀虫剂)的生物的完整(即未裂解)细胞用试剂处理，其中在施加该细胞至靶害虫的环境时，所述的试剂延长细胞中所产生毒素的活性。

备选地，通过导入杀虫基因至细胞宿主中产生杀虫剂。杀虫基因的表达直接或间接地导致该杀虫剂的胞内产生和维持。在本发明的一个方面，这些细胞随后在下述条件下处理，其中在施加该细胞至靶害虫的环境时，所述的条件延长细胞中所产生毒素的活性。所得的产物保留毒素的毒性。这些天然封装的杀虫剂随后可以根据常规技术配制以施加至容纳靶害虫的环境，例如，土壤、水和植物的叶。见，例如EPA 0192319及其中引用的参考文献。备选地，可以配制表达本发明基因的细胞，从而允许应用所得的物质作为杀虫剂。

本发明的活性成分正常地以组合物的形式施加并且可以是与其他化合物同时或依次地施加至待处理的作物区域或植物。这些化合物可以是肥料、除草剂、抗冻剂、表面活性剂、去垢剂、杀虫皂、休眠油、聚合物和/或延时释放或生物可降解载体制剂，其在单次施加该制剂后允许对靶区域长期给药。它们也可以是选择性除草剂、化学杀虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、抗阿米巴药、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫药、杀螺剂或这些制品中几种制品的混合物，根据需要，连同其他农业上可接受的载体、表面活性剂或制剂领域常规使用的应用促进佐剂。合适的载体和佐剂可以是固体或液体并且对应于配制技术中通常使用的物质，例如天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。通常，制剂可以制备成可食性“饵料”或加工成害虫“陷阱”以允许杀虫制剂被靶害虫采食或摄取。

施加本发明的活性成分或本发明的农业化学组合物的方法包括叶施加、种子包衣和土壤施加，其中所述的农业化学组合物含有少一种由本发明细菌菌株产生的杀虫蛋白。施加的次数和施加的速率取决于相应害虫的侵袭强度。

组合物可以配制为散剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂、溶液剂等，并且可以通过常规手段如干燥、冻干、匀浆、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩包含所述多肽的细胞的培养物制备。在含有至少一种所述杀虫多肽的全部此类组合物中，该多肽可以以按重量计约1％至约99％的浓度存在。

可以通过本发明的方法杀死给定地区内的鳞翅目、双翅目或鞘翅目害虫或减少其数目，或可以预防地施加至环境地区以防止易感害虫侵袭。优选地，害虫摄取或接触杀虫有效量的所述多肽。“杀虫有效量”意指杀虫剂的能够对至少一种害虫造成死亡或能够显著减少害虫生长、采食或正常生理发育的量。该量将根据此类因素变动，例如，待控制的特定靶害虫、待处理的具体环境、位置、植物、作物或农业地点、环境条件，和施加杀虫有效性多肽组合物的方法、速率、浓度、稳定性及量。制剂也可以随气候条件、环境考虑和/或施加频率和/或害虫侵袭的严重性变动。

可以通过将细菌细胞、晶体和/或孢子悬液或分离的蛋白质组分与想要的可农用载体配制来制备所描述的杀虫剂组合物。组合物可以在施用之前以适宜的手段如冻干、冷冻干燥、脱水或在水性载体、介质或合适稀释剂如盐水或其他缓冲液中配制。配制的组合物可以处于尘剂或颗粒物质的形式或是油(植物油或矿物油)中的混悬剂或水或油/水乳剂，或作为可湿性粉剂，或与适用于农业应用的任何其他载体物质组合。合适的农用载体可以是固体或液体并且是本领域熟知的。术语“可农用载体”涵盖杀虫剂配制技术中通常使用的全部佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些物质是杀虫剂配制领域的技术人员熟知的。所述制剂可以与一种或多种固体或液体佐剂混合并且通过多种手段制备，例如，通过使用常规配制技术将杀虫性组合物与合适佐剂均匀地混合、掺合和/或研磨。合适的配制和施加方法在通过引用并入本文的美国专利号6,468,523中描述。

“害虫”包括但是不限于昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。昆虫害虫包括选自鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，尤其选自鞘翅目、鳞翅目和双翅目的昆虫。

鞘翅目包括肉食亚目(Adephaga)和多食亚目(Polyphaga)。肉食亚目包括步甲总科(Caraboidea)和豉甲总科(Gyrinoidea)，而多食亚目包括水龟虫总科(Hydrophiloidea)、隐翅虫总科(Staphylinoidea)、花萤总科(Cantharoidea)、郭公虫总科(Cleroidea)、叩头虫总科(Elateroidea)、花甲总科(Dascilloidea)、泥甲总科(Dryopoidea)、丸甲总科(Byrrhoidea)、扁甲总科(Cucujoidea)、芜菁总科(Meloidea)、花蚤总科(Mordelloidea)、拟步行甲总科(Tenebrionoidea)、长蠢总科(Bostrichoidea)、金龟总科(Scarabaeoidea)、天牛总科(Cerambycoidea)、叶甲总科(Chrysomeloidea)和象虫总科(Curculionoidea)。步甲总科包括虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)和龙虱科(Dytiscidae)。豉甲总科包括豉甲科(Gyrinidae)。水龟虫总科包括水龟虫科(Hydrophilidae)。隐翅甲总科包括葬甲科(Silphidae)隐翅甲科(Staphylinidae)。花萤总科包括花萤科(Cantharidae)和萤科(Lampyridae)。郭公虫总科包括郭公虫科(Cleridae)和皮蠹科(Dermestidae)。叩头虫总科包括叩头虫科(Elateridae)和吉丁虫科(Buprestidae)。扁甲总科包括瓢虫科(Coccinellidae)。芜菁总科包括芫菁科(Meloidae)。拟步行甲总科包括拟步甲科(Tenebrionidae)。金龟总科包括黑蜣科(Passalidae)和金龟科(Scarabaeidae)。天牛总科包括天牛科(Cerambycidae)。叶甲总科包括叶甲科(Chrysomelidae)。象虫总科包括象虫科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)。

双翅目包括长角亚目(Nematocera)、短角亚目(Brachycera)和环裂亚目(Cyclorrhapha)。长角亚目包括大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、摇蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)和瘿蚊科(Cecidomyiidae)。短角亚目包括水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、剑虻科(Therevidae)、食虫虻科(Asilidae)、拟食虫虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)和长足虻科(Dolichopodidae)。环裂亚目包括无缝组(Aschiza Division)和有缝组(Schizophora Division)。无缝组包括蚤蝇科(Phoridae)、蚜蝇科(Syrphidae)和眼蝇科(Conopidae)。有缝组包括无瓣类(Acalyptratae)和有瓣类(Calyptratae)。无瓣类包括斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科(Agromyzidae)和果蝇科(Drosophilidae)。有瓣类包括虱蝇科(Hippoboscidae)、狂蝇科(Oestridae)、寄蝇科(Tachinidae)、花蝇科(Anthomyiidae)、蝇科(Muscidae)、丽蝇科(Calliphoridae)和麻蝇科(Sarcophagidae)。

鳞翅目包括凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、天蚕蛾科(Saturniidae)、尺蛾科(Geometridae)、灯蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)和谷蛾科(Tineidae)。

针对主要农作物的本发明虫害包括：玉米：玉米螟(Ostrinia nubilalis)、欧洲玉米螟(European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon)、黑地老虎(black cutworm)；谷实夜娥(Helicoverpa zea)、棉铃虫(corn earworm)；草地夜娥(Spodoptera frugiperda)、秋夜蛾(fall armyworm)；西南玉米秆草螟(Diatraea grandiosella)、西南玉米螟(southwestern corn borer)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米秆螟(lesser cornstalk borer)；小蔗螟(Diatraea saccharalis)，小蔗螟(surgarcane borer)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)、西方玉米根虫(western corn rootworm)；长角叶甲巴氏亚种(Diabrotica longicornis barberi)、北方玉米根虫(northern cornrootworm)；黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctatahowardi)，南方玉米根虫(southern corn rootworm)；梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)、金针虫(wireworms)；北方圆头犀金龟(Cyclocephalaborealis)、北方假面金龟子(northern masked chafer)(蛴螬)；南方圆头犀金龟(Cyclocephala immaculata)，南方假面金龟子(southern maskedchafer)(蛴螬)；日本弧丽金龟(Popillia japonica)，日本金龟子(Japanesebeetle)；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria)、玉米铜色跳甲；玉米长啄象(Sphenophorus maidis)，玉米长啄象；玉米蚜(Rhopa1osiphum maidis)，玉米蚜；玉米根蚜(Anuraphis maidiradicis)，玉米根蚜(corn root aphid)；美洲谷秆长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)，美洲谷秆长蝽(chinchbug)；赤胫黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，红胫蝗虫(redleggedgrasshopper)；血黑蝗(Melanoplus sanguinipes)，迁徙蝗虫；灰种蝇(Hylemya platura)、玉米种蝇(seedcorn maggot)；玉米斑潜蝇(Agromyzaparvicornis)、玉米斑潜蝇；黄呆蓟马(Anaphothrips obscrurus)、草蓟马(grass thrips)；窃蚁(Solenopsis milesta)、窃蚁(thief ant)；二斑叶螨(Tetranychus urticae)、二斑叶螨；高粱：斑禾草螟(Chilo partellus)，高粱螟；草地夜蛾，秋夜蛾；谷实夜娥，棉铃虫；南美玉米苗斑螟，小玉米秆螟；粒肽脏切夜娥(Feltia subterranea)，颗粒地老虎(granulate cutworm)；长毛食叶然金龟(Phyllophaga crinita)、蛴螬；伪金针虫属物种(Eleodesspp.)、单叶叩甲属物种(Conoderus spp.)、以及Aeolus spp.，线虫；黑角负泥虫(Oulema melanopus)，谷类叶甲(cereal leaf beetle)；玉米铜色跳甲，玉米铜色跳甲；玉米长啄象，玉米谷象；玉米蚜，玉米蚜；美甘蔗伪毛蚜(Sipha flava)，黄甘蔗蚜(yellow sugarcane aphid)；美洲谷秆长蝽，美洲谷秆长蝽；高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola)，粱痪蚊(sorghum midge)；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)，朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)；二斑叶蹒(Tetranychus urticae)，二斑叶蹒；小麦：一点黏虫(Pseuda1etiaunipunctata)，黏虫(army worm)；草地夜蛾，秋夜蛾；南美玉米苗斑螟，小玉米秆螟；西方灰地老虎(Agrotis orthogonia)，西方地老虎；南美玉米苗斑螟，小玉米秆螟；黑角负泥虫，谷类叶甲；三叶草叶象(Hyperapunctata)，三叶草叶象；黄瓜十一星叶甲食根亚种，南方玉米根虫；俄罗斯小麦蚜虫(Russian wheat aphid)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum)，麦二叉蚜；麦长管蚜(Macrosiphum avenae)，麦长管蚜；赤胫黑蝗，赤胫黑蝗；特异黑蝗(Melanoplus differentia1is)，特异黑蝗；血黑蝗，迁徙蝗虫；小麦瘿蚊(Mayetiola destructor)，小麦瘿蚊(Hessian fly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana)，麦蛆(wheat midge)；美洲杆蝇(Meromyzaamericana)，美洲麦秆黄潜蝇(wheat stem maggot)；麦瘿种蝇(Hylemyacoarctata)，麦种蝇(wheat bulb fly)；烟褐花蓟马(Frankliniella fusca)，烟草褐蓟马(tobacco thrips)；麦茎蜂(Cephus cinctus)，麦茎蜂；郁金香瘤瘿螨(Aceria tulipae)，小麦曲叶螨(wheat curl mite)；向日葵：向日葵芽卷叶娥(Suleima helianthana)，向日葵芽娥；向日葵同斑螟(Homoeosomaelectellum)，向日葵娥；向日葵叶甲(zygogramma exclamationis)，向日葵甲虫；胡萝卜利犀金龟(Bothyrus gibbosus)，胡萝卜甲虫；向日葵籽瘿蚊(Neolasioptera murtfeldtiana)，向日葵籽瘿蚊；棉花：烟芽夜娥(Heliothisvirescens)，棉花蚜虫；谷实夜娥，棉铃虫；甜菜夜娥(Spodoptera exigua)，甜菜夜娥；红铃麦娥(Pectinophora gossypiella)，粉色螟蛉(pink bollworm)；墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis)，棉子象鼻虫；棉蚜(Aphis gossypii)，棉蚜；棉序盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)，棉花跳盲蝽；茼麻粉虱(Trialeurodes abutilonea)，带状翅白粉虱(bandedwinged whitefly)；美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)，tarnished plant bug；赤胫黑蝗，红胫蝗虫；特异黑蝗，特异黑蝗；烟蓟马(Thrips tabaci)，洋葱蓟马；烟褐花蓟马，烟草褐蓟马；朱砂叶螨，朱砂叶螨；二斑叶螨，二斑叶螨；稻：小蔗螟，小蔗螟；草地夜娥，秋夜娥；谷实夜娥，棉铃虫；葡萄鞘叶甲(Colaspis brunnea)，葡萄鞘叶甲；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)，稻水象甲；米象(Sitophilus oryzae)，米象；二条黑尾叶蝉(Nephotettix nigropictus)，米叶蝉；美洲谷秆长蝽，美洲谷秆长蝽；拟缘蝽(Acrosternum hilare)，绿蝽；大豆：大豆夜娥(Pseudoplusia includens)，大豆尺夜娥(soybean looper)；梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，梨豆夜蛾(velvetbean caterpillar)；夜蛾科；苜蓿绿夜娥(Plathypena scabra)，苜蓿绿夜娥；玉米螟，欧洲玉米螟；小地老虎，黑地老虎；甜菜夜娥，甜菜夜娥；烟芽夜娥(Heliothis virescens)，烟芽夜蛾；谷实夜娥，棉铃虫；墨西哥大豆瓢虫(Epilachna varivestis)，墨西哥大豆瓢虫；桃蚜(Myzus persicae)，桃蚜；蚕豆微叶蝉(Empoasca fabae)，马铃薯叶蝉；拟缘蝽，绿蝽；赤胫黑蝗，赤胫黑蝗；特异黑蝗，特异黑蝗；灰种蝇(Hylemya platura)，玉米种蝇；大豆蓟马(Sericothrips variabilis)，大豆蓟马；烟蓟马，洋葱蓟马；土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani)，草莓叶螨；二斑叶螨，二斑叶螨；大麦：玉米螟，欧洲玉米螟；小地老虎，黑地老虎；麦二叉蚜，麦二叉蚜(greenbug)；美洲谷秆长蝽，美洲谷秆长蝽；拟缘蝽，绿蝽；烟草蝽(Euschistus servus)，褐臭蝽；灰地种蝇(Deliaplatura)，玉米种蝇(seedcorn maggot)；小麦瘿蚊，小麦瘿蚊；麦岩螨(Petrobia latens)，麦长腿蜘蛛；油菜：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)，卷心菜蚜；黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae)，跳甲(Flea beetle)；蓓带夜娥(Mamestra configurata)，贝莎夜蛾(Bertha armyworm)；菜蛾(Plutellaxylostella)，小菜蛾(Diamond-back moth)；地种蝇属物种(Delia ssp.)，根蛆(Root maggot)。

线虫类包括寄生性线虫，例如根节，胞囊和损伤线虫，包括胞囊线虫属物种(Heterodera spp.)、根结线虫数物种(Meloidogyne spp.)和球胞囊线虫属物种(Globodera spp.)，特别是胞囊线虫类的成员，包括但不局限于，大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)(甜菜胞囊线虫)、燕麦胞囊线虫(Heterodera avenae)(谷类胞囊线虫)；和马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)以及马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯胞囊线虫(potata cyst nematodes))。损伤线虫包括短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)。

还可以用一种或多种化学组合物来处理植物，这些化学组合物包括一种或多种除草剂、杀虫剂、或杀真菌剂。示例性的化学组合物包括：果实/ 蔬菜类除草剂：莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草丁膦、氯吡嘧磺隆(Gowan)、百草枯、戊炔草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、Indaziflam；果实/蔬菜杀虫 剂：涕灭威、转苏云金芽孢杆菌、甲萘威、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、二嗪磷、马拉硫磷、阿维菌素、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、双苯氟脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、唑虫酰胺、噻虫胺、螺螨酯、γ-三氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、氯虫酰胺、Cyazypyr、Spinoteram、杀虫脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氯虫双酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、Cyanopyrafen、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、Spinotoram、硫双威、氟啶虫酰胺、甲硫威、因灭汀-苯甲酸盐、茚虫威、Fozthiazate、苯线磷、硫线磷、蚊蝇醚、苯丁锡、噻螨酮、灭多威、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮；水果/蔬菜杀真菌剂类：多菌灵、百菌清、EBDC、硫、甲基硫菌灵、嘧菌酯、霜脲氰、氟啶胺、三乙膦酸、异菌脲、醚菌酯、甲霜灵/精甲霜灵、肟菌酯、噻唑菌胺、丙森锌、肟菌酯、环酰菌胺、富马酸恶咪唑、赛座灭、咪唑菌酮、苯酰菌胺、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、环氟菌胺、啶酰菌胺；谷物除草剂类：异丙隆、溴苯腈、碘苯腈、苯氧基类、氯磺隆、炔草酸、禾草灵、氟虫腈、精恶唑禾草灵、双氟磺草胺、氟草烟、甲磺隆、醚苯磺隆、氟酮磺隆、碘磺隆、丙苯磺隆、氟吡酰草胺、磺胺磺隆、氟丁酰草胺、唑啉草酯、酰嘧磺隆、噻磺隆、苯磺隆、氟啶嘧磺隆、磺酰磺隆、Pyrasulfotole、甲氧磺草胺、氟噻草胺、肟草酮、Pyroxasulfon；谷物杀真菌剂类：多菌灵、百菌清、嘧菌酯、环唑醇、嘧菌环胺、丁苯吗啉、氟环唑、醚菌酯、喹氧灵、戊唑醇、肟菌酯、硅氟唑、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌胺、丙硫菌唑、氟嘧菌酯；谷类杀 昆虫剂类：乐果、λ-氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、α-氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、Clorphyriphos、甲胺磷、乙酰甲胺磷、抗蚜威、甲硫威；玉米除草剂类：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S-)甲酚噻草胺、草铵膦、草甘膦、异恶唑草酮、(S-)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、Topramezone、Tembotrione、嘧啶肟草醚、酮脲磺草吩酯、氟噻草胺、Pyroxasulfon；玉蜀黍杀昆虫剂 类：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、λ-三氟氯氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、螺甲螨酯、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、杀虫隆、七氟菊酯、嘧丙磷、乙虫腈、Cyazypyr、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素、甲硫威、螺螨酯、螺虫乙酯；玉米杀真菌剂类：种衣酯、福美双、丙硫菌唑、戊唑醇、肟菌酯；稻除草剂类：丁草胺、敌稗、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草酯、杀草隆、四唑酰草胺、咪唑磺隆、苯噻草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、禾草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、去稗安、苯并双环酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚、稻思达、乙氧嘧磺隆、丙草胺、硝草酮、Tefuryltrione、恶草酮、精恶唑禾草灵、Pyrimisulfan；稻杀昆虫剂类：二嗪磷、杀螟硫磷、仲丁威、久效磷、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、噻虫胺、乙虫腈、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、Cyazypyr、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氯氰菊酯、毒死蜱、杀螟丹、甲胺磷、醚菊酯、三唑磷、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、克百威、丙硫克百威；稻杀真菌剂类：甲基硫菌灵、嘧菌酯、环丙酰菌胺、敌瘟磷、嘧菌腙、异稻瘟净、稻瘟灵、戊菌隆、噻菌灵、咯奎酮、三环唑、肟菌酯、双氯氰菌胺、氰菌胺、硅氟唑、噻酰菌胺；棉花除草剂类：敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、丁基吡氟禾草灵、草甘膦、哒草伏、二甲戊乐灵、嘧硫苯甲酸钠、三氟啶磺隆、得杀草、草铵膦、丙炔氟草胺、塞苯隆；棉花杀昆虫剂类：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、马拉硫磷、久效磷、阿维菌素、啶虫脒、因灭汀-苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威、λ-三氟氯氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-三氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氯虫双酰胺、Cyazypyr、多杀菌素、Spinotoram、γ-三氟氯氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、氟啶虫胺腈、丙溴磷、三唑磷、硫丹；棉花杀真菌剂类：土菌灵、甲霜灵、喹硫磷；大豆除 草剂类：甲草胺、灭草松、氟乐灵、氯嘧磺隆、氯酯磺草胺、精恶唑禾草灵、氟磺胺草醚、丁基吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊乐灵、得杀草、草铵膦；大豆杀昆虫 剂类：λ-三氟氯氰菊酯、灭多威、对硫磷、甲硫威、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、Cyazypyr、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ三氟氯氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀虫脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂类：嘧菌酯、环唑醇、氟环唑、粉唑醇、吡唑醚菌酯、戊唑醇、肟菌酯、丙硫菌唑、四氟醚唑；甜菜除草剂类：杀草敏、甜安宁、乙氧氟草黄、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、丁基吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、三氟啶磺隆、得杀草、精喹禾灵；甜菜杀昆虫剂类：吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ/λ三氟氯氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、Cyaxypyr、氟虫腈、克百威；低芥酸菜籽除草剂类：二氯吡啶酸、禾草灵、丁基吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐灵、胺苯磺隆、喹草酸、精喹禾灵、烯草酮、得杀草；低芥酸菜籽杀真菌剂类：嘧菌酯、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、丙氯灵、烯菌酮；低芥酸菜籽杀昆虫剂类：克百威、有机磷酸盐类、拟除虫菊酯、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ以及λ三氟氯氰菊酯、τ-氟氰胺菊酯、乙虫腈、多杀菌素、Spinotoram、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、Cyazypyr、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。

用于增加植物产量的方法

提供用于增加植物产量的方法。所述方法包括将包含本文中公开的杀虫序列的多核苷酸导入植物或植物细胞。如本文中定义，植物的“产量”指由植物产生的生物量的品质和/或量。“生物量”意指任何所度量的植物产物。生物量产生的增加是任何所度量植物产物的产量方面的任意改善。增加植物产量具有几项商业应用。例如，增加植物叶生物量可以增加用于人或动物消费的叶菜类的产量。另外，增加叶生物量可以用来增加植物衍生的药用或工业产物的生产。产量的增加可以包含任何统计学显著的增加，包括，但不限于与不表达杀虫序列的植物相比，产量增加至少1％、增加至少3％、增加至少5％、增加至少10％、增加至少20％、增加至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更多。

以下实施例以说明方式且不以限制方式提供。

实验

实施例1.表达构建体

pAX 5510是基于pRSF1b1载体系统(Invitrogen)的表达载体，其含有在T7启动子下游的可读框SEQ ID NO：1(本文中命名为axmi-R1，其编码

检索号POA379描述的序列)，从而诱导T7启动子的转录(例如，在BL21：DE3菌株中)导致带有N末端His标签的cry-R1蛋白(SEQID NO：2，其对应于检索号POA379描述的序列)在大肠杆菌细胞中积累。

实施例2.西方玉米根虫(WCRW)和南方玉米根虫(SCRW)生物测定 法

将西方和南方玉米根虫卵(分别是玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)和黄瓜十一星叶甲(Diabrotica undecimpunctata))(Crop Characteristics，MN)洗涤并且在25℃孵育直至接近孵化。将熔融的人工食物如先前描述(美国专利号7,351,881，其通过引用方式并入本文中)制备，以1ml等份放置并且允许在24孔组织培养平板(Corning 3527)中冷却1小时。一旦固化，将40μl样品置于每孔中并且允许扩散至食物中。在样品被吸收后，将7.5μl卵：0.15％琼脂浆液(每孔大约25个根虫卵)递送到每孔的侧面上并且允许干燥。一旦干燥，将平板用BREATHE-

透气膜(Research ProductsInternational)密封并且置于黑暗生长箱(25℃，90％相对湿度(RH))中。

24小时后，从每块平板移走膜并且随后移出未孵化的卵，将平板以透气膜再密封并且返回黑暗生长箱(25℃，90％RH)持续额外的4日。在总共5日后，样品孔中的昆虫与板内对照比较并且评估生长迟缓和死亡率(评分系统，见表1)。

表1.WCRW和SCRW生物测定法中所用的评分系统

评分	定义
		0	无活动
1	轻微，不均匀的生长迟缓
		2	不均匀的生长迟缓
3	均匀的生长迟缓
		4	伴有死亡率(表示为百分数)的均匀生长迟缓
5	伴有100％死亡率的均匀生长迟缓

实施例3.诱变策略和第一诱变处理文库的产生

第一代点突变文库(PM文库1，PM1)靶向SEQ ID NO：2的4个区域，包含二十八(28)个位置。使用pAX5510作为模板，使用

位点定向诱变试剂盒将几个独立位置随机化，并且测定大量变体的DNA序列。通过DNA序列的分析，汇集想要的变体，同时消除不想要的的克隆(如野生型克隆、重复突变体和移码突变体)。从PM库鉴定出二百九十四个(294)独特变体用于进一步测试。

初步筛选.将汇集的文库变体以及pAX5510转化至BL21＊DE3细胞中并且平板接种在LB+卡那霉素(100μg/ml)上。挑取新鲜菌落至8.5mlLB+卡那霉素(100ug/ml)液体培养基中并且在24深孔板中于37℃和250转/分钟培育直至达到0.3-0.4的OD600nm。添加IPTG至终浓度0.5mM，并且将培养物在20℃孵育额外的18小时。测定OD600nm，并且通过离心(在4℃，4500转/分钟，10分钟)收集细胞。细胞沉淀以10OD600/ml的密度重悬于50mM碳酸钠pH 10.5，1mM DTT中。通过小珠打浆法破坏细胞，并且在4℃以4000转/分钟离心15分钟后获得可溶性提取物。

每种变体4次重复测定所述提取物针对WCRW和SCRW的活性。在5日后，通过平均来自4个重复的评分确定根虫毒性评分。这个初级筛选中筛选到变体(总计436个)，提供1.5x文库覆盖度。

再测定和放大.使用与初步筛选中相同的实验条件，再测定在初步筛选中评分≥3的43个变体。平均从初步筛选和再测定中获得的评分，包括因采样过密而来自重复分离株的评分，并且为更广泛的放大，将20种变体按优先顺序列出。

为了放大，将5个新鲜转化的菌落挑至135ml LB+卡那霉素(100μg/ml)中并且在1升摇瓶于37℃和250转份钟培育直至达到0.3-0.4的OD600nm。添加IPTG至终浓度0.5mM，并且将培养物在20℃孵育额外的18小时。测定OD600nm，并且通过离心(在4℃，5000转/分钟，10分钟)收集细胞。细胞沉淀以10OD600/ml的密度重悬于50mM碳酸钠pH 10.5，1mM DTT中。通过小珠打浆法破坏细胞，并且在4℃以4000转/分钟离心15分钟后获得可溶性提取物。通过提取物的连续稀释与已知浓度的BSA标准物比较，在以考马斯染色的SDS-PAGE上定量这些提取物中的AXMI-R1变体。所研究的诸AXMI-R1变体的浓度是接近的，范围是0.13-0.22μg/ul。

为了测定，在来自用pRSF1b转化的BL21＊DE3的对照提取物中制备含有AXMI-R1变体的提取物的连续稀释液。稀释度范围从40至1.25μl的含有AXMI-R1变体的提取物。因而，滴定AXMI-R1变体的浓度，同时BL21#DE3蛋白的量维持恒定。在WCRW上测定每种变体和稀释度的40个重复。确定每个稀释度的平均评分，以及EC50。

AXMI-R1变体根据40μl提取物情况下的平均生物测定法评分(n＝40)评定(表2)。为了比较，制备AXMI-R1野生型(wt)的6个生物学重复物，并且提供数据和标准差。

变体D4F11、H9、G5、H4、D5D8和D4A2显示针对WCRW的显著改善的活性。编码D5D8的核苷酸序列在SEQ ID NO：5中描述，并且氨基酸序列在SEQ ID NO：6中描述。

表2.对WCRW具有改善活性的变体

因而，尽管不受任何具体理论或机制束缚，改善的WCRW活性可能与AXMI-R1的3个位置中的突变有关(表2)。AXMI-R1的第154和160位置处于所提出的加工与孔形成区内，而第316位处于所提出的受体结合区内(Li等人，1991，Nature 353：815-821)。

实施例4.组合变体：

产生下述变体，其组合有第316位置处的有用突变与第54和160位置处的有用突变以鉴定出提供加工和受体识别作用累积改善的突变组合。表3列出这个试验的结果；生物测定数据表明，组合突变体P160I；G316T(H9+D5D8)和P160F；G316T(H4+D5D8)提供了活性的累积改善。编码H9+D5D8的核苷酸序列在SEQ ID NO：7中描述，并且氨基酸序列在SEQ IDNO：8中描述。H4+D5D8的氨基酸序列在SEQ ID NO：26中描述。

表3a.组合变体针对SCRW的活性

表3b.组合变体针对WCRW的活性

实施例5.点突变体文库2：在第316位侧翼的残基

考虑到PM文库1(PM1)中因第316残基中突变所产生的改善的杀虫活性，相对于SEQ ID NO：2的第313、314、315、317和318位产生第二个点突变文库(PM文库2，PM2)。该文库具有61种变体的理论多样性。测定了九十二个(92)变体，并且在第316位侧翼的5个变体(R315F、R315M、R315W、Y317E、Y317N)在初步筛选中显示一定的改善。将变体R315M和R315W放大并且以范围125-250μg/ml的蛋白浓度测定。数据显示第315位的改变可以产生针对CRW的改善活性。

表4a.变体针对WCRW的活性

表4b.变体针对SCRW的活性

实施例6.变换文库1

靶定第154、155、158和160位产生变换诱变(permutationalmutagenesis)文库。使用如本领域已知的寡-定向诱变方法产生该种文库(文库P1；P1)，从而产生具有768种变体的理论复杂度的文库。掺入该文库中的多样性如下：

表5.在文库2中变更的位置

以24孔形式分析了五百七十三个(573)克隆(每个克隆4次重复)，并且鉴定了用于进一步测试的155个克隆。将73个克隆再测试，并且在(如本文中所述)放大后，最终测试8个克隆。

实施例7.变体对WCRW和SCRW的死亡率

选择来自P1的显示所希望活性的几个变体用于如本文中所述的放大实验。所得的蛋白质以范围125-250μg/ml的蛋白浓度测试。几种变体在这些测定法中显示杀死WCRW和SCRW的能力，而对照蛋白AXMI-R1wt在这些测定法中对WCRW或SCRW显示无死亡率。

在第一组实验中，将CRW卵置入孔中，添加样品，并且在5日后，评定对CRW的损伤和％CRW死亡率(如果适用)(表6)。平均评分和平均死亡率基于对WCRW的40次重复和对SCRW的20次重复。数据显示变体PermutP3c6和PermutP3c7针对WCRW产生8-9％的死亡率并且针对SCRW产生60-80％死亡率，而AXMI-R1wt不显示死亡率(表7)。编码3c7变体的核苷酸序列在SEQ ID NO：12中描述，并且氨基酸序列在SEQ IDNO：13中描述。

通过SDS-PAGE对蛋白质的分析显示AXMI-R1wt、3c6和3c7的表达水平不可区分的并且可能是相同的。

表6.变体对玉米根虫的活性

表7.变体对玉米根虫的死亡率

在后续实验中，将CRW卵置入孔中，添加样品，并且在1日后，移出未未孵化的卵。该方法产生早期孵化CRW幼虫的更同步的种群，所述的种群在样品施加1-2日内遭遇样品。在这些条件下，变体3c7针对WCRW实现44％死亡率并且针对SCRW实现86％死亡率(表8)。

表8.变体PermutP3c7在修改的玉米根虫测定法中的死亡率

与AXMI-R1对照相比，第三变体3a11(V155K；R158G；P160T)也针对WCRW诱导死亡率。在该实验中，将CRW卵置入孔中，添加样品，并且在1日后，移出未孵化的卵。在该测定法中在暴露于3a11的根虫中观察到36％的死亡率(表9)。

表9.变体3a11对玉米根虫的活性

表10.某些变体的氨基酸变化的总结

蛋白质ID	相对于SEQ ID NO：2的氨基酸变化
		3c7	P154A；V155K；P160V
3c6	P154Q；V155E；P160L
		3a11	V155K；R158G；P160T

实施例8.组合变体

产生将3c7(P154A、V155K、P160V)和来自文库PM1的变体D5D8(G316T)组合的变体并且测试其CRW活性，并且在范围125-250μg/ml的蛋白浓度针对WCRW和SCRW显示死亡率。编码3c7+D5D8变体的核苷酸序列在SEQ ID NO：9中描述，并且氨基酸序列在SEQ IDNO：10中描述。

实施例9.文库PM2

产生第二代点突变文库(PM2)以将第482和483位置中的变更与第315和316位置中的变更组合。该文库含有756个变体。挑出多于1,100个克隆并测试活性。发现与AXMI-R1相比，变体‘1g8’(G316E、Q482L、G483K)和‘2b11’(G316A、Q482L、G483K)对根虫害虫显示改善的活性。与3c7相比，变体1g8在大多数情况下显示优异活性。编码1g8变体的核苷酸序列在SEQ ID NO：14中描述，并且氨基酸序列在SEQ ID NO：15中描述。

表11.具有50％或更大死亡率的孔的百分数

	WCRW	SCRW
			AXMI-R1(pAX5510)	0	0
3c7	56	13
			1g8	100	50
载体对照	6	0

实施例10.文库P3

产生处在与AXMI-R1第481至486位置(本文中命名为‘环3’)相对应的位置中的变体文库(文库P3)。测试各个克隆以评估每个残基对杀虫活性的贡献。发现残基482和483对活性有贡献，因为在这些残基中的变体对玉米根虫显示改善的活性(表12)。

表12.来自残基482和483的改善的变体

相对于SEQ ID NO：2的氨基酸变化		WCRW(评分)	SCRW(评分)
				无	试验1	1	0
	试验2	2	0
					试验3	2	2
Q482I	试验1	4	2
					试验2	3	2
G483K	试验1	4	3
					试验2	4	4
G483S	试验1	3	1
					试验2	4	3
G438Q	试验1	2	3
					试验2	4	3

实施例11.组合变体

产生了将变体1g8和2b11中观察到的变更与3c7中的变更组合的克隆。测试所得的克隆AXMI-R1(3c7+1g8)和AXMI-R1(3c7+2b11)并且发现它们保留针对玉米根虫的活性。值得注意地，AXMI-R1(3c7+1g8)似乎比单独的3c7显示针对玉米根虫的更高死亡率。AXMI-R1(3c7+2b11)也在一些试验中显示比单独3c7更大的活性。

实施例12.AXMI-R1(EVO23)的产生

将加工区的第二代变换文库克隆至AXMI-R1(1g8)(SEQ ID NO：15)中，因而允许在变体AXMI-R1(1g8)的环境下加工区内的多样性筛选，其中所述的变体AXMI-R1含有在受体结合区内的突变。该文库的多样性是573。筛选了变体(n＝813)，再测定163个克隆，并且将40种变体放大。来自该文库的AXMI-R1(EVO23)(SEQ ID NO：17)具有最高活性。编码AXMI-R1(EVO23)的核苷酸序列在SEQ ID NO：16中描述。EVO23对WCRW的活性在表13中显示。

表13.变体EVO23对西方玉米根虫的活性

	WCRW平均死亡率(％)	标准差
			AXMI-R1	1.67	3.79
Evo23	23.44	6.15
			pRSF1b	0.20	0.78

实施例13.结构域II/III界面变体的产生

对axmi-R1的建模已经鉴定了对结构域2和结构域3之间界面有贡献的3个区域。这些区域对应于SEQ ID NO：2的第331-335位置、第368-373位置和第518-524位置。产生靶定这些区域的变体文库。与第518-524位相对应的文库的多样性是8(表14)。筛选到12个变体，并将L61E11再测定和放大。

表14结构域II/III界面变体文库

L61E11变体针对WCRW的活性在表15中显示。

表15.L61E11对西方玉米根虫的活性

	WCRW平均死亡率(％)	标准差
			AXMI-R1	13	14.2
L61e11	18	14.5
			pRSF1b	0	0

本发明说明本文中所述残基的变更产生对害虫具有改善活性的变体。表16中提供了在本发明中予以改变的残基的概述。

表16.在改善的变体中改变的位置概述

实施例14.进化的AXMI-R1序列在其他Cry蛋白质中的用途

含有有用突变的AXMI-R1序列区段可以插入其他的同源Cry蛋白以改善加工、受体结合和活性。例如，来自覆盖加工区的进化AXMI-R1变体中的序列区段可用来替换axmi008、axmi028和其他Cry蛋白中的同源区域。由于Cry蛋白的立体折叠是保守的，因而可以实现杂合蛋白的改善的加工和效力。对这些AXMI-R1变体序列的进一步诱变可以在宿主蛋白的背景下帮助适应和改善AXMI-R1变体序列。

实施例15.杀虫活性的额外测定法

可以检验本发明的核苷酸序列产生杀虫蛋白的能力。常常以众多方式评估杀虫蛋白作为杀虫剂对害虫发挥作用的能力。本领域熟知的一种方式是进行饲喂测定法。在这种饲喂测定法中，使害虫暴露于含有待检验化合物的样品或对照样品。这常常通过将待检验的物质或该物质的合适稀释物放置到害虫会摄取的物质(如人工食物)上进行。待检验的物质可以由液体、固体或浆液组成。待检验的物质可以置于表面上并随后允许干燥。备选地，待检验的物质可以与熔融的人工食物混合，随后分配至测定箱中。测定箱可以是例如杯、碟或微量滴定板的孔。

用于吸吮性害虫(例如蚜虫)的测定法可以涉及通过隔板(理想地是可以被吸吮昆虫的吸口部分穿透以允许摄取试验材料的部分)将试验材料与昆虫分隔。该试验材料常常与饲喂刺激物如蔗糖混合以促进摄取试验化合物。

其他类型的测定法可以包括显微注射试验材料至害虫的口或肠，以及使转基因植物发育，随后检验害虫以该转基因植物为食的能力。植物检验法可以涉及分离正常消费的植物部分，例如，与叶子连接的小笼，或在含有昆虫的小笼中分离完整植物。

测定害虫的其他方法是本领域已知的，并且可以例如在Robertson和Preisler编著(1992)Pesticide bioassays with arthropods，CRC，BocaRaton，FL中找到。备选地，测定法通常在期刊Arthropod ManagementTests和Journal of Economic Entomology中描述或由美国昆虫学协会成员(Entomological Society of America(E SA))讨论。

实施例16.用于植物表达的基因的运载

本发明的编码区是与用于在植物中表达的适当的启动子和终止子序列相连的。此类序列在本领域内是所熟知的，并且可以包括用于在单子叶植物中表达的稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子，用于在双子叶植物中表达的拟南芥属UBQ3启动子或CaMV 35S启动子、以及nos或PinII终止子。用于生产并证实启动子-基因-终止子构建体的技术在本领域内也是熟知的。

在本发明的一个方面中，设计并产生了合成的DNA序列。这些合成的序列具有相对该亲本序列的经改变的核苷酸序列，但是这些合成的序列编码了与该亲本序列基本一致的蛋白

在本发明的另一个方面，这些合成基因的改进形式被设计为使得将得到的肽靶向一种植物细胞器，如内质网或质外体。已知导致将融合蛋白靶向植物细胞器的肽序列在本领域内是已知的。例如，来自白羽扇豆(Lupinusalbus)的酸性磷酸酶基因的N-末端区域(

ID GI：14276838，Miller et al.(2001)Plant Physiology 127：594-606)在本领域内是已知导致异源蛋白的内质网靶向作用。如果得到的融合蛋白在C-末端还包含一个内质网保留序列，该序列包括肽N-末端-赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(即，“KDEL”基序，SEQ ID NO：11)，则该融合蛋白将被靶向内质网。如果这种融合蛋白在C-末端缺少一个靶向内质网的序列，则该蛋白将被靶向内质网，但最终将被隔离在质外体中。

因此，这个基因编码了一种融合蛋白，该融合蛋白包含了来自白羽扇豆的酸性磷酸酶基因的N-末端31个氨基酸(

ID GI：14276838，Miller et al，2001，同上文)，它们融合到本发明的氨基酸序列的N-末端上，以及C-末端上的KDEL序列上。因此，预测得到的蛋白一旦表达于植物细胞时就被靶向该植物的内质网。

将以上说明的植物表达盒与辅助经转化的细胞和组织的选择的一种合适的植物选择标记物相组合，并且将其连接到植物转化载体中。这些可以包括来自土壤杆菌介导的转化的二元载体、或用于气溶胶或生物射弹转化的简单的质粒载体。

实施例17.使用在本文中说明的杀虫蛋白基因的玉米细胞的转化

最好在授粉后8至12天收集玉米穗。将胚与穗进行分离，并且那些大小为0.8-1.5mm的胚是优选用于转化的。将这些胚以盾片侧向上的方式接种在合适的孵育培养基上，如DN62A5S培养基(3.98g/L N6盐；1mL/L(的1000x母液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/L L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(的1mg/mL母液)2，4-D)。然而，培养基和盐类(而不是DN62A5S)是适当的并且在本领域内是已知的。将这些胚在黑暗中在25℃下孵育过夜。然而，本质上不需要将这些胚孵育过夜。

将所得到的外植体转移至网眼方阵(30-40个/平板)，转移至渗透培养基上并保持大约30-45分钟，随后转移至一个聚束平板(beaming plate)上(见，例如，PCT公开号WO/0138514和美国专利号5,240,842)。

在植物细胞中将被设计为本发明基因的DNA构建体加速进入植物组织中，这是使用一种气溶胶束加速器、使用基本上如PCT公开号WO/0138514中所说明的条件进行的。在聚束之后，将胚在渗透培养基上孵育大约30分钟，并且将其置于孵育培养基上在25℃下在黑暗中过夜。为了避免不适当地破坏经聚束的外植体，它们在转移至恢复培养基之前被孵育至少24小时。然后，将胚在25℃下在黑暗中扩散到恢复培养基上，持续大约5天，随后转移至一种选择培养基中。将外植体在选择培养基中孵育达到8周，这取决于所利用的特定选择的性质和特征。在选择期之后，将得到的愈伤组织转移至胚成熟培养基中，直至观察到成熟的体细胞胚的形成。然后，将得到的成熟的体细胞胚置于低光照下，并且通过本领域已知的方法引发该再生过程。允许这些得到的芽在生根培养基上生根，并且将得到的植物转移至育苗盆(nursery pot)中并繁殖成转基因植物。

材料

DN62A5S培养基

用1N KOH/1N KCl将该溶液的pH调整至pH 5.8，加入高达3g/L的浓度的Gelrite(Sigma)，并将该培养基高压灭菌。在冷却至50℃之后，加入2ml/L的5mg/ml硝酸银母液(Phytotechnology Labs)。

实施例18.通过土壤杆菌-介导的转化在植物细胞中转化本发明的基因

穗最好在授粉之后8至12天进行收集。将胚与穗进行分离，并且那些大小为0.8-1.5mm的胚是优选用于转化的。将胚以盾片侧向上的方式置于适当的孵育培养基中，并且在25℃下在黑暗中孵育过夜。然而，本质上不需要将这些胚孵育过夜。将这些胚与一种土壤杆菌属菌株进行接触，该菌株包含了这些适当的载体用于Ti质粒介导的转化，持续大约5-10分钟，并接着将其平板接种在共培养基上大约3天(25℃下、在黑暗中)。在共培养之后，将外植体转移到恢复期培养基中，持续大约5天(25℃下、在黑暗中)。将外植体在选择培养基中孵育达到8周，这取决于所利用的特定选择的性质和特征。在选择期之后，将得到的愈伤组织转移至胚成熟培养基中，直至观察到成熟的体细胞胚的形成。然后，将得到的成熟的体细胞胚置于低光照下，并且如本领域内所已知来引发再生过程。

在本说明书中提到的所有出版物和专利申请对于本发明所涉及的领域的普通技术人员的技术水平而言是指示性的。所有出版物和专利申请是通过引用并入本文的，其程度就像每个单独出版物或专利申请被专门地和单独地表明通过引用并入本文一样。

尽管本发明在上文中出于理解清楚的目的、通过展示和实例已经相当详细地描述了本发明，应当明显的是可以在所附的权利要求的范围内实行某些改变和修改。

Claims (36)

1.包含编码变体Cry3氨基酸序列的核苷酸序列的重组核酸分子，其中所述的变体包含与表16中所列氨基酸替换相对应的一个或多个氨基酸替换，并且其中所述的变体具有杀虫活性。

2.权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述变体的杀虫活性相对于SEQ ID NO：2的杀虫活性得到改善。

3.权利要求1或2所述的重组核酸分子，其中所述的杀虫活性是针对鞘翅目害虫。

4.权利要求1-3任一项所述的重组核酸分子，其中所述的杀虫活性是针对根虫害虫。

5.权利要求1-4任一项所述的重组核酸分子，其中所述的根虫是西方玉米根虫或南方玉米根虫。

6.权利要求1-5任一项所述的重组核酸分子，其中所述的核苷酸序列是已经设计用于在植物中表达的合成序列。

7.权利要求1-6任一项所述的重组核酸分子，其中所述的核苷酸序列与能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中表达的启动子有效连接。

8.载体，其包含权利要求1-7任一项的核酸分子。

9.权利要求8所述的载体，其还包含编码异源多肽的核酸分子。

10.宿主细胞，其包含权利要求8或9的载体。

11.权利要求10所述的宿主细胞，其是细菌宿主细胞。

12.权利要求10所述的宿主细胞，其是植物宿主细胞。

13.转基因植物，其包含权利要求12的宿主细胞。

14.权利要求13所述的转基因植物，其中所述的植物选自由玉米、高粱、小麦、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜组成的组。

15.种子，其包含权利要求1-7任一项的核酸分子。

16.包含变体Cry3氨基酸序列的重组多肽，其中所述的变体包含与表16中所列氨基酸替换相对应的一个或多个氨基酸替换，并且其中所述的变体具有杀虫活性。

17.权利要求16所述的重组多肽，其中所述变体的杀虫活性相对于SEQ ID NO：2的杀虫活性得到改善。

18.权利要求16或17所述的重组多肽，其中所述的杀虫活性是针对鞘翅目害虫。

19.权利要求18所述的重组多肽，其中所述的杀虫活性是针对根虫害虫。

20.权利要求19所述的重组多肽，其中所述的根虫是西方玉米根虫或南方玉米根虫。

21.权利要求16-20任一项所述的多肽，其还包含异源氨基酸序列。

22.组合物，其包含权利要求16的多肽。

23.权利要求22所述的组合物，其中所述的组合物选自由散剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂和溶液剂组成的组。

24.权利要求22或23所述的组合物，其中所述的组合物通过干燥、冻干、匀浆、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩苏云金芽孢杆菌细胞的培养物制备。

25.权利要求22-24任一项所述的组合物，其包含以重量计约1％至约99％的所述多肽。

26.用于控制鞘翅目害虫种群的方法，包括使所述种群接触杀虫有效量的权利要求16的多肽。

27.用于杀死鞘翅目害虫的方法，包括使所述害虫接触或对所述害虫饲喂杀虫有效量的权利要求16的多肽。

28.用于产生对鞘翅目害虫具有杀虫活性的多肽的方法，包括培养包含权利要求8的载体的宿主细胞。

29.植物，其具有稳定掺入其基因组的包含核酸分子的DNA构建体，所述核酸分子包含编码变体Cry3氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述的变体包含与表16中所列氨基酸替换相对应的一个或多个氨基酸替换，并且其中所述的变体具有杀虫活性。

30.权利要求29所述的植物，其中所述变体的杀虫活性相对于SEQ IDNO：2的杀虫活性得到改善。

31.权利要求29或30所述的植物，其中所述的杀虫活性是鞘翅目活性。

32.权利要求31所述的植物，其中所述的活性针对根虫害虫。

33.权利要求32所述的植物，其中所述的根虫是西方玉米根虫或南方玉米根虫。

34.权利要求29-33任一项所述的植物，其中所述的植物是植物细胞。

35.用于保护植物免遭害虫影响的方法，包括在植物或其细胞中表达编码变体Cry3氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述的变体包含与表16中所列氨基酸替换相对应的一个或多个氨基酸替换，并且其中所述的变体具有杀虫活性。

36.权利要求35所述的方法，其中所述变体的杀虫活性相对于SEQ IDNO：2的杀虫活性得到改善。

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