CN102369283A

CN102369283A - 靶向胸苷酸合酶的RNAi分子及其应用

Info

Publication number: CN102369283A
Application number: CN2010800155816A
Authority: CN
Inventors: 和田洋巳; 黃政龙
Original assignee: Delta Fly Pharma Inc
Current assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd; Delta Fly Pharma Inc
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2010-03-29
Publication date: 2012-03-07
Also published as: DK2415870T3; RU2011143753A; CN107090454A; TW201038278A; KR20110135980A; US20120016012A1; PL2415870T3; JPWO2010113844A1; HUE029171T2; WO2010113844A1; JP5687188B2; PT2415870T; RU2535993C2; ES2599153T3; HRP20161293T1; EP2415870A9; EP2415870A1; EP2415870B1; US8524876B2; EP2415870A4

Abstract

此发明公开了可显著加强5-FU型抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的新RNAi分子。具体公开的是：包含在SEQIDNO:2中显示的核苷酸序列的RNAi分子，以及包含该RNAi分子和5-FU型抗肿瘤剂的抗肿瘤剂。

Description

靶向胸苷酸合酶的RNAi分子及其应用

技术领域

本发明涉及靶向胸苷酸合酶的RNAi分子，包含该RNAi分子的抗肿瘤剂，包含该RNAi分子的加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂，和包含该RNAi分子和5-FU抗肿瘤剂（特别是包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物）的药物组合物。

背景技术

5-FU抗肿瘤剂，例如5-氟尿嘧啶（下文称为“5-FU”），包含替加氟和尿嘧啶的组合药物，或包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物（以1：0.4：1的摩尔比例包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物，下文称为“S-1”）通常用于治疗多种类型的癌症，包括消化系统癌症和非小细胞肺癌。已知涉及DNA合成的胸苷酸合酶（下文称为“TS”）是5-FU的靶分子。因此迄今为止许多临床试验已报导了TS表达水平和对5-FU抗肿瘤剂的敏感性之间的相关性。特别地，5-FU抗肿瘤剂对展示相对低的TS表达水平的癌症患者的作用显著，尽管许多展示相对高的TS表达水平的癌症患者对5-FU抗肿瘤剂具有抗性(Patrick G. Johnston 等人, Cancer Res., 1995; 55: 1407-12; Kun-Huei Yeh 等人, Cancer, 1998; 82: 1626-31)。因此，期待开发新的加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的癌症治疗技术用于展示相对高的TS表达水平和对5-FU抗肿瘤剂具有抗性的癌症患者。

也有报导TS表达可被RNA干扰（下文称为“RNAi”）的使用所抑制，RNAi已被开发为抑制给定基因的表达的工具（日本专利公开(Kokai) No. 2005-253342 A）。因此，已经尝试了通过RNAi抑制TS表达加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用，尽管加强抗肿瘤作用的效果还不令人满意(Kadota 等人, the 67th Annual Meeting of the Japanese Cancer Association, 2008, p. 235, P-4274)。

发明概述

本发明要达到的目的

本发明旨在提供可显著加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的新RNAi分子。

达到目的的手段

在上述情况下，本发明人进行了有关可显著加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的新RNAi分子的研究。结果，他们发现了可以特别显著的水平抑制TS表达的新RNAi分子。本发明人也确认了这样的RNAi分子可显著抑制TS表达和因此施加抗肿瘤作用并加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用（特别是包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物）。这导致了本发明的实现。

具体地，本发明如下描述。

[1]能够通过RNAi作用抑制胸苷酸合酶表达的RNAi分子，其包含由与反义链杂交的由SEQ ID NO: 1, 3或5所代表的核苷酸序列组成的有义链构成的双链RNA结构域，所述反义链在严格杂交条件下与所述有义链杂交。

[2]根据[1]的RNAi分子，其包含任意以下有义链和反义链组合：

由SEQ ID NO: 1所代表的核苷酸序列组成的有义链和由SEQ ID NO: 2所代表的核苷酸序列组成的反义链；

由SEQ ID NO: 3所代表的核苷酸序列组成的有义链和由SEQ ID NO: 4所代表的核苷酸序列组成的反义链；或

由SEQ ID NO: 5所代表的核苷酸序列组成的有义链和由SEQ ID NO: 6所代表的核苷酸序列组成的反义链。

[3]根据[1]或[2]的RNAi分子，其中所述有义链通过接头区与反义链连接。

[4]根据[3]的RNAi分子，其由SEQ ID NO: 8所代表的核苷酸序列组成。

[5]包含根据[3]或[4]的RNAi分子的模板DNA并表达RNAi分子的载体。

[6]包含根据[1]至[4]中任一项的RNAi分子和/或根据[5]的载体的抗肿瘤剂。

[7]用于治疗和/或预防癌症的药物组合物，其包含与5-FU抗肿瘤剂组合的根据[1]至[4]中任一项的RNAi分子和/或根据[5]的载体。

[8]根据[7]的药物组合物，其中5-FU抗肿瘤剂是包含替加氟的组合药物。

[9]根据[8]的药物组合物，其中5-FU抗肿瘤剂是包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物。

[10]根据[9]的药物组合物，其以1：0.4：1的摩尔比例包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾。

[11]根据[7]至[10]中任一项的药物组合物，其中根据[1]至[4]中任一项的RNAi分子和/或根据[5]的载体和5-FU抗肿瘤剂各个是单活性成分制品。

[12]根据[7]至[10]中任一项的药物组合物，其中根据[1]至[4]中任一项的RNAi分子和/或根据[5]的载体和5-FU抗肿瘤剂是试剂盒制剂的形式。

[13]加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂，其包含根据[1]至[4]中任一项的RNAi分子和/或根据[5]的载体。

[14]根据[13]的加强抗肿瘤作用的试剂，其中5-FU抗肿瘤剂是包含替加氟的组合药物。

[15]根据[14]的加强抗肿瘤作用的试剂，其中5-FU抗肿瘤剂是包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物。

本说明书包括如日本专利申请号2009-086463的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，其是本申请的优先权文件。

发明效果

本发明的RNAi分子能够以特别显著的水平抑制TS表达并能够抑制表达TS的肿瘤的生长。此外，本发明的RNAi分子能够以显著水平加强5-FU抗肿瘤剂（特别是包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物）的抗肿瘤作用。

附图说明

图1是特性图，其显示了靶向TS的siRNA在DLD-1/5FU人结肠直肠癌细胞系中抑制TS表达的作用。

图2是特性图，其显示了靶向TS的shRNA和/或S-1在携带DLD-1/5FU人结肠直肠癌细胞系的小鼠中的抗肿瘤作用。

具体实施方式

本发明的RNAi分子包含由与反义链杂交的由SEQ ID NO: 1, 3或5所代表的核苷酸序列组成的有义链构成的双链RNA结构域，所述反义链具有与有义链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本发明的RNAi分子靶向与有义链的核苷酸序列相同的TS的mRNA结构域（下文称为“靶mRNA结构域”）。其因此以TS特异性方式展示RNAi作用，并且其可显著抑制TS表达。

本发明的RNAi分子“靶向”靶mRNA结构域的情况在下述条件下发生，即本发明的RNAi分子的双链RNA结构域的反义链能够在严格条件下杂交靶mRNA结构域。

可依照常规技术基于核酸杂交的解链温度（Tm）确定严格条件。在可维持杂交状态的严格条件下，例如，通常在约1× SSC, 0.1% SDS中在37℃进行洗涤。在更严格的条件下，在约0.5× SSC, 0.1% SDS中在42℃进行洗涤。在更严格的条件下，在约0.1× SSC, 0.1% SDS中在65℃进行洗涤。

本发明的RNAi分子的双链RNA结构域的反义链优选地是由与靶mRNA结构域完全互补的核苷酸序列组成的RNA。只要杂交可在严格条件下进行，反义链可包含错配，包括1至3个核苷酸，优选1或2个核苷酸，和更优选1个核苷酸的缺失、取代或添加。

优选地，本发明的RNAi分子包含双链RNA结构域，所述双链RNA结构域包含如下述的与反义链杂交的有义链：

由SEQ ID NO: 3所代表的核苷酸序列组成的有义链和由SEQ ID NO: 4所代表的核苷酸序列组成的反义链；

特别优选地，本发明的RNAi分子包含由与反义链杂交的由SEQ ID NO: 1所代表的核苷酸序列组成的有义链构成的双链RNA结构域，所述反义链由SEQ ID NO: 2所代表的核苷酸序列组成。

组成本发明的RNAi分子的有义或反义链可根据需要包含在3’端的突出端。组成这样的突出端的核苷酸的类型和数目没有限制。例如，突出端序列可由1至5个，优选1至3个，和更优选1或2个核苷酸（例如，TTT，UU或TT）组成。在本发明中，“突出端”是添加至组成RNAi分子的链末端的核苷酸，所述RNAi分子在另一条链的对应位置没有可与这样的“突出端”互补结合的核苷酸。突出端可为组成DNA的核苷酸。另外，只要不影响RNAi活性，组成RNAi分子的有义或反义链根据需要可进一步包括1至3个核苷酸和更优选1或2个核苷酸的取代、添加或缺失，以使多种实验操作，例如基因测序可顺利地进行。

根据需要，有义或反义链的5’端也可被磷酸化，或可将三磷酸（ppp）结合至5’端。

本发明的RNAi分子的实例包括双链RNA分子，例如siRNA（小干扰RNA）分子和shRNA（短发夹RNA）分子，并优选siRNA和shRNA分子。

在本发明中，siRNA分子是双链RNA分子，其是由通过有义链与反义链的杂交形成的双链区而得到的。

可依照已知技术体外合成组成siRNA分子的有义链和反义链，例如化学合成或利用使用启动子和RNA聚合酶的转录系统。可选地，有义链和反义链的模板DNA可被引入适当的表达载体，然后将得到的表达载体施用至适当的宿主细胞以体内合成目的有义和反义链。可通过本领域已知的普通方法使合成的有义和反义链退火。将合成的有义和反义链分别溶解在用于双链RNA的退火缓冲液中，将其等量（相等的摩尔量）彼此混合，加热混合物直到双链分离，然后在逐渐冷却下孵育生成物。例如可通过允许混合物在90℃保持1分钟和然后在37℃保持1小时进行退火。之后，进行酚/氯仿提取和乙醇沉淀，然后可得到siRNA分子（即双链RNA分子）。

在本发明中，shRNA分子是由通过接头区与反义链连接的有义链组成的单链RNA。其由40至60个核苷酸组成，接头区通过环形成而折叠，且反义链与有义链杂交。因此形成双链区。

在shRNA中包含的接头区没有特别的限制，且其可为多核苷酸或非多核苷酸接头，只要其能够将有义链连接至反义链以形成茎-环结构。由2至22个核苷酸组成的本领域已知的多核苷酸接头是优选的。具体实例包括UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7)、UUCAAGAGA、CCACC、CUCGAG、CCACACC、UUCAAGAGA、AUG、CCC和UUCG，其中UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7)是优选的。

优选的shRNA分子是由SEQ ID NO: 8所代表的核苷酸序列组成的单链RNA。

可依照如上所述的已知技术体外或体内合成shRNA分子。当合成shRNA分子时，包含取向为相反反向的有义链和反义链的单链RNA被合成，然后将得到的单链RNA进行自身互补结合以形成双链结构。因此可得到shRNA分子。

也可使用包含编码shRNA分子的模板DNA的表达载体得到shRNA分子。

在本发明中可使用的载体实例包括质粒、病毒和非病毒载体。可使用的质粒载体的实例包括pBAsi、pSUPER和pBAsi-hU6载体。可使用的病毒载体的实例包括腺病毒（例如pAxcwit）、逆转录病毒和慢病毒载体。非病毒载体的实例是脂质体载体。

将启动子和/或另外的控制序列可操作地连接至shRNA分子的模板DNA并将生成物插入载体。表述“可操作地连接……插入”指将启动子和/或另外的控制序列连接和参入载体，以致在已引入这样的载体的细胞中在启动子和/或另外的控制序列的控制下表达shRNA分子和降解靶TS的mRNA。可参入载体的启动子和/或其他控制序列没有特别限制。可适当地选择本领域已知的启动子和/或其他控制序列，例如组成型启动子、组织特异性启动子、阶段特异性启动子、tRNA启动子、H1启动子、U6启动子、聚合酶II启动子、CMV启动子和另外的控制元件（例如包含至少4个连续的胸苷残基的终止子序列）。

这样制备的表达shRNA分子的载体能够在已引入所述载体的细胞中表达shRNA分子和特异性降解TS mRNA。

可通过任意方法施用本发明的RNAi分子，只要其能够在肿瘤中施加其作用。RNAi分子可被施用至肿瘤或血液中。当本发明的RNAi分子被施用至血液中时，可通过已知的核酸修饰技术修饰RNAi分子，以避免RNAi分子被降解。另外，可使用已知的药物递送系统（DDS），例如脂质体或聚合物微团，以使RNAi分子可容易地到达肿瘤。

本发明的shRNA分子表达载体可通过例如通过脂质（例如lipofectamine法）介导的载体介导的运输、通过化学物质（例如磷酸钙）介导的运输、显微注射、用基因枪植入或电穿孔而被引入细胞。

本发明的RNAi分子或shRNA分子表达载体的作用可通过使用与未引入（或尚未引入）这样的分子或载体的细胞、组织或个体中的水平相比，在已引入这样的分子或载体的细胞、组织或个体中降低的TS mRNA或蛋白质的表达水平作为指示来进行评估。当要测定mRNA时，可通过RNA杂交，RT-PCR，原位杂交或其他手段测定mRNA。当要测定蛋白质时，可通过蛋白质印迹，ELISA，使用已结合抗体的蛋白质芯片的蛋白质测定，或蛋白质活性测定或通过其他手段来测定蛋白质。

与对照样品相比，本发明的RNAi分子或shRNA分子表达载体能够在已引入这样的分子或载体的细胞、组织或个体中降低50%或更高，60%或更高，70%或更高，优选80%或更高，和更优选90%或更到的TS mRNA或蛋白质的表达水平。

本发明的RNAi分子或shRNA分子表达载体能够以本领域已知的靶向TS mRNA的RNAi分子或shRNA分子表达载体的效力的2、3、4、5、10、20、30、40、50、100或更高倍施加抑制TS表达的作用。

已知多种技术可用作在靶mRNA结构域中选择核苷酸序列用于设计RNAi分子的方法。例如，可使用siRNA设计支持系统(Takara Bio, Inc.)。然而，应当注意不是所有具有通过这样的技术选择的核苷酸序列的RNAi分子具有RNAi作用。因此，从具有通过上述技术选择的核苷酸序列的RNAi候选分子中选择具有显著抑制TS表达作用的目的RNA分子非常困难。

上述RNAi分子或shRNA分子表达载体可用作以下物质的活性成分：（a）抗肿瘤剂，（b）加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂，和（c）用于治疗和/或预防癌症的药物组合物。

（a）抗肿瘤剂

如在以下实施例中详细描述的，本发明的RNAi分子或shRNA分子表达载体能够抑制肿瘤细胞生长。因此，本发明的RNAi分子或shRNA分子表达载体可用作抗肿瘤剂用于治疗和/或预防癌症。

可使用本发明的抗肿瘤剂治疗展示高TS表达水平的癌症。这样的癌症的实例包括但不具体限于：结肠直肠癌、肝癌、肾癌、头颈部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆囊癌和胆管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫体癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、成骨与软组织肉瘤、白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌和脑肿瘤。优选的实例是结肠直肠癌、胃癌、头颈部癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胆道癌和肝癌，其中结肠直肠癌是特别优选的。

本发明的抗肿瘤剂可单独包含本发明的RNAi分子或shRNA分子表达载体或2种或更多种的组合。使用shRNA分子表达载体作为本发明的抗肿瘤剂的活性成分是优选的，原因如下。即，使用这样的载体比合成RNAi分子成本效益更高，这样的载体在引入细胞后被扩增，并且shRNA分子可被稳定的大量产生。因此，使用这样的载体比引入RNAi分子在数量上更有效。shRNA表达载体优选地表达SEQ ID NO: 8所代表的shRNA分子。

除了本发明的RNAi分子或shRNA分子表达载体以外，本发明的抗肿瘤剂可包含通常使用的适当物质，例如载体、稀释剂、乳化剂、赋形剂、填料、粘结剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂、增溶剂、抗菌剂、色素、增味剂或稳定剂。

本发明的抗肿瘤剂可通过注射直接施用于癌症。其也可通过口服或胃肠外途径施用（例如静脉内施用、动脉内施用、通过注射局部施用、腹膜内或胸廓内施用、皮下施用、肌肉内施用、舌下施用、经皮吸收或直肠内施用）。

本发明的抗肿瘤剂可依照施用途径被制备为适当的剂型。具体地，抗肿瘤剂可被制备为多种剂型，例如注射制品、悬浮剂、乳化剂、软膏剂、乳膏剂、片剂、胶囊、颗粒制品、粉末制品、药丸、微粒、锭剂、用于直肠内施用的药物制品、油质栓剂或水溶性栓剂。

参入本发明的抗肿瘤剂的本发明的RNAi分子或shRNA分子表达载体的量可根据例如年龄、体重或患者疾病的严重度等因素而变化。可在每kg体重0.0001 mg 至100 mg的范围内适当地确定剂量。

在本发明的抗肿瘤剂中包含的RNAi分子或shRNA分子表达载体可通过在基因治疗领域中通常使用的多种技术被递送至靶组织或细胞。例如，可使用已知的DDS技术例如使用脂质体或聚合物微团的技术，通过脂质（例如lipofectamine法）介导的载体介导的运输，通过化学物质（例如磷酸钙）介导的运输，显微注射，用基因枪植入或电穿孔，如上所述。

可通过下述方法评估本发明的抗肿瘤剂的效果：对来源于癌症的细胞或组织或对患有癌症的个体施用抗肿瘤剂，将其肿瘤大小与未施用（或尚未施用）抗肿瘤剂的细胞、组织或个体比较，并使用比较的结果（即肿瘤的缩小或消除）作为指示。可用于评估本发明的抗肿瘤剂的效果的癌细胞没有特别限制，只要其表达TS。其实例包括DLD-1/5FU、KM12C/5FU和HT29/5FU人结肠直肠癌细胞系和NUGC-3/5FU人胃癌细胞系。

本发明的抗肿瘤剂能够施加这样的抗肿瘤作用，其是包含本领域已知的靶向TS mRNA的RNAi分子或shRNA分子表达载体作为活性成分的抗肿瘤剂的作用的2、3、4、5、10、20、30、40、50、100或更多倍。

（b）加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂

在本领域中众所周知的是展示高TS表达水平的肿瘤可对5-FU抗肿瘤剂具有抗性(Johnston P. G. 等人, Cancer Res., 1995; 55: 1407-12; Yeh K. H. 等人, Cancer, 1998; 82: 1626-31)。如在以下实施例中具体描述地，根据本发明的加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂能够在这样的肿瘤中抑制TS表达并加强施用的5-FU抗肿瘤剂的作用。

在本发明中，5-FU抗肿瘤剂的实例包括5-FU和包含5-FU作为活性代谢物的5-FU衍生物。5-FU衍生物的实例是包含替加氟的试剂。5-FU衍生物优选地是包含替加氟的组合药物。具体实例包括包含替加氟和尿嘧啶的组合药物，包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物，去氧氟尿苷，卡培他滨（capecitabine）和卡莫氟（carmofur）。下述的包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物（例如TS-1（注册商标），Taiho Phamaceutical Co., Ltd.）是特别优选的。

本发明的加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂可单独包含本发明的RNAi分子或shRNA分子表达载体或2种或更多的组合。所述试剂优选包含shRNA分子表达载体。shRNA表达载体优选地表达SEQ ID NO: 8所代表的shRNA分子。

本发明的加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂中包含的本发明的RNAi分子或shRNA分子表达载体的量可根据例如年龄、体重或患者疾病的严重度等因素而变化。可在每kg体重0.0001 mg 至100 mg的范围内适当地确定剂量。

根据例如使用途径或施用的靶等因素可依照已知技术适当地制备本发明的加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂，如抗肿瘤剂的情况。在所述试剂中包含的RNAi分子或shRNA分子表达载体可通过在基因治疗领域中通常使用的多种技术被递送至靶组织或细胞。

可通过下述方法评估本发明的加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂的效果：对来源于癌症的细胞或组织或对患有癌症的个体施用5-FU抗肿瘤剂和本发明的加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂，将其肿瘤大小与单独施用5-FU抗肿瘤剂的细胞、组织或个体比较，并使用比较的结果（即肿瘤的缩小或消除）作为指示。可用于评估本发明的加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂的效果的癌细胞没有特别限制，只要其表达TS。其实例包括DLD-1/5FU、KM12C/5FU和HT29/5FU人结肠直肠癌细胞系和NUGC-3/5FU人胃癌细胞系。可同时或分别施用5-FU抗肿瘤剂和本发明的加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂。

通过与5-FU抗肿瘤剂组合使用本发明的加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂，5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用可被提高为2、3、4、5、10、20、30、40、50或更多倍。

本发明的加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂能够加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用。因此，可降低治疗患有上述癌症的患者所需要的5-FU抗肿瘤剂的剂量。这可抑制或延迟施用5-FU抗肿瘤剂所导致的副作用的发展。副作用的实例包括但不限于：骨髓抑制、溶血性贫血、弥漫性血管内凝血综合征、暴发性肝功能衰竭、脱水、肠炎、间质性肺炎、口腔炎、胃肠道溃疡、胃肠道出血、消化道穿孔、急性肾衰竭、粘膜-皮肤-眼综合症、中毒性表皮坏死松解症、精神性神经病、急性胰腺炎、横纹肌溶解症和嗅觉缺失症。

（c）用于治疗和/或预防癌症的药物组合物

本发明的用于治疗和/或预防癌症的药物组合物包含本发明的RNAi分子或shRNA分子表达载体和5-FU抗肿瘤剂作为活性成分。本发明的药物组合物展示高TS表达水平并因此可用于治疗和/或预防展示对5-FU抗肿瘤剂具有抗性的癌症。

可使用本发明的药物组合物治疗展示高TS表达水平的癌症。这样的癌症的实例包括但不特别限于：结肠直肠癌、肝癌、肾癌、头颈部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆囊癌和胆管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫体癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、成骨与软组织肉瘤、白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌和脑肿瘤。优选的实例是结肠直肠癌、胃癌、头颈部癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胆道癌和肝癌，其中结肠直肠癌是特别优选的。

本发明的药物组合物中包含的5-FU抗肿瘤剂不限于5-FU，并且包含5-FU作为活性代谢物的5-FU衍生物属于5-FU抗肿瘤剂的范围内。5-FU衍生物的实例是包含替加氟的试剂。包含替加氟的组合药物是优选的，且具体实例包括包含替加氟和尿嘧啶的组合药物，包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物，去氧氟尿苷，卡培他滨（capecitabine）和卡莫氟（carmofur）。包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物是特别优选的。

替加氟是已知的化合物，其名称为5-氟-1-(2-四氢呋喃)-2,4-(1H,3H)-嘧啶二酮，其在体内被活化并释放5-FU，5-FU是抗肿瘤活性物质。替加氟可依照已知技术制备，例如日本专利申请(Kokoku) No. S49-10510 B(1974)公开的方法。

吉美嘧啶是已知的化合物，其名称为2,4-二羟基-5-氯吡啶，且其不具有任何抗肿瘤活性。吉美嘧啶在体内代谢中抑制5-FU的失活，然后其可加强抗肿瘤作用。

氧嗪酸钾是已知的化合物，其名称为1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代-1,3,5-三嗪-6-羧酸一钾，且其不具有任何抗肿瘤活性。氧嗪酸钾主要分布在胃肠道，且其在那里抑制5-FU活化以抑制胃肠道疾病。

替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾参入包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物的优选量没有特别限制，只要每种化合物能够施加目的作用。这样的量可与日本专利号2,614,164中公开的已知组合药物的量相同。例如，对于每摩尔替加氟，可参入约0.1至5摩尔和优选约0.2至1.5摩尔的吉美嘧啶，以及约0.1至5摩尔和优选约0.2至2摩尔的氧嗪酸钾作为每日量。特别优选地，参入的活性成分（即替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾）的量为以摩尔计1：0.4：1。在本文中有时将以1：0.4：1的摩尔比例包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物称为“S-1”。

本发明的药物组合物可单独包含本发明的RNAi分子或shRNA分子表达载体或2种或更多种的组合。药物组合物优选包含shRNA分子表达载体。更优选地，shRNA分子表达载体表达SEQ ID NO: 8所代表的shRNA分子。

本发明的药物组合物可为以适当混合比例包含RNAi分子或shRNA分子表达载体和替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物（即包含多种活性成分的药物；单活性成分制品）。可选地，药物组合物可为包含任意上述活性成分作为单活性成分（即包含单活性成分的药物）的多成分药物或组合药物（即多成分剂型）的形式，从而这些活性成分可同时或单独使用。替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾优选地被制备为单剂型的组合药物，且RNAi分子或shRNA分子表达载体优选地被制备为单活性成分制品形式。

这些药物制品的剂型没有特别限制且可依照治疗目的适当地选择。具体实例包括口服制品（例如片剂、包衣片剂、粉末、颗粒、胶囊和液体制品），注射制品，栓剂，粘着的皮肤贴剂和软膏剂。当本发明的药物组合物在多成分药物制品中存在时，这样的药物制品可具有相同或不同的剂型。例如，优选包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物为口服制品的形式和RNAi分子或shRNA分子表达载体为注射制品的形式。

本发明的药物组合物可以对于每种药物制品单独制备、包装和分配，只要包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物与RNAi分子或shRNA分子表达载体组合施用。可选地，药物制品的全部或部分可被制备、包装和分配为单个包装形式用于组合施用这些药物（即，试剂盒制剂）。

可依照已知技术通过使用药学上可接受的载体制备包含本发明的药物组合物的活性成分的药物制品。这样的载体的实例包括通常用于药物制品的多种物质，例如赋形剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、稀释剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、色素、增味剂和矫味剂。

赋形剂的实例包括乳糖、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、肌醇、葡聚糖、山梨醇、白蛋白、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅土、甲基纤维素、甘油、海藻酸钠、阿拉伯树胶和其任意的混合物。润滑剂的实例包括提纯的滑石粉、硬脂酸、四硼酸钠、聚乙二醇和其任意的混合物。粘合剂的实例包括单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、虫胶、甲基纤维素、乙基纤维素、水、乙醇、磷酸钾和其任意的混合物。崩解剂的实例包括干淀粉、海藻酸钠、琼脂粉末、昆布糖粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、淀粉、乳糖和其任意的混合物。稀释剂的实例包括水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、乙氧基化的异十八醇、聚氧基化的异十八醇、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯和其任意的混合物。稳定剂的实例包括焦亚硫酸钠、乙二胺四乙酸、巯基乙酸、硫代乳酸和其任意的混合物。等渗剂的实例包括氯化钠、硼酸、葡萄糖、甘油和其任意的混合物。 pH调节剂和缓冲剂的实例包括柠檬酸钠、柠檬酸、醋酸钠、磷酸钠和其任意的混合物。安抚剂的实例包括盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因和其任意的混合物。

在将要施用的本发明的药物组合物中的活性成分的量没有特别限制，只要这样的活性成分能够发挥目的作用。依照年龄、癌症种类、阶段、转移的发生、治疗史、其他抗肿瘤剂的使用和患者的其他情况，适当地确定这些量。例如，替加氟的量是0.2至40 mg/kg/天并优选0.5至20 mg/kg/天，吉美嘧啶的量是0.05至12 mg/kg/天并优选0.1至6 mg/kg/天，氧嗪酸钾的量是0.2至40 mg/kg/天并优选0.5至20 mg/kg/天，和RNAi分子或shRNA分子表达载体的量是0.0001至100 mg/kg/天。

施用本发明的药物组合物中的活性成分的顺序和间隔没有特别限制，只要可获得组合使用这些活性成分所得到的协同作用。当以试剂盒的形式制备本发明的药物组合物时，可同时或单独施用药物。

可通过下述方法评估本发明的药物组合物的效果：对来源于上述癌症的细胞或组织或患有这些癌症的个体施用药物组合物，将其肿瘤大小和未施用（或尚未施用）药物组合物的细胞或组织或个体相比较，并使用比较结果（即肿瘤的缩小或消除）作为指示。可用于评估本发明的药物组合物的效果的癌细胞没有特别限制，只要其表达TS。其实例包括DLD-1/5FU、KM12C/5FU和HT29/5FU人结肠直肠癌细胞系和NUGC-3/5FU人胃癌细胞系。

本发明的药物组合物的抗肿瘤作用不是由每个活性成分的抗肿瘤作用得到的累加作用。本发明的药物组合物的抗肿瘤作用可以是协同作用，其通过RNAi分子或shRNA分子表达载体所发挥的对5-FU抗肿瘤剂作用的加强活性而得到。“累加作用”构成每个活性成分施加的抗肿瘤作用之和，且累加作用可表示为由活性成分施加的肿瘤生长抑制率的乘积所确定的值，如在以下实施例中详细描述的。术语“协同作用”指在统计学上显著高于活性成分发挥的累加抗肿瘤作用的抗肿瘤作用。这样的肿瘤生长抑制率在统计上显著高于活性成分带来的累加作用所得到的肿瘤生长抑制率，如在以下实施例中详细描述的。

本发明也涉及癌症治疗的方法，其涉及抗肿瘤剂，加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂和/或本发明的药物组合物的使用。通过这些方法可治疗的癌症实例包括上述癌症。

实施例

在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，应当注意本发明不受限于这些实施例。

（实施例1）

鉴定靶向TS的siRNA分子

在6厘米培养皿中培养DLD-1/5FU人结肠直肠癌细胞系(Int. J. Oncol., 2000; 17: 277-83)24小时直到细胞达到50%至60%汇合，据报导所述细胞系对5-FU有抗性。

之后，化学合成siRNA分子（即，TS-siRNA1分子(有义链: SEQ ID NO: 1; 反义链: SEQ ID NO: 2)、TS-siRNA2分子(有义链: SEQ ID NO: 3; 反义链: SEQ ID NO: 4)和TS-siRNA3分子(有义链: SEQ ID NO: 5; 反义链: SEQ ID NO: 6)），依照常规技术将2.5ml分别包含上述siRNA分子的溶液（终浓度：25 nM）和25 μl TransIT-TKO转染试剂(Mirus)转染至上述细胞。使用杂乱的（scrambled）siRNA(TS-Scra1)作为阴性对照。

通过Taqman实时PCR(ABI PRISM 7700序列检测系统; Applied Biosystems)在转染后72小时检查siRNA分子对TS表达的抑制作用。对TS引物和探针使用Assays-on-Demand基因表达测定混合物(测定ID Hs00426591_m1; PCR产物大小: 87 bp; Applied Biosystems)。使用GAPDH作为内标(Assays-on-Demand基因表达系统; 测定ID: Hs99999905_m1; PCR产物大小: 122 bp; Applied Biosystems)。

结果在图1中显示。TS-siRNA1至TS-siRNA3展示了抑制TS表达的作用，TS-siRNA1对TS表达的抑制作用比TS-siRNA2和TS-siRNA3的作用强(83.5 ± 1.3%)。

（实施例2）

构建表达靶向TS的shRNA分子的腺病毒载体

基于TS-siRNA1 (TS-siRNA1有义链(GTAACACCATCGATCATGA, SEQ ID NO: 9),接头区(TAGTGCTCCTGGTTG, SEQ ID NO: 10), TS-siRNA1反义链(TCATGATCGATGGTGTTAC, SEQ ID NO: 11)和聚合酶III终止子(TTTTTT))合成靶向TS的shRNA分子的模板DNA。为了制备表达靶向TS的shRNA分子的质粒载体，将得到的模板插入含有人U6启动子的pBAsi-hU6质粒载体(Takara Bio Inc.)。

之后，使用腺病毒表达载体试剂盒(Takara Bio Inc.)，将从质粒载体上用EcoRV切割出的人U6启动子和模板插入pAxcwit粘粒载体，。通过COS-TPC方法(Jpn. J. Med. Sci. Biol., 1994; 47: 157-66)构建表达靶向TS的shRNA分子的E1-缺陷腺病毒载体（下文称为“Ad-shTS”）。使用含有细菌LacZ基因的腺病毒载体（下文称为“Ad-LacZ”）作为对照(Oncogene, 2004, 23: 7475-83)。

（实施例3）

靶向TS的shRNA分子对TS-1的加强抗肿瘤效果的作用

将各个具有约8 mm³体积的皮下继代培养的DLD-1/5FU人结肠直肠癌细胞系碎片移植至6周龄雄性裸小鼠的背部，当肿瘤体积变为约200 mm³时将小鼠分为各由6只个体组成的组。在已施用Ad-shTS的组（下文称为“Ad-shTS组”）和已施用Ad-shTS和S-1的组（下文称为“Ad-shTS+S-1组”）中，在16天期间每4天注射1次Ad-shTS (2 × 10⁹pfu)至肿瘤。对Ad-shTS+S-1组和已施用S-1的组（下文称为“S-1组”），连续14天每天口服施用1次10 mg/kg S-1 (Taiho Phamaceutical Co., Ltd.)。首次Ad-shTS施用在开始S-1施用2天前进行。对于对照组，在16天期间每4天注射1次PBS至肿瘤。

之后，在30天期间每3天测量1次肿瘤大小，并检测每只小鼠中的肿瘤生长。使用以下等式确定肿瘤体积和肿瘤生长率：

肿瘤体积(mm³) = (肿瘤的长直径) × (肿瘤的短直径)² × 0.5

肿瘤生长率=（测量日的肿瘤体积）/（开始施用时的肿瘤体积）。

结果在图2中显示。对照组的肿瘤生长率在第30天为44.5 ± 18.0，而Ad-shTS组的为22.3 ± 8.2，S-1组的为17.4 ± 11.5，和Ad-shTS+S-1组的为4.7 ± 0.9。因此，发现Ad-shTS+S-1组的抗肿瘤作用在统计学上显著高于对照组、Ad-shTS组和S-1组的抗肿瘤作用。

相对于对照组，Ad-shTS组的肿瘤生长抑制率（%）是50%和S-1组的为39%（即，已施用每种试剂的组在第30天的肿瘤生长率/对照组在第30天的肿瘤生长率×100）。当通过使用Ad-shTS组合S-1得到的加强抗肿瘤作用的功能导致累加作用时，Ad-shTS+S-1组相对于对照组的肿瘤生长抑制率应当为20%，这是通过将Ad-shTS组的肿瘤生长抑制率乘以S-1组的肿瘤生长抑制率（即50% × 39% = 20%）测定的。然而，实际测量值为11%。这表明通过使用Ad-shTS组合S-1得到的加强抗肿瘤作用的功能是协同作用。

工业适用性

根据本发明的靶向TS mRNA的RNAi分子能够抑制肿瘤细胞中的TS表达水平并且也能够抑制肿瘤细胞生长。通过使用本发明的RNAi分子抑制TS表达水平，5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用可被加强且可有效治疗和/或预防癌症。

本文引用的所有出版物，专利和专利申请以其整体引入本文作为参考。

序列表

<110> TAIHO PHARMACEUTICAL CO., LTD.

<120> 靶向胸苷酸合酶的RNAi分子及其应用

<130> PH-4265-PCT

<150> JP 2009-086463

<151> 2009-03-31

<160> 11

<170> PatentIn 版本3.4

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 1

guaacaccau cgaucauga 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 2

ucaugaucga ugguguuac 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 3

gaauacagag auauggaau 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 4

auuccauauc ucuguauuc 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 5

cgaucaugau guagagugu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 6

acacucuaca ucaugaucg 19

<210> 7

<211> 15

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 7

uagugcuccu gguug 15

<210> 8

<211> 53

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 8

guaacaccau cgaucaugau agugcuccug guugucauga ucgauggugu uac 53

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 9

gtaacaccat cgatcatga 19

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 10

tagtgctcct ggttg 15

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 11

tcatgatcga tggtgttac 19

Claims

1. 一种能够通过RNAi作用抑制胸苷酸合酶表达的RNAi分子，其包含由与反义链杂交的由SEQ ID NO: 1, 3或5所代表的核苷酸序列组成的有义链构成的双链RNA结构域，所述反义链在严格杂交条件下与所述有义链杂交。

2. 根据权利要求1的RNAi分子，其包含任意以下有义链和反义链的组合：

3. 根据权利要求1或2的RNAi分子，其中所述有义链通过接头区与所述反义链连接。

4. 根据权利要求3的RNAi分子，其由SEQ ID NO: 8所代表的核苷酸序列组成。

5. 一种包含根据权利要求3或4的RNAi分子的模板DNA并表达所述RNAi分子的载体。

6. 一种包含根据权利要求1至4中任一项的RNAi分子和/或根据权利要求5的载体的抗肿瘤剂。

7. 一种用于治疗和/或预防癌症的药物组合物，其包含与5-FU抗肿瘤剂组合的根据权利要求1至4中任一项的RNAi分子和/或根据权利要求5的载体。

8. 根据权利要求7的药物组合物，其中所述5-FU抗肿瘤剂是包含替加氟的组合药物。

9. 根据权利要求8的药物组合物，其中所述5-FU抗肿瘤剂是包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物。

10. 根据权利要求9的药物组合物，其以1：0.4：1的摩尔比例包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾。

11. 根据权利要求7至10中任一项的药物组合物，其中根据权利要求1至4中任一项的RNAi分子和/或根据权利要求5的载体和所述5-FU抗肿瘤剂各个是单活性成分制品。

12. 根据权利要求7至10中任一项的药物组合物，其中根据权利要求1至4中任一项的RNAi分子和/或根据权利要求5的载体和所述5-FU抗肿瘤剂是试剂盒制剂的形式。

13. 一种加强5-FU抗肿瘤剂的抗肿瘤作用的试剂，其包含根据权利要求1至4中任一项的RNAi分子和/或根据权利要求5的载体。

14. 根据权利要求13的加强抗肿瘤作用的试剂，其中所述5-FU抗肿瘤剂是包含替加氟的组合药物。

15. 根据权利要求14的加强抗肿瘤作用的试剂，其中所述5-FU抗肿瘤剂是包含替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸钾的组合药物。