CN102369008A

CN102369008A - 脂质体组合物

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Publication number: CN102369008A
Application number: CN2010800146982A
Authority: CN
Inventors: 菊池宽; 兵头健治; 石原比吕之
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2009-03-30
Filing date: 2010-03-30
Publication date: 2012-03-07
Anticipated expiration: 2030-03-30
Also published as: BRPI1014527B8; SMT201600307B; BRPI1014527A2; CA2756811A1; HRP20161157T1; AU2010232347A1; PT2415470T; BRPI1014527B1; PE20151519A1; CN102369008B; CO6430500A2; PE20120923A1; LT2415470T; ME02518B; JP5551683B2; EP2415470A4; EP2415470B1; EP2415470A1; SG174255A1; PL2415470T3

Abstract

本发明提供一种含有艾日布林或其药理学上允许的盐的新脂质体组合物及其制备方法。

Description

脂质体组合物

技术领域

本发明涉及一种含有艾日布林或其药理学上允许的盐的新脂质体组合物。另外，本发明涉及该脂质体组合物的制造方法。

背景技术

脂质体为微小封闭囊泡，所述微小封闭囊泡具有被1个以上脂质双层(lipid bilayer)包围的内相，能够将水溶性物质保持在内相、将脂溶性物质保持在脂质双层中。将活性化合物包封在脂质体中、送达至目标组织时，如何以高效率将活性化合物包封在脂质体中、以及如何确保利用脂质体的活性化合物的保持稳定性成为重要的课题。

将脂溶性化合物包封在脂质体中时，能够比较容易地实现高包封率，但除两性霉素B(脂质体药品AmBisome的主药)之类的膜亲和性非常高的化合物的情况之外，通常在血浆中的保持稳定性低，难以充分改善药物动力学。将水溶性化合物包封到脂质体中的包封方法中，包括类脂膜法(Vortex法)、反相蒸发法、表面活性剂除去法、冻融法或遥控装载法(pH梯度法、离子梯度法)等各种方法。但是，能够得到接近100％的高包封率的方法仅为遥控装载法，其他方法中只能得到5～30％左右的包封率。

作为遥控装载法，已知利用pH梯度或硫酸铵离子梯度的方法。所谓利用pH梯度的遥控装载法即pH梯度法，是指利用由目标化合物的pH引起的分子型/离子型的离解平衡的移动，将化合物摄入脂质体内的技术。

作为利用pH梯度法被包封在脂质体内的化合物的一个例子，例如可以举出阿霉素(DOX，pKa：8.2)。使用pH4的缓冲液配制脂质体溶液后，将脂质体外相置换为pH7的缓冲液。在上述脂质体溶液中加入了DOX时，由于加入的pH7的溶液中分子型的DOX变成脂溶性，所以向脂质体膜转移、而不向水相转移。进而，向脂质体膜转移后的DOX与pH4的脂质体内相接触时，变为离子型溶于脂质体内相。如上所述，通过离解平衡的移动，DOX由脂质体外相被输送至内相(参见非专利文献1、非专利文献2及专利文献1)。

另外，将上述遥控装载法改良后的各种技术已有报道。

非专利文献3中公开了一种技术：在称作不含胆固醇的脂质体的特别组成的脂质体中进行pH梯度法时，通过向脂质体外相中添加活性化合物及乙醇，提高活性化合物的包封率。

专利文献2中公开了一种技术：除pH梯度之外，通过使脂质体内相中存在铜离子，提高活性化合物的包封率。

所谓利用了硫酸铵离子梯度的遥控装载法即硫酸铵法，是指利用2价硫酸铵等的离子梯度代替pH梯度法中的pH梯度，将活性化合物摄入脂质体内相的技术(参见非专利文献1及专利文献3)。

专利文献4中公开了一种技术：除由硫酸铵产生离子梯度之外，通过向脂质体外相中添加活性化合物和硼酸，将活性化合物摄入脂质体内。另外，专利文献5中公开了一种技术：通过利用由葡萄糖醛酸阴离子产生的离子梯度代替由硫酸铵产生的离子梯度，将活性化合物摄入脂质体内，与利用了硫酸铵的情况相比，提高了活性化合物的释放速度。

如上所述，从包封率的方面考虑，遥控装载法为优异的包封方法。但是，采用遥控装载法时，除了被包封在脂质体内相的活性化合物结晶化的Doxil(Dox的脂质体制剂)等特殊的例子之外，存在活性化合物在血浆中容易从脂质体漏出、活性化合物的保持稳定性较低的问题。

如上所述，在现有技术的方法中，现状是难以同时实现脂质体中的活性化合物的高包封率、及脂质体中的活性化合物的保持稳定性。

专利文献1：美国专利第5192549号说明书

专利文献2：国际公开第2006/037230号说明书

专利文献3：美国专利第5316771号说明书

专利文献4：美国专利第6051251号说明书

专利文献5：国际公开第2005/046643号说明书

非专利文献1：佐塚泰之，“脂质体的制备法”，“脂质体应用的新进展：面向人工细胞的开发(秋吉一成，辻井薰主编)”，NTS，(2005)，pp.33-37。

非专利文献2：Mayer LD et al.，Biochimica et Biophysica Acta，(1986)，857：pp.123-126.

非专利文献3：N.Dos Santos et al.，Biochimica et Biophysica Acta，(2004)，1661(1)：pp.47-60.

发明内容

本发明要解决的课题在于提供一种活性化合物的保持稳定性及包封率高的脂质体组合物。

本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现以艾日布林或其药理学上允许的盐作为活性化合物的脂质体组合物中，脂质体组合物中的活性化合物的保持稳定性及包封率极高，从而完成了本发明。

即，本发明如下。

[1]一种脂质体组合物，所述脂质体组合物含有脂质体、且在脂质体内相中含有活性化合物，所述活性化合物为艾日布林或其药理学上允许的盐。

[2]如1所述的脂质体组合物，其中，所述脂质体组合物为固态或液态。

[3]如1或2所述的脂质体组合物，其中，在脂质体内相中还含有铵盐。

[4]如3所述的脂质体组合物，其中，上述铵盐的浓度为10mM以上。

[5]如1～4中任一项所述的脂质体组合物，其中，在脂质体内相中还含有盐、酸、碱及/或氨基酸。

[6]如5所述的脂质体组合物，其中，上述盐的浓度为1～300mM。

[7]如5或6所述的脂质体组合物，其中，上述酸的浓度为1～300mM。

[8]如5～7中任一项所述的脂质体组合物，其中，上述氨基酸的浓度为1～300mM。

[9]如5～8中任一项所述的脂质体组合物，其中，上述碱的浓度为1～300mM。

[10]如1～9中任一项所述的脂质体组合物，其中，上述活性化合物的浓度为0.01～300mg/mL。

[11]如1～10中任一项所述的脂质体组合物，其中，上述活性化合物为甲磺酸艾日布林。

[12]如1～11中任一项所述的脂质体组合物，其中，在脂质体内相中还含有硫酸铵、柠檬酸及活性化合物。

[13]如1～12中任一项所述的脂质体组合物，其中，在脂质体外相中含有糖、电解质、及/或氨基酸。

[14]如1～13中任一项所述的脂质体组合物，其中，在脂质体外相中含有糖或电解质、及氨基酸。

[15]如13或14所述的脂质体组合物，其中，上述糖的浓度为2～20％。

[16]如13～15中任一项所述的脂质体组合物，其中，上述氨基酸的浓度为1～300mM。

[17]如1～16中任一项所述的脂质体组合物，其中，在脂质体外相中含有蔗糖或氯化钠、及组氨酸。

[18]如1～17中任一项所述的脂质体组合物，其中，在上述脂质体内相中实质上不含有环糊精。

[19]如1～18中任一项所述的脂质体组合物，其中，脂质体含有氢化卵磷脂。

[20]如1～19中任一项所述的脂质体组合物，其中，脂质体含有胆固醇。

[21]如1～20中任一项所述的脂质体组合物，其中，脂质体含有甲氧基聚乙二醇缩合物。

[22]如21所述的脂质体组合物，其中，上述甲氧基聚乙二醇缩合物为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇缩合物。

[23]如1～22中任一项所述的脂质体组合物，其中，脂质体含有氢化卵磷脂、胆固醇及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇缩合物。

[24]如23所述的脂质体组合物，含有10～80％上述氢化卵磷脂、1～60％上述胆固醇、0～50％上述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇缩合物。

[25]如1～24中任一项所述的脂质体组合物，其中，脂质体含有氢化大豆卵磷脂、胆固醇及聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺。

[26]一种制备1～25中任一项所述的脂质体组合物的方法，包括下述步骤：

供给含有脂质体的脂质体分散液的步骤；

将上述脂质体分散液和上述活性化合物混合的步骤；

将上述活性化合物导入上述脂质体分散液的脂质体内相中的步骤。

[27]如26所述的方法，其中，上述脂质体分散液在脂质体外相中实质上不含有铵盐。

[28]如26或27所述的方法，其中，上述脂质体分散液的脂质体外相中的pH为3～10。

[29]如26～28中任一项所述的方法，其中，上述脂质体分散液的脂质体外相的pH为7～10。

[30]如28或29所述的方法，其中，上述pH为将上述脂质体分散液和上述活性化合物混合的步骤中的上述脂质体分散液的脂质体外相的pH。

[31]如26～30中任一项所述的方法，其中，供给上述脂质体分散液的步骤包括：

供给脂质体准备液的步骤，所述脂质体准备液含有脂质体、且在脂质体内相及脂质体外相中含有铵盐；

置换或稀释上述脂质体准备液的脂质体外相的步骤。

[32]如31所述的方法，其中，置换或稀释上述脂质体外相的步骤是使脂质体外相的pH高于脂质体内相的pH的步骤。

[33]如31或32所述的方法，其中，置换或稀释上述脂质体外相的步骤是使脂质体内相的pH与脂质体外相的pH的差为1～5的步骤。

[34]如26～33中任一项所述的方法，其中，上述脂质体内相的pH为3～9。

[35]如26～34中任一项所述的方法，其中，上述脂质体内相的pH为4～9。

[36]如26～35中任一项所述的方法，其中，上述脂质体内相的pH为5～8。

[37]如26～36中任一项所述的方法，其中，在导入上述活性化合物的步骤中，脂质体外相为含有电解质的溶液。

[38]如26～37中任一项所述的方法，其中，上述脂质体分散液在脂质体内相中实质上不含有环糊精。

[39]如26～38中任一项所述的方法，其中，还包括使脂质体外相的pH为中性的步骤。

根据本发明，能够提供一种新的脂质体组合物。本发明的脂质体组合物以高效率将活性化合物包封到脂质体内相中，并且具有活性化合物的高保持稳定性。

附图说明

[图1]表示体外大鼠血浆中(37℃)的甲磺酸艾日布林的脂质体组合物的浓度进展。

[图2]表示体内FaDu罹癌裸鼠(nude mice)中由脂质体产生的甲磺酸艾日布林的抗肿瘤活性。

[图3]表示体内ACHN罹癌裸鼠中由脂质体产生的甲磺酸艾日布林的抗肿瘤活性。

具体实施方式

通过用于实施发明的方案具体说明本发明，但本发明并不限定于以下用于实施发明的方案，可以进行各种变形而实施。

本发明中所参照的文献中公开的内容，作为参照被引入本发明中。

[定义]

所谓“脂质体”，是指具有被脂质双层包围的内相的微小封闭囊泡。在本发明中，脂质体包括小单层脂质体(SUV：small unilamellarvesicle)、大单层脂质体(LUV：large unilamellar vesicle)、更大单层脂质体(GUV：giant unilamellar vesicle)、具有同心圆状的多层膜的多层脂质体(MLV：multilamellar vesicle)、具有不是同心圆状、而为不规则的多层膜的脂质体(MVV：Multivesicular vesicle)等。

“脂质体内相”是指被脂质体的脂质双层包围的水性区域，以“内水相”及“脂质体内水相”的相同含义进行使用。在脂质体分散在液体中时，“脂质体外相”是指没有被脂质体的脂质双层包围的区域(即除内相及脂质双层之外的区域)。

所谓“脂质体组合物”是指含有脂质体、并且在脂质体内相中还含有甲磺酸艾日布林的组合物。在本发明中，脂质体组合物包括固态及液态。

所谓“脂质体分散液“，为含有脂质体的组合物，是指活性化合物被导入到脂质体内相前的组合物。

所谓“脂质体准备液”，为含有脂质体的组合物，是指为了将甲磺酸艾日布林包封在脂质体内相中，调节脂质体外相前的组合物。

所谓“脂质体试剂”，在液态时是指脂质体分散液，在固态时，是指通过溶解或混悬在规定的溶剂中能够得到脂质体分散液的试剂。溶剂如下所述。如下所述，固态的脂质体试剂例如可以通过干燥脂质体分散液得到。

需要说明的是，本说明书中，所谓将固体和液体混合，包含将固体溶解及混悬在液体中，可以彼此交替使用混合、溶解、混悬。同样地，溶剂和分散介质也可以交替使用。

另外，本发明的脂质体组合物、脂质体分散液、脂质体准备液、脂质体试剂实质上不含有环糊精。所谓实质上不含有环糊精，是指不添加环糊精。需要说明的是，只要不含有可以明显地确认到由环糊精引起的活性化合物的溶解度(表观溶解度)提高的量的环糊精即可，加入不能显著地确认到活性化合物的溶解度提高的量时，作为本发明的实施方式也不能被排除。

进而，作为本发明的优选方案，所谓脂质体分散液中的脂质体分散液在脂质体外相中实质上不含有铵盐，是指不向脂质体分散液的脂质体外相中添加铵盐。需要说明的是，加入能够达成本发明目的范围的量的铵盐，作为本发明的实施方式不能被排除。另外，脂质体准备液的脂质体外相中含有铵盐时，通过使用实质上不含有铵盐的溶液，置换或稀释脂质体准备液的脂质体外相，能够制备实质上不含有铵盐的脂质体分散液。

[活性化合物]

本发明的活性化合物为艾日布林或其药理学上允许的盐(以下有时也记作“艾日布林等”)。所谓药理学上允许的盐，可以为无机酸盐、有机酸盐中的任一种，只要与艾日布林形成盐即可，没有特别限定，例如可以举出盐酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、过磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、糖精酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、亚甲基双羟萘酸盐(pamoate)等，优选盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐等，较优选甲磺酸盐。即，本发明中的活性化合物优选甲磺酸艾日布林。另外，作为艾日布林的药理学上允许的盐，可以为艾日布林与铝、钙、锂、镁、钙、钠、锌、二乙醇胺形成的盐。艾日布林或其药理学上允许的盐，为国际公开第99/65894号说明书或美国专利第6214865号公报(所述专利文献所记载的内容作为参照被引入)中记载的化合物或其盐，含有抗肿瘤及抗有丝分裂活性，具有药理学活性。艾日布林或其药理学上允许的盐作为抗肿瘤剂，对于黑色素瘤、纤维肉瘤、单核细胞性白血病、结肠癌、卵巢癌、乳癌、骨癌、前列腺癌、肺癌及ras-转化成纤维细胞(transformed fibroblasts)等具有抗肿瘤活性。

但是，作为能够与艾日布林等一同组合的活性化合物，可以选自药品(包含诊断药)、化妆品、食品等领域中使用的化合物。活性化合物可以为艾日布林等以外的1种化合物或2种以上的化合物的组合。

作为活性化合物，可以举出低分子化合物等，其中，优选用作抗肿瘤剂、抗菌剂、抗炎剂、抗心肌梗死剂、造影剂的化合物。

活性化合物的分子量优选为100～2000、较优选为200～1500、更优选为300～1000。通常，在上述范围内，活性化合物的脂质体膜透过性良好，可以适当地应用本发明。

活性化合物含有水溶性化合物及脂溶性化合物，只要多少溶于水或水性溶剂，就可以应用本发明。

本发明中，作为抗肿瘤剂没有特别限定，例如可以举出盐酸伊立替康、盐酸拓扑替康、依沙替康、RFS-2000、Lurtotecan、BNP-1350、Bay-383441、PNU-166148、IDEC-132、BN-80915、DB-38、DB-81、DB-90、DB-91、CKD-620、T-0128、ST-1480、ST-1481、DRF-1042、DE-310等喜树碱衍生物；多西他赛水合物、多西他赛、紫杉醇、IND-5109、BMS-184476、BMS-188797、T-3782、TAX-1011、SB-RA-31012、SBT-1514、DJ-927等紫杉烷衍生物；异环磷酰胺、盐酸尼莫司汀、卡巴醌(carvocon)、环磷酰胺、达卡巴嗪、噻替派、白消安、马法兰、雷莫司汀、雌莫司汀磷酸酯钠、6-巯基嘌呤核苷、依诺他滨、盐酸吉西他滨、卡莫氟(carmfur)、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐、替加氟、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氨甲喋呤、巯嘌呤(mercaptopurine)、磷酸氟达拉滨、放线菌素D、盐酸阿柔比星、盐酸伊达比星、盐酸吡柔比星、盐酸表柔比星、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、表柔比星、吡柔比星、柔红霉素、阿霉素、盐酸吡柔比星、盐酸博来霉素、净司他丁斯酯、新制癌菌素、丝裂霉素C、硫酸博来霉素、硫酸培洛霉素、依托泊苷、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、硫酸长春碱、盐酸氨柔比星、吉非替尼、依西美坦、卡培他滨、TNP-470、TAK-165、KW-2401、KW-2170、KW-2871、KT-5555、KT-8391、TZT-1027、S-3304、CS-682、YM-511、YM-598、TAT-59、TAS-101、TAS-102、TA-106、FK-228、FK-317、E7070、(8E、12E、14E)-7-〔(4-环庚基哌嗪-1-基)羰基}氧基-3，6，16，21-四羟基-6，10，12，16，20-五甲基-18，19-环氧基二十三碳-8，12，14-三烯-11-交酯(E7107)、KRN-700、KRN-5500、J-107088、HMN-214、SM-11355、ZD-0473等。上述抗肿瘤剂中，作为盐记载的化合物可以为任何盐，也可以为游离体。另外，作为游离体记载的化合物可以为任何盐。

作为抗菌剂，没有特别限定，例如可以举出两性霉素B、头孢替安酯、头孢菌素、氯霉素、双氯芬酸等。在上述抗菌剂中，化合物可以为任何盐。

作为抗炎剂，没有特别限定，例如可以举出前列腺素类(PGE1、PGE2)、地塞米松、氢化可的松、吡罗昔康(pyroxicam)、吲哚美辛、泼尼松龙等。上述抗炎剂中，化合物可以为任何盐。

作为抗心肌梗塞剂，没有特别限定，例如可以举出腺苷、阿替洛尔、吡西卡尼等，作为造影剂，可以举出碘帕醇、碘克沙酸、碘海醇、碘美普尔等。上述抗心肌梗塞剂及上述造影剂中，化合物可以为任何盐。

[脂质]

本发明的脂质体中，作为膜构成成分，优选含有磷脂及/或磷脂衍生物。作为磷脂及磷脂衍生物，例如可以举出磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心磷脂、鞘磷脂、神经酰胺磷酸乙醇胺、神经酰胺磷酸甘油、神经酰胺磷酸甘油磷酸酯、1，2-二肉豆蔻酰-1，2-脱氧卵磷脂、缩醛磷脂、磷脂酸等。磷脂及磷脂衍生物可以为上述物质中的1种或2种以上的组合。

磷脂及磷脂衍生物中的脂肪酸残基没有特别限定，例如可以举出碳原子数12～20的饱和或不饱和的脂肪酸残基，具体而言，可以举出月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等来自脂肪酸的酰基。另外，还可以使用蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂等来自天然物质的磷脂、及不饱和脂肪酸残基中部分或完全氢化的部分氢化蛋黄卵磷脂、(完全)氢化蛋黄卵磷脂、部分氢化大豆卵磷脂、(完全)氢化大豆卵磷脂等。

制备脂质体时使用的磷脂及/或磷脂衍生物的配合量(摩尔分数)没有特别限定，相对于全部脂质体膜成分，优选为10～80％，较优选为30～60％。

本发明的脂质体中，作为膜构成成分，除磷脂及/或磷脂衍生物之外，还可以含有胆固醇、胆甾烯醇等固醇类作为膜稳定剂、具有碳原子数8～22的饱和或不饱和的酰基的脂肪酸类、α-生育酚等抗氧化剂。

制备脂质体时使用的上述固醇类的配合量(摩尔分数)没有特别限定，相对于全部脂质体膜成分，优选为1～60％，较优选为10～50％，更优选为30～50％。

另外，脂肪酸类的配合量(摩尔分数)没有特别限定，相对于全部脂质体膜成分，优选为0～30％，较优选为0～20％，更优选为0～10％。抗氧化剂的配合量(摩尔分数)只要添加能够获得抗氧化效果的量就足够，优选为全部脂质体膜成分的0～15％，较优选为0～10％，更优选为0～5％。

本发明的脂质体中，作为膜构成成分，可以含有功能性脂质或修饰脂质。

作为功能性脂质，可以举出血中滞留性脂质衍生物、温度变化敏感性脂质衍生物、pH敏感性脂质衍生物等。作为修饰脂质，可以举出PEG化脂质、糖脂质、抗体修饰脂质、肽修饰脂质等。

作为血中滞留性脂质衍生物，例如可以举出血型糖蛋白、神经节苷酯GM1、神经节苷酯GM3、葡糖醛酸衍生物、谷氨酸衍生物、聚甘油磷脂衍生物、磷酸乙醇胺和甲氧基聚乙二醇的缩合物如N-{羰基-甲氧基聚乙二醇-2000}-1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-〔羰基-甲氧基聚乙二醇-5000}-1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-{羰基-甲氧基聚乙二醇-750}-1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-{羰基-甲氧基聚乙二醇-2000}-1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(MPEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)、N-{羰基-甲氧基聚乙二醇-5000}-1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺等聚乙二醇衍生物(甲氧基聚乙二醇缩合物等)等。脂质体通过含有血中滞留性脂质衍生物，脂质体不易作为外来异物在肝脏等中被捕捉，由此，能够提高脂质体的血中滞留性等。

作为温度变化敏感性脂质衍生物，例如可以举出二棕榈酰卵磷脂等。脂质体通过含有温度变化敏感性脂质衍生物，能够在特定的温度下破坏脂质体、使脂质体的表面特性发生变化等。进而通过与肿瘤等靶部位的加热组合，能够在靶部位破坏脂质体、在靶部位释放活性化合物等。

作为pH敏感性脂质衍生物，例如可以举出二油酰磷脂酰乙醇胺等。脂质体通过含有pH敏感性脂质衍生物，能够在通过内吞作用将脂质体摄入细胞时促进脂质体与核内体的膜融合、改良活性化合物向细胞质的送达等。

作为糖脂质、抗体修饰脂质及肽修饰脂质，可以举出与靶细胞或靶组织具有亲和性的糖、连接有抗体或肽的脂质。通过使用修饰脂质，能够主动地将脂质体运送至靶细胞或靶组织中。

制备脂质体时使用的血中滞留性脂质衍生物的配合量(摩尔分数)没有特别限定，优选为全部脂质体膜构成成分脂质的0～50％，较优选为0～30％，更优选为0～20％。

[脂质体]

如上所述，脂质体为具有被脂质双层包围的内相的微小封闭囊泡。

理想情况下，优选脂质体具有屏蔽能，即，a)一旦将艾日布林等包封在内相后，艾日布林等不会漏出至脂质体外相中。另外，用作药品时，优选脂质体在生物体内稳定，另外，优选脂质体具有屏蔽能，即，给与生物体时，在血中艾日布林等不会漏出至脂质体外相中。

用于以能够实用的水平具有上述膜透过性的脂质体的膜构成成分的组合，如果是本领域技术人员，可以根据需要通过参照下述实施例，根据活性化合物及靶组织等适当设定(参见菊池宽他，“脂质体I-制备法及检验法-”，细胞工学，(1983)，2(9)：pp.1136-1149及该文献中引用的文献等)。

需要说明的是，用作药品时，优选脂质体到达靶组织、细胞或细胞内小器官后，艾日布林等从脂质体中被释放。通常，脂质体膜构成成分本身具有生物降解能力，最终在靶组织等被分解。可以认为包封的艾日布林等由此被释放。另外，脂质体本身可以被细胞摄取。

另外，脂质体组合物不仅可以用于靶向固形癌等靶组织，也可以用于将活性化合物送达至血液癌等，也可以用作血中的缓释性制剂(slow release formulation)和控释制剂(controlled releaseformulation)等。

脂质体的粒径可以根据目的进行设定。例如，打算将脂质体作为注射剂等通过EPR(Enhanced Permeability and Retention)效果送达至癌组织或炎症组织时，脂质体的粒径优选为30～400nm，较优选为50～200nm。另外，打算将脂质体送达至巨噬细胞时，脂质体的粒径优选为30～1000nm，较优选为100～400nm。另外，将脂质体组合物用作口服制剂或透皮制剂时等，脂质体的粒径可以为几微米。需要说明的是，(1)正常组织中(由于血管内皮细胞紧密地构成血管壁)血管壁成为屏障，高分子和特定大小的脂质体之类的微细粒子不能分布在组织内，但病变组织中(血管内皮细胞间出现间隙)血管壁变得松弛，血管透过性增加，高分子和微细粒子能够分布在血管外的组织中(enhanced permeability)，另外，(2)在正常组织中淋巴系统发达，但是已知由于在病变组织中淋巴系统不发达，所以高分子或微细粒子一旦被摄入则不会被全身系统回收，而是留在其病变组织中(enhanced retention)，称作EPR效果(松村、前田，Cancer Research，(1986)，46：pp.6387-6392)。由此，通过调节脂质体的粒径，能够控制药物动力学。

需要说明的是，本发明中，脂质体的粒径是指根据动态光散射法(准弹性光散射法)测定的重量平均粒径。此处表示使用动态光散射(Dynamic Light Scattering)测量仪器(例如Malvern InstrumentsLtd公司制Zetasizer Nano ZS型号或大冢电子公司制ELS-8000)测定的粒径。测量仪器测定粒子的布朗运动，基于确立的动态光散射法理论确定粒径。

脂质体内相的溶剂没有特别限定，例如可以举出磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲生理盐水等缓冲液、生理盐水、细胞培养用的培养基等。作为溶剂，使用缓冲液时，缓冲剂的浓度优选为5～300mM，较优选为10～100mM。脂质体内相的pH没有特别限定，优选为3～11，较优选为4～9。

[脂质体组合物]

根据本发明提供了脂质体组合物。脂质体组合物含有脂质体，在脂质体内相还含有艾日布林等。如上所述，脂质体组合物包括固态及液态。脂质体组合物为固态时，如下所述通过溶解或混悬在规定溶剂中，能够变成液态。另外，脂质体组合物为冷冻的固体时，通过室温放置等使其溶化，由此可以变成液态。

脂质体组合物中的脂质体的浓度及活性化合物的浓度，可以根据脂质体组合物的目的、剂型等适当设定。脂质体组合物为溶液剂时，脂质体的浓度以作为脂质体的构成成分的全部脂质的浓度计，可以为0.2～100mM，优选为1～30mM。使用脂质体组合物作为药物时活性化合物的浓度(用量)如下所述。脂质体组合物中的环糊精的量，相对于艾日布林等优选小于0.1摩尔当量，较优选为检出限以下。

本发明的脂质体中，艾日布林等可以分配在脂质双层中。

脂质体组合物为溶液剂时脂质体组合物的溶剂(分散介质)没有特别限定，例如可以举出磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲生理盐水等缓冲液、生理盐水、细胞培养用的培养基等。脂质体组合物中的脂质体外相的pH没有特别限定，优选为3～11，较优选为4～9。

还可以向脂质体组合物中加入葡萄糖、半乳糖、甘露糖醇、果糖、肌醇、核糖、木糖等单糖类；乳糖、蔗糖、纤维素二糖、海藻糖、麦芽糖等二糖类；棉籽糖、松三糖等三糖类；环糊精等多糖类；赤藓醇、木糖醇、山梨醇、甘露糖醇、麦芽糖醇等糖醇等的糖；甘油、双甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇、乙二醇单烷基醚、二乙二醇单烷基醚、1，3-丁二醇等多元醇等。可以将糖和醇组合使用。

为了稳定地长期保存分散在上述溶剂(分散介质)中的脂质体，从凝集等物理稳定性的方面考虑，优选尽可能消除溶剂(分散介质)中的电解质。另外，从脂质的化学稳定性方面考虑，优选将溶剂(分散介质)的pH由酸性设定为中性附近(pH3.0～8.0)、及通过吹入氮气除去溶解氧。

脂质体组合物含有的糖或多元醇的浓度没有特别限定，但在脂质体分散在溶剂中的状态下，例如优选糖的浓度为2～20％(W/V)，较优选为5～10％(W/V)。多元醇的浓度优选为1～5％(W/V)，较优选为2～2.5％(W/V)。上述溶剂也可以用作脂质体分散液的脂质体外相，通过用上述溶剂置换或稀释脂质体准备液的脂质体外相，可以使脂质体外相的溶液为上述溶液。

脂质体组合物的固体制剂例如优选含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖醇、果糖、肌醇、核糖、木糖的单糖类、乳糖、蔗糖、纤维素二糖、海藻糖、麦芽糖等二糖类；棉籽糖、松三糖等三糖类；环糊精等多糖类；赤藓醇、木糖醇、山梨醇、甘露糖醇、麦芽糖醇等糖醇等糖。较优选为葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇的配合，更优选为乳糖、蔗糖、海藻糖的配合。由此，能够稳定地长期保存固体制剂。另外，冷冻时，固体制剂优选含有甘油、双甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇、乙二醇单烷基醚、二乙二醇单烷基醚、1，3-丁二醇等多元醇(水溶液)。多元醇(水溶液)较优选为甘油、丙二醇、聚乙二醇，更优选为甘油、丙二醇。由此，能够稳定地长期保存固体制剂。可以组合糖和多元醇使用。

[脂质体组合物的制造方法]

根据本发明，提供了一种制造含有艾日布林或其药理学上允许的盐的脂质体组合物的方法。制造脂质体组合物的方法包括下述步骤：供给含有脂质体的脂质体分散液的步骤；将上述脂质体分散液和上述活性化合物(艾日布林或其药理学上允许的盐)混合的步骤；将上述活性化合物导入上述脂质体分散液的脂质体内相的步骤。

供给含有脂质体的脂质体分散液的步骤，优选包括供给脂质体准备液的步骤、及置换或稀释上述脂质体准备液的脂质体外相的步骤。

脂质体准备液例如可以通过在含有铵盐的溶液中制备脂质体而供给。通过在含有铵盐的溶液中制备脂质体准备液，可以制成在脂质体内相还含有铵盐的脂质体分散液。

制备脂质体准备液时的含有铵盐的溶液，可以是任何含有铵盐的溶液，没有特别限定。

作为铵盐，例如可以举出氯化铵、硼酸铵、硫酸铵、甲酸铵、乙酸铵、柠檬酸铵、酒石酸铵、琥珀酸铵、磷酸铵，优选为硫酸铵、乙酸铵、柠檬酸铵、酒石酸铵、磷酸铵，较优选为硫酸铵、柠檬酸铵、酒石酸铵，特别优选为硫酸铵。

上述铵盐中，可以组合任意2种以上的铵盐进行使用。

含有铵盐的溶液中铵盐的浓度，可以根据包封的艾日布林等的量适当设定，浓度越高越好，优选为10mM以上，较优选为20mM以上，更优选为50mM以上。优选含有铵盐的溶液的pH为3～9，从包封率与稳定性的均衡性考虑，较优选为4～9，更优选为5～8。

为了调节含有铵盐的溶液的pH，可以使用pH调节剂。含有铵盐的溶液中的各个pH调节剂的浓度没有特别限定，优选为1～300mM，较优选为5～100mM。

pH调节剂例如可以举出精氨酸、组氨酸、甘氨酸等氨基酸；抗坏血酸、苯甲酸、柠檬酸、谷氨酸、磷酸、乙酸、丙酸、酒石酸、碳酸、乳酸、硼酸、马来酸、富马酸、苹果酸、己二酸、盐酸、硫酸等酸；上述酸的钠盐、钾盐、铵盐等盐；三羟甲基氨基甲烷、氨水(氨)、氢氧化钠、氢氧化钾等碱性化合物(碱)等。作为pH调节剂，优选为氢氧化钠、盐酸、氨水、乙酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、柠檬酸及磷酸，较优选为氢氧化钠、氨水、盐酸、乙酸、柠檬酸及磷酸，更优选为氢氧化钠、氨水、盐酸、柠檬酸及磷酸。pH调节剂可以组合任何2种以上的铵盐进行使用。另外，作为pH调节剂，可以使用磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲生理盐水等缓冲液。

作为脂质体准备液，优选使用通过实质上不含有环糊精地制备脂质体得到的溶液。另外，作为脂质体准备液，脂质体内相中还可以含有盐、酸、碱及/或氨基酸，这种情况下，优选脂质体内相中含有活性化合物、铵盐及酸。作为铵盐，可以举出硫酸铵作为优选例子，作为酸，可以举出柠檬酸作为优选例子。

脂质体的制备，可以举出类脂膜法(Vortex法)、反相蒸发法、超声波法、Pre-vesicle法、乙醇注入法、French Press法、胆酸除去法、Triton X-100分批法、Ca²⁺融合法、醚注入法、退火法、冻融融合法等。

脂质体的制备中的各种条件(膜构成成分的量、温度等)可以根据脂质体的制备方法或作为目标的脂质体的组成、粒径等适当确定(参见上述菊池(1983)等)。

根据需要，可以任意调节脂质体的粒径。例如可以通过使用孔径均匀的膜过滤器，在高压力下进行挤出(挤出过滤)来调节粒径。粒径的调节可以在本发明的脂质体组合物的制造中的任意时刻进行，例如可以在调节脂质体准备液中的脂质体外相之前、调节脂质体准备液中的脂质体外相之后、或将活性化合物导入脂质体内相之后进行。粒径的调节优选在将活性化合物导入脂质体内相之前进行，较优选在调节脂质体准备液中的脂质体外相之前进行。

通过置换或稀释得到的脂质体准备液的脂质体外相，可以得到脂质体分散液。脂质体外相的置换或稀释可以进行1次，也可以组合各种置换或稀释的方法进行多次。

作为置换脂质体准备液的脂质体外相的方法，可以举出透析、离心分离、凝胶过滤等方法。通过置换脂质体外相，可以实施本发明，使脂质体外相实质上不含有环糊精或铵盐。另外，通过置换或稀释脂质体外相，也可以有效地将艾日布林或其药理学上允许的盐包封在脂质体内相中。

透析例如可以使用透析膜进行。作为透析膜，可以举出纤维素管或Spectra/Por等以分子量馏化的膜。

离心分离例如优选以100,000g以上、较优选以300,000g以上的离心加速度实施。通过离心来置换脂质体外相，可以与脂质体外相的置换一同进行脂质体的浓缩。

凝胶过滤例如可以通过使用Sephadex或Sepharose等柱，基于分子量进行馏化而实施。

作为置换及/或稀释脂质体外相时使用的溶剂(分散介质)，例如可以举出蔗糖溶液、食盐水、细胞培养用培养基等。通过使用上述溶剂，可以制备稳定的脂质体组合物。

所述溶剂的pH没有特别限定，可以在2～11的范围内设定，优选为3～10，较优选为6～10，更优选为7～10。如下所述，艾日布林等向脂质体内相的导入时也可以利用pH梯度。此时，可以设定溶剂的pH，使脂质体外相变成目标pH。

为了调节所述溶剂的pH，可以使用pH调节剂。使用的浓度没有特别限定，优选为1～300mM，较优选为5～100mM。

作为pH调节剂，例如可以举出精氨酸、组氨酸、甘氨酸等氨基酸、抗坏血酸、苯甲酸、柠檬酸、谷氨酸、磷酸、乙酸、丙酸、酒石酸、碳酸、乳酸、硼酸、马来酸、富马酸、苹果酸、己二酸、盐酸、硫酸等酸；上述酸的钠盐、钾盐、铵盐等盐；三羟甲基氨基甲烷、氨水、氢氧化钠、氢氧化钾等碱性化合物。优选为氢氧化钠、盐酸、组氨酸、酒石酸、琥珀酸、柠檬酸及磷酸，较优选为氢氧化钠、盐酸、组氨酸、酒石酸、柠檬酸及磷酸，更优选为氢氧化钠、盐酸、组氨酸、磷酸。

为了改善艾日布林或其药理学上允许的盐在脂质体中的包封率，可以向脂质体外相中添加含有电解质的溶液(盐类溶液)使离子强度增大，由此增加包封率。脂质体外相中含有的电解质(盐类)没有特别限定，优选为氯化钠、氯化钾，较优选为氯化钠。另外，也可以使用生理盐水。另外，作为脂质体分散液等的脂质体外相，可以含有糖、电解质、及/或氨基酸，也可以含有糖或电解质、及氨基酸。作为糖，可以举出蔗糖作为优选例子，作为电解质，可以举出生理盐水、氯化钠等作为优选例子，作为氨基酸可以举出组氨酸。

优选得到的脂质体分散液在脂质体外相及脂质体内相中实质上不含有环糊精或铵盐，但本发明中，由于某些原因向脂质体分散液的脂质体外相中添加环糊精或铵盐时等，即使脂质体分散液在脂质体外相中含有环糊精或铵盐，也可以将艾日布林或其药理学上允许的盐导入脂质体内相中。

脂质体分散液中的脂质体的脂质浓度优选为1～100mM，较优选为1～50mM。在上述范围内，可以不破坏脂质体分散液的物性、适当地形成更多的脂质体粒子。

将得到的脂质体分散液和艾日布林等活性化合物混合，向脂质体分散液的脂质体内相导入活性化合物，由此可以得到脂质体组合物。优选导入的步骤包括提高脂质体分散液与活性化合物的混合液中的脂质体的膜透过性的步骤。由此，能够以更短时间将艾日布林等包封到脂质体中。但是，将脂质体分散液和艾日布林等混合后，即使不特别进行用于提高脂质体的膜透过性的操作，经过一定时间也能够将艾日布林等包封到脂质体中。

在将艾日布林或其药理学上允许的盐混合的步骤中，作为艾日布林等，可以使用溶解在溶剂中的上述物质、或固态的上述物质。溶剂没有特别限定，例如可以使用与脂质体分散液中的脂质体外相相同的溶剂。

根据需要，任意地也可以在将艾日布林等导入脂质体内相时利用pH梯度。此时，脂质体分散液中的脂质体内相的pH优选为3～9，较优选为4～9，更优选为5～8。

另外，可以将脂质体外相的pH设定为高于脂质体内相的pH，赋予pH梯度。优选的pH梯度为1～5，较优选为2～3。

进而，通过使脂质体外相的pH在艾日布林等的pKa附近，可以提高包封到脂质体中的包封率。优选为7.5～12.5，较优选为8.5～11.5，更优选为9～10.5(甲磺酸艾日布林的pKa＝9.6)。

作为脂质体准备液，优选使用通过实质上不含有环糊精地制备脂质体而得到的溶液。

作为提高得到的混合液中脂质体的膜透过性的方法，可以举出加热混合液的方法、向混合液中加入膜流化剂的方法等。

加热混合液时，通常，能够通过升温至更高的温度，更有效地将活性化合物导入在脂质体内相中。具体而言，优选考虑活性化合物及使用的脂质体膜构成成分的热稳定性，设定升温温度。特别优选升温的温度在脂质体的脂质双层膜的相变温度以上。

所谓脂质体的脂质双层膜的“相变温度”，是指升温状态下的差热分析中的吸热开始温度(吸热反应开始时的温度)。所谓差热分析，是如下所述的技术，即，能够通过一边改变样品及基准物质的温度，一边测定该样品与基准物质的温度差作为时间或温度的函数，来分析样品的热特性。针对脂质体的膜构成成分进行差热分析时，随着温度的上升，发生脂质体膜成分的流化，观察到吸热反应。如本技术领域中众所周知那样，根据脂质体的膜成分，观察到吸热反应的温度域变化很大。例如，脂质体膜成分由纯粹的脂质构成时，观察到吸热反应的温度域非常窄，多在相对于吸热峰温度为±1℃的范围内观察到吸热反应。另一方面，脂质体膜成分由多种脂质构成时，特别在由来自天然物质的脂质构成等时，观察到吸热反应的温度域有变宽的倾向，有时在相对于吸热峰温度例如为±5℃的范围内观察到吸热反应(即能够观察到宽峰)。本发明中，认为通过升温至脂质体的脂质双层膜的相变温度以上，脂质体的膜流动性提高，活性化合物的膜透过性提高。

例如，虽然也取决于活性化合物和使用的脂质体膜构成成分的热稳定性等，但优选在脂质体的脂质双层膜的相变温度～相变温度+20℃的温度范围内，较优选在相变温度～相变温度+10℃的温度范围内，更优选在相变温度+5℃～相变温度+10℃的温度范围内。

升温的温度通常为20～100℃，优选为40～80℃，更优选为45～65℃。

具体而言，在为以二棕榈酰卵磷脂(单体的相变温度：41℃)和胆固醇作为主体的脂质体膜的情况下，虽然也取决于其组成，但通常升温温度优选为40～60℃，较优选为45～50℃。另外，在为以氢化大豆卵磷脂(HSPC，单体的相变温度：50～60℃)和胆固醇作为主体的脂质体膜的情况下，虽然也取决于其组成，但通常升温温度优选为50～70℃，较优选为55～65℃。但是，上述升温的温度并不限定本发明。

升温的步骤中，维持在相变温度以上的温度的时间没有特别限定，例如可以在几秒～30分钟的范围内适当设定，但考虑活性化合物和脂质的热稳定性、及有效的大量生产时，优选在短时间内处理。即，升温维持时间优选在1分钟～30分钟，较优选为2分钟～5分钟。但是，上述温度维持的时间并不限定本发明。

另外，如上所述，通过向得到的混合液中添加膜流化剂(即向脂质体的外相侧添加)，也能够提高脂质体的膜透过性。作为膜流化剂，可以举出可溶于水系溶剂中的有机溶剂、表面活性剂、酶等。更具体而言，作为有机溶剂，例如可以举出乙醇、苯甲醇等一元醇类；甘油、丙二醇等多元醇类；二甲基亚砜(DMSO)等非质子性极性溶剂。作为表面活性剂，可以举出脂肪酸钠、单烷基硫酸盐、单烷基磷酸盐等阴离子类表面活性剂；烷基三甲基铵盐等阳离子类表面活性剂；烷基二甲基氧化胺等两性表面活性剂；聚氧乙烯烷基醚、烷基单甘油醚、脂肪酸山梨醇酯等非离子性表面活性剂。作为酶，可以举出胆碱酯酶、胆固醇氧化酶等。如果是本领域技术人员，可以根据脂质体膜构成成分的组成、膜流化剂等，考虑由膜流化剂的添加引起的活性化合物包封效率化的程度、及脂质体的稳定性等，设定膜流化剂的量。

本发明的脂质体组合物的制造方法可以继上述导入的步骤后，包括调节所得脂质体组合物的脂质体外相的pH的步骤。

调节的外相的pH没有特别限定，但从构成脂质体的磷脂的化学稳定性的观点考虑，优选为4～10，较优选为5～9，更优选为6～8的中性pH。

另外，可以还包括干燥所得脂质体组合物的步骤。

即，脂质体组合物为溶液剂时，可以将由上述导入的步骤得到的液态的脂质体组合物可以直接作为最终的脂质体组合物，或可以通过调节(置换等)得到的液态脂质体组合物的脂质体外相，作为最终的脂质体组合物。此时的脂质体外相的调节可以与脂质体准备液的脂质体外相的调节同样地进行。脂质体组合物为溶液剂时，可以直接使用。

另外，脂质体组合物为固体制剂时，可以通过对由上述导入步骤得到的液态脂质体组合物进行干燥，作为最终的固态脂质体组合物。作为对脂质体组合物进行干燥的方法，可以举出冻干及喷雾干燥等。脂质体组合物为固体制剂时，脂质体组合物可以通过溶解或混悬在适当的溶剂中，作为溶液剂使用。溶剂可以根据脂质体组合物的使用目的等适当设定，例如使用脂质体组合物作为注射剂时，溶剂优选为灭菌蒸馏水。使用脂质体组合物作为药物时，例如可以由医生或患者将溶剂注入包封有固体制剂的安瓿中，由此进行上述用时制备。另外，为将液态的脂质体组合物冷冻所得的固体制剂时，可以在冷冻状态下保存，使用时通过在室温下放置溶化或利用加热迅速溶化来使其恢复液态，由此作为溶液剂使用。

[药物组合物等]

本发明的脂质体组合物在药物领域中，可以用作治疗药。具体而言，本发明的脂质体组合物可以用作抗肿瘤剂的药物组合物。

使用本发明的脂质体组合物作为药物组合物时，脂质体组合物可以通过注射(静注、动脉注射、局部注射)、口服、经鼻、透皮、经肺或滴眼给与，特别是除静脉注射、皮下注射、皮内注射、动脉内注射之外，优选对于作为目标的细胞或脏器的局部注射等注射。作为口服给与时的脂质体组合物的剂型，例如可以举出片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、胶囊剂、内服溶液剂等。作为非口服给与时的脂质体组合物的剂型，例如可以举出注射剂、滴剂、滴眼剂、软膏剂、栓剂、混悬剂、巴布剂、洗剂、气雾剂、硬膏剂(plaster)等，特别优选注射剂、滴剂。

药物组合物的给药量，根据作为对象的疾病的种类、活性化合物的种类、患者的年龄、性别、体重、症状的程度等明显不同，但通常成人每1日的艾日布林或其药理学上允许的盐的给药量没有特别限定，作为优选盐的甲磺酸艾日布林通常为0.1～10mg。另外，可以1日1次给予，或分数次给与。可以给与在脂质体内相含有例如0.01～300mg/mL的艾日布林或其药理学上允许的盐的脂质体组合物作为本发明的脂质体组合物。

[试剂盒]

根据本发明，提供了一种用于制备脂质体组合物的试剂盒。

试剂盒可以用于制备作为药物的脂质体组合物，医者和患者本人可以在临床现场使用。

试剂盒含有脂质体试剂。脂质体试剂可以为固态或液态的任一种。脂质体试剂为液态时，可以使用上述脂质体分散液作为脂质体试剂。另外，脂质体试剂为固态时，脂质体试剂可以通过溶解或混悬在适当的溶剂中而得到脂质体分散液，可以通过干燥上述脂质体分散液而得到脂质体试剂。干燥可以与上述脂质体组合物的干燥同样地进行。使用试剂盒时，脂质体试剂为固态时，通过将脂质体试剂溶解或混悬在适当的溶剂中，作为脂质体分散液。此时的溶剂与上述脂质体分散液中的脂质体外相相同。

本发明的试剂盒还含有艾日布林或其药理学上允许的盐(作为优选的盐为甲磺酸艾日布林)。艾日布林或其药理学上允许的盐可以为固态或液态(溶解或混悬在溶剂中的状态)中的任一种。使用试剂盒时，在艾日布林等为固态时，优选使艾日布林等溶解或混悬在适当的溶剂中，制成液态。溶剂可以根据艾日布林等的物性等适当设定，例如可以与上述脂质体分散液中的脂质体外相相同。本发明的试剂盒中可以含有除艾日布林或其药理学上允许的盐之外的活性化合物。

在试剂盒中，脂质体试剂和活性化合物可以单独包装，或者，脂质体试剂和活性化合物分别为固态，可以被混合。

脂质体试剂为固态时，除了如上所述通过溶解或混悬制备脂质体分散液之外，试剂盒也可以通过进行下述步骤而使用，所述步骤与上述脂质体组合物的制造方法中脂质体分散液与活性化合物的混合、及将活性化合物导入脂质体分散液的脂质体内相相同。由此，可以制备将活性化合物导入脂质体试剂的脂质体内相的脂质体组合物。

脂质体试剂和活性化合物分别为固态，被一起包装时，使所述脂质体试剂和活性化合物的混合物溶解或混悬在适当的溶剂中。此时的溶剂与上述脂质体分散液中的脂质体外相相同。由此，可以形成将脂质体分散液和活性化合物混合的状态，之后，可以通过进行上述脂质体组合物的制造方法中的、将活性化合物导入脂质体分散液的脂质体内相中的其他步骤进行使用。

实施例

给出实施例及比较例，具体说明本发明，但本发明并不限于以下的实施例。

[实施例1]

<脂质体内相用水溶液的制备>

将396.4mg硫酸铵及189.1mg柠檬酸一水合物溶解在纯水中，稀释为15mL，由此制备200mM硫酸铵/60mM柠檬酸水溶液。脂质体内相用水溶液如下制备，即用氨水将2.5mL 200mM硫酸铵/60mM柠檬酸水溶液的pH调节为5.5之后，使用纯水稀释为5mL。

<脂质体准备液的制备>

将317.9mg氢化大豆卵磷脂(Lipoid公司制)、116.0mg胆固醇(Sigma公司制)及130.4mg聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺(Genzyme公司制，MPEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)溶解在10mL氯仿中，之后精确地分成3份，其中的1份使用旋转蒸发器减压蒸馏除去氯仿，制成脂质膜。向得到的脂质膜中添加加热至60℃的5mL脂质体内相用水溶液，搅拌制备脂质体准备液。超声波处理上述脂质体准备液20分钟后，使用加热至约65℃的挤压机(Lipex Biomembranes公司制)整粒，得到脂质体准备液。使用动态光散射法测定所得脂质体准备液中的脂质体的粒径，结果均为90～100nm。

<脂质体分散液的制备>

通过使用Sephadex G-50柱，用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.6)洗脱得到的脂质体准备液，将脂质体外相置换为0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液。置换脂质体外相后，以400,000×g离心30分钟。离心后再分散，使用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液调节液量为5mL，得到脂质体分散液。

<活性化合物溶液的制备>

用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林，得到1mg/mL的甲磺酸艾日布林溶液。

<脂质体组合物的制备>

在10mL的玻璃容器中，将0.5mL的脂质体分散液和0.5mL的甲磺酸艾日布林溶液混合，在55℃的水浴中孵化(incubation)3分钟，由此得到甲磺酸艾日布林被导入到脂质体内的脂质体组合物。

<包封率的测定>

包封率如下所述求出。

将包封有活性化合物的脂质体组合物以400,000×g超速离心30分钟。用HPLC测定上清液中的活性化合物浓度，由此对未包封在脂质体中的活性化合物量进行定量。通过下式计算包封率。

[式1]

甲磺酸艾日布林的包封率为90.9％。

[实施例2]

<脂质体内相用水溶液的制备>

与实施例1同样地，将264.3mg硫酸铵及126.1mg柠檬酸一水合物溶解在纯水中，使用容量瓶稀释为10mL，由此制成200mM硫酸铵/60mM柠檬酸水溶液。从中量取1mL，用氨水将pH调节为5.5之后，用纯水稀释为2mL，由此制备脂质体内相用水溶液。

<脂质体准备液的制备>

分别称量80mg脂质混合物(氢化大豆卵磷脂∶胆固醇∶聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺＝58.6∶19.2∶22.2(重量比))，添加加热至约80℃的脂质体内相用水溶液2mL，搅拌制备脂质体准备液。使用加热至约80℃的挤压机(Lipex Biomembranes公司制)将上述脂质体准备液整粒，得到脂质体准备液。

<脂质体分散液的制备>

用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.6)将得到的脂质体准备液稀释为10mL，以400,000×g离心30分钟。离心后，弃去全部上清液。使用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液将沉淀再分散，使用容量瓶将液量调节为1mL，得到脂质体分散液。

<药物溶液的制备>

使用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林(甲磺酸艾日布林)，得到5mg/mL的甲磺酸艾日布林溶液。

<脂质体组合物的制备>

在10mL的玻璃容器中，将0.96mL脂质体分散液和0.24mL甲磺酸艾日布林溶液混合，在60℃的水浴中孵化3分钟，由此得到甲磺酸艾日布林被导入到脂质体内的脂质体组合物。

<大鼠血浆中的稳定性>

将0.2mL制备的甲磺酸艾日布林包封脂质体和1.8mL大鼠血浆混合，使用液相孵化箱在37℃下振荡。制备后，立即在振荡开始6小时后、12小时后、24小时后、48小时后、72小时后进行取样，用HPLC测定甲磺酸艾日布林的脂质体内残留量。

测定结果如图1所示。由图1可知，表明即使经过120小时的长时间，甲磺酸艾日布林也稳定地保持在血浆中，可以缓释。

[实施例3]

<脂质体内相用水溶液的制备>

将264.3mg硫酸铵及126.1mg柠檬酸一水合物溶解在纯水中，制成约15mL。用氢氧化钠水溶液将pH调节为7.0后，用纯水稀释为20mL，由此制备脂质体内相用水溶液(100mM硫酸铵/30mM柠檬酸)。

<脂质体准备液的制备>

称量378mg脂质混合物(氢化大豆卵磷脂∶胆固醇∶聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺＝58.6∶19.2∶22.2(重量比))，添加加热至约80℃的上述脂质体内相用水溶液10mL，搅拌制备脂质体准备液。使用安装有50nm的聚碳酸酯膜过滤器、加热至约80℃的挤压机(Lipex Biomembranes公司制)将脂质体准备液整粒，得到粒径约80nm的脂质体准备液。

<脂质体分散液的制备>

使用Sephadex G-50柱，用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.6)洗脱所得脂质体准备液，由此将脂质体外相置换为0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液。置换脂质体外相后，以约400,000×g离心30分钟。离心后，用96mg/mL蔗糖/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.6)再分散，将液量稀释为10mL，由此得到脂质体分散液。

<药物溶液的制备>

用96mg/mL蔗糖/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.6)溶解甲磺酸艾日布林，得到5mg/mL的甲磺酸艾日布林溶液。

<脂质体组合物的制备>

在10mL的玻璃容器中，将9.6mL脂质体分散液和1.2mL甲磺酸艾日布林溶液混合，使用氢氧化钠将pH调节为9.5。在60℃的水浴中孵化3分钟，由此得到甲磺酸艾日布林被导入到脂质体内的脂质体组合物。冷却后，使用盐酸将pH调节为7.5。与实施例1同样地测定包封率，结果包封率为99％。

[实施例4]

<脂质体内相用水溶液的制备>

与实施例1同样地制备100mM硫酸铵/30mM柠檬酸水溶液(pH＝5.5)。

<脂质体准备液的制备>

分别仅称量下述表1记载的量的氢化大豆卵磷脂、胆固醇及聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺。分别溶解在3mL氯仿中，之后使用旋转蒸发器减压蒸馏除去氯仿，制成脂质膜。向得到的脂质膜中添加10mL加热至约80℃的脂质体内相用水溶液，搅拌制备脂质体准备液。使用加热至约80℃的挤压机(Lipex Biomembranes公司制)整粒，得到整粒后的脂质体准备液。使用动态光散射法测定得到的脂质体准备液中的脂质体的粒径，结果Rp.1为77nm，Rp.2为95nm，Rp.3为79nm，Rp.4为128nm。

[表1]

Rp.	氢化大豆卵磷脂	胆固醇	聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺
				1	234mg	76mg	15mg
2	234mg	76mg	15mg
				3	222mg	73mg	87mg
4	222mg	73mg	87mg

<脂质体组合物的制备>

与实施例1同样地得到脂质体分散液。另外，用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林，得到5mg/mL的甲磺酸艾日布林溶液。

在10mL的玻璃容器中，将4.8mL各脂质体分散液与0.6mL甲磺酸艾日布林溶液分别混合，在60℃的水浴中孵化3分钟，由此得到甲磺酸艾日布林被导入到脂质体内的脂质体组合物。向各个脂质体组合物中添加24.6mL的0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液，使用0.22μm的聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)过滤器过滤、灭菌，由此得到给药样品(甲磺酸艾日布林浓度：0.1mg/mL)。

与实施例1同样地测定包封率，确认了任一处方中包封率均为90％以上。

对雌性裸鼠(NU/NU，日本Charles River株式会社)皮下接种人黑色素瘤LOX细胞，11日后或12日后尾静脉内给与样品，使其为10mL/kg(换算成甲磺酸艾日布林为1.0mg/kg)。给药后经过一定时间(15分钟、30分钟、1、2、4、8、12、24、36、48小时)后利用心脏穿刺采集血液并摘除肿瘤组织(n＝3)。将血液收集到含有肝素的试管中，采集后30分钟以内，在4℃下、以1,500×g离心分离10分钟，得到血浆。摘除全部肿瘤组织，用PBS清洗，用吸水纸擦拭后，立即测定并记录组织重量。将组织装入试管中，在冰水中冷却后，在-80℃下保存至分析操作。

血浆中及肿瘤组织中的甲磺酸艾日布林使用LC/MS/MS进行测定。

PK参数使用非房室模型(non-compartment model)分析软件(WinNonlin v.5.0.1)算出。甲磺酸艾日布林的血浆PK参数及肿瘤组织PK参数的结果分别示于表2及表3。

[表2]

LOX罹癌鼠中的Rp.1～4及甲磺酸艾日布林的血浆PK参数

Ratio1＝AUC_{血浆脂质体}/AUC_{血浆甲磺酸艾日布林}

[表3]

LOX罹癌鼠中的Rp.1～4及甲磺酸艾日布林的血浆PK参数

Ratio2＝AUC_{肿瘤脂质体}/AUC_{肿瘤甲磺酸艾日布林}

由表2及表3可知，在Rp.1～4的所有脂质体组合物中，与游离的甲磺酸艾日布林相比，血浆及肿瘤组织的AUC增大，因此，甲磺酸艾日布林的肿瘤迁移量及滞留性提高。

[实施例5]

<脂质体内相用水溶液的制备>

与实施例1同样地制备100mM硫酸铵/30mM柠檬酸水溶液(pH＝5.5)。

<脂质体准备液的制备>

称量221.8mg氢化大豆卵磷脂、72.5mg胆固醇及86.9mg聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺。溶解在3mL氯仿中，之后使用旋转蒸发器减压蒸馏除去氯仿，制成脂质膜。向得到的脂质膜中添加10mL加热至约80℃的制成的脂质体内相用水溶液，搅拌制备脂质体准备液。使用加热至约80℃的挤压机(Lipex Biomembranes公司制)整粒，得到整粒的脂质体准备液。使用动态光散射法测定所得脂质体准备液中的脂质体的粒径，结果为约90nm。

<脂质体分散液的制备>

使用Sephadex G-50柱，用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.6)洗脱得到的脂质体准备液，由此将脂质体外相置换为0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液。置换脂质体外相后，以400,000×g离心分离30分钟。离心后再分散，使用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液将液量调节为10mL，得到脂质体分散液。

<药物溶液的制备>

用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林，得到1mg/mL的甲磺酸艾日布林溶液。另外，作为游离体的给药样品，用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液稀释甲磺酸艾日布林溶液，使用0.22μm的PVDF过滤器过滤灭菌，由此得到给药样品(甲磺酸艾日布林浓度：0.3mg/mL及0.4mg/mL)。

<脂质体组合物的制备>

在10mL的玻璃容器中，将1.8mL脂质体分散液和1.2mL甲磺酸艾日布林溶液分别混合，在60℃的水浴中孵化3分钟，由此得到甲磺酸艾日布林被导入在脂质体内的脂质体组合物。用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液稀释得到的脂质体组合物，使用0.22μm的PVDF过滤器过滤灭菌，由此得到给药样品(甲磺酸艾日布林浓度：0.2mg/mL)。与实施例1同样地测定包封率，确认包封率为90％以上。

在含有10％胎牛血清的MEM培养基中培养人咽部鳞状细胞癌细胞株即FaDu(购自American Type Culture Collection)，使其增殖。使用0.05％Trypsin-EDTA溶液使细胞从烧瓶分离，回收。用PBS洗涤后，将细胞悬浮在PBS中使其为5×10⁷个/mL，在冰上保持。向6周龄的裸鼠(日本Charles·River株式会社)的右腹侧部皮下注射细胞悬浮液，每1只注射0.1mL。每天观察各个小鼠，发现状态异常时进行适当记录。使用游标卡尺经时测定肿瘤的大小，基于计算式：长径×(短径的平方)÷2算出肿瘤的大小。在肿瘤的大小变为100～200mm3的时刻进行分组，使各试验组间的肿瘤的大小及小鼠体重的平均值均匀(各试验组的小鼠数为5只)，进行药物的尾静脉给药(0.2mL/20g；每7天给药1次，共3次)。

给与样品后的平均肿瘤体积的发展结果示于图2。

如图2所示，由于FaDu为对甲磺酸艾日布林敏感性低的细胞株，所以给与游离体时，即使给与作为最大耐受剂量的4mg/kg，也不能得到肿瘤缩小效果。另一方面，给予脂质体组合物时，即使给与作为最大耐受剂量以下的2mg/kg，也明确地确认到肿瘤缩小效果，表明即使对于目前为止甲磺酸艾日布林不起效的癌症种类，也能得到非常高的药理效果。

[实施例6]

<脂质体内相用水溶液的制备>

与实施例1同样地制备100mM硫酸铵/30mM柠檬酸水溶液(pH＝5.5)。

<药物溶液的制备>

与实施例5同样地实施，得到游离体的给予样品(甲磺酸艾日布林浓度：0.2mg/mL、0.3mg/mL及0.4mg/mL)。

<脂质体组合物的制备>

除使用如上所述制备的脂质体内相用水溶液之外，与实施例5同样地得到脂质体组合物(甲磺酸艾日布林浓度：0.3mg/mL)。与实施例1同样地测定包封率，确认到包封率为90％以上。

在含有10％胎牛血清的MEM培养基中培养作为人肾癌细胞株的ACHN(购自American Type Culture Collection)，使其增殖。使用0.05％Trypsin-EDTA溶液使细胞从烧瓶分离，回收。用PBS洗涤后，将细胞悬浮在PBS中使其为5×10⁷个/mL，在冰上保持。向6周龄的裸鼠(日本Charles River株式会社)的右腹侧部皮下注射细胞悬浮液，每1只注射0.1mL。每天观察各个小鼠，发现状态异常时进行适当记录。使用游标卡尺经时测定肿瘤的大小，基于计算式：长径×(短径的平方)÷2算出肿瘤的大小。在肿瘤的大小变成150～200mm3的时刻进行分组，使各试验组间的肿瘤大小及小鼠的体重的平均值均匀(各试验组的小鼠数为5只)，进行药物的尾静脉内给药(0.2mL/20g；每7天给药1次，共3次)。

给与样品后的平均肿瘤体积的发展结果示于图3。

如图3所示，由于ACHN为对甲磺酸艾日布林具有耐受性的细胞株，所以给与游离体时，在2mg/kg给药组、3mg/kg给药组及4mg/kg(最大耐受剂量)给药组的任一组中，给与样品开始45天后没有确认到与无处置组间的显著差异。另一方面，在脂质体组合物3mg/kg给药组中确认到肿瘤增殖抑制效果，开始给与样品45天后，对于无处置组及游离体给药组，显示出明显小的肿瘤体积值。如上所述，表明即使对于目前为止甲磺酸艾日布林完全得不到治疗效果的癌症种类，通过制成脂质体制剂，也可以延迟肿瘤的增殖。

[实施例7]

<脂质体内相用水溶液的制备>

制备以下表4所示的12种内相用水溶液。

<脂质体准备液的制备>

分别称量120mg脂质混合物(氢化大豆卵磷脂∶胆固醇∶聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺＝58.6∶19.2∶22.2(重量比))装入试管中，用3mL加热至80℃的各内相用水溶液进行水合。

使用加热至约80℃的挤压机对上述脂质体准备液进行整粒，得到脂质体准备液。

<脂质体分散液的制备>

使用Sephadex G-50柱，用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液洗脱得到的脂质体准备液，由此将脂质体外相置换为0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液。

置换脂质体外相后，以400,000×g离心1小时，完全除去上清液。用96mg/mL蔗糖/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.5)将沉淀物进行再悬浮，使其变为约2mL。

使用动态光散射法测定所得脂质体分散液的粒径，结果均为约80nm。

<药物溶液的制备>

用96mg/mL蔗糖/10mM组氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林，得到5mg/mL的甲磺酸艾日布林溶液。

<脂质体组合物的制备>

在10mL玻璃容器中，混合脂质体分散液和甲磺酸艾日布林溶液，使甲磺酸艾日布林为0.2mg/mL、总脂质浓度为16μmol/mL。在60℃下升温5分钟，得到甲磺酸艾日布林被导入在脂质体内的脂质体组合物。

<包封率的测定>

与实施例1同样地测定包封率。结果示于表4。由表4可知，内相中使用任一种铵盐时，甲磺酸艾日布林的包封率均提高。特别是使用硫酸铵、柠檬酸铵、磷酸铵、酒石酸铵时，包封率显著提高。

[表4]

[实施例8]

<脂质体内相用水溶液的制备>

与实施例7同样地制备100mM硫酸铵/30mM柠檬酸水溶液(pH＝7.5)的脂质体内相用水溶液。

<脂质体准备液的制备>

使用上述脂质体内相用水溶液，与实施例7同样地制备脂质体准备液。

<脂质体分散液的制备>

置换脂质体外相后，以400,000×g离心1小时，完全除去上清液。用96mg/mL/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.5)将沉淀物进行再悬浮，将脂质体外相置换为96mg/mL蔗糖/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.5)，得到脂质体分散液。使用动态光散射法测定所得脂质体分散液的粒径，结果约为80nm。

将脂质体分散液分注到7个小瓶中，向脂质体外相中分别添加已知量的硫酸铵(已使用氢氧化钠水溶液将pH调节为7.5)，使其为表5的各浓度，得到脂质体外相中存在已知浓度的硫酸铵的脂质体分散液。

<药物溶液的制备>

用96mg/mL蔗糖/10mM组氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林，得到5mg/mL甲磺酸艾日布林溶液。

<脂质体组合物的制备>

在10mL玻璃容器中，混合脂质体分散液和甲磺酸艾日布林溶液，使甲磺酸艾日布林为0.2mg/mL、总脂质浓度为16mM。在60℃下升温5分钟，得到甲磺酸艾日布林被导入在脂质体内的脂质体组合物。

<包封率的测定>

与实施例1同样地测定包封率。结果如表5所示。表明在脂质体外相中仅存在0.4mM硫酸铵，包封率显著下降，而存在10mM时，几乎没有被包封。

[表5]

[实施例9]

<脂质体内相用水溶液的制备>

<脂质体准备液的制备>

<脂质体分散液的制备>

使用Sephadex G-50柱，用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液洗脱所得的脂质体准备液，由此将脂质体外相置换为0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液。

置换脂质体外相后，以400,000×g离心1小时，完全除去上清液。用96mg/mL蔗糖/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.5)将沉淀物进行再悬浮，将脂质体外相置换为96mg/mL蔗糖/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.5)，得到脂质体分散液。用动态光散射法测定所得脂质体分散液的粒径，结果约为80nm。

之后，将脂质体分散液分注至7个小瓶中。

<药物溶液的制备>

将甲磺酸艾日布林溶解在96mg/mL蔗糖/10mM组氨酸水溶液中，得到5mg/mL的甲磺酸艾日布林溶液。

<脂质体组合物的制备>

在10mL玻璃容器中，分别混合脂质体分散液和甲磺酸艾日布林溶液，使甲磺酸艾日布林为0.2mg/mL、总脂质浓度为16mM。如表6所示，使用1M氢氧化钠水溶液分别调节脂质体外相的pH。在60℃下升温5分钟，得到甲磺酸艾日布林被导入在脂质体内的脂质体组合物。接下来，使用盐酸将外相的pH调节为7.5。

<包封率的测定>

与实施例1同样地测定包封率。结果示于表6。随着脂质体外相的pH的升高，艾日布林的包封率显著提高，实现了几乎100％的包封率。

[表6]

[实施例10]

<脂质体内相用水溶液的制备>

<脂质体准备液的制备>

<脂质体分散液的制备>

使用Sephadex G-50柱，用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液洗脱所得脂质体准备液，由此将脂质体外相置换为0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液。

将脂质体分散液分注至4个小瓶中，以400,000×g离心1小时，完全除去上清液。用96mg/mL蔗糖/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.5)将其中2个小瓶的沉淀物进行再悬浮，将脂质体外相置换为96mg/mL蔗糖/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.5)。用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.5)将剩余2个小瓶的沉淀物进行再悬浮，将脂质体外相置换为0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.5)。使用动态光散射法测定所得脂质体分散液的粒径，结果均为约80nm。

<药物溶液的制备>

用96mg/mL蔗糖/10mM组氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林，得到5mg/mL的甲磺酸艾日布林溶液。另外，同样地用0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林，得到5mg/mL甲磺酸艾日布林溶液。

<脂质体组合物的制备>

在10mL的玻璃容器中分别混合脂质体分散液和甲磺酸艾日布林溶液，使甲磺酸艾日布林为0.2mg/mL、总脂质浓度为16mM。通过添加氢氧化钠，将脂质体外相为96mg/mL蔗糖/10mM组氨酸水溶液(pH＝7.5)的2个小瓶中的1瓶的脂质体外相的pH调节为9.5。同样地通过添加氢氧化钠，将脂质体外相为0.9％氯化钠/10mM组氨酸水溶液(pH＝75)的2个小瓶中的1瓶的脂质体外相的pH调节为9.5。在60℃下升温5分钟，得到甲磺酸艾日布林被导入在脂质体内的脂质体组合物。

<包封率的测定>

与实施例1同样地测定包封率。结果示于表7。可知与脂质体外相为作为非电解质的蔗糖时相比，作为电解质的氯化钠的情况能够得到非常高的包封率。另外，除电解质的效果之外，通过应用使脂质体外相为碱性的pH梯度，实现了100％的包封率。

[表7]

本申请基于2009年3月30日申请的日本专利申请(日本特愿2009-082521号)及美国专利临时申请(61/164653)，将其内容作为参照引入本说明书中。

产业上的可利用性

本发明可以提供一种以较高包封率制备活性化合物的保持稳定性高的脂质体的方法。

本发明的脂质体组合物优选通过艾日布林或其药理学上允许的盐的药理作用，用于治疗用途。

Claims

1.一种脂质体组合物，所述脂质体组合物含有脂质体、且在脂质体内相中含有活性化合物，所述活性化合物为艾日布林或其药理学上允许的盐。

2.如权利要求1所述的脂质体组合物，其中，所述脂质体组合物为固态或液态。

3.如权利要求1或2所述的脂质体组合物，其中，在所述脂质体内相中还含有铵盐。

4.如权利要求3所述的脂质体组合物，其中，所述铵盐的浓度为10mM以上。

5.如权利要求1～4中任一项所述的脂质体组合物，其中，在脂质体内相中还含有盐、酸、碱及/或氨基酸。

6.如权利要求5所述的脂质体组合物，其中，所述盐的浓度为1～300mM。

7.如权利要求5或6所述的脂质体组合物，其中，所述酸的浓度为1～300mM。

8.如权利要求5～7中任一项所述的脂质体组合物，其中，所述氨基酸的浓度为1～300mM。

9.如权利要求5～8中任一项所述的脂质体组合物，其中，所述碱的浓度为1～300mM。

10.如权利要求1～9中任一项所述的脂质体组合物，其中，所述活性化合物的浓度为0.01～300mg/mL。

11.如权利要求1～10中任一项所述的脂质体组合物，其中，所述活性化合物为甲磺酸艾日布林。

12.如权利要求1～11中任一项所述的脂质体组合物，其中，在脂质体内相中还含有硫酸铵、柠檬酸及活性化合物。

13.如权利要求1～12中任一项所述的脂质体组合物，其中，在脂质体外相中含有糖、电解质、及/或氨基酸。

14.如权利要求1～13中任一项所述的脂质体组合物，其中，在脂质体外相中含有糖或电解质、及氨基酸。

15.如权利要求13或14所述的脂质体组合物，其中，所述糖的浓度为2～20％。

16.如权利要求13～15中任一项所述的脂质体组合物，其中，所述氨基酸的浓度为1～300mM。

17.如权利要求1～16中任一项所述的脂质体组合物，其中，在脂质体外相中含有蔗糖或氯化钠、及组氨酸。

18.如权利要求1～17中任一项所述的脂质体组合物，其中，在所述脂质体内相中实质上不含有环糊精。

19.如权利要求1～18中任一项所述的脂质体组合物，其中，所述脂质体含有氢化卵磷脂。

20.如权利要求1～19中任一项所述的脂质体组合物，其中，所述脂质体含有胆固醇。

21.如权利要求1～20中任一项所述的脂质体组合物，其中，所述脂质体含有甲氧基聚乙二醇缩合物。

22.如权利要求21所述的脂质体组合物，其中，所述甲氧基聚乙二醇缩合物为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇缩合物。

23.如权利要求1～22中任一项所述的脂质体组合物，其中，所述脂质体含有氢化卵磷脂、胆固醇及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇缩合物。

24.如权利要求23所述的脂质体组合物，含有10～80％所述氢化卵磷脂、1～60％所述胆固醇、0～50％所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇缩合物。

25.如权利要求1～24中任一项所述的脂质体组合物，其中，所述脂质体含有氢化大豆卵磷脂、胆固醇及聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺。

26.一种制备权利要求1～25中任一项所述的脂质体组合物的方法，包括下述步骤：

供给含有脂质体的脂质体分散液的步骤；

将所述脂质体分散液和所述活性化合物混合的步骤；及

将所述活性化合物导入所述脂质体分散液的脂质体内相的步骤。

27.如权利要求26所述的方法，其中，所述脂质体分散液在脂质体外相中实质上不含有铵盐。

28.如权利要求26或27所述的方法，其中，所述脂质体分散液的脂质体外相的pH为3～10。

29.如权利要求26～28中任一项所述的方法，其中，所述脂质体分散液的脂质体外相的pH为7～10。

30.如权利要求28或29所述的方法，其中，所述pH为将所述脂质体分散液和所述活性化合物混合的步骤中的所述脂质体分散液的脂质体外相的pH。

31.如权利要求26～30中任一项所述的方法，其中，所述供给脂质体分散液的步骤包括：

置换或稀释所述脂质体准备液的脂质体外相的步骤。

32.如权利要求31所述的方法，其中，置换或稀释所述脂质体外相的步骤是使脂质体外相的pH高于脂质体内相的pH的步骤。

33.如权利要求31或32所述的方法，其中，置换或稀释所述脂质体外相的步骤是使脂质体内相的pH与脂质体外相的pH的差为1～5的步骤。

34.如权利要求26～33中任一项所述的方法，其中，所述脂质体内相的pH为3～9。

35.如权利要求26～34中任一项所述的方法，其中，所述脂质体内相的pH为4～9。

36.如权利要求26～35中任一项所述的方法，其中，所述脂质体内相的pH为5～8。

37.如权利要求26～36中任一项所述的方法，其中，在导入所述活性化合物的步骤中，脂质体外相为含有电解质的溶液。

38.如权利要求26～37中任一项所述的方法，其中，所述脂质体分散液在脂质体内相中实质上不含有环糊精。

39.如权利要求26～38中任一项所述的方法，其中，还包括使脂质体外相的pH为中性的步骤。