TWI526211B - RNAi molecules for thymidine nucleotide synthesis enzymes and their use - Google Patents
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Description
本發明係關於一種針對胸腺核苷酸合成酵素之RNAi(Ribonucleic Acid interference,干擾性核糖核酸)分子、含有該RNAi分子之抗腫瘤劑、含有該RNAi分子之5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑、以及含有該RNAi分子及5-FU系抗腫瘤劑(特別是喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑(Tegafur,Gimeracil and Oteracil Potassium compounding agent))之醫藥組合物。
5-氟尿嘧啶(以下稱為5-FU)、喃氟啶‧尿嘧啶複合劑、喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑(以1:0.4:1之莫耳比將喃氟啶、吉莫斯特、氧酸鉀調配而成的製劑。以下稱為S-1)等5-FU系抗腫瘤劑係常規用於消化器癌或非小細胞肺癌等廣泛的癌症種類之治療中。作為5-FU之標靶分子,已知有參與DNA合成之胸腺核苷酸合成酵素(以下稱為TS)。迄今為止,由大量之臨床試驗報告了TS之表現量與5-FU系抗腫瘤劑之敏感性之關係,即,對於癌症患者中TS之表現相對較低之癌症患者而言,5-FU系抗腫瘤劑顯著地發揮效果,另一面,癌症患者中TS之表現相對較亢奮之癌症患者大多對5-FU系抗腫瘤劑具有抗藥性(非專利文獻1、2)。因此,為治療TS之表現較高、對5-FU系抗腫瘤劑具有抗藥性之癌症患者,而謀求使5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強之新的癌症治療法。
又,亦報告:使用作為抑制特定基因之表現的工具而開發出之RNA干擾(以下,RNAi),可抑制TS之表現(專利文獻1)。因此,嘗試利用RNAi抑制TS之表現,增強5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果,但其增強效果尚無法滿足要求(非專利文獻3)。
專利文獻1:日本專利特開2005-253342號公報
非專利文獻1Patrick G.Johnston et al.,Cancer Res(癌症研究) 1995;55: 1407-12。
非專利文獻2]Kun-Huei Yeh et al.,Cancer(癌症) 1998;82: 1626-31。
非專利文獻3門田等人,第67次日本癌症學會(2008);235頁,P-4274。
本發明之目的在於提供一種可使5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果顯著增強的新穎之RNAi分子。
本發明者們鑒於上述現狀而對使5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果顯著增強的新穎之RNAi分子進行了反覆研究,結果發現一種可特別顯著地抑制TS之表現的新穎之RNAi分子。又,本發明者們確認到,該RNAi分子顯著抑制TS之表現,藉此具有抗腫瘤效果,並且增強5-FU系抗腫瘤劑(特別是喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑)之抗腫瘤效果,從而完成了本發明。
即,本發明如下述。
[1] 一種RNAi分子,其係可藉由RNAi作用抑制胸腺核苷酸合成酵素之表現者,且其含有雙鏈RNA部分,該雙鏈RNA部分係包含序列編號1、3或5所示之鹼基序列之正義鏈與和該正義鏈在嚴格條件下雜交之反義鏈雜交而成。
[2] 如[1]之RNAi分子,其包含以下之正義鏈與反義鏈之組合:包含序列編號1所示之鹼基序列之正義鏈與包含序列編號2所示之鹼基序列之反義鏈;包含序列編號3所示之鹼基序列之正義鏈與包含序列編號4所示之鹼基序列之反義鏈;或包含序列編號5所示之鹼基序列之正義鏈與包含序列編號6所示之鹼基序列之反義鏈。
[3] 如[1]或[2]之RNAi分子,其中正義鏈與反義鏈係經由連接子部分而連結。
[4] 如[3]之RNAi分子,其包含序列編號8所示之鹼基序列。
[5] 一種載體,其含有如[3]或[4]之RNAi分子之模板DNA而表現該RNAi分子。
[6] 一種抗腫瘤劑,其含有如[1]至[4]中任一項之RNAi分子及/或如[5]之載體。
[7] 一種醫藥組合物,其係將如[1]至[4]中任一項之RNAi分子及/或如[5]之載體與5-FU系抗腫瘤劑組合而成,用於治療及/或預防癌症。
[8] 如[7]之醫藥組合物,其中5-FU系抗腫瘤劑為含有喃氟啶之複合劑。
[9] 如[8]之醫藥組合物,其中5-FU系抗腫瘤劑為喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑。
[10] 如[9]之醫藥組合物,其以1:0.4:1之莫耳比而含有喃氟啶、吉莫斯特、氧酸鉀。
[11] 如[7]至[10]中任一項之醫藥組合物,其中如[1]至[4]中任一項之RNAi分子及/或如[5]之載體、與5-FU系抗腫瘤劑分別為單劑。
[12] 如[7]至[10]中任一項之醫藥組合物,其中如[1]至[4]中任一項之RNAi分子及/或如[5]之載體、與5-FU系抗腫瘤劑為套裝製劑。
[13] 一種5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑,其含有如[1]至[4]中任一項之RNAi分子及/或如[5]之載體。
[14] 如[13]之抗腫瘤效果增強劑,其中5-FU系抗腫瘤劑為含有喃氟啶之複合劑。
[15] 如[14]之抗腫瘤效果增強劑,其中5-FU系抗腫瘤劑為喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑。
本說明書包含作為本申請案之優先權基礎的日本專利申請案2009-086463號之說明書及/或圖式所記載之內容。
本發明之RNAi分子可特別顯著地抑制TS之表現,從而可抑制表現TS之腫瘤之增殖。進而,藉由本發明之RNAi分子,可使5-FU系抗腫瘤劑(特別是喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑)之抗腫瘤效果顯著增強。
本發明之RNAi分子含有雙鏈RNA部分,該雙鏈RNA部分是包含序列編號1、序列編號3或序列編號5所示之鹼基序列的正義鏈與具有和該正義鏈之鹼基序列互補的鹼基序列之反義鏈雜交而成。本發明之RNAi分子將具有與該正義鏈相同之鹼基序列的TS之mRNA部分(以下稱為標靶mRNA部分)作為標靶,藉此可對TS特異性地發揮RNAi作用,顯著抑制TS之表現。
此處所謂本發明之RNAi分子將標靶mRNA部分作為「標靶」,係指本發明之RNAi分子之雙鏈RNA部分之反義鏈可與標靶mRNA部分於嚴格條件下雜交。
所謂嚴格條件下,可根據依照通常方法形成雜種之核酸之熔解溫度(Tm)而求出。例如,作為可維持雜交狀態之清洗條件,通常可列舉「1×SSC、0.1%SDS、37℃」左右之條件,更嚴格可列舉「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」左右之條件,進而嚴格可列舉「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」左右之條件。
本發明之RNAi分子之雙鏈RNA部分之反義鏈理想的是包含與標靶mRNA部分完全互補之鹼基序列的RNA,但只要可於嚴格條件下雜交,則亦可具有包括1~3個鹼基、較好的是1~2個鹼基、更好的是1個鹼基之缺失、置換、插入的錯配。
較好的是本發明之RNAi分子含有以下之正義鏈與反義鏈雜交而成之雙鏈RNA部分:包含序列編號1所示之鹼基序列之正義鏈與包含序列編號2所示之鹼基序列之反義鏈;包含序列編號3所示之鹼基序列之正義鏈與包含序列編號4所示之鹼基序列之反義鏈;或包含序列編號5所示之鹼基序列之正義鏈與包含序列編號6所示之鹼基序列之反義鏈。
特別好的是本發明之RNAi分子含有如下的雙鏈RNA部分,即,包含序列編號1所示之鹼基序列之正義鏈與包含序列編號2所示之鹼基序列之反義鏈雜交而成的雙鏈RNA部分。
構成本發明之RNAi分子之正義鏈或反義鏈視需要亦可於3'末端具有突出。該突出之鹼基之數量、數量並無限定,例如可列舉包含1~5、較好的是1~3、更好的是1或2個鹼基之序列,例如可列舉TTT、UU或TT。於本發明中,所謂突出,係指插入至RNAi分子之一條鏈之末端、且於另一條鏈之對應位置不存在可互補結合之鹼基的鹼基。突出亦可為構成DNA之鹼基。進而,對於構成RNAi分子之正義鏈或反義鏈而言,為順暢地進行基因之序列決定等各種實驗操作,於不對RNAi活性造成影響之範圍內視需要亦可進一步包含1~3個鹼基、更好的是1或2個鹼基之置換、插入、缺失。
又,正義鏈或反義鏈視需要亦可將5'末端磷酸化,亦可於5'末端結合有三磷酸(ppp)。
本發明之RNAi分子中含有siRNA(small interfering RNA,小干擾型RNA)分子、shRNA(short hairpin RNA,短髮夾型RNA)分子等雙鏈RNA分子,以siRNA分子及shRNA分子為宜。
本發明中所謂siRNA分子,係指上述正義鏈與反義鏈雜交而形成雙鏈部分之雙鏈RNA分子。
構成siRNA分子之正義鏈及反義鏈可根據公知之方法藉由化學合成、或使用啟動子及RNA聚合酶之轉錄系統in vitro(於試管內)合成。又,亦可藉由在適當之表現載體中導入該反義鏈及正義鏈之模板DNA,並將該載體投予至適當之宿主細胞內而in vivo(於活體內)合成。所合成之正義鏈與反義鏈之黏合可藉由業者公知之通常方法而進行。該黏合可藉由如下方式進行:將所合成之正義鏈及反義鏈分別溶解於雙鏈RNA用黏合緩衝液中,將等量(等莫耳數)混合,加熱至雙鏈解離之溫度為止,然後緩慢冷卻而進行培育。關於黏合條件,例如可藉由在90℃下靜置1分鐘,繼而在37℃下靜置1小時而進行黏合。其後,進行苯酚/氯仿萃取‧乙醇沈澱,藉此可獲得作為雙鏈RNA分子之siRNA分子。
本發明中所謂shRNA分子,係指經由連接子部分將上述正義鏈與反義鏈連結的包含40~60個鹼基之單鏈RNA,由於該連接子部分形成環而被摺疊,該反義鏈與該正義鏈雜交而形成雙鏈部分。
shRNA分子所含之連接子部分只要可連結正義鏈與反義鏈而形成莖環結構,則可為聚核苷酸連接子,亦可為非聚核苷酸連接子,並無特別限定,以業者公知之2~22個鹼基之聚核苷酸連接子為宜。具體可例示UAGUGCUCCUGGUUG(序列編號7)、UUCAAGAGA、CCACC、CUCGAG、CCACACC、UUCAAGAGA、AUG、CCC及UUCG,以UAGUGCUCCUGGUUG(序列編號7)為宜。
作為較好之shRNA分子,為包含序列編號8所示之鹼基序列之單鏈RNA。
shRNA分子亦可如上述般根據公知之方法in vitro或in vivo而合成。合成時,可合成含有正義鏈與反義鏈作為反向序列之1條RNA鏈,其後使該1條RNA鏈藉由自我互補結合而形成雙鏈結構,獲得shRNA分子。
又,shRNA分子亦可使用含有編碼該shRNA分子之模板DNA之表現載體而獲得。
作為本發明中可使用之載體,可使用質體載體、病毒載體、非病毒載體等。作為質體載體,可使用pBAsi載體、pSUPER載體、pBAsi-hU6等。作為病毒載體,可使用腺病毒載體(pAxcwit等)、反轉錄病毒載體、慢病毒載體等。作為非病毒載體,可使用脂質體載體等。
於載體中,以可對shRNA分子之模板DNA發揮功能之形式連結插入啟動子及/或其他控制序列。所謂「以可發揮功能之形式連結插入」,係指以於導入有該載體之細胞中,於啟動子及/或其他控制序列之控制下表現上述shRNA分子而將成為標靶之TS的mRNA分解之方式,連結啟動子及/或其他控制序列並組入至載體中。可組入至載體中之啟動子及/或其他控制序列並無特別限定,可適當選擇:構成性啟動子、組織特異性啟動子、時期特異性啟動子、tRNA啟動子、H1啟動子、U6啟動子、聚合酶II系啟動子、CMV啟動子等,其他調節因子等(例如包含至少4個以上之胸腺苷殘基連續的序列之終止子序列)該領域中公知之啟動子及/或其他控制序列。
以上述方式製作之表現上述shRNA分子之載體可於所導入之細胞內表現shRNA分子,特異性地分解TS之mRNA。
本發明之RNAi分子之投予方法只要可於腫瘤內起效則並無特別限制,RNAi分子可投予至腫瘤內或血中。於將本發明之RNAi分子投予至血中之情形時,為防止RNAi分子之分解,亦可藉由公知之核酸修飾法加以修飾。又,為使其容易到達腫瘤,亦可使用脂質體或高分子微胞等之公知之給藥系統(DDS,Drug Delivery System)技術。
又,作為將本發明之shRNA分子表現載體導入至細胞中之方法,可列舉:以脂質作為媒介之載體傳輸法(例如Lipofectamine法)、以化學物質(磷酸鈣等)作為媒介之傳輸、微注射法、利用基因槍之打入法、電穿孔法等。
關於本發明之RNAi分子或shRNA分子表現載體之效果,可依照下述標準進行評價:導入有該分子或載體之細胞或組織、及個體中的TS之mRNA或蛋白質之表現量與未導入該分子或載體之(或導入前之)細胞或組織、及個體中的TS之mRNA或蛋白質之表現量相比較,有所下降。於測定對象為mRNA時,可藉由北方雜合法、RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,反轉錄聚合酶鏈反應)、in situ hybridization(原位雜交法)等進行測定。又,於測定對象為蛋白質時,可藉由西方墨點法、ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,酶聯免疫吸附分析)、使用結合有抗體之蛋白質晶片之測定、蛋白質之活性測定等進行測定。
本發明之RNAi分子或shRNA分子表現載體可使所導入之細胞或組織、及個體中的TS之mRNA或蛋白質之表現量與對照相比較下降5成以上、6成以上、7成以上,較好的是8成以上或更好的是9成以上。
關於本發明之RNAi分子或shRNA分子表現載體之效果,與將TS之mRNA作為標靶的業者公知之RNAi分子或shRNA分子表現載體相比,可具有2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍或該程度以上之TS之表現抑制效果。
再者,於RNAi分子之設計中,作為選擇標靶mRNA部分之鹼基序列之方法,已知有各種方法,例如可使用siRNA Design Support System(Takara-Bio股份有限公司)等。然而,具有藉由該方法而選擇之鹼基序列的RNAi分子並非全部具有RNAi作用。因此,自具有藉由該方法而選擇之鹼基序列的候補RNAi分子中選擇具有所需之顯著抑制TS之表現的作用之RNAi分子具有極大的困難性。
上述RNAi分子或shRNA分子表現載體可用作(a)抗腫瘤劑、(b)5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑、及(c)用以治療及/或預防癌症之醫藥組合物之有效成分。
如下述實施例將詳述般,本發明之RNAi分子或shRNA分子表現載體可抑制腫瘤細胞之增殖,故本發明之RNAi分子或shRNA分子表現載體可用作用以治療及/或預防癌症之抗腫瘤劑。
作為可使用本發明之抗腫瘤劑治療之癌症,可列舉高表現TS之癌症,並無特別限制,例如可列舉:結腸‧直腸癌、肝癌、腎癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、膽道癌、膽囊‧膽管癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮體癌、膀胱癌、前列腺癌、睪丸腫瘤、骨‧軟組織肉瘤、白血病、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚癌、腦腫瘤等。以結腸‧直腸癌、胃癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、胰腺癌、膽道癌、肝癌為宜,特別好的是結腸‧直腸癌。
本發明之抗腫瘤劑可含有一種或者組合含有複數種的上述本發明之RNAi分子或shRNA分子表現載體。又,作為本發明之抗腫瘤劑之有效成分,較好的是使用shRNA分子表現載體。其原因在於:該載體與合成RNAi分子相比更為廉價,且可於導入至細胞內後擴增而穩定地大量生成shRNA分子,就該方面而言與導入RNAi分子相比量產效率亦更好。該shRNA表現載體以表現序列編號8所示之shRNA分子者為宜。
又,本發明之抗腫瘤劑中,亦可與本發明之RNAi分子或shRNA分子表現載體一併而含有通常使用之適當之載體、稀釋劑、乳液、賦形劑、增量劑、黏合劑、浸潤劑、崩解劑、界面活性劑、潤滑劑、分散劑、緩衝劑、保存劑、溶解助劑、防腐劑、著色料、香味劑及穩定劑等。
本發明之抗腫瘤劑可藉由注射而直接對癌症投予,又,亦可藉由口服或非口服(例如靜脈內投予、動脈內投予、利用注射之局部投予、對腹腔或胸腔之投予、皮下投予、肌肉內投予、舌下投予、經皮吸収或直腸內投予等)而投予。
又,本發明之抗腫瘤劑可根據投予途徑而製成適當之劑形。具體可製備成注射劑、懸浮劑、乳化劑、軟膏劑、霜劑、錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、丸劑、細粒劑、口含錠、直腸投予劑、油脂性栓劑、水溶性栓劑等各種製劑形態。
本發明之抗腫瘤劑中所含的本發明之RNAi分子或shRNA分子表現載體可根據患者之年齡、體重、疾病之嚴重度等要因而變化,可含有自每1次每1 kg體重0.0001 mg~100 mg之範圍中適當選擇之量。
又,本發明之抗腫瘤劑中所含有的RNAi分子或shRNA分子表現載體之朝目標組織或細胞之基因傳送可利用基因治療領域中通常使用的各種投予方法,例如可如上所述般利用脂質體或高分子微胞等之公知之DDS技術、以脂質作為媒介之載體傳輸法(例如Lipofectamine法)、以化學物質(磷酸鈣等)作為媒介之傳輸、微注射法、利用基因槍之打入法、電穿孔法等。
本發明之抗腫瘤劑之效果可依照下述標準進行評價:對來源於上述癌之細胞或組織、及罹患上述癌症之個體投予該抗腫瘤劑,腫瘤之大小與未投予該抗腫瘤劑之(或投予前之)細胞或組織、及個體的腫瘤之大小相比較,腫瘤縮小或消失。作為可用於評價本發明之抗腫瘤劑之效果的癌細胞,只要表現TS則癌症種類等並無特別限制,例如可列舉:人類結腸直腸癌細胞株DLD-1/5FU、KM12C/5FU、HT29/5FU,人類胃癌細胞株NUGC-3/5FU等。
關於本發明之抗腫瘤劑之效果,與將以TS之mRNA為標靶的業者公知之RNAi分子或shRNA分子表現載體作為有效成分的抗腫瘤劑相比較,可具有2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍或該程度以上之抗腫瘤效果。
如該領域中眾所周知般,TS之表現較高的腫瘤對5-FU系抗腫瘤劑可能具有抗藥性(Johnston P. G. et al.,Cancer Res 1995;55: 1407-12.;Yeh K. H. et al.,Cancer 1998;82: 1626-31.)。如下述實施例將詳述般,本案發明之5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑可於該腫瘤中抑制TS之表現,而提高所投予之5-FU系抗腫瘤劑之效果。
於本發明中,作為5-FU系抗腫瘤劑,可列舉5-FU及活性代謝物質為5-FU之5-FU衍生物。作為5-FU衍生物,例如可列舉含有喃氟啶者。作為5-FU衍生物,以含有喃氟啶之複合劑為宜,具體可例示喃氟啶‧尿嘧啶複合劑、喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑、去氧氟尿苷、卡培他濱(Capecitabine)、卡莫氟(carmofur)等。其中,特別好的是下文將詳述之喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑、例如TS-1(註冊商標)(大鵬藥品工業股份有限公司)。
本發明之5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑可含有一種或組合含有複數種的上述本發明之RNAi分子或shRNA分子表現載體。以含有shRNA分子表現載體為宜。較好的是該shRNA表現載體表現序列編號8所示之shRNA分子。
本發明之5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑中所含的本發明之RNAi分子或shRNA分子表現載體可根據患者的年齡、體重、疾病之嚴重度等要因而變化,可含有自每1次每1 kg體重0.0001 mg~100 mg之範圍中適當選擇的量。
本發明之5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑與上述抗腫瘤劑相同,可根據投予途徑、投予對象等要因依照公知之方法適當製備,所含有之RNAi分子或shRNA分子表現載體可利用基因治療之領域中通常使用之各種投予方法朝目標組織或細胞傳送。
本發明之5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑之效果可依照如下標準進行評價:對來源於上述癌之細胞或組織、及罹患上述癌症之個體一併投予5-FU系抗腫瘤劑與本發明之5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑,腫瘤之大小與單獨投予5-FU系抗腫瘤劑的細胞或組織、及個體之腫瘤之大小相比較,腫瘤縮小或消失。作為可用於評價本發明之5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑之效果的癌細胞,只要表現TS則癌症種類等並無特別限制,例如可列舉:人類結腸直腸癌細胞株DLD-1/5FU、KM12C/5FU、HT29/5FU,人類胃癌細胞株NUGC-3/5FU等。5-FU系抗腫瘤劑與本發明之5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑可同時或空開間隔而投予。
本發明之5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑可藉由與5-FU系抗腫瘤劑一併使用而將5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果提高至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或該程度以上。
本發明之5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑可增強5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果,故可減少對罹患上述癌症之患者進行治療所必需的5-FU系抗腫瘤劑之投予量。藉此,可抑制或延緩由於5-FU系抗腫瘤劑之投予而可能引起的副作用(例如骨髄抑制、溶血性貧血、瀰漫性血管內凝血症候群、猛爆性肝炎、脫水症狀、腸炎、間質性肺炎、口炎、消化道潰瘍、消化道出血、消化道穿孔、急性腎功能衰竭、皮膚黏膜眼症候群、中毒性表皮壞死症、精神神經障礙、急性胰臟炎、橫紋肌溶解症、嗅覺缺失等,不限定於該等)之發病。
本發明之用以治療及/或預防癌症之醫藥組合物含有上述本發明之RNAi分子或shRNA分子表現載體與5-FU系抗腫瘤劑作為有效成分。本發明之醫藥組合物可用於治療及/或預防高表現TS、且對5-FU系抗腫瘤劑表現出抗藥性之癌症。
作為可藉由本發明之醫藥組合物治療的癌症,可列舉高表現TS之癌症,並無特別限制,例如可列舉:結腸‧直腸癌、肝癌、腎癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、膽道癌、膽囊‧膽管癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮體癌、膀胱癌、前列腺癌、睪丸腫瘤、骨‧軟組織肉瘤、白血病、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚癌、腦腫瘤等。以結腸‧直腸癌、胃癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、胰腺癌、膽道癌、肝癌為宜,特別好的是結腸‧直腸癌。
於本發明之醫藥組合物中,所謂5-FU系抗腫瘤劑,不僅是指含有5-FU者,亦指含有活性代謝物質為5-FU之5-FU衍生物者,例如可為含有喃氟啶者。以含有喃氟啶之複合劑為宜,具體可例示喃氟啶‧尿嘧啶複合劑、喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑、去氧氟尿苷、卡培他濱、卡莫氟等。該等之中,以喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑為宜。
所謂喃氟啶,係5-氟-1-(2-四氫呋喃基)-2,4-(1H,3H)-嘧啶二酮所表示之公知化合物,且係於生物體內受到活化而釋放出抗腫瘤活性之本體即5-FU的藥劑。喃氟啶可依照公知之方法、例如日本專利特公昭49-10510號公報所記載之方法而製造。
所謂吉莫斯特,係2,4-二羥基-5-氯吡啶所表示之公知化合物,其自身完全不具有抗腫瘤活性,但其抑制5-FU於生物體內代謝而失去活性,從而可使抗腫瘤效果增強。
所謂氧酸鉀,係1,2,3,4-四氫-2,4-二氧雜-1,3,5-三-6-羧酸單鉀鹽所示之公知化合物,其自身不具有抗腫瘤活性,但主要分布於消化道中並抑制該部位之5-FU之活化,藉此抑制消化道障礙。
較好之喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑中,喃氟啶、吉莫斯特、氧酸鉀之調配比例只要在發揮各自之調配目的之範圍內則並無特別限制,例如宜為與日本專利第2614164號公報中所記載之公知複合劑相同之範圍,作為1日之量,相對於喃氟啶1莫耳,將吉莫斯特設定為0.1~5莫耳左右、較好的是0.2~1.5莫耳左右即可,且將氧酸鉀設定為0.1~5莫耳左右、較好的是0.2~2莫耳左右即可。特別好的是各有效成分之調配比例為喃氟啶:吉莫斯特:氧酸鉀(莫耳比)=1:0.4:1。再者,有時於本說明書中將以1:0.4:1之莫耳比調配喃氟啶、吉莫斯特、氧酸鉀而成之喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑稱為S-1。
本發明之醫藥組合物可含有一種或組合含有複數種的上述本發明之RNAi分子或shRNA分子表現載體。以含有shRNA分子表現載體為宜。更好的是該shRNA表現載體表現序列編號8所示之shRNA分子。
本發明之醫藥組合物可為將RNAi分子或shRNA分子表現載體、以及喃氟啶、吉莫斯特及氧酸鉀以適當之調配比以複合劑(含有複數種有效成分之製劑)之形式製成一種劑型之製劑者(單劑型形態),亦可為以能同時或空開間隔而分別使用之方式將上述有效成分以單劑(含有單一之有效成分之製劑)或複合劑之形式製成複數種劑型之製劑者(多劑型形態)。其中,喃氟啶、吉莫斯特及氧酸鉀宜以複合劑之形式製成一種劑型之製劑,RNAi分子或shRNA分子表現載體宜以單劑之形式製成製劑。
作為上述各製劑之投予形態,並無特別限制,可視治療目的而適當選擇,具體可例示口服劑(錠劑、包衣錠劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑等)、注射劑、栓劑、貼附劑、軟膏劑等。於將本發明之醫藥組合物製成複數種劑型之製劑的情形時,上述各製劑可為各不相同之投予形態亦可為相同之投予形態。例如,宜將喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑製成口服劑,且將含有RNAi分子或shRNA分子表現載體之製劑製成注射劑。
本發明之醫藥組合物只要將喃氟啶‧吉莫斯特‧氧酸鉀複合劑與RNAi分子或shRNA分子表現載體併用投予,則上述各製劑可各自獨立地製造‧包裝‧流通,又,亦可將上述各製劑全部或一部分以適於併用投予之單一包裝(套裝製劑)之形式製造‧包裝‧流通。
含有本發明之醫藥組合物中的各有效成分之製劑可使用藥理學上容許之載體藉由通常公知之方法製備。作為該載體,可例示通常之藥劑中廣泛使用之各種物質,例如賦形劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、稀釋劑、溶解助劑、懸浮劑、等張劑、pH調整劑、緩衝劑、穩定劑、著色劑、調味劑、調香劑等。
作為賦形劑,例如可列舉乳糖、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖醇、赤藻糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、肌醇、葡聚糖、山梨糖醇、白蛋白、脲、澱粉、碳酸鈣、高嶺土、結晶纖維素、矽酸、甲基纖維素、甘油、海藻酸鈉、阿拉伯膠及該等之混合物等。作為潤滑劑,例如可列舉精製滑石、硬脂酸鹽、硼砂、聚乙二醇及該等之混合物等。作為黏合劑,例如可列舉單糖漿、葡萄糖液、澱粉液、明膠溶液、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯啶酮、羧甲基纖維素、蟲膠、甲基纖維素、乙基纖維素、水、乙醇、磷酸鉀及該等之混合物等。作為崩解劑,例如可列舉乾燥澱粉、海藻酸鈉、瓊脂粉、昆布糖粉、碳酸氫鈉、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯類、月桂基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、澱粉、乳糖及該等之混合物等。作為稀釋劑,例如可列舉水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、乙氧化異硬脂醇、聚氧化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯類及該等之混合物等。作為穩定劑,例如可列舉焦亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸、巰乙酸、硫代乳酸及該等之混合物等。作為等張劑,例如可列舉氯化鈉、硼酸、葡萄糖、甘油及該等之混合物等。作為pH調整劑及緩衝劑,例如可列舉檸檬酸鈉、檸檬酸、乙酸鈉、磷酸鈉及該等之混合物等。作為無痛劑,例如可列舉鹽酸普魯卡因、鹽酸利多卡因及該等之混合物等。
本發明之醫藥組合物中的各有效成分之投予量只要為發揮各自之調配目的之量則並無特別限制,可根據患者之年齢、癌症種類、病期、轉移之有無、治療史、其他抗腫瘤劑之有無等而適當設定,喃氟啶可例示0.2~40 mg/kg/day、宜為0.5~20 mg/kg/day,吉莫斯特可例示0.05~12 mg/kg/day、宜為0.1~6 mg/kg/day,氧酸鉀可例示0.2~40 mg/kg/day、宜為0.5~20 mg/kg/day,RNAi分子或shRNA分子表現載體可例示0.0001~100 mg/kg/day。
本發明之醫藥組合物中的各有效成分之投予順序或投予間隔只要在可獲得各有效成分之協同效果的範圍內則並無特別限制。又,於將本發明之醫藥組合物製成套組之情形時,亦可同時或空開間隔而投予各單獨之製劑。
本發明之醫藥組合物之效果可依照如下標準進行評價:對來源於上述癌之細胞或組織、及罹患上述癌症之個體投予該醫藥組合物,腫瘤之大小與未投予該醫藥組合物之(或投予前之)細胞或組織、及個體中的腫瘤之大小相比較,腫瘤縮小或消滅。作為可用於評價本發明之醫藥組合物之效果的癌細胞,只要表現TS則癌症種類等並無特別限制,例如可列舉:人類結腸直腸癌細胞株DLD-1/5FU、KM12C/5FU、HT29/5FU,人類胃癌細胞株NUGC-3/5FU等。
本發明之醫藥組合物所具有之抗腫瘤效果並非各有效成分各自所具有之抗腫瘤效果的累加效果,而可能為由RNAi分子或shRNA分子表現載體所帶來之5-FU系抗腫瘤劑之活性增強效果的協同效果。所謂「累加效果」,係指由各有效成分所帶來之抗腫瘤效果之總和,如下述實施將所詳述般,可作為將由各有效成分所帶來之腫瘤增殖抑制率相乘之值來表示。另一方面,所謂「協同效果」,係指與由各有效成分所帶來之抗腫瘤效果之累加效果相比較於統計學上顯著高的抗腫瘤效果,如下述實施例將詳述般,表現出與由各有效成分所帶來之累加效果的腫瘤增殖抑制率相比較於統計學上顯著低的腫瘤增殖抑制率。
又,本發明係關於一種使用上述本發明之抗腫瘤劑、5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑、及/或醫藥組合物的癌症之治療方法。作為可藉由該方法治療之癌症,包括上文所定義般之癌症。
以下示出實施例而對本發明加以更詳細說明。然而,本發明不限於該等實施例。
將已報告對5-FU表現出抗藥性之人類結腸直腸癌細胞株DLD-1/5FU(Int J Oncol 2000;17: 277-83.)於6 cm培養皿上培養24小時直至50~60%融合為止。
接著,化學合成以下的siRNA分子:TS-siRNA1(正義鏈:序列編號1,反義鏈:序列編號2)、TS-siRNA2(正義鏈:序列編號3,反義鏈:序列編號4)、TS-siRNA3(正義鏈:序列編號5,反義鏈:序列編號6),使用各siRNA分子(最終濃度25 nM)與含有TransIT-TKO Transfection Reagent(Mirus公司)25 μl之2.5 ml的溶液依照常法轉染至上述細胞中。再者,使用Scrambled siRNA(TS-Scra1)作為陰性對照。
自轉染開始72小時後,利用Taqman即時PCR法(ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems公司))確認各siRNA分子之TS表現抑制效果。再者,TS之引子及探針係使用Assays-on Demand Gene Expression Assay Mix(assay ID Hs00426591_m1,PCR product size 87 bp;Applied Biosystems公司)。又,作為內標準,係使用GAPDH(Assays-on-Demand Gene Expression system,assay ID Hs99999905_m1,PCR product size 122 bp;Applied Biosystems公司)。
將結果示於圖1中。TS-siRNA1~3全部可確認到TS之表現抑制效果,其中,TS-siRNA1與TS-siRNA2、3相比較更強地抑制TS之表現(83.5±1.3%)。
表現針對TS之shRNA分子的腺病毒載體之構建
合成作為基於TS-siRNA1而針對TS之shRNA分子的模板之DNA(TS-siRNA1之正義鏈(GTAACACCATCGATCATGA,序列編號9)+連接子部分(TAGTGCTCCTGGTTG,序列編號10)+TS-siRNA1之反義鏈(TCATGATCGATGGTGTTAC,序列編號11)+聚合酶III終止子(TTTTTT))。為製作表現針對TS之shRNA分子的質體載體,而將該模板插入至具有人類U6啟動子之pBAsi-hU6質體載體(Takara-Bio股份有限公司)中。
繼而,使用Adenovirus Expression Vector kit(腺病毒表現載體試劑盒,Takara-Bio股份有限公司),將利用EcoRV自上述質體載體中切出之人類U6啟動子與該模板插入至pAxcwit黏接質體載體中。使用COS-TPC法(Jpn J Med Sci Biol 1994;47: 157-66.),構建表現將TS作為標靶之shRNA分子的E1區缺損型腺病毒載體(以下稱為Ad-shTS)。再者,使用含有細菌之LacZ基因的腺病毒載體(以下稱為Ad-LacZ)(Oncogene 2004;23: 7475-83.)作為對照。
針對TS之shRNA分子的TS-1之抗腫瘤效果增強作用
將經皮下傳代之人類結腸直腸癌細胞株DLD-1/5FU之約8 mm3的片斷移植至6週齡之雄性裸鼠之背部,當其腫瘤體積達到約200mm3時,以每群6隻而進行分群。對於投予Ad-shTS之群(以下稱為Ad-shTS群)及投予Ad-shTS與S-1之群(以下稱為Ad-shTS+S-1群),16天中每4天1次將2×109 pfu之Ad-shTS注射至腫瘤內。對於Ad-shTS+S-1群及投予S-1之群(以下稱為S-1群),1天1次連續14天口服10 mg/kg之S-1(大鵬藥品工業股份有限公司)。Ad-shTS之最初投予係於S-1投予開始之2天前進行。再者,對於對照群,16天中每4天1次將PBS注射至腫瘤中。
其後30天中每3天1次對腫瘤之大小進行測定,藉此研究各小鼠之腫瘤增殖。再者,腫瘤體積及腫瘤增殖率係藉由以下之式而求出。
腫瘤體積(mm3)=(腫瘤之長邊)×(腫瘤之短邊)2×0.5
腫瘤增殖率=(測定日之腫瘤體積)/(投予開始時之腫瘤體積)
將結果示於圖2中。第30天之對照群之腫瘤增殖率為44.5±18.0,相對於此,Ad-shTS群為22.3±8.2,S-1群為17.4±11.5,Ad-shTS+S-1群為4.7±0.9。因此可確認,Ad-shTS+S-1群之抗腫瘤效果與對照群、Ad-shTS群及S-1群相比較於統計學上顯著高。
又,關於相對於對照群之腫瘤增殖抑制率(%)(=第30天之各藥劑投予群之腫瘤增殖率/第30天之對照群之腫瘤增殖率×100),Ad-shTS群為50%,S-1群為39%。此處,當藉由Ad-shTS與S-1之併用而獲得的抗腫瘤效果之增強作用為累加效果時,可認為Ad-shTS+S-1群相對於對照群之腫瘤增殖抑制率為將兩者相乘所得之50%×39%=20%。然而,實際上為11%,故其暗示藉由Ad-shTS與S-1之併用所得的抗腫瘤效果之增強作用為協同效果。
本發明之將TS mRNA作為標靶的RNAi分子可抑制腫瘤細胞中之TS之表現量,並且可抑制腫瘤細胞之增殖。又,藉由使用本發明之RNAi分子抑制TS之表現量,可增強5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果,且可有效率地治療及/或預防癌症。
本說明書中引用之所有出版物、專利及專利申請案係直接以參考之方式併入至本說明書中。
<110> 日商大鵬藥品工業股份有限公司
<120> 針對胸腺核苷酸合成酵素之RNAi分子及其用途
<130> PH-4265-PCT
<140> 099110007
<141> 2010-03-31
<150> 2009-086463
<151> 2009-03-31
<160> 11
<170> Patentln版本3.4
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
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<212> DNA
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圖1係表示將人類結腸直腸癌株DLD-1/5FU中的將TS作為標靶之siRNA之TS表現抑制效果的特性圖;及
圖2係表示人類結腸直腸癌株DLD-1/5FU荷癌小鼠的將TS作為標靶之shRNA及/或S-1之抗腫瘤效果的特性圖。
(無元件符號說明)
Claims (14)
- 一種RNAi分子,其係可藉由RNAi作用抑制胸腺核苷酸合成酵素之表現者,且其含有雙鏈RNA部分,該雙鏈RNA部分係由序列編號1所示之鹼基序列所組成之正義鏈與由序列編號2所示之鹼基序列所組成之反義鏈雜交而成。
- 如請求項1之RNAi分子,其中正義鏈與反義鏈係經由連接子部分而連結。
- 如請求項2之RNAi分子,其由序列編號8所示之鹼基序列所組成。
- 一種載體,其含有如請求項2或3之RNAi分子之模板DNA而表現該RNAi分子。
- 一種抗腫瘤劑,其含有如請求項1至3中任一項之RNAi分子及/或如請求項4之載體。
- 一種醫藥組合物,其係將如請求項1至3中任一項之RNAi分子及/或如請求項4之載體與5-FU系抗腫瘤劑組合而成,用於治療及/或預防癌症。
- 如請求項6之醫藥組合物,其中5-FU系抗腫瘤劑為含有喃氟啶之複合劑。
- 如請求項7之醫藥組合物,其中5-FU系抗腫瘤劑為喃氟啶.吉莫斯特.氧酸鉀複合劑。
- 如請求項8之醫藥組合物,其以1:0.4:1之莫耳比而含有喃氟啶、吉莫斯特、氧酸鉀。
- 如請求項6至9中任一項之醫藥組合物,其中如請求項1 至3中任一項之RNAi分子及/或如請求項4之載體、與5-FU系抗腫瘤劑分別為單劑。
- 如請求項6至9中任一項之醫藥組合物,其中如請求項1至3中任一項之RNAi分子及/或如請求項4之載體、與5-FU系抗腫瘤劑為套裝製劑。
- 一種5-FU系抗腫瘤劑之抗腫瘤效果增強劑,其含有如請求項1至3中任一項之RNAi分子及/或如請求項4之載體。
- 如請求項12之抗腫瘤效果增強劑,其中5-FU系抗腫瘤劑為含有喃氟啶之複合劑。
- 如請求項13之抗腫瘤效果增強劑,其中5-FU系抗腫瘤劑為喃氟啶.吉莫斯特.氧酸鉀複合劑。
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