PT2415870T - Molécula de arni para timidilato sintase e utilização da mesma - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
MOLÉCULA DE ARNI PARA TIMIDILATO SINTASE E UTILIZAÇÃO DA MESMA
Campo da Técnica A presente invenção refere-se a uma molécula de ARNi visando timidilato sintase, um agente antitumoral contendo a molécula de ARNi, um agente para potenciar os efeitos antitumorais de um agente antitumoral 5-FU contendo a molécula de ARNi, e uma composição farmacêutica contendo a molécula de ARNi e o agente antitumoral 5-FU (um fármaco de combinação contendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico, em particular). Técnica Anterior
Os agentes antitumorais 5-FU, tais como 5-fluorouracilo (doravante, referido como "5-FU"), um fármaco de combinação compreendendo tegafur e uracilo, ou um fármaco de combinação compreendendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico (um fármaco composto contendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico numa razão de 1: 0,4: 1 por mol, doravante referido como "5-1") , sã o geralmente utilizados no tratamento de vários tipos de cancro, incluindo cancro do sistema digestivo e cancro pulmonar de células não pequenas. A timidilato sintase (doravante, referida como "TS") envolvida na síntese de ADN é conhecida como "molécula alvo de 5-FU". A correlação entre o nível de expressão de TS e a sensibilidade a agentes antitumorais 5-FU foi até agora relatada como um resultado de vários ensaios clínicos. Especificamente, os efeitos dos agentes antitumorais 5-FU são notáveis para pacientes de cancro exibindo níveis de expressão de TS relativamente baixos, embora muitos pacientes de cancro exibindo níveis de TS relativamente elevados tenham resistência a agentes antitumorais 5-FU (Patrick G. Johnston et al. , Cancer Res., 1995; 55: 1407-12; Kun-Huei Yeh et al. , Cancer, 1998; 82: 1626-31).
Consequentemente, é esperado o desenvolvimento de uma técnica de tratamento de cancro inovadora para potenciar os efeitos antitumorais dos agentes antitumorais 5-FU para pacientes de cancro exibindo níveis de expressão de TS relativamente elevados e tendo resistência a agentes antitumorais 5-FU.
Foi também relatado que a expressão de TS poderia ser suprimida com a utilização de ARN de interferência (doravante, referido como "ARNi") , que foi desenvolvida como uma ferramenta para suprimir a expressão de um determinado gene (Publicação de Patente JP (Kokai) N.0 2005-253342 A). Consequentemente, foram realizadas tentativas de potenciar os efeitos antitumorais de agentes antitumorais 5-FU através da supressão da expressão de TS através de ARNi, embora os efeitos de potenciamento dos efeitos antitumorais não sejam ainda satisfatórios (Kadota et al., the 67th Annual Meeting of the Japanese Cancer Association, 2008, p. 235, P-4274).
Schmitz et al. (2004) Cancer Research 64,1431-1435 divulgam TS1058, um ARNip direcionado contra os nucleótidos 1058-1077 no UTR 3 ' do ARNm de TS, imediatamente a jusante do codão de terminação da tradução. TS10589 inibiu de forma potente a expressão de TS em células RKO de cancro do cólon humano e restaurou a quimiossensibilidade da linha celular RKO-HTStet resistente a vários compostos inibidores. O documento WO 2008/124927 exemplifica um duplex de ARNip direcionado contra os nucleótidos 868-886 do ARNm de TS. Outras sequências alvo de ARNip são divulgadas mas não exemplificadas, incluindo os nucleótidos 1184-1203, 1436-1455 e 1081-1100 na UTR 3'. ARNip de hairpin curto (ARNsh) são também divulgados mas não exemplificados.
Sumário da Invenção
Objetivo a ser Alcançado pela Invenção A presente invenção pretende proporcionar uma molécula de ARNi inovadora que possa potenciar notavelmente os efeitos antitumorais de agentes antitumorais 5-FU.
Meios para Alcançar o Objetivo
Sob as circunstâncias acima, os presentes inventores realizaram estudos com respeito a uma molécula de ARNi inovadora que possa potenciar notavelmente os efeitos antitumorais de agentes antitumorais 5-FU. Como um resultado, descobriram uma molécula de ARNi inovadora que pode suprimir a expressão de TS a um nível particularmente notável. Igualmente, os presentes inventores confirmaram que uma tal molécula de ARNi suprimiria notavelmente a expressão de TS e consequentemente exerceria efeitos antitumorais e potenciaria os efeitos antitumorais de agentes antitumorais 5-FU (um fãrmaco de combinação compreendendo tegafur, gimeracil, e oteracil potãssico, em particular). Isto levou à conclusão da presente invenção. A invenção proporciona moléculas de ARNi, vetores, composições farmacêuticas e agentes para utilização em métodos de tratamento médico, todos conforme definido nas reivindicações.
Efeitos da Invenção A molécula de ARNi da presente invenção é capaz de suprimir a expressão de TS a um nível particularmente notável e é capaz de suprimir o crescimento de tumores expressando TS. Adicionalmente, a molécula de ARNi da presente invenção é capaz de potenciar os efeitos antitumorais do agente antitumoral 5-FU (um fãrmaco de combinação compreendendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico, em particular) a um nível notável.
Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 é um diagrama característico mostrando os efeitos de ARNip visado por TS para suprimir a expressão de TS em linhas celulares de cancro colorrectal humano DLD- 1/5FU. A Fig. 2 é um diagrama característico mostrando os efeitos antitumorais de ARNsh e/ou S-l em ratinhos portando linhas celulares de cancro colorrectal humano DLD- 1/5FU. Formas de Realização da Invenção A molécula de ARNi da presente invenção compreende um domínio de ARN de cadeia dupla composto por uma cadeia se sentido direto consistindo na sequência de nucleótidos representada pela SEQ ID NO: 1, hibridada com uma cadeia anti sentido consistindo na sequência de nucleótidos representada pela SEQ ID NO: 2 . A molécula de ARNi da presente invenção visa um domínio de ARNm de TS tendo uma sequência de nucleótidos idêntica à da cadeia de sentido direto (doravante, referido como "domínio de ARNm alvo"). Exibe consequentemente ações de ARNi de uma maneira específica de TS, e pode suprimir de forma notável a expressão de TS.
Uma cadeia de sentido direto ou anti sentido constituindo a molécula de ARNm da presente invenção pode compreender uma cadeia suspensa na extremidade 3 ' , de acordo com a necessidade. Os tipos e números de nucleótidos constituindo uma tal cadeia suspensa não são limitados. Por exemplo, uma sequência de cadeia suspensa pode consistir de 1 a 5, preferentemente 1 a 3, e mais preferentemente 1 ou 2 nucleótidos (por exemplo, TTT, UU, ou TT). Na presente invenção, uma "cadeia suspensa" é um nucleótido adicionado à extremidade de uma cadeia constituindo uma molécula de ARNi não tendo quaisquer nucleótidos numa posição correspondente da outra cadeia à qual tal "cadeia suspensa" pode ligar de forma complementar. Uma cadeia suspensa pode ser um nucleótido constituindo ADN. Adicionalmente, uma cadeia de sentido direto ou anti-sentido constituindo a molécula de ARNi ou pode incluir adicionalmente uma substituição, uma adição, ou uma eliminação de 1 a 3 nucleótidos, e mais preferentemente 1 ou 2 nucleótidos, de acordo com a necessidade, contanto que a atividade do ARNi não seja influenciada, de tal forma que uma variedade de operações experimentais, tais como sequenciação de genes, possam ser realizadas facilmente.
Adicionalmente, a extremidade 5' de uma cadeia de sentido direto ou anti sentido pode ser fosforilada, ou pode ser ligado ácido trifosfórico (PPP) à extremidade 5', de acordo com a necessidade.
Exemplos das moléculas de ARNi da presente invenção incluem moléculas de ARN de cadeia dupla, tais como moléculas de ARNip (ARN de interferência pequena) e moléculas de ARNsh (ARN de hairpin curto), e são preferíveis moléculas de ARNip e ARNsh.
Na presente invenção, uma molécula de ARNip é uma molécula de ARN de cadeia dupla resultando a partir da formação de uma região de cadeia dupla através de hibridação de uma cadeia de sentido direto com uma cadeia anti sentido.
Uma cadeia de sentido direto e uma cadeia anti sentido constituindo uma molécula de ARNip podem ser sintetizadas in vitro de acordo com uma técnica conhecida, tal como síntese química ou utilização de um sistema de transcrição utilizando um promotor e uma ARN polimerase. Alternativamente, podem ser introduzidos ADN moldes da cadeia de sentido direto e da cadeia anti sentido num vetor de expressão adequado, e o vetor resultante pode ser administrado numa célula hospedeira adequada para sintetizar as cadeias de sentido direto e anti sentido de interesse in vivo. As cadeias de sentido direto e anti sentido sintetizadas podem ser submetidas a hibridização através de um método comum conhecido na técnica. As cadeias de sentido direto e anti sentido sintetizadas são dissolvidas separadamente num tampão de hibridização para ARN de cadeia dupla, quantidades equivalentes (igual número de moles) das mesmas são misturadas entre si, a mistura é aquecida até a cadeia dupla estar dissociada, e o resultante é então incubado com arrefecimento gradual. A hibridização pode ser levada a cabo ao permitir que a mistura seja mantida a 90 °C durante 1 minuto e posteriormente a 37 °C durante 1 hora, por exemplo. Posteriormente, são levadas a cabo extração com fenol/clorofórmio e precipitação por etanol, e pode ser obtida uma molécula de ARNip (isto é, uma molécula de ARN de cadeia dupla).
Na presente invenção, uma molécula de ARNsh é ARN de cadeia simples consistindo na cadeia de sentido direto ligada à cadeia anti sentido através de uma região ligante. Consiste em 40 a 60 nucleótidos, a região ligante é dobrada através de formação de ansas, e a cadeia anti sentido é hibridada com a cadeia de sentido direto. Consequentemente, é formada uma região de cadeia dupla.
Uma região ligante contida numa molécula de ARNsh não está particularmente limitada, e pode ser um ligante polinucleótido ou não polinucleótido, contanto que seja capaz de ligar a cadeia de sentido direto à cadeia anti sentido para formar uma estrutura de tronco e ansa. É preferível um ligante polinucleótido consistindo em 2 a 22 nucleótidos conhecidos na técnica. Exemplos específicos incluem UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7) , UUCAAGAGA, CCACC, CUCGAG, CCACACC, UUCAAGAGA, AUG, CCC, e UUCG, com UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7) sendo preferível.
Uma molécula de ARNsh preferível é ARN de cadeia simples consistindo na sequência de nucleótidos representada pela SEQ ID NO: 8.
Uma molécula de ARNsh pode ser sintetizada in vitro ou in vivo de acordo com técnicas conhecidas conforme descrito acima. Ao sintetizar uma molécula de ARNsh, é sintetizada uma cadeia simples de ARN compreendendo uma cadeia de sentido direto e uma cadeia anti sentido orientadas em direções opostas, e a cadeia simples de ARN resultante é então submetida a ligação auto-complementar para formar uma estrutura de cadeia dupla. Consequentemente, pode ser obtida uma molécula de ARNsh.
Igualmente, pode ser obtida uma molécula de ARNsh com a utilização de um vetor de expressão compreendendo ADN molde codificando a molécula de ARNsh.
Exemplos de vetores que podem ser utilizados na presente invenção incluem vetores de plasmídeos, virais, e não virais. Exemplos de vetores de plasmídeos que podem ser utilizados incluem vetores pBAsi, pSUPER, e pBAsi -hU6 . Exemplos de vetores virais que podem ser utilizados incluem vetores de adenovirus (por exemplo, pAxcwit), retrovirus, e lentivirus). Um exemplo de um vetor não virai é um vetor de lipossoma.
Um promotor e/ou outra sequência de controlo são operativamente ligados a um ADN molde de uma molécula de ARNsh e o resultante é inserido num vetor. A expressão "operativamente ligado... inserido" refere-se à ligação e incorporação de um promotor e/ou outra sequência de controlo no vetor, de tal forma que a molécula de ARNsh seja expressa e o ARNm de TS alvo seja degradado sob o controlo de um promotor e/ou outra sequência de controlo numa célula na qual o vetor foi introduzido. 0 promotor e/ou outra sequência de controlo que podem ser incorporados num vetor não estão particularmente limitados. Pode ser adequadamente selecionado um promotor e/ou outra sequência de controlo conhecidos na técnica, tais como um promotor constitutivo, promotor específico de tecido, promotor específico de estádio, promotor de ARNt, promotor Hl, promotor U6, promotor de polimerase II, promotor CMV, e outro elemento de controlo (por exemplo, uma sequência de terminação compreendendo pelo menos 4 resíduos de timidina contínuos). 0 vetor consequentemente preparado expressando uma molécula de ARNsh é capaz de expressar uma molécula de ARNsh e degradar especificamente ARNm de TS numa célula na qual o vetor foi introduzido. A molécula de ARNi da presente invenção pode ser administrada através de qualquer método, contanto que seja capaz de exercer os seus efeitos no tumor. A molécula de ARNi pode ser administrada no tumor ou no sangue. Quando a molécula de ARNi da presente invenção é administrada no sangue, a molécula de ARNi pode ser modificada através de uma técnica de modificação de ácido nucleico conhecida, de tal forma a prevenir que a molécula de ARNi se degrade. Adicionalmente, podem ser empregues sistemas de administração de fármaco (DDSs) conhecidos, tais como lipossomas ou micelas poliméricas, de tal forma que a molécula de ARNi pode facilmente alcançar o tumor. 0 vetor de expressão da molécula de ARNsh da presente invenção pode ser introduzido numa célula através de, por exemplo, transporte mediado por portador mediado por um lípido (por exemplo, o método de lipofetamina) , transporte mediado por uma substância química (por exemplo, fosfato de cálcio), microinjeção, implante com uma pistola de genes, ou eletroporação.
Os efeitos do vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh da presente invenção podem ser avaliados utilizando, como indicador, os níveis de expressão reduzidos de ARNm ou proteínas de TS em células, tecido, ou um indivíduo no qual tal molécula ou vetor tenha sido introduzido, em comparação com os de células, tecido, ou um indivíduo no qual tal molécula ou vetor não tenha sido introduzido (ou não tenha ainda sido introduzido) , Quando se destina a ser ensaiado ARNm, o ARNm pode ser ensaiado através de hibridação Northern, RT-PCR, hibridação in situ, ou outros meios. Quando se destinam a ser ensaiadas proteínas, as proteínas podem ser ensaiadas através de hibridação Western, ELISA, ensaio proteico com a utilização de um chip proteico ao qual foi ligado um anticorpo, ou ensaio de atividade proteica ou através de outros meios. 0 vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh da presente invenção é capaz de reduzir os níveis de expressão de ARNm ou proteína de TS em células, tecido, ou um indivíduo no qual tal molécula ou vetor tenha sido introduzido em 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, preferentemente 80% ou mais, e mais preferentemente 90% ou mais, em comparação com uma amostra de controlo. O vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh da presente invenção é capaz de exercer efeitos de supressão de TS com duas, três, quatro cinco, dez, vinte, trinta, quarenta, cinquenta, cem, ou mais vezes a eficácia dos vetores de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh conhecidos na técnica que visam ARNm de TS. São conhecidas uma variedade de técnicas como métodos para selecionar sequências nucleotídicas no domínio de ARNm visado para o desenho de moléculas de ARNi. Por exemplo, por ser empregue o ARNip Design Support System (Takara Bio, Inc.). Contudo, deve ser notado que não todas as moléculas de ARNi tendo sequências nucleotídicas selecionadas através de tal técnica têm ações de ARNi. Consequentemente, é muito difícil selecionar moléculas de ARNi de interesse tendo efeitos de supressão significativa da expressão de TS de entre as moléculas de ARNi candidatas tendo sequências nucleotídicas selecionadas através da técnica mencionada anteriormente. 0 vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh descrito acima pode ser utilizado como um ingrediente ativo de (a) um agente antitumoral, (b) um agente para potenciar os efeitos antitumorais de um agente antitumoral 5-FU, e (c) uma composição farmacêutica utilizada para o tratamento e/ou prevenção do cancro. (a) Agente anti tumoral
Conforme descrito em detalhe nos exemplos abaixo, o vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh da presente invenção é capaz de suprimir o crescimento de células tumorais. Consequentemente, o vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh da presente invenção pode ser utilizado como um agente anti tumoral para o tratamento e/ou prevenção do cancro.
Cancros exibindo níveis de expressão de TS elevados podem ser tratados com a utilização do agente anti tumoral da presente invenção. Exemplos de tais cancros incluem, mas não estão particularmente limitados a, cancro colorrectal, cancro do fígado, cancro renal, cancro da cabeça e pescoço, cancro esofágico, cancro gástrico, cancro do trato biliar, cancro da vesícula biliar e duto biliar, cancro pancreático, cancro pulmonar, cancro da mama, cancro ovárico, cancro do colo do útero, cancro do corpo uterino, cancro da bexiga, cancro da próstata, tumor testicular, sarcomas osteogénicos e do tecido mole, leucemia, linfoma maligno, mieloma múltiplo, cancro da pele, e tumor cerebral. Exemplos preferíveis são cancro colorrectal, cancro gástrico, cancro da cabeça e pescoço, cancro pulmonar, cancro da mama, cancro pancreático, cancro do trato biliar, e cancro hepático, com o cancro colorrectal sendo particularmente preferível. 0 agente anti tumoral da presente invenção pode compreender o vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh da presente invenção por si só ou em combinações de dois ou mais. A utilização do vetor de expressão da molécula de ARNsh como um ingrediente ativo do agente anti tumoral da presente invenção é preferível pelos seguintes motivos. Isto é, a utilização de um tal vetor é mais rentável do que a síntese de moléculas de ARNi, o tal vetor é amplificado após introdução nas células, e, as moléculas de ARNsh podem ser produzidas em massa com estabilidade. Consequentemente, a utilização de um tal vetor é quantitativamente mais eficaz do que a introdução de moléculas de ARNi . 0 vetor de expressão de ARNsh expressa preferentemente a molécula de ARNsh representada pela SEQ ID NO: 8. 0 agente anti tumoral da presente invenção pode compreender, para além do vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh da presente invenção, substâncias adequadas que são geralmente utilizadas, tais como portadores, diluentes, emulsões, excipientes, cargas, aglutinantes, agentes humidificantes, desintegrantes, agentes tensioativos, lubrificantes, dispersantes, tampões, conservantes, solubilizantes, antissépticos, corantes, agentes aromatizantes, ou estabilizantes. 0 agente anti tumoral da presente invenção pode ser diretamente administrado para o cancro através de injeção. Pode também ser administrado através de uma via oral ou parentérica (por exemplo, administração intravenosa, administração intra-arterial, administração tópica através de injeção, administração intraperitoneal ou intratorácica, administração subcutânea, administração intramuscular, administração sublingual, absorção percutânea, ou administração intrarretal). 0 agente anti tumoral da presente invenção pode ser preparado numa forma farmacêutica adequada de acordo com a via de administração. Especificamente, o agente anti tumoral pode ser preparado em várias formas farmacêuticas, tais como preparações para injeção, suspensões emulsificantes, pomadas, cremes, comprimidos, cápsulas, preparações de grânulos, preparações em pó, pílulas, grãos finos, pastilhas, preparações de fãrmacos para administração intrarretal, supositórios oleaginosos, ou supositórios hidrossolúveis. A quantidade do vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh da presente invenção a ser incorporada no agente anti tumoral da presente invenção pode variar dependendo de fatores tais como idade, massa corporal, ou gravidade da doença de um paciente. Pode ser adequadamente determinada uma dose dentro do intervalo desde 0,0001 mg até 100 mg por kg de massa corporal. 0 vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh contido no agente anti tumoral da presente invenção pode ser administrado ao tecido ou células alvo através de uma variedade de técnicas que são comummente empregues no campo da terapêutica génica. Por exemplo, podem ser empregues técnicas de DDS conhecidas tais como aquelas utilizando lipossomas ou micelas poliméricas, transporte mediado por portador mediado por um lípido (por exemplo, o método de lipofetamina), transporte mediado por uma substância química (por exemplo, fosfato de cálcio), microinjeção, implante com uma pistola de genes, ou eletroporação, conforme descrito acima.
Os efeitos do agente anti tumoral da presente invenção podem ser avaliados através da administração do agente anti tumoral a células ou tecido originando a partir de cancro ou a indivíduos afligidos com cancro, comparação do tamanho do tumor dos mesmos com o de células, tecido, ou um indivíduos ao qual o agente anti tumoral não tenha sido administrado (ou não tenha sido ainda administrado) , e utilização dos resultados da comparação (isto é, diminuição ou eliminação do tumor) como um indicador. As células cancerígenas que podem ser utilizadas para avaliação dos efeitos do agente anti tumoral da presente invenção não estão particularmente limitadas, contanto que TS seja expresso. Exemplos das mesmas incluem as linhas celulares de cancro colorrectal humano DLD-1/5FU, KM12C/5FU, e HT29/5FU e a linha celular de cancro gástrico humano NUGC-3/5FU. 0 agente anti tumoral da presente invenção é capaz de exercer efeitos anti tumorais que são duas, três, quatro cinco, dez, vinte, trinta, quarenta, cinquenta, cem, ou mais vezes tão grandes como um agente anti tumoral compreendendo, como um ingrediente ativo, vetores de expressão de moléculas de ARNi ou de moléculas de ARNsh que visam ARNm de TS conhecidos na técnica.
(b) Agente para potenciar os efeitos antitumorais de agente antitumoral 5-FU É bem sabido na técnica que os tumores exibindo níveis de expressão de TS elevados podem ser resistentes ao agente anti tumoral 5-FU (Johnston P. G. et al., Cancer Res., 1995; 55: 1407-12; Yeh K. Η. et al. , Cancer, 1998; 82: 1626-31) . Conforme especificamente descrito nos exemplos abaixo, o agente para potenciamento dos efeitos anti tumorais do agente anti tumoral 5-FU de acordo com a presente invenção é capaz de suprimir a expressão de TS em tais tumores e potenciar os efeitos de um agente anti tumoral 5-FU administrado.
Na presente invenção, exemplos de agentes anti tumorais 5-FU incluem 5-FU e um derivado de 5-FU compreendendo 5-FU como um metabolito ativo. Um exemplo de um derivado de 5-FU é um agente contendo tegafur. Um derivado de 5-FU é preferentemente um fármaco de combinação compreendendo tegafur. Exemplos específicos incluem um fármaco de combinação compreendendo tegafur e uracilo, um fármaco de combinação compreendendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico, doxifluridina, capeeitabina, e carmofur. 0 fármaco de combinação compreendendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico (por exemplo, TS-1 (marca comercial registada), Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.) descrito abaixo é particularmente preferível. O agente para potenciamento dos efeitos do agente anti tumoral 5-FU da presente invenção pode compreender o vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh da presente invenção por si só ou em combinações de dois ou mais. 0 agente compreende preferentemente o vetor de expressão da molécula de ARNsh. 0 vetor de expressão de ARNsh expressa preferentemente a molécula de ARNsh representada pela SEQ ID NO: 8 . A quantidade do vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh da presente invenção contido no agente para potenciamento dos efeitos do agente anti tumoral 5-FU da presente invenção pode variar dependendo de fatores tais como idade, massa corporal, ou gravidade da doença de um paciente. Pode ser adequadamente determinada uma dose dentro do intervalo desde 0,0001 mg até 100 mg por kg de massa corporal. O agente para potenciamento dos efeitos do agente anti tumoral 5-FU da presente invenção pode ser preparado adequadamente de acordo com uma técnica conhecida, dependendo de fatores tais como a via de administração ou alvo de administração, tal como no caso do agente anti tumoral. O vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh contido no agente pode ser administrado a tecido ou células alvo através de uma variedade de técnicas que são comummente empregues no campo da terapêutica génica.
Os efeitos do agente para potenciamento dos efeitos do agente anti tumoral 5-FU da presente invenção podem ser avaliados através da administração do agente anti tumoral 5-FU e do agente para potenciamento dos efeitos do agente anti tumoral 5-FU da presente invenção a células ou tecido originando a partir de cancro ou a indivíduos afligidos com cancro, comparação do tamanho do tumor dos mesmos com o das células, tecido, ou um indivíduo ao qual o agente anti tumoral 5-FU tenha sido administrado por si só, e utilização dos resultados da comparação (isto é, diminuição ou eliminação do tumor) como um indicador. As células cancerígenas que podem ser utilizadas para a avaliação do agente para potenciamento dos efeitos anti tumorais do agente anti tumoral 5-FU da presente invenção não estão particularmente limitadas, contanto que TS seja expresso. Exemplos das mesmas incluem as linhas celulares de cancro colorrectal humano DLD-1/5FU, KM12C/5FU, e HT29/5FU e a linha celular de cancro gástrico humano NUGC-3/5FU. 0 agente anti tumoral 5-FU e o agente para potenciamento dos efeitos do agente anti tumoral 5-FU da presente invenção podem ser administrados simultaneamente ou separadamente.
Com a utilização do agente para potenciamento dos efeitos do agente anti tumoral 5-FU da presente invenção em combinação com o agente anti tumoral 5-FU, os efeitos anti tumorais de agentes anti tumorais 5-FU podem ser melhorados por duas, três, quatro cinco, dez, vinte, trinta, quarenta, cinquenta, ou mais vezes. 0 agente para potenciamento dos efeitos anti tumorais do agente anti tumoral 5-FU da presente invenção é capaz de potenciar os efeitos anti tumorais de agentes anti tumorais 5-FU. Consequentemente, a dose do agente anti tumoral 5-FU requerida para o tratamento de pacientes afligidos com cancros descritos acima pode ser reduzida. Isto pode suprimir ou atrasar o desenvolvimento de efeitos secundários que podem ser causados pela administração do agente anti tumoral 5-FU. Exemplos de efeitos secundários incluem, mas não estão limitados a, supressão da medula óssea, anemia hemolítica, síndrome de coagulação intravascular disseminada, insuficiência hepática fulminante, desidratação, enterite, pneumonia intersticial, estomatite, úlcera do trato gastrointestinal, hemorragia gastrointestinal, perfuração do trato digestivo, insuficiência renal aguda, síndrome ocular mucocutâneo, necrólise epidérmica tóxica, distúrbio psiconeurótico, pancreatite aguda, rabdomiólise, e anosmia, (c) Composição farmacêutica utilizada para o tratamento e/ou prevenção do cancro A composição farmacêutica utilizada para o tratamento e/ou prevenção do cancro da presente invenção compreende, como ingredientes ativos, o vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh da presente invenção e o agente anti tumoral 5-FU. A composição farmacêutica da presente invenção exibe níveis de expressão de TS elevados e consequentemente pode ser utilizada para o tratamento e/ou prevenção de cancro exibindo resistência ao agente anti tumoral 5-FU.
Cancros exibindo níveis de expressão de TS elevados podem ser tratados com a utilização da composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos de tais cancros incluem, mas não estão particularmente limitados a, cancro colorrectal, cancro do fígado, cancro renal, cancro da cabeça e pescoço, cancro esofágico, cancro gástrico, cancro do trato biliar, cancro da vesícula biliar e duto biliar, cancro pancreático, cancro pulmonar, cancro da mama, cancro ovãrico, cancro do colo do útero, cancro do corpo uterino, cancro da bexiga, cancro da próstata, tumor testicular, sarcomas osteogénicos e do tecido mole, leucemia, linfoma maligno, mieloma múltiplo, cancro da pele, e tumor cerebral. Exemplos preferíveis são cancro colorrectal, cancro gástrico, cancro da cabeça e pescoço, cancro pulmonar, cancro da mama, cancro pancreático, cancro do trato biliar, e cancro hepático, com o cancro colorrectal sendo particularmente preferível. 0 agente anti tumoral 5-FU contido na composição farmacêutica da presente invenção não está limitado a 5-FU, e um derivado de 5-FU compreendendo 5-FU como um metabolito ativo encontra-se dentro do âmbito do agente anti tumoral 5-FU. Um exemplo de um derivado de 5-FU é um agente contendo tegafur. É preferível um fármaco de combinação compreendendo tegafur, e exemplos específicos incluem um fármaco de combinação compreendendo tegafur e uracilo, um fármaco de combinação compreendendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico, doxifluridina, capecitabina, e carmofur. Um fármaco de combinação compreendendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico é particularmente preferível.
Tegafur é um composto conhecido denotado como 5-fluoro-1-(2-tetraidrofuril)-2,4-(1H,3H)-pirimidinodiona, é ativado in vivo, e liberta 5-FU, que é uma substância anti tumoral ativa. 0 tegafur pode ser preparado de acordo com uma técnica conhecida, tal como o método divulgado pela Publicação de Patente JP (Kokoku) N.0 S49-10510 B (1974).
Gimeracil é um composto conhecido denotado como 2,4-diidroxi-5-cloropiridina, e não tem qualquer atividade anti tumoral. 0 gimeracil suprime a inativação de 5-FU após metabolismo in vivo, e pode potenciar os efeitos anti tumorais.
Oteracil potássico é um composto conhecido denotado como 1,2,3,4 -tetraidro-2,4-dioxo-1,3,5-triazina-6-carboxilato monopotássico, e não tem qualquer atividade anti tumoral. 0 oteracil potássico está principalmente distribuído no trato gastrointestinal, e suprime a ativação de 5-FU no mesmo para suprimir distúrbios do trato gastrointestinal.
As quantidades preferíveis de tegafur, gimeracil, e oteracil potássico incorporadas num fármaco de combinação compreendendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico não são particularmente limitadas, contanto que cada composto seja capaz de exercer os efeitos de interesse. Tais quantidades podem ser as mesmas que aquelas do fármaco de combinação conhecido divulgado na Patente JPN.° 2.614.164. Por exemplo, podem ser incorporadas aproximadamente 0,1 a 5 moles, e preferentemente aproximadamente 0,2 a 1,5 moles de gimeracil, e aproximadamente 0,1 a 5 moles, e preferentemente aproximadamente 0,2 a 2 moles de oteracil potássico para cada mol de tegafur como a quantidade por dia. Particularmente preferentemente, as quantidades de ingredientes ativos (isto é, tegafur, gimeracil, e oteracil potássico) incorporadas são 1:0,4:1 por mol. Um fármaco de combinação compreendendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico contendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico a uma razão de 1:0,4:1 por mol é ocasionalmente referido como "S-l" no presente documento. A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender o vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh da presente invenção por si só ou em combinações de dois ou mais tais vetores. A composição farmacêutica compreende preferentemente um vetor de expressão de molécula de ARNsh. Mais preferentemente, o vetor de expressão da molécula de ARNsh expressa a molécula de ARNsh representada pela SEQ ID NO: 8. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser um fármaco de combinação compreendendo o vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh e tegafur, gimeracil, e oteracil potássico a uma razão de mistura adequada (isto é, um fármaco compreendendo uma pluralidade de ingredientes ativos; uma preparação de ingrediente ativo único). Alternativamente, a composição farmacêutica pode estar na forma de um fármaco de componentes múltiplos compreendendo quaisquer dos ingredientes ativos acima como um componente ativo único (isto é, um fármaco compreendendo um ingrediente ativo único) ou um fármaco de combinação (isto é, uma forma farmacêutica de componentes múltiplos), de tal forma que os ingredientes ativos possam ser utilizados simultaneamente ou separadamente. 0 tegafur, gimeracil, e oteracil potássico são preferentemente preparados na forma de fármacos de combinação numa forma farmacêutica única, e o vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh é preferentemente preparado na forma de uma preparação de ingrediente ativo único.
As formas farmacêuticas para tais preparações de fármacos não estão particularmente limitadas e podem ser adequadamente selecionadas de acordo com o propósito do tratamento. Exemplo específicos incluem preparações orais (por exemplo, comprimidos, comprimidos revestidos, pó, grânulos, cápsulas, e preparações líquidas), preparações para inj eção, supositórios, emplastros cutâneos adesivos, e pomadas. Quando a composição farmacêutica da presente invenção está presente numa preparação de fármaco de componentes múltiplos, tal preparação de fármaco pode ter a mesma ou diferentes formas farmacêuticas. Por exemplo, é preferível que um fãrmaco de combinação compreendendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico esteja na forma de uma preparação oral e o vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh esteja na forma de uma preparação para injeção. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser preparada, embalada, e distribuída separadamente para cada preparação farmacêutica, contanto que o fãrmaco de combinação compreendendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico seja administrado em combinação com o vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh. Alternativamente, todas ou algumas das preparações de fãrmaco podem ser preparadas, embaladas, e distribuídas numa forma de embalagem única adequada para administração de tais fármacos em combinação (isto é, uma formulação de kit).
Podem ser preparadas preparações de fãrmaco compreendendo ingredientes ativos da composição farmacêutica da presente invenção de acordo com uma técnica conhecida com a utilização de portadores farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de tais portadores incluem várias substâncias que são geralmente utilizadas para preparações de fármacos, tais como excipientes, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, diluentes, solubilizantes, agentes de suspensão, agentes de isotonização, modificadores do pH, tampões, estabilizantes, corantes, agentes aromatizantes, e corretores.
Exemplos de excipientes incluem lactose, sacarose, cloreto de sódio, glucose, maltose, manitol, eritritol, xilitol, maltitol, inositol, dextrano, sorbitol, albumina, ureia, amido, carbonato de cálcio, caulino, celulose cristalina, sílica, metilcelulose, glicerina, alginato de sódio, goma-arábica, e uma mistura de quaisquer dos mesmos. Exemplos de lubrificantes incluem talco purificado, estearato, borato de sódio, polietilenoglicol, e uma mistura de quaisquer dos mesmos. Exemplos de aglutinantes incluem xarope simples, solução de glucose, solução de amido, solução de gelatina, álcool polivinílico, éter polivinílico, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, goma laca, metilcelulose, etilcelulose, água, etanol, fosfato de potássio, e uma mistura de quaisquer dos mesmos. Exemplos de desintegrantes incluem amido seco, alginato de sódio, pó de agar, pó de laminarano, bicarbonato de sódio, carbonato de cálcio, ésteres de ácido gordo de polioxietileno sorbitano, lauril sulfato de sódio, monoglicerídeo de ácido esteárico, amido, lactose, e uma mistura de quaisquer dos mesmos. Exemplos de diluentes incluem água, álcool etílico, macrogol, propilenoglicol, álcool isoestearílico etoxilado, álcool isoestearílico polioxilado, ésteres de ácido gordo de polioxietileno sorbitano, e uma mistura de quaisquer dos mesmos. Exemplos de estabilizantes incluem pirossulfito de sódio, ácido etilenodiaminatetraacético, ácido tioglicólico, ácido tiolático, e uma mistura de quaisquer dos mesmos. Exemplos de agentes de isotonização incluem cloreto de sódio, ácido bórico, glucose, glicerina, e uma mistura de quaisquer dos mesmos. Exemplos de modificadores e tampões de pH incluem citrato de sódio, ácido cítrico, acetato de sódio, fosfato de sódio, e uma mistura de quaisquer dos mesmos. Exemplos de agentes calmantes incluem cloridrato de procaína, cloridrato de lidocaína, e uma mistura de quaisquer dos mesmos.
As quantidades dos ingredientes ativos na composição farmacêutica da presente invenção a ser administrada não estão particularmente limitados, contanto que tais ingredientes ativos sejam capazes de exercer os efeitos de interesse. Tais quantidades são adequadamente determinadas de acordo com idade, tipo de cancro, estádio, ocorrência de metástases, historial de tratamento, utilização de outros agentes an ti tumorais, e outras condições do paciente. Por exemplo, a quantidade de tegafur é 0,2 a 40 mg/kg/dia e preferentemente 0,5 a 20 mg/kg/dia, a quantidade de gimeracil é 0,05 a 12 mg/kg/dia e preferentemente 0,1 a 6 mg/kg/dia, a quantidade de oteracil potássico é 0,2 a 40 mg/kg/dia e preferentemente 0,5 a 20 mg/kg/dia, e a quantidade do vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh é 0,0001 a 100 mg/kg/dia. A ordem e intervalos de administração dos ingredientes ativos da composição farmacêutica da presente invenção não estão particularmente limitados, contando que possam ser alcançados efeitos sinérgicos resultando a partir da utilização de tais ingredientes ativos em combinação. Quando a composição farmacêutica da presente invenção é preparada na forma de um kit, os f ármacos podem ser administrados simultaneamente ou separadamente.
Os efeitos da composição farmacêutica da presente invenção podem ser avaliados através da administração da composição farmacêutica a uma célula ou tecido originando a partir do cancro mencionado acima ou a um indivíduo afligido com tal cancro, comparação do tamanho do tumor dos mesmos com o da célula ou tecido ou com um indivíduo ao qual a composição farmacêutica não tenha sido administrada (ou não tenha sido ainda administrada) , e utilização dos resultados da comparação (isto é, diminuição ou eliminação do tumor) como um indicador. As células cancerígenas que podem ser utilizadas para a avaliação dos efeitos da composição farmacêutica da presente invenção não estão particularmente limitadas, contanto que TS seja expresso. Exemplos das mesmas incluem as linhas celulares de cancro colorrectal humano DLD-1/5FU, KM12C/5FU, e HT29/5FU e a linha celular de cancro gástrico humano NUGC-3/5FU.
Os efeitos anti tumorais da composição farmacêutica da presente invenção não são efeitos aditivos resultando a partir de efeitos anti tumorais de cada ingrediente ativo. Os efeitos anti tumorais da composição farmacêutica da presente invenção podem ser efeitos sinérgicos resultando a partir dos efeitos do agente anti tumoral 5-FU para o potenciamento da atividade exercida por parte do vetor de expressão da molécula de ARNi ou da molécula de ARNsh. Os "efeitos" aditivos" constituem a soma de efeitos anti tumorais exercidos por cada ingrediente ativo, e os efeitos aditivos podem ser representados como valores determinados através da multiplicação das taxas de inibição do crescimento tumoral exercida por parte dos ingredientes ativos conforme descrito em detalhe nos exemplos abaixo. 0 termo "efeitos sinérgicos" refere-se a efeitos anti tumorais que são estatisticamente significativamente mais elevados do que efeitos anti tumorais aditivos exercidos por parte dos ingredientes ativos. Tais taxas de inibição do crescimento tumoral são estatisticamente significativamente mais elevadas do que a taxa de inibição do crescimento tumoral alcançada através dos efeitos aditivos provocados pelos ingredientes ativos conforme descrito em maior detalhe nos exemplos abaixo.
Exemplos
Doravante, a presente invenção é descrita em maior detalhe com referência aos exemplos abaixo. Contudo, deve ser notado que a presente invenção não está limitada a estes exemplos. (Exemplo 1)
Identificação de moléculas de ARNip visando TS
As linhas celulares de cancro colorrectal humano DLD-1/5FU (Int. J. Oncol., 2000; 17: 277-83) que foram relatadas como sendo resistentes a 5-FU foram cultivadas numa placa de cultura de 6 cm durante 24 horas até as células alcançarem confluência de 50% a 60%.
Subsequentemente, foram sintetizadas quimicamente moléculas de ARNip (isto é, moléculas de TS-ARNipl (cadeia de sentido direto: SEQ ID NO: 1; cadeia anti sentido: SEQ ID NO: 2), moléculas de TS-ARNip2 (cadeia de sentido direto: SEQ ID NO: 3; cadeia anti sentido: SEQ ID NO: 4), e moléculas de TS-ARNip3 (cadeia de sentido direto: SEQ ID NO: 5; cadeia anti sentido: SEQ ID NO: 6)), e foram transfetados 2,5 ml de uma solução contendo cada uma das moléculas de ARNip acima (concentração final: 25 nM) e 25 ul de TransIT-TKO Transfection Reagent (Mirus) nas células acima de acordo com uma técnica convencional. Foi utilizado ARNip desordenado (TS-Scral) como controlo negativo.
Os efeitos das moléculas de ARNip sobre a inibição da expressão de TS foram inspecionados através de PCR a tempo real Taqman (ABI PRISM 7700 Sequence Detection System; Applied Biosystems) 72 horas após transfeção. Foi utilizado o Assays-on-Demand Gene Expression Assay Mix (ID do ensaio Hs00426591__ml; tamanho do produto de PCR: 87 pb; Applied Biosystems) para iniciadores e sondas de TS. Foi utilizado GAPDH como o padrão interno (Assays-on-Demand Gene Expression System; ID do ensaio: Hs99999905_ml; tamanho do produto de PCR: 122 pb; Applied Biosystems).
Os resultados são mostrados na Fig. 1. TS-ARNipl a TS-ARNip3 exibiram efeitos de inibição da expressão de TS, e os efeitos de TS-ARNipl sobre a inibição da expressão de TS foram mais fortes do que os de TS-ARNip2 e TS-ARNip3 (83,5 ± 1,3%). (Exemplo 2)
Construção de um vetor de adenovirus expressando moléculas de ARNsh visando TS
Foi sintetizado ADN molde da molécula de ARNsh visando TS com base em TS-ARNipl (cadeia de sentido direto de TS-ARNipl (GTAACACCATCGATCATGA, SEQ ID NO: 9), região ligante (TAGTGCTCCTGGTTG, SEQ ID NO: 10), cadeia anti sentido de TS-ARNipl (TCATGATCGATGGTGTTAC, SEQ ID NO: 11), e terminador de polimerase III (TTTTTT)). De modo a preparar um vetor de plasmídeo expressando a molécula de ARNsh visando TS, o molde resultante foi inserido no vetor de plasmídeo pBAsi-hU6 (Takara Bio Inc.) contendo um promotor U6 humano.
Subsequentemente, o promotor U6 humano clivado a partir do vetor de plasmídeo com EcoRV e o molde foram inseridos no vetor de cosmídeo pAxcwit utilizando o kit Adenovirus Expression Vector (Takara Bio Inc.). Foi construído um vetor de adenovirus expressando moléculas de ARNsh visando TS (doravante, referido como "Ad-shTS") utilizando o método COS-TPC (Jpn. J. Med. Sei. Biol. , 1994; 47: 157-66). Foi utilizado um vetor de adenovirus contendo o gene bacteriano
LacZ (doravante, referido como "Ad-LacZ" como controlo (Oncogene, 2004, 23: 7475-83). (Exemplo 3) Ação de potenciamento de efeitos anti tumorais de moléculas de ARNsh visadas por TS sobre TS-1
Foram transplantados fragmentos subcultivados por via subcutânea de linhas celulares de cancro colorrectal humano DLD-1/5FU tendo cada uma um volume de aproximadamente 8 mm3 no dorso de ratinhos nus de 6 semanas de idade, e os ratinhos foram divididos em grupos consistindo cada um em 6 indivíduos quando o tamanho dos tumores alcançou aproximadamente 200 mm3. Foi injetado Ad-shTS (2 x 10s pfu) no tumor cada 4 dias durante o período de 16 dias no grupo ao qual foi administrado Ad-shTS (doravante, referido como o "grupo Ad-shTS") e no grupo ao qual foram administrados Ad-shTS e S-l (doravante, referido como o "grupo Ad-shTS+S-1") . Ao grupo Ad-shTS+S-1 e ao grupo ao qual foi administrado S-l (doravante, referido como o "grupo S-l") , foram administrados 10 mg/kg de S-l (Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.) por via oral uma vez por dia durante 14 dias contínuos. A administração inicial de Ad-shTS foi levada a cabo 2 dias antes do início da administração de S-l. Relativamente ao grupo de controlo, foi injetado PBS no tumor cada 4 dias durante um período de 16 dias.
Posteriormente, o tamanho do tumor foi medido cada 3 dias durante um período de 30 dias, e o crescimento tumoral em cada ratinho foi inspecionado. 0 volume do tumor e a taxa de crescimento tumoral foram determinados utilizando as equações abaixo.
Volume do tumor (mm3) = (diâmetro longo do tumor) x (diâmetro curto do tumor)2 * 0,5
Taxa de crescimento tumoral = (volume do tumor no dia da medição) / (volume do tumor no início da administração)
Os resultados são mostrados na Fig. 2 . Enquanto a taxa de crescimento tumoral do grupo de controlo foi 44,5 ± 18,0 no dia 30, a do grupo Ad-shTS foi 22,3 ± 8,2, a do grupo S-l foi 17,4 ± 11,5, e a do grupo Ad-shTS+S-1 foi 4,7 ± 0,9.
Consequentemente, os efeitos anti tumorais do grupo Ad-shTS+S-1 foram constatados como sendo estatisticamente significativamente mais elevados do que os do grupo de controlo, do grupo Ad-shTS, e do grupo S-l. A razão de inibição do crescimento tumoral (%) do grupo Ad-shTS foi 50% e a do grupo S-l foi 39% em relação ao grupo de controlo (isto é, a taxa de crescimento tumoral de um grupo ao qual cada agente foi administrado no dia 30 / taxa de crescimento tumoral do grupo de controlo no dia 30 x 100). Quando a ação de potenciamento dos efeitos anti tumorais alcançada através da utilização de Ad-shTS em combinação com S-l resulta em efeitos aditivos, a taxa de inibição do crescimento tumoral do grupo Ad-shTS+S-1 em relação ao grupo de controlo é considerada como sendo 20%, que é determinada multiplicando a razão de inibição do crescimento tumoral do grupo Ad-shTS pela do grupo S-l (isto é, 50% x 39% = 20%). Contudo, o valor realmente determinado foi 11%. Isto indica que as ações de potenciamento dos efeitos anti tumorais alcançadas através da utilização de Ad-shTS em combinação com S-l são efeitos sinérgicos.
Aplicabilidade Industrial A molécula de ARNi visando ARNm de TS de acordo com a presente invenção é capaz de inibir o nível de expressão de TS em células tumorais e é também capaz de inibir o crescimento de células tumorais. Ao suprimir o nível de expressão de TS com a utilização da molécula de ARNi da presente invenção, os efeitos anti tumorais dos agentes anti tumorais 5-FU podem ser potenciados e o cancro pode ser tratado e/ou prevenido de forma eficaz.
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> TAIHO PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Uma Molécula de ARNi Contra uma Timidilato Sintase e Utilização da Mesma
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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • JP 2005253342 A [0003] • WO 2008124927 A [0005] • JP S4910510 B [0053] • JP 2614164 B [0056] • PH 4265 W [0079] • JP 2009086463 A [0079]
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Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Uma molécula de ARNi capaz de suprimir a expressão da timidilato sintase através da ação de ARNi compreendendo um domínio de ARN de cadeia dupla composto por uma cadeia de sentido direto consistindo na sequência de nucleótidos representada pela SEQ ID NO: 1 hibridada com uma cadeia anti sentido consistindo na sequência de nucleótidos representada pela SEQ ID NO: 2, em que a cadeia de sentido direto está ligada à cadeia anti sentido através de uma região ligante.
  2. 2. A molécula de ARNi de acordo com a reivindicação 1, que consiste na sequência de nucleótidos representada pela SEQ ID NO: 8 .
  3. 3. Um vetor compreendendo ADN molde da molécula de ARNi de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 e capaz de expressar a molécula de ARNi.
  4. 4. Uma composição farmacêutica compreendendo a molécula de ARNi de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 e/ou o vetor de acordo com a reivindicação 3 em combinação com um agente anti tumoral 5-FU.
  5. 5. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, em que o agente anti tumoral 5-FU um fármaco de combinação compreendendo tegafur.
  6. 6 . A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, em que o agente anti tumoral 5-FU um fármaco de combinação compreendendo tegafur, gimeracil, e oteracil potássico.
  7. 7. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, que compreende tegafur, gimeracil, e oteracil potássico) a uma razão de 1:0,4:1 por mol.
  8. 8. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, em que a molécula de ARNi de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 e/ou o vetor de acordo com a reivindicação 3, e o agente anti tumoral 5-FU são cada um uma preparação de ingrediente ativo único.
  9. 9. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, em que a molécula de ARNi de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 e/ou o vetor de acordo com a reivindicação 3 e o agente anti tumoral 5-FU estão na forma de uma formulação de kit.
  10. 10. Um agente compreendendo a molécula de ARNi de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 e/ou o vetor de acordo com a reivindicação 3, para utilização num método de tratamento médico. 11. 0 agente acordo com a reivindicação 10, para utilização no tratamento e/ou prevenção do cancro e/ou para utilização no potenciamento dos efeitos anti tumorais de um agente anti tumoral 5-FU.
  11. 12 . O agente para utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o agente anti tumoral 5-FU um fármaco de combinação compreendendo tegafur.
  12. 13 . O agente para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o agente anti tumoral 5-FU um fármaco de combinação compreendendo tegafur, gimeracil, e oteracil potãssico.
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