JP6341987B2 - がん治療のためのリポソームオキサリプラチン組成物 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国仮出願第６１／７８０，０００号の優先権の利益を請求し、その内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

連邦政府による支援を受けた研究開発下でなされた発明に対する権利に関する陳述
適用されず

「配列表」、表、またはコンパクトディスクで提出されたコンピュータプログラム一覧の添付書類に対する言及
適用されず

白金ベースの薬物（または「プラチン」）は効果的な抗がん薬物であり、がん細胞におけるＤＮＡおよびＲＮＡ合成を遮断するＤＮＡ付加物を形成し、アポトーシスを誘導する。シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンは、卵巣がん、肺がん、結腸直腸がん、精巣がん、膀胱がん、胃がん、メラノーマ、および頭頸部がんを含めた、多数の固形腫瘍を処置するために用いられる主要なプラチンである。しかしながら、プラチンの主な欠点は毒性である。一般的な副作用は、腎臓および神経の損傷、ハイエンドの（ｈｉｇｈ−ｅｎｄ）聴力喪失、長期間の吐き気、および嘔吐を含む。シスプラチンは、特に、血中半減期が非常に短く、この結果、腎臓による薬物の排泄のため急性腎毒性がもたらされる。

オキサリプラチンは、１，２−ジアミノシクロヘキサン（ＤＡＣＨ）担体リガンドを持つ白金ベースの化学療法剤である。オキサリプラチンは、シスプラチンのアミン基がジアミノシクロヘキサン（ＤＡＣＨ）によって置き換えられ、２つのクロライドが二座シュウ酸部分によって置き換えられている点でシスプラチンとは異なる。オキサリプラチンの分子量は３９７．３ｇ／モルである。オキサリプラチン（Ｉ）およびシスプラチン（ＩＩ）の化学構造を以下に示す。

オキサリプラチンは、多くの腫瘍細胞系に対してイン・ビトロおよびイン・ビボ有効性を示してきた。オキサリプラチンの作用メカニズムは完全には解明されていないが、オキサリプラチンの生体内変換から得られる水誘導体はＤＮＡと相互作用して、鎖間および鎖内の両方の架橋を形成し、その結果、ＤＮＡ合成が破壊され、細胞毒性効果および抗腫瘍効果をもたらすことが示されている（Ｒａｙｍｏｎｄら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、９：１０５３−１０７１、１９９８）。活性化されたオキサリプラチンによる嵩高いＤＡＣＨ環の保持の結果、白金−ＤＮＡ付加物が形成されると考えられており、これは、ＤＮＡの複製の遮断により効果的であるようであり、シスプラチンから形成された付加物よりもより細胞毒性である。オキサリプラチンは、シスプラチンまたはカルボプラチンのいずれかによる最初の処置に対して耐性を呈したがんに対する処置に特に重要である（ＢｏｕｌｉｋａｓおよびＶｏｕｇｉｏｕｋａ、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ、１０：１６６３−１６８２、２００３）。シスプラチンとは対照的に、腎毒性は観察されておらず、その投与の間に水和は必要とされない。腎尿細管壊死は稀にしか観察されていない。研究は、また、多数の他の化合物との相加および／または相乗活性を明らかにし、イン・ビトロおよびイン・ビボの両方におけるフルオロウラシルとの組合せにおけるなどの、併用療法でのオキサリプラチンの使用の可能性を示唆する（Ｉｂｒａｈｉｍ，Ａ．ら、Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、９：８−１２、２００４）。

シスプラチンとは異なり、血漿中のオキサリプラチンは、その薬物動態プロフィールを複雑にするプロセスであるシュウ酸基の置換えのために、反応性化合物への非酵素的変換を迅速に受ける。該化合物のほとんどは、薬理学的に不活性であるようであるが、ジクロロ（ＤＡＣＨ）白金錯体は細胞に入り、そこで、それらは細胞毒性特性を有する。オキサリプラチンは、イン・ビトロおよびイン・ビボにおける広い抗腫瘍効果およびシスプラチンよりも良好な安全性プロフィールを示しているが、主な有害反応は、神経毒性ならびに血液系および胃腸（ＧＩ）の毒性である（Ｉｂｒａｈｉｍら）。

リポソームは、プラチン用の送達ビークルとして、該薬物の毒性を低下させる試みで用いられてきた。リポソームは、外部の水相と内部の水相とを分離するリン脂質二重層を含む小胞である。リポソームは、薬物送達用の、脂質二重層における疎水性薬物および／または水性コアにおける親水性薬物の両方を保持することができる。リポソームの大きさは、典型的には、直径が５０〜２５０ｎｍの範囲であり、５０〜１５０ｎｍの直径が、ある種の適用のために特に好ましい。オキサリプラチンを含めたリポソームプラチンの使用は、かなりの難題を提示してきた。リポソームプラチンは、遊離薬物と比較して、分布、代謝、および体からの排泄の独特なパターン、ならびに様々な毒性レベルおよび独特な副作用を示す。特に、リポソームプラチンの放出速度を最適化することは、イン・ビボ半減期と放出との間、または安全性と有効性との間の難しい均衡を保つ行為である。一般に、漏洩性リポソームは、封入薬物をより利用しやすくするが、天然の薬物と同様に、毒性におけるより高い危険性を引き起こす。他方、漏洩性の低いリポソームは毒性を低下させ得るが、それらは適切な有効性のための十分な薬物放出を提供できないことがある。そのような難問は、第ＩＩ相試験において立体的に安定化されたリポソームシスプラチン（ＳＰＩ−７７）の限定されたイン・ビボ有効性に反映された（Ｆｅｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、５４：４４１−４４８、２００４）。
従って、既存のリポソームおよび非リポソームプラチン治療剤と比較して、改善された特性を備えたリポソームオキサリプラチンを開発することが望ましい。有効性と安全性とが均衡しており、かつ標的とするがん細胞に対するオキサリプラチンの生物学的利用性を改善する製剤に対する要望が存在する。本発明は、これらおよび他の要望に取り組むものである。

Ｒａｙｍｏｎｄら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、９：１０５３−１０７１、１９９８ ＢｏｕｌｉｋａｓおよびＶｏｕｇｉｏｕｋａ、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ、１０：１６６３−１６８２、２００３ Ｉｂｒａｈｉｍ，Ａ．ら、Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、９：８−１２、２００４ Ｆｅｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、５４：４４１−４４８、２００４

１つの態様において、本発明はがんの処置用の組成物を提供する。該組成物は、（ａ）５０〜７０モル％のホスファチジルコリン脂質またはホスファチジルコリン脂質の混合物、２５〜４５モル％のコレステロール、および２〜８モル％のＰＥＧ−脂質より実質的になる双性イオン性リポソーム；および（ｂ）オキサリプラチン（ｏｘａｐｌａｔｉｎ）重量に対する全脂質重量の比が約２０：１〜約６５：１であるような量の、該リポソームに封入したオキサリプラチンを含む。

第二の態様において、本発明は、がんを処置する方法を提供する。該方法は、本発明の組成物を、投与を必要とする被験体に投与することを含む。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
（ａ）約５０モル％〜約７０モル％のホスファチジルコリン脂質またはホスファチジルコリン脂質の混合物、約２５モル％〜約４５モル％のコレステロール、および約２モル％〜約８モル％のＰＥＧ−脂質より実質的になる双性イオン性リポソーム；および
（ｂ）オキサリプラチンであって、該オキサリプラチン重量に対する全脂質重量の比が約２０：１〜約６５：１であるような量の、該リポソームに封入したオキサリプラチン；
を含み、
ここで、該ホスファチジルコリン脂質またはホスファチジルコリン脂質の混合物は、１４個またはそれを超える炭素原子の脂肪酸鎖を有し、２つの該脂肪酸鎖のうちの１つ以下は不飽和である、がんの処置用の組成物。
（項目２）
オキサリプラチンが、該オキサリプラチン重量に対する全脂質重量の比が約３０：１〜約４５：１であるような量の前記リポソームに封入されている、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記ホスファチジルコリン脂質またはホスファチジルコリン脂質の混合物が、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）以外であるか、またはＨＳＰＣを含む混合物以外である、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記ホスファチジルコリン脂質またはホスファチジルコリン脂質の混合物が、１５個またはそれを超える炭素原子の脂肪酸鎖を有する、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記ホスファチジルコリン脂質が、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ステアロイルオレオイルホスファチジルコリン（ＳＯＰＣ）、およびジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）よりなる群から選択される、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記ホスファチジルコリン脂質がＰＯＰＣである、項目１に記載の組成物。
（項目７）
前記ＰＥＧ−脂質が、ジアシル−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］である、項目１に記載の組成物。
（項目８）
前記ＰＥＧ−脂質が、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００）およびジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）５０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−５０００）よりなる群から選択される項目１〜７のいずれかに記載の組成物。
（項目９）
前記双性イオン性リポソームが、約５５モル％のＰＯＰＣ、約４０モル％のコレステロール、および約５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
前記双性イオン性リポソームが、約６５モル％のＰＯＰＣ、約３０モル％のコレステロール、および約５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
前記オキサリプラチン重量に対する前記全脂質重量の比が約５０：１である、項目９または項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
前記オキサリプラチン重量に対する前記全脂質重量の比が約３０：１〜約３５：１である、項目９または項目１０に記載の組成物。
（項目１３）
前記双性イオン性リポソームが、約７５〜約１２５ｎｍの平均粒径を有する、項目１に記載の組成物。
（項目１４）
前記双性イオン性リポソームが、約９０ｎｍの平均粒径を有する、項目１に記載の組成物。
（項目１５）
前記双性イオン性リポソームが：
ａ）前記ホスファチジルコリン脂質、前記コレステロール、前記ＰＥＧ−脂質、およびＣ _１−４ アルカノールおよびＣ _１−４ アルカノール／水混合物よりなる群から選択される溶媒を含む脂質溶液を形成し；
ｂ）該脂質溶液を水性緩衝液と混合して、多層小胞（ＭＬＶ）を形成し；
ｃ）該ＭＬＶを多孔性フィルターを通して押し出して、小型単層小胞（ＳＵＶ）を形成し；
ｄ）透析濾過を行って、該リポソーム製剤から封入されていないオキサリプラチンを除去し；
それにより、該双性イオン性リポソームを形成することを含む方法によって調製される、項目１に記載の組成物。
（項目１６）
前記オキサリプラチンの封入が、該オキサリプラチンを前記ＭＬＶの形成中に前記水性緩衝液に含めることによって行われる、項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
前記方法が、さらに；
ｅ）前記双性イオン性リポソームを滅菌濾過すること
を含む、項目１５に記載の組成物。
（項目１８）
がんを処置する方法であって、項目１〜１７のいずれかに記載の組成物を、投与を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
（項目１９）
前記がんが膀胱がん、結腸直腸がん、胃がん、食道がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、および前立腺がんよりなる群から選択される固形腫瘍がんである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記組成物が：
ａ）約５５モル％のＰＯＰＣ、約４０モル％のコレステロール、および約５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）より実質的になる双性イオン性リポソーム；および
ｂ）オキサリプラチンであって、該オキサリプラチン重量に対する全脂質重量の比が約５０：１であるような量の、該リポソームに封入したオキサリプラチン
を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記双性イオン性リポソームが、ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、６５／３０／５リポソーム；ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、６５／３０／５リポソーム；およびＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、６５／３０／５リポソームよりなる群から選択されるリポソームである、項目１に記載の組成物。
（項目２２）
前記双性イオン性リポソームが、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、５０／４５／５リポソーム；ＰＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、５０／４５／５リポソーム；ＤｉＣ２０ＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、５０／４５／５リポソーム；ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、５０／４５／５リポソーム；ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、５０／４５／５リポソーム；ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、５０／４５／５リポソーム；およびＳＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、５０／４５／５リポソームよりなる群から選択されるリポソームである、項目１に記載の組成物。
（項目２３）
前記双性イオン性リポソームが、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、７０／２５／５リポソーム；ＰＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、７０／２５／５リポソーム；ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、７０／２５／５リポソーム；ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、７０／２５／５リポソーム；およびＳＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、７０／２５／５リポソームよりなる群から選択されるリポソームである、項目１に記載の組成物。
（項目２４）
前記双性イオン性リポソームが、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、６０／３５／５リポソーム；ＰＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、６０／３５／５リポソーム；ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、６０／３５／５リポソーム；ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、６０／３５／５リポソーム；ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、６０／３５／５リポソーム；ＤｉＣ２０ＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、６０／３５／５リポソーム；およびＳＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、６０／３５／５リポソームリポソームよりなる群から選択されるリポソームである、項目１に記載の組成物。
（項目２５）
前記双性イオン性リポソームが、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（５０００）、６５／３０／５リポソームである、項目１に記載の組成物。

図１は、様々な脂質含有量を持つリポソームからのオキサリプラチンのイン・ビトロ放出を示す。

図２は、ｐＨ＝７．４およびｐＨ＝５における、ジステアロイルホスファチジルコリン（Ａ）またはパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（Ｂ，Ｃ）を含有するリポソームからのシスプラチンのイン・ビトロ放出を示す。

図３は、ｐＨ＝７．４およびｐＨ＝５における、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリンを含有するリポソームからのオキサリプラチンのイン・ビトロ放出を示す。

図４は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４および５）およびＦＢＳ中での、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソームからのオキサリプラチンの放出速度を示す。

図５は、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソーム中のモル％コレステロールに対する％オキサリプラチン放出の相関を示す。

図６は、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソーム中のモル％コレステロールに対するＩＣ_５０の相関を示す。

図７は、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソームにおけるオキサリプラチン放出速度に対するＩＣ_５０の相関を示す。

図８は、４０ｍｇ／ｋｇおよび６０ｍｇ／ｋｇのリポソームオキサリプラチン（リポソームオキサリプラチン５ａ）、１５ｍｇ／ｋｇの遊離オキサリプラチン（ＭＴＤ）、または生理食塩水（対照）の単回の静脈内投与後に測定された平均ＫＢ腫瘍体積を示す。テストされた両方の用量におけるリポソームオキサリプラチン５ａは、投与後２７日目のオキサリプラチン（＃、Ｐ＜０．０５）および投与後３１日目の対照（＊、Ｐ＜０．０５）と比較して、腫瘍成長を有意に阻害した。一元配置ＡＮＯＶＡと、その後のニューマン＝コイルス（Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）事後検定。値は５〜１０匹のマウス／群についての平均値±ＳＥＭである。

図９は、リポソームオキサリプラチン５ａ（ＰＯＰＣ ６５：３０：５）、オキサリプラチン、または生理食塩水で処置された、ＫＢ異種移植片腫瘍を持つヌードマウスのカプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）生存プロットを示す。

図１０は、ＨＴ２９ヒト結腸直腸異種移植片を持つマウスにおける、エロキサチンと比較したリポソームオキサリプラチン５ａの抗腫瘍効果を示す。平均腫瘍体積を、２２ｍｇ／ｋｇ／投薬のリポソームオキサリプラチン５ａ、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬の遊離オキサリプラチン（ＭＴＤ）または生理食塩水（対照）の週１回の３回の（ｔｈｒｅｅ ｗｅｅｋｌｙ）静脈内投与後に測定した。値は５〜１０匹のマウス／群についての平均値±ＳＥＭである。

図１１は、２２ｍｇ／ｋｇ／投薬のリポソームオキサリプラチン５ａ、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬の遊離オキサリプラチン（ＭＴＤ）、または生理食塩水（対照）の週１回の３回の静脈内投与後における、ＨＴ２９結腸直腸異種移植片腫瘍を持つ無胸腺ヌードマウスの体重の変化を示す。値は、５〜１０匹のマウス／群についての平均値±ＳＥＭである。

図１２は、２２ｍｇ／ｋｇ／投薬のリポソームオキサリプラチン５ａ、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬の遊離オキサリプラチン（ＭＴＤ）または生理食塩水（対照）の週１回の３回の静脈内投与で処置した、ＨＴ２９結腸直腸異種移植片を持つ無胸腺ヌードマウスのパーセント生存を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。リポソームオキサリプラチン５ａは、エロキサチンおよび生理食塩水と比較して有意に生存を増加させた。ｐ＜０．０５、マンテル−コックス（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）、ｌｏｇ−ランク検定。各群は、腫瘍を持つ１０匹の雌マウスで開始した。

図１３は、ＨＴ２９ヒト結腸直腸異種移植片を持つマウスにおける、エロキサチンと比較した、リポソームオキサリプラチン５ａの抗腫瘍効果、研究ＩＩを示す。平均腫瘍体積を、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬、２５ｍｇ／ｋｇ／投薬、３５ｍｇ／ｋｇ／投薬のリポソームオキサリプラチン５ａ、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬の遊離オキサリプラチン（ＭＴＤ）または生理食塩水（対照）の週１回の３回の静脈内投与で測定した。リポソームオキサリプラチン５ａ処置は、最初の投与後３０日のエロキサチンまたは生理食塩水処置と比較して、有意に腫瘍成長を阻害した。ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定。値は、５〜１０匹のマウス／群についての平均値±ＳＥＭである。

図１４は、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬、２５ｍｇ／ｋｇ／投薬、３５ｍｇ／ｋｇ／投薬のリポソームオキサリプラチン５ａ、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬の遊離オキサリプラチン（ＭＴＤ）または生理食塩水（対照）の週１回の３回の静脈内投与での、ＨＴ２９結腸直腸異種移植片腫瘍を持つ無胸腺ヌードマウスの体重の変化を示す。値は、５〜１０匹のマウス／群についての平均値±ＳＥＭである。

図１５は、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬、２５ｍｇ／ｋｇ／投薬、３５ｍｇ／ｋｇ／投薬のリポソームオキサリプラチン５ａ、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬の遊離オキサリプラチン（ＭＴＤ）または生理食塩水（対照）の週１回の３回の静脈内投与で処置した、ＨＴ２９結腸直腸異種移植片腫瘍を持つ無胸腺ヌードマウスのパーセント生存を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。各群は、腫瘍を持つ１０匹の雌マウスで開始した。

図１６は、エロキサチンおよびリポソームオキサリプラチン５ａを無胸腺ヌードマウスに投与した後における、経時的な腫瘍中白金レベルを示す。全ての投薬は、オキサリプラチンのモル等量として与える。データは、３匹のマウスの平均値±標準誤差として表す。

図１７は、エロキサチンおよびリポソームオキサリプラチン５ａを無胸腺ヌードマウスに投与した後における、経時的な血漿中白金レベルを示す。全ての投薬は、オキサリプラチンのモル等量として与える。データは、３匹のマウスの平均値±標準誤差として表す。

図１８は、ＢｘＰＣ−３ヒト膵臓異種移植片を持つマウスにおける、エロキサチンと比較した、リポソームオキサリプラチン５ａの抗腫瘍効果を示す。平均腫瘍体積を、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬、２５ｍｇ／ｋｇ／投薬、３５ｍｇ／ｋｇ／投薬のリポソームオキサリプラチン５ａ、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬の遊離オキサリプラチン（ＭＴＤ）、または生理食塩水（対照）の週１回の３回の静脈内投与で測定した。値は、５〜１０匹のマウス／群についての平均値±ＳＥＭである。

図１９は、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬、２５ｍｇ／ｋｇ／投薬、３５ｍｇ／ｋｇ／投薬のリポソームオキサリプラチン５ａ、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬の遊離オキサリプラチン（ＭＴＤ）または生理食塩水（対照）の週１回の３回の静脈内投与での、ＢｘＰＣ−３膵臓異種移植片腫瘍を持つ無胸腺ヌードマウスの体重の変化を示す。値は、５〜１０匹のマウス／群についての平均値±ＳＥＭである。

図２０は、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬、２５ｍｇ／ｋｇ／投薬、３５ｍｇ／ｋｇ／投薬のリポソームオキサリプラチン５ａ、１５ｍｇ／ｋｇ／投薬の遊離オキサリプラチン（ＭＴＤ）または生理食塩水（対照）の週１回の３回の静脈内投与で処置した、ＢｘＰＣ−３膵臓異種移植片腫瘍を持つ無胸腺ヌードマウスのパーセント生存を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。各群は、腫瘍を持つ１０匹の雌マウスで開始した。

Ｉ．概要
本発明は、がん療法のためのリポソームオキサリプラチン組成物に関する。本明細書に記載されるリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合脂質、および封入したオキサリプラチンより実質的になる。開示された組成物は、典型的には、約２０℃よりも低いゲル−流体間相転移温度を有し、酸性媒体中で驚くほど迅速であるｐＨ依存的なオキサリプラチン放出を示す。該組成物を調製する方法、および該組成物でのがんの処置方法もまた記載される。該組成物は、がん細胞において細胞内オキサリプラチン生物学的利用性を増強し、がん処置のための全体的な安全性を改善するために特に有用である。該組成物は、がんを予防し、制御し、多数の利点を患者および臨床家に提供するために広く適用可能である。

ＩＩ．定義
本明細書中で用いる場合、用語「リポソーム」は、脂質二重層によって包まれたあらゆる区画を含む。用語リポソームは、単一の脂質二重層よりなり、一般に、約２０〜約４００ｎｍの範囲の直径を有する単層小胞を含む。リポソームは多層であってもよく、これは、一般に、１〜１０μｍの範囲の直径を有する。いくつかの実施態様において、リポソームは、多層小胞（ＭＬＶ；大きさが約１μｍ〜約１０μｍ）、大型単層小胞（ＬＵＶ；大きさが数百ナノメートル〜約１０μｍ）、および小型単層小胞（ＳＵＶ；大きさが約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ）を含むことができる。

本明細書中で用いる場合、用語「双性イオン性リポソーム」とは、同じ脂質分子中に正電荷を持つ官能基と負電荷を持つ官能基の両方を持つ脂質を含有するリポソームをいう。双性イオン性リポソームの全体的な表面電荷は、外部媒体のｐＨに応じて変化する。一般に、双性イオン性リポソームの全体的な表面電荷は、生理学的ｐＨ（すなわち、ｐＨ約７．４）において中性または負である。

本明細書中で用いる場合、用語「リポソームの大きさ」および「平均粒径」とは、リポソームの外径をいう。平均粒径は、動的光散乱（ＤＬＳ）、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）、および電子顕微鏡観察を含めた多数の技術によって決定することができる。

本明細書中で用いる場合、用語「モルパーセント（ｍｏｌａｒ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）」および「モル％」とは、リポソームの所定の脂質成分のモル数を全ての脂質成分の合計モル数で割ったものをいう。明示的に述べない限り、リポソームの脂質成分についてモル％を計算する場合に、活性剤、希釈剤または他の成分の量は含まれない。

本明細書中で用いる場合、用語「ホスファチジルコリン脂質」とは、コリン頭部基（すなわち、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）を有するジアシルグリセリドリン脂質をいう。ホスファチジルコリン脂質中のアシル基は、一般に、６〜２４個の炭素原子を有する脂肪酸に由来する。ホスファチジルコリン脂質は、合成および天然由来の１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含むことができる。

本明細書中で用いる場合、用語「コレステロール」とは、２，１５−ジメチル−１４−（１，５−ジメチルヘキシル）テトラシクロ［８．７．０．０^２，７．０^{１１，１５}］ヘプタコス−７−エン−５−オール（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ登録番号５７−８８−５）をいう。

本明細書中で用いる場合、用語「ＰＥＧ−脂質」とは、疎水性または両親媒性脂質部分に共有結合したポリ（エチレングリコール）ポリマーをいう。脂質部分は、脂肪、ワックス、ステロイド、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、リン脂質、およびスフィンゴ脂質を含むことができる。好ましいＰＥＧ−脂質はジアシル−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］およびＮ−アシル−スフィンゴシン−１−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）］｝を含む。ＰＥＧ−脂質中のＰＥＧの分子量は、一般に、約５００〜約５０００ダルトン（Ｄａ；ｇ／モル）である。ＰＥＧ−脂質中のＰＥＧは、線状または分岐状構造を有することができる。

本明細書中で用いる場合、用語「オキサリプラチン」とは、［（１Ｒ，２Ｒ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン］（エタンジオアト−Ｏ，Ｏ’）白金（ＩＩ）（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ登録番号６３１２１−００−６）をいう。

本明細書中で用いる場合、用語「組成物」とは、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組合せから直接的にまたは間接的に得られるあらゆる生成物をいう。本発明の医薬組成物は、一般に、本明細書に記載されたリポソームオキサリプラチン、および薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤を含有する。「薬学的に許容され得る」とは、担体、希釈剤または賦形剤が製剤の他の成分と適合しなければならず、かつその受容者に対して有害であってはならないことを意味する。

本明細書中で用いる場合、用語「アルカノール」とは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有するＣ_１−４アルカンをいう。アルカノールは、限定されるものではないが、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびｔ−ブタノールを含む。

本明細書中で用いる場合、用語「多孔性フィルター」とは、規定された直径（例えば、３０〜１０００ｎｍ）を持つ孔を含有するポリマー膜または無機膜をいう。多孔性フィルターは、限定されるものではないが、ポリカーボネートおよびポリエステルを含むポリマー、ならびに限定されるものではないが、多孔性アルミナを含む無機基材で作製することができる。

本明細書中で用いる場合、用語「滅菌濾過」とは、微生物および／またはウイルスを濾液から排除する能力を持つフィルターに組成物を通すことによる組成物の滅菌をいう。一般に、滅菌に用いるフィルターは、フィルターを通ってリポソームが濾液へと通過することを可能とするのに十分大きいが、細菌または真菌などの生物の通過を阻止するのに十分小さな孔を含有する。

本明細書中で用いる場合、用語「がん」とは、ヒトのがんおよび癌、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病、および固形がんおよびリンパ性がんを含めた状態をいう。様々なタイプのがんの例としては、限定されるものではないが、肺がん（例えば、非小細胞肺がんまたはＮＳＣＬＣ）、卵巣がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肝臓がん（すなわち、肝癌）、腎臓がん（すなわち、腎臓細胞癌）、膀胱がん、乳がん、甲状腺がん、胸膜がん、膵臓がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、肛門がん、膵臓がん、胆管がん、胃腸カルチノイド腫瘍、食道がん、胆嚢がん、虫垂がん、小腸がん、胃（胃の）がん、中枢神経系のがん、皮膚がん、絨毛癌、頭頸部がん、血液がん、骨原生肉腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、膠腫、メラノーマ、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、単球性白血病、骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、および多発性骨髄腫が挙げられる。

本明細書中で用いる場合、用語「処置する」、「処置すること」および「処置」とは、症状の緩和；軽快；縮小、またはがんまたはがん症状を患者にとってより許容できるものとする；または、ある状況においては、がんの発症を予防するようなあらゆる客観的または主観的パラメータを含めた、がんまたはがんの症状の処置または軽減における成功のあらゆる兆候をいう。症状の処置または軽減は、例えば、理学的検査または臨床検査の結果を含めた、あらゆる客観的または主観的パラメータに基づくことができる。

本明細書中で用いる場合、用語「投与する」、「投与された」、または「投与すること」とは、本発明のリポソーム組成物を投与する方法をいう。本発明のリポソーム組成物は、非経口、静脈内、皮内、筋肉内、または腹腔内を含めた、種々の方法で投与することができる。リポソーム組成物は、組成物または製剤の一部として投与することもできる。

本明細書中で用いる場合、用語「被験体」とは、一生のいずれかの段階におけるいずれかの哺乳動物、特にヒトをいう。

本明細書中で用いる場合、用語「約」は、特定の値を修飾するのに用いられる場合、その数値の前後の近い範囲を示す。「Ｘ」が値である場合、例えば、「約Ｘ」は、０．９Ｘ〜１．１Ｘの値、より好ましくは、０．９５Ｘ〜１．０５Ｘの値を示す。「約Ｘ」へのあらゆる言及は、少なくとも値Ｘ、０．９Ｘ、０．９１Ｘ、０．９２Ｘ、０．９３Ｘ、０．９４Ｘ、０．９５Ｘ、０．９６Ｘ、０．９７Ｘ、０．９８Ｘ、０．９９Ｘ、１．０１Ｘ、１．０２Ｘ、１．０３Ｘ、１．０４Ｘ、１．０５Ｘ、１．０６Ｘ、１．０７Ｘ、１．０８Ｘ、１．０９Ｘ、および１．１Ｘを具体的に示す。

ＩＩＩ．本発明の実施態様
リポソーム
１つの実施態様において、本発明は、がんの処置用の組成物を提供する。該組成物は、（ａ）約５０モル％〜約７０モル％のホスファチジルコリン脂質またはホスファチジルコリン脂質の混合物、約２５モル％〜約４５モル％のコレステロールおよび約２モル％〜約８モル％のＰＥＧ−脂質より実質的になる双性イオン性リポソーム；および（ｂ）オキサリプラチン重量に対する全脂質重量の比が約２０：１〜約６５：１であるような量の、リポソームに封入したオキサリプラチンを含む。いくつかの実施態様において、ホスファチジルコリン脂質またはホスファチジルコリン脂質の混合物は、１４個またはそれを超える炭素原子の脂肪酸鎖を有し、２つの脂肪酸鎖のうちの１つ以下は不飽和である。

本発明のリポソームは、あらゆる適切なホスファチジルコリン脂質（ＰＣ）またはＰＣの混合物を含有することができる。適切なホスファチジルコリン脂質は、飽和ＰＣおよび不飽和ＰＣを含む。

飽和ＰＣの例としては、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ジステアロイルホスファチジルコリン；ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ジパルミトイルホスファチジルコリン；ＤＰＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＳＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＰＰＣ）、および１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＰＣ）が挙げられる。

不飽和ＰＣの例としては、限定されるものではないが、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＯＰＣ）、１−ステアロイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−オレオイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＭＰＣ）、１−オレオイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＰＰＣ）、および１−オレオイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＳＰＣ）が挙げられる。

卵ＰＣ、心臓抽出物、脳抽出物、肝臓抽出物、大豆ＰＣ、および水素添加大豆ＰＣ（ＨＳＰＣ）などの脂質抽出物もまた本発明で有用である。いくつかの実施態様において、リポソーム中のホスファチジルコリン脂質またはホスファチジルコリン脂質の混合物は、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）以外、またはＨＳＰＣを含む混合物以外である。

いくつかの実施態様において、ホスファチジルコリン脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＳＰＣ、ＳＯＰＣ、およびＤＰＰＣから選択される。いくつかの実施態様において、ホスファチジルコリン脂質はＰＯＰＣである。

一般に、本発明の組成物は、５０〜７０モル％のホスファチジルコリン脂質またはホスファチジルコリン脂質の混合物を含有するリポソームを含む。リポソームは、例えば、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０モル％のホスファチジルコリンを含有することができる。いくつかの実施態様において、リポソームは５０〜５５モル％のホスファチジルコリンを含有する。いくつかの実施態様において、リポソームは５５〜７０モル％のホスファチジルコリンを含有する。いくつかの実施態様において、リポソームは６５モル％のホスファチジルコリンを含有する。いくつかの実施態様において、リポソームは６０モル％のホスファチジルコリンを含有する。いくつかの実施態様において、リポソームは５５モル％のホスファチジルコリンを含有する。

本発明の組成物におけるリポソームは、２５〜４５モル％のコレステロール（すなわち、２，１５−ジメチル−１４−（１，５−ジメチルヘキシル）テトラシクロ［８．７．０．０^２，７．０^{１１，１５}］ヘプタコス−７−エン−５−オール）も含有する。リポソームは、例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５モル％のコレステロールを含有することができる。いくつかの実施態様において、リポソームは２５〜４０モル％のコレステロールを含有する。いくつかの実施態様において、リポソームは４０〜４５モル％のコレステロールを含有する。いくつかの実施態様において、リポソームは３０モル％のコレステロールを含有する。いくつかの実施態様において、リポソームは３５モル％のコレステロールを含有する。いくつかの実施態様において、リポソームは４０モル％のコレステロールを含有する。

本発明のリポソームは、任意の適切なポリ（エチレングリコール）−脂質誘導体（ＰＥＧ−脂質）を含むことができる。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ−脂質はジアシル−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］である。ＰＥＧ−脂質中のポリ（エチレングリコール）の分子量は、一般に、約５００Ｄａ〜約５０００Ｄａの範囲である。ポリ（エチレングリコール）は、例えば、７５０Ｄａ、１０００Ｄａ、２０００Ｄａ、または５０００Ｄａの分子量を有することができる。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ−脂質はジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００）およびジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−５０００）から選択される。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ−脂質はＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００である。

一般に、本発明の組成物は、２〜８モル％のＰＥＧ−脂質を含有するリポソームを含む。リポソームは、例えば、２、３、４、５、６、７または８モル％のＰＥＧ−脂質を含有することができる。いくつかの実施態様において、リポソームは４〜６モル％のＰＥＧ−脂質を含有する。いくつかの実施態様において、リポソームは５モル％のＰＥＧ−脂質を含有する。

いくつかの実施態様において、双性イオン性リポソームは、約５５モル％のＰＯＰＣ、約４０モル％のコレステロール、および約５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）を含む。いくつかの実施態様において、双性イオン性リポソームは、約６０モル％のＰＯＰＣ、約３５モル％のコレステロールおよび約５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）を含む。いくつかの実施態様において、双性イオン性リポソームは、約６５モル％のＰＯＰＣ、約３０モル％のコレステロール、および約５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）を含む。

一般に、本発明の組成物は、治療上有効用量のオキサリプラチンを好都合な投与体積で被験体に送達できるような量のリポソームに封入したオキサリプラチンを含有する。所定の製剤のオキサリプラチン含有量は、絶対濃度（例えば、ｍｇ／ｍＬ）として、またはリポソーム中の脂質に対する相対的な量として表すことができる。一般に、オキサリプラチン（ｏｘａｐｌａｔｉｎ）重量に対する全脂質重量の比は、約２０：１〜約６５：１である。脂質：オキサリプラチン比は、例えば、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、または６５：１であり得る。いくつかの実施態様において、オキサリプラチンは、オキサリプラチン重量に対する全脂質重量の比が約３０：１〜約４５：１であるような量で、前記リポソームに封入されている。いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、オキサリプラチン（ｏｘａｐｌａｔｉｎ）の重量に対する全脂質重量の比が約５０：１であるような量の、リポソームに封入したオキサリプラチンを含有するリポソームを含む。いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、オキサリプラチン（ｏｘａｐｌａｔｉｎ）重量に対する全脂質重量の比が約３０：１〜約３５：１であるような量の、リポソームに封入したオキサリプラチンを含有するリポソームを含む。

リポソームの大きさは、当業者に知られた多数の方法によって決定することができる。リポソームの大きさは、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）、分析超遠心、または電子顕微鏡観察によって決定することができる。リポソームの大きさは、リポソームの直径、リポソームの体積、光散乱強度、または他の特徴に関して報告することができる。いくつかの実施態様において、リポソームの平均粒径は、リポソームの体積平均値に対応する。いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、約７５〜約１２５ｎｍ（直径）の平均粒径を有する双性イオン性リポソームを含む。例えば、リポソームは、７５、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、または１２５ｎｍの直径を有することができる。いくつかの実施態様において、リポソームは、８０〜１２０ｎｍの平均粒径を有する。いくつかの実施態様において、リポソームは９０〜１２０ｎｍの平均粒径を有する。いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、９０ｎｍの平均粒径を有するリポソームを含有する。

リポソームオキサリプラチンを調製する方法
リポソームは、当業者に知られた多数の技術を用いて調製し、オキサリプラチンを負荷することができる。脂質小胞は、例えば、（適切な容器中の脂質と有機溶媒との混合物の蒸発によって調製された）乾燥した脂質フィルムを水または水性緩衝液で水和することによって調製することができる。脂質フィルムの水和は、典型的には、多層小胞（ＭＬＶ）の懸濁液をもたらす。別法として、ＭＬＶは、Ｃ_１−４アルカノールなどの適切な溶媒中の脂質の溶液を水または水性緩衝液で希釈することによって形成することができる。単層小胞は、超音波処理、または規定された細孔径を持つ膜を通す押出しによってＭＬＶから形成することができる。オキサリプラチンの封入は、薬物を、ＭＬＶ形成中にフィルム水和または脂質希釈に用いられる水溶液に含めることによって行うことができる。

従って、本発明のいくつかの実施態様は、上記の双性イオン性リポソームを含有する組成物を提供し、ここで、リポソームは：ａ）ホスファチジルコリン脂質、コレステロール、ＰＥＧ−脂質、およびＣ_１−４アルカノールおよびＣ_１−４アルカノール／水混合物から選択される溶媒を含有する脂質溶液を形成し；ｂ）該脂質溶液を水性緩衝液と混合して、多層小胞（ＭＬＶ）を形成し；ｃ）該ＭＬＶを多孔性フィルターを通して押し出して、小型単層小胞（ＳＵＶ）を形成することを含む方法によって調製される。いくつかの実施態様において、オキサリプラチンの封入は、ＭＬＶの形成中にオキサリプラチンを水性緩衝液に含めることによって行われる。別法として、オキサリプラチンの封入は、低量のコレステロール〜実質的に０の量のコレステロールがある場合、押出してＳＵＶを形成した後に、行うことができる。いくつかの実施態様において、リポソームの調製は、さらに、双性イオン性リポソームを滅菌濾過することを含む。

製剤および投与
いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、上記のリポソームおよび生理学的に（すなわち、薬学的に）許容され得る担体を含むことができる。用語「担体」とは、リポソームオキサリプラチン用の希釈剤またはビークルとして用いられる典型的には不活性な物質をいう。該用語は、粘着性の性質を組成物に付与する典型的には不活性な物質も含む。典型的には、生理学的に許容され得る担体は、液体形態で存在する。液体担体の例としては、生理食塩水、リン酸緩衝液、規定濃度の緩衝化食塩水（１３５〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、水、緩衝化水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、安定性の増強を提供するための糖タンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等）等が挙げられる。いくつかの実施態様において、担体は、限定されるものではないが、スクロース、デキストロース、ラクトース、アミロース、または澱粉などの炭水化物を含む。生理学的に許容され得る担体は、部分的には、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するのに用いられる特定の方法によって決定されるので、本発明の医薬組成物の多種多様な適切な製剤がある（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版、１９８９参照）。

本発明の組成物は、慣用的なよく知られた滅菌技術によって滅菌してよく、または滅菌条件下で生産してよい。水溶液は、使用のために無菌条件下で包装することができるか、または無菌条件下で濾過して凍結乾燥することができ、凍結乾燥した調製物は、投与に先立って滅菌水溶液と合わせられる。該組成物は、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張性調整剤、湿潤剤等などの、生理学的条件に近似するのに必要な薬学的に許容され得る補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウムを含有することができる。凍結乾燥したリポソーム組成物のための安定化剤など、組成物を安定化させるために糖を含めることもできる。

例えば、関節内、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内、および皮下経路によるなどの、非経口投与に適した製剤は、水性および非水性の等張滅菌注射溶液を含む。注射溶液は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図した受容者の血液と等張にする溶質、および懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含むことができる水性および非水性滅菌懸濁液を含有することができる。注射溶液および懸濁液は、凍結乾燥したリポソームなどの滅菌粉末から調製することもできる。本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈内注入によって、腹腔内、膀胱内、または髄腔内投与することができる。非経口投与および静脈内投与が投与の好ましい方法である。リポソーム組成物の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの、単位用量（ｕｎｉｔ−ｄｏｓｅ）または複数回用量の密閉された容器中で与えることができる。

医薬調製物は、好ましくは、単位投与形態で存在する。そのような形態において、調製物は、適切な量の活性成分、例えば、リポソーム組成物を含有する単位用量にさらに分割される。単位投与形態は、包装された調製物であってよく、該包装は個別の量の調製物を含有する。組成物は、所望であれば、他の適合する治療剤を含有することもできる。

がんを処置する方法
別の態様において、本発明は、がんを処置する方法を提供する。該方法は、上記のリポソームオキサリプラチンを含有する組成物を、投与を必要とする被験体に投与することを含む。いくつかの実施態様において、該方法は、（ａ）約５０モル％〜約７０モル％のホスファチジルコリン脂質またはホスファチジルコリン脂質の混合物、約２５モル％〜約４５モル％のコレステロール、および約２モル％〜約８モル％のＰＥＧ−脂質より実質的になる双性イオン性リポソーム；および（ｂ）オキサリプラチン（ｏｘａｐｌａｔｉｎ）重量に対する全脂質重量の比が約２０：１〜約６５：１であるような量の、リポソームに封入したオキサリプラチンを含有する組成物を投与することを含む。いくつかの実施態様において、該方法は、ａ）５５モル％のＰＯＰＣ、４０モル％のコレステロール、および５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）より実質的になる双性イオン性リポソーム；およびｂ）オキサリプラチン（ｏｘａｐｌａｔｉｎ）重量に対する全脂質重量の比が約５０：１であるような量の、リポソームに封入したオキサリプラチンを含有する組成物を投与することを含む。いくつかの実施態様において、該方法は、ａ）６５モル％のＰＯＰＣ、３０モル％のコレステロール、および５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）より実質的になる双性イオン性リポソーム；およびｂ）オキサリプラチン（ｏｘａｐｌａｔｉｎ）重量に対する全脂質重量の比が約３０：１〜約４０：１であるような量の、リポソームに封入したオキサリプラチンを含有する組成物を投与することを含む。

がんの処置のための治療的使用において、本発明のリポソーム組成物は、オキサリプラチンの初期投与量が、毎日約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの範囲であるように投与することができる。約０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ、または約１〜１００ｍｇ／ｋｇ、または約１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ、または約２ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇの日用量範囲を用いることができる。

投与量は、患者の要求、処置されるがんの重症度およびタイプ、および使用されるリポソーム組成物に応じて変化し得る。例えば、投与量は、特定の患者において診断されたがんのタイプおよびステージを考慮して経験的に決定することができる。患者に投与される用量は、経時的に患者における有益な治療的応答に影響を及ぼすのに十分なものとすべきである。用量の大きさは、特定の患者における特定のリポソーム組成物の投与に伴うあらゆる有害な副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。特定の状況のために適切な投与量の決定は、開業医の技量の範囲内のものである。一般に、処置は、リポソーム組成物の最適用量未満であるより小さな投与量で開始される。その後、投与量を状況下での最適な効果に到達するまで、小さな増分ずつ増加させる。便宜上、毎日の投与量の合計を、所望であれば、該日の間に少量ずつに分割して投与してよい。

本明細書に記載された方法は、特に、（血液学的悪性疾患と反対に）器官および組織のがん、理想的には上皮がんである固形腫瘍がん（固形腫瘍）に適用される。固形腫瘍がんの例としては、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝細胞がん、肺がん、メラノーマ、神経内分泌がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がんおよび腎臓がんが挙げられる。実施態様の１つの群において、本発明の方法による処置に適した固形腫瘍がんは、ＣＲＣ、乳がんおよび前立腺がんから選択される。実施態様の別の群において、本発明の方法は、例えば、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、および慢性骨髄性白血病を含む血液学的悪性疾患の処置に適用される。

上記方法で用いられる組成物は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて投与してよい。追加の剤は、限定されるものではないが、アバスチン、ドキソルビシン、シスプラチン、（非リポソーム形態の）オキサリプラチン、カルボプラチン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、またはパクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサンを含む抗がん剤または細胞毒性剤であり得る。追加の抗がん剤は、限定されるものではないが、２０−エピ−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３，４−イポメアノール、５−エチニルウラシル、９−ジヒドロタキソール、アビラテロン、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、全−ｔｋアンタゴニスト、アルトレタミン、アンバムスチン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミドックス、アミホスチン、アミノグルテチミド、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラフォリド、血管新生阻害剤、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリクス、アントラマイシン、抗背側化形態形成タンパク質−１（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、抗エストロゲン、抗ネオプラストン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、グリシン酸アフィジコリン、アポトーシス遺伝子調節剤、アポトーシス制御因子、アプリン酸、ＡＲＡ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザシチジン、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、アゼテパ、アゾトマイシン、バッカチンＩＩＩ誘導体、バラノール、バチマスタット、ベンゾクロリン、ベンゾデパ、ベンゾイルスタウロスポリン、ベータラクタム誘導体、ベータ−アレチン、ベタクラマイシンＢ、ベツリン酸、ＢＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、塩酸ビサントレン、ビスアジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ジメシル酸ビスナフィド、ビストラテンＡ、ビゼレシン、ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、ＢＲＣ／ＡＢＬアンタゴニスト、ブレフレート、ブレキナールナトリウム、ブロピリミン、ブドチタン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カクチノマイシン、カルシポトリオール、カルホスチンＣ、カルステロン、カンプトテシン誘導体、カナリポックスＩＬ−２、カペシタビン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルボキサミド−アミノ−トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、カレストＭ３、カルムスチン、カム７００、軟骨由来阻害剤、塩酸カルビシン、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セデフィンゴール、セトロレリクス、クロラムブシル、クロリン、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シロレマイシン、シスプラチン、シス−ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クランベスシジン８１６、クリスナトール、メシル酸クリスナトール、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体、クラシンＡ、シクロペンタントラキノン（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ）、シクロホスファミド、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダカルバジン、ダクリキシマブ、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デヒドロジデムニンＢ、デスロレリン、デキシホスファミド、デキソルマプラチン、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジコン、ジデムニンＢ、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ−５−アザシチジン、ジオキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ドロナビノール、デュアゾマイシン(ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ)、デュオカルマイシンＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エダトレキセート、エデルホシン、エドレコロマブ、エフロミチン、塩酸エフロミチン、エレメン、エルサミトルシン、エミテフール、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン、塩酸エピルビシン、エプリステリド、エルブロゾール、赤血球遺伝子療法ベクター系、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、エストラムスチン類似体、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、エキセメスタン、ファドロゾール、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルアステロン、フルダラビン、リン酸フルダラビン、塩酸フルオロダウノルニシン（ｆｌｕｏｒｏｄａｕｎｏｒｕｎｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、フルオロウラシル、フルオロシタビン、ホルフェニメクス、フォルメスタン、フォスキドン、フォストリエシン、フォストリエシンナトリウム、フォテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリクス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセタミド、ヒドロキシ尿素、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、塩酸イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イホスファミド、イルモホシン、イロマスタット、イミダゾアクリドン、イミキモド、免疫刺激ペプチド、インスリン様成長因子−１受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロンアルファ−２Ａ、インターフェロンアルファ−２Ｂ、インターフェロンアルファ−Ｎ１、インターフェロンアルファ−Ｎ３、インターフェロンベータ−ＩＡ、インターフェロンガンマ−ＩＢ、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イプロプラチン、イリノテカン、塩酸イリノテカン、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンＢ、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、ラメラリン−Ｎトリアセテート、ランレオチド、酢酸ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球アルファインターフェロン、酢酸ロイプロリド、ロイプロリド／エストロゲン／プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミゾール、リアロゾール、塩酸リアロゾール、線状ポリアミン類似体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リソクリナミド７（ｌｉｓｓｏｃｌｉｎａｍｉｄｅ ７）、ロバプラチン、ロムブリシン、ロメトレキソール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロニダミン、ロソキサントロン、塩酸ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ルルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、溶解性ペプチド、メイタンシン（ｍａｉｔａｎｓｉｎｅ）、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリリシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルバロン、メルカプトプリン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトトレキセート、メトトレキセートナトリウム、メトクロプラミド、メトプリン、メツレデパ、微細藻類プロテインキナーゼＣ阻害剤、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ、ミチンドミド、ミトカルシン（ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）、ミトクロミン（ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ）、ミトギリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ミトマルシン（ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）、マイトマイシン、マイトマイシン類似体、ミトナフィド、ミトスペル（ｍｉｔｏｓｐｅｒ）、ミトタン、マイトトキシン線維芽細胞成長因子−サポリン、ミトキサントロン、塩酸ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、モノホスホリル脂質ａ／ミオバクテリア細胞壁ＳＫ、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多発性腫瘍サプレッサー１ベースの療法、マスタード抗がん剤、ミカペルオキシドＢ、マイコバクテリア細胞壁抽出物、ミコフェノール酸、ミリアポロン、ｎ−アセチルジナリン、ナファレリン、ナグレスチップ（ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）、ナロキソン／ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、中性エンドペプチダーゼ、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素調節剤、ニトロキシド抗酸化剤、ニトルリン、ノコダゾール、ノガラマイシン、ｎ−置換ベンズアミド、０６−ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカインインデューサ、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキサウノマイシン、オキシスラン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペグアスパルガーゼ（ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）、ペルデシン、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ペントサンポリ硫酸ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、硫酸ペプロマイシン、ペルフルブロン、ペルフォスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、酢酸フェニル、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニール、塩酸ピロカルピン、ピポブロマン、ピポスルファン、ピラルビシン、ピリトレキシム、塩酸ピロキサントロン、プラセチンＡ、プラセチンＢ、プラスミノーゲンアクチベータ阻害剤、白金錯体、白金化合物、白金−トリアミン錯体、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、プロピルビス−アクリドン、プロスタグランジンＪ２、前立腺癌抗アンドロゲン、プロテアソーム阻害剤、タンパク質Ａベースの免疫調節剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、プルプリン、ピラゾフリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート、ＲＡＦアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ＲＡＳファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＲＡＳ阻害剤、ＲＡＳ−ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウムＲＥ１８６エチドロネート、リゾキシン、リボプリン、リボザイム、ＲＩＩレチナミド、ＲＮＡｉ、ログレチミド、ロヒツキン、ロムルチド、ロキニメクス（ｒｏｑｕｉｎｉｍｅｘ）、ルビギノンＢ１、ルボキシル、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、サイントピン、サルクヌ（ｓａｒｃｎｕ）、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、ＳＤＩ １ミメティックス、セムスチン、老化由来阻害剤１、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達調節剤、シムトラゼン、一本鎖抗原結合タンパク質、シゾフラン、ソブゾキサン、ボロカプテートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂｏｒｏｃａｐｔａｔｅ）、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルホサートナトリウム、スパルホス酸、スパルソマイシン、スピカマイシンＤ、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、スプレノペンチン、スポンギスタチン１、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、
スチピアミド、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン、スロフェヌル（ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ）、超活性血管作用性腸ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スワインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリソマイシン、タリムスチン、タモキシフェンメチオダイド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフール、テルラピリリウム、テロメラーゼ阻害剤、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、サリブラスチン、サリドマイド、チアミプリン、チオコラリン、チオグアニン、チオテパ、トロンボポエチン、トロンボポエチンミメティック、チマルファシン、チモポエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、チアゾフリン、スズエチルエチオプルプリン、チラパザミン、二塩化チタノセン、塩酸トポテカン、トプセンチン、トレミフェン、クエン酸トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、酢酸トレストロン、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、リン酸トリシリビン、トリメトトレキセート、グルクロン酸トリメトトレキセート、トリプトレリン、トロピセトロン、塩酸ツブロゾール、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルフォスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメクス、ウラシルマスタード、ウレデパ、尿生殖洞由来成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンＢ、ベラレソール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシネート、硫酸ビンロイロシン、ビノレルビン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、ビンキサルチン、硫酸ビンゾリジン、ビタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブ、ジノスタチン、ジノスタチンスチマラマー、または塩酸ゾルビシンを含むことができる。いくつかの実施態様においては、該方法はフルオロウラシル、ロイコボリン、およびそれらの混合物から選択される薬物の投与を含むことができる。

ＩＶ．実施例
実施例１ リポソームプラチン組成物の調製
リポソーム中へのオキサリプラチンの封入は、溶媒希釈手法によって行った。脂質混合物を１００ｍＬのガラス瓶中に秤量し、ｔ−ブタノール（ｔ−ＢｕＯＨ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、および水の溶液に溶解させ、透明になるまで７０℃で加熱した。溶液は、一般に、１：１のｔ−ＢｕＯＨ：ＥｔＯＨ（ｖ：ｖ）または４９：４９：２のｔ−ＢｕＯＨ：ＥｔＯＨ：水（ｖ：ｖ：ｖ）を含有したが、水含有量は、用いる脂質の具体的な量によって調整した。オキサリプラチンを予め加熱されたスクロース／酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、３００ｍＭスクロース、ｐＨ５．５；滅菌濾過）に７０℃で溶解させた。必要な場合、超音波処理を用いた。脂質溶液を、迅速に混合しながらオキサリプラチン溶液に加えて、多層小胞（ＭＬＶ）を形成した。調製物の例を表１にまとめる。

７０℃まで加熱したＬＩＰＥＸ^ＴＭ押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｃ．）を用いて、ＭＬＶをポリカーボネートフィルターに通した。押出しは、一般に、８００ｍＬの押出機中の３×８０ｎｍの重ねたポリカーボネートフィルターおよびドレインディスクを用いて行った。必要であれば、押し出される脂質組成物によってフィルターの数を調整した。それぞれ押出機を通過させた後に、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）粒径アナライザーを用いて、小胞の大きさおよびサイズ分布を決定した。押出しは、９０〜１２０ｎｍの体積平均径が達成された後に停止した。押出しに続き、リポソームを冷（２〜１５℃）スクロース／酢酸緩衝液で１０倍希釈した。４００ｍＬのリポソームを３６００ｍＬの冷緩衝液で希釈した。希釈は、それに続く加工の間に、あらゆる封入されていないオキサリプラチンの沈殿も防止することができる。次いで、リポソームを限外濾過によってほぼ５０ｍｇ／ｍＬ脂質の濃度まで濃縮した。

透析濾過を行って、外部緩衝液を交換してリポソームを濃縮し、封入されていないオキサリプラチンおよび残存する有機溶媒を除去した。透析濾過システムは、Ｌ／Ｓポンプヘッドおよび３６ゲージ配管を備えたＭａｓｔｅｒｆｌｅｘポンプを含むものであった。一般に、カートリッジの入口において１０ｐｓｉｇを維持することができるペリスタポンプを用いることができる。透析濾過システムは、脂質１グラム当たりほぼ５５ｃｍ^２の表面積を持つ５００ｋＤａカートリッジも含むものであった。例えば、直列の２つのＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｍ４−５００Ｓ−２６０−０１Ｎ ＰＳ ６１５ｃｍ^２カートリッジは、２０グラムの脂質を含有する調製物の濾過のための適切な表面積を提供することができる。該システムを少なくとも５００ｍＬの精製水で、次いで、少なくとも２００ｍＬの１３００ｍＭスクロース／酢酸緩衝液で徹底的にすすいだ。体積は、用いたカートリッジの大きさに基づいて調整した。濃縮されたリポソーム（５０ｍｇ／ｍＬ）を、１０容の洗浄緩衝液（１０ｍＭ酢酸塩、３００ｍＭスクロース、ｐＨ５．５）に対して透析濾過した。限外濾過を再度行って、ほぼ９０ｍｇ／ｍＬの脂質濃度を達成した。調製物の一部を、粒度測定および分析のために保存した。

組成物の滅菌濾過を、酢酸セルロース膜（例えば、０．２０μｍ ＭｉｎｉＳａｒｔ、表面積＝６．２ｃｍ^２；０．２０μｍ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ １５０、表面積＝１５０ｃｍ^２）を備えた０．２μｍのシリンジフィルターを用いて行った。必要であれば、フィルターを置き換えた。一般に、１平方センチメートルの膜が、３〜１０ｍＬの組成物を適切に濾過することが判明した。必要な場合、組成物の滅菌緩衝液での希釈を行って、滅菌濾過前に、所望のオキサリプラチン濃度（例えば、１ｍｇ／ｍＬ）を得た。滅菌した発熱物質除去バイアルに、滅菌ピペットを用いて組成物を充填した。バイアルに、オートクレーブ処理したブチルストッパーおよび圧着アルミニウムシールで蓋をし、２〜８℃で貯蔵した。

上記の方法を用いて、表２にまとめた組成物を調製した。

上記の方法をやはり用いて、表３にまとめたオキサリプラチンおよびシスプラチン組成物を調製した。

実施例２ リポソームからのプラチン薬物のイン・ビトロ放出
実施例１ａ〜１ｅにおけるリポソーム（表２）からのオキサリプラチンのイン・ビトロ放出をｐＨ７．１で調べた。図１において示されるように、放出プロフィールは、ＰＯＰＣベースの製剤１ｄが、飽和脂質を用いる他の製剤と比較して最高の放出速度を有していたことを示した。他の４つのオキサリプラチン製剤については、有意差は観察されなかった。

シスプラチンまたはオキサリプラチンのいずれかを含有する実施例１ｆ〜１ｊ（表３）を、プラチン放出速度に関して比較した。イン・ビトロ放出を、ｐＨ５．０およびｐＨ７．１において決定した。表４に示すように、オキサリプラチンを含有するＰＯＰＣベースの製剤（１ｉおよび１ｊ）は、ｐＨ依存的な放出速度を呈し、他方、シスプラチンを含有する他の製剤は、そのような放出速度を呈しない。オキサリプラチン製剤は、シスプラチン製剤よりも速くかつ高い放出も呈する。表４中のデータは図２および図３においてプロットされる。

ＰＯＰＣベースの製剤についての放出データを纏めると、４８時間におけるオキサリプラチンの放出速度は、ｐＨ７．１において、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（５５：４０：５）を含有するリポソームについては約１０％であったが、ｐＨ５．０において、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（各々、６０：３５：５および６５：３０：５）を含有するリポソームについては、２０％および３０％であった。ここに示されるように、リポソームのＰＯＰＣ含有量およびＰＯＰＣ／コレステロール比、ならびにオキサリプラチンのｐＨ依存的な特徴は、酸性媒体中でのオキサリプラチンの増強された放出に寄与することが判明した。

実施例３ リポソーム組成物の物理的特徴付け
ゲル−流体間相転移の相転移温度（Ｔ_ｍ）を、表５に示されるように、様々な脂質含有量を持つリポソームについて決定した。５５〜９５％の飽和ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、またはＨＳＰＣ）、０〜４０モル％のコレステロール、および５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧを含有する混合物について、明瞭な相転移温度が検出された。Ｔ_ｍ値は、周囲温度または生理学的温度よりもかなり高い約４１〜５６℃の範囲であった。対照的に、ＰＯＰＣベースの製剤については、検出可能な転移ピークはなかった。ＰＯＰＣのゲル−液晶熱転移温度は−２℃前後である。ＰＯＰＣとコレステロールとの二元混合物についての転移温度は、０℃をかなり下回ると報告された。

総じて、プラチン放出データ、および選択されたリポソーム組成物の相転移挙動を考慮すると、本発明の組成物の有利な特性は、膜力学とｐＨ依存的な荷電状態との組合せから少なくとも部分的には生じると考えられる。

リポソームナノ粒子は、治療剤を「増強された透過性および滞留」（ＥＰＲ）効果によって固形腫瘍部位まで送達するのに特に適している（Ｖ．Ｐ．Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ、Ｔｈｅ ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ、９（２）：Ａｒｔｉｃｌｅ １５、２００７）。固形腫瘍は、がん細胞における酸素および栄養素に対する高い要求を持続するのに、極端に活動的な新脈管形成に大きく依拠する。これらの腫瘍が、それらの血管系の膜構造内において多孔性有窓を呈することがよく知られており、これは、腫瘍部位に優先的に送達されるべきある粒径範囲のナノ粒子のための優れた経路を提供する。約５０〜１５０ｎｍの粒径範囲のリポソームナノ粒子は、薬物送達のためのこの現象を利用するのに特に適している。

エンドソーム−リソソームプロセスは、リポソームのようなナノ粒子の内部移行および細胞内消化を担う主な経路であると考えられる（Ｄｅｓｎｉｃｋ，Ｒ．Ｊ．およびＳｃｈｕｃｈｍａｎ，Ｅ．Ｈ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．３：９５４−９６６．２００２）。プロセスの結果として、ほとんどの細胞外ナノ粒子は、エンドサイトーシスによって内部移行して初期のエンドソームを形成し、これは、原形質膜から細胞核に向けて移動する。初期のエンドソームのこの移動につれて、それらは酸性となり、「後期」エンドソームを生じる。この酸性の増加は、マンノース−６−リン酸受容体からのリソソーム酵素の解離をもたらす。また、後期エンドソームは（ゴルジ体からのリソソームヒドロラーゼおよび芽を含有する）一次リソソームと融合して、二次リソソームを形成する。後期エンドソームとリソソームとの間の区別は、主として、ｐＨに基づく。リソソームはより酸性の区画であり、そこでは、ほとんどの高分子の分解が起こる。酸性媒体中でのオキサリプラチンの驚くほど速い放出と結びつけて考えると、本発明の組成物中のリポソームの大きさは、ＥＰＲ効果、およびオキサリプラチンをがん組織に選択的に送達するためのエンドソーム−リポソーム内部移行プロセスを利用するのに特に有用である。

実施例４ オキサリプラチンの放出速度および有効性に対するリポソーム組成物の効果
方法
オキサリプラチン製剤Ｅ０００２０１−００１の調製。２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、５８１ｍｇのＰＯＰＣ（１−ヘキサデカノイル−２−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、Ｌｉｐｏｉｄ、ＦＷ＝７６０、０．７６ミリモル）、４０７ｍｇのコレステロール（Ｆｉｓｈｅｒ、ＦＷ＝３８６．７、１．０５ミリモル）および２６３ｍｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、Ｌｉｐｏｉｄ、ＦＷ＝２７４９、０．１０ミリモル）を加えた。これを２．５ｍＬのＥｔＯＨに溶解させた（６５℃および周囲温度においてＥｔＯＨに溶解させた脂質はペーストである）。

６０ｍＬの琥珀色瓶に、４００ｍｇのオキサリプラチン（ＬＣ ｌａｂｓ、９９％ＦＷ＝３９７、１ミリモル）および２５ｍＬの０．３Ｍスクロース水溶液を加えた。オキサリプラチン溶液を、温度が制御された水浴中で６５℃まで加熱した。加熱した溶液に、脂質のＥｔＯＨ溶液を加え、乳白色の懸濁液を得た。加熱を、水浴中で６５℃で３０分間継続した。

２００〜６００ｐｓｉｇの窒素下で、１００ｍＬのＬｉｐｅｘ^ＴＭ押出機を用いて、６５℃で、上記小胞を０．１ミクロンの二重に重ねた膜（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ Ｔｒａｃｋ−Ｅｔｃｈｅｄ、押出しはアイソレーター中で行った）を５回通して押し出した。

得られたリポソームを５℃で一晩冷却し、これにより、過剰のオキサリプラチンの結晶化が引き起こされた。０．４５ミクロンのナイロンフィルターを用いて、リポソームを結晶のオキサリプラチンから濾過した。ｍＰＥＳ ５００ＫＤａ ＭＷＣＯホローファイバー（ＫｒｏｓＦｌｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＩモデル接線流透析濾過ユニット）を用いて、濾液を、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．１）を含有する３００ｍＬの０．３Ｍスクロースに対して透析濾過した。保持されたリポソームの最終体積は約１５ｍＬであり、５℃で、琥珀色ガラスセラムバイアル（ゴムストッパー）中に貯蔵した。

粒径およびゼータ電位を、Ｍａｌｖｅｒｎゼータサイザー（ＤＬＳ）を用いて決定し（５０ｕＬをｐＨ７のＰＢＳで１ｍＬまで希釈した）、ｎｍ単位で体積平均値として報告した。

脂質をＨＰＬＣによって分析し、他方、ＰｔをＩＣＰ−ＭＳによって定量した。「遊離」Ｐｔを、３０ＫＤａ Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルター（周囲温度で１０分間９０００ｒｐｍ）から得られた濾液のＩＣＰ−ＭＳによって決定した。

オキサリプラチン製剤Ｅ０００２０１−００２〜００５およびＥ０００２０１−００８および００９の調製。リポソームＥ０００２０１−００２〜００５およびＥ０００２０１−００８および００９の調製のための手法は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）の５％（モル）量を維持しながら、コレステロールに対するＰＯＰＣの多様な比を得るために様々な量の脂質でＥ０００２０１−００１を調製するのに用いた手法と同一であった。

オキサリプラチンリポソーム製剤：ＰＯＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）の分析のための手法。ＥＬＳＤ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ Ｘｓｅｌｅｃｔ逆相カラムを用いる逆相ＨＰＬＣ法を用いて、リポソーム薬物生成物の製剤中のコレステロール、ＰＯＰＣ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）およびＬｙｓｏ−ＤＳＰＣについて、濃度（μｇ／ｍＬ単位）を決定した。カラムはＸ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８、３．５μｍ、３．０×１５０ｍｍ（ＰＮ：１８６００５２６３）であった。カラム温度は５０℃であり、オートサンプラー温度は１０℃であった。１０μＬの注入物を作製し、１．０ｍＬ／分の流量で、２５分のクロマトグラフィープログラムを用いて分離した。Ｔｏｔａｌｃｈｒｏｍにおける電圧の範囲は２ボルトであった。Ａｌｌｔｅｃｈ ＥＬＳＤは、利得を４に設定し、１．５Ｌ／分のガス圧力を用いて、８０℃でドリフトチューブで運転した。移動相Ａ（Ｈ_２Ｏ中の２５ｍＭギ酸アンモニウム）および移動相Ｂ（メタノール中の２０％アセトニトリル）を、表６において概説したグラジエントプログラムで用いた。

製剤の２０μＬアリコートを風袋を除いた微量遠心バイアル中に秤量し、８０μＬのｎ−プロパノールを加えた。バイアルを渦撹拌し、２０分間超音波処理した。１：５０および１：１００の希釈物を、希釈剤としてｎ−プロパノールを用いて調製した。液体原液標準および実用標準をｎ−プロパノール中で調製した。脂質標準曲線（１シリーズ当たり６つの試料）を、段階希釈によって調製した。上限（Ｓ１）濃度は、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールについては９００μｇ／ｍＬ；コレステロールについては７００μｇ／ｍＬ；ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）については４００μｇ／ｍＬ；およびリゾリン脂質については１５０μｇ／ｍＬであった。希釈は、表７に従って行った。

オキサリプラチンのリポソームからの放出。リポソーム薬物生成物からのオキサリプラチンの放出速度を、膜透析と、その後のＩＣＰ−ＭＳ分析によって決定した。この方法は、透析膜を用いて、遊離（放出された）オキサリプラチンを封入したオキサリプラチンから分離する。次いで、レシーバー流体をＩＣＰ−ＭＳによって分析して、オキサリプラチン同等物に変換される白金濃度を決定した。３つのイン・ビトロ放出アッセイは、リポソーム製剤の安定性の様々な態様に取り組む。生理学的放出を、イン・ビボ状態を模倣するために３７℃においてＰＢＳ ｐＨ７を用いて測定した。ＰＢＳのｐＨを５まで下げることによって、放出は細胞内のエンドソーム状態を反映した。ＦＢＳを用いる生物学的放出は、関連するタンパク質濃度の存在下における放出データを提供した。

Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ膜を、０．５ｍＬのＰＢＳ ｐＨ７を膜中に加えることによって予めコンディショニングした。膜を、製剤の添加に先立って、少なくとも１０分間予めコンディショニングした。膜を周期的に倒立させて、全膜領域が予めコンディショニングされることを確実とした。サーモシェーカーを３７℃まで予熱し、振盪スピードを４００ｒｐｍに設定した。

０．５ｍＬのリポソーム製剤をＦｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ膜中に負荷した。放出溶液（ＰＢＳ ｐＨ７、ＰＢＳ ｐＨ５、またはＦＢＳ）の１５ｍＬ分を５０ｍＬのコニカルチューブに加えた。Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒをコニカルチューブに挿入し、その組立品をサーモシェーカーに入れた。表８にまとめられた試料回収スケジュールを用いて、試料を周期的に回収した。各時点における１００μＬの試料を予めラベルが付された深いウェルプレートに移した。深いウェルプレートを密閉し、回収時点の間に冷蔵庫中で貯蔵した。

ＩＣＰ−ＭＳによる試料中の全白金の決定。白金（Ｐｔ）の濃度を、（Ｍｅｉｎｈａｒｄ同心ネブライザー、低体積石英サイクロンスプレーチャンバーおよび石英トーチを含む）試料導入システム、ＲＦ発生器励起源、金でメタライズしたセラミック四重極およびＳｉｍｕｌＳｃａｎデュアルステージ検出器（電子増倍管）付きの質量分析計、およびＳ１０オートサンプラーを備えたＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ誘導結合プラズマ質量分析計（ＮｅｘＩＯＮ３００ｑ ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて、ＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析）によって測定した。

キャリブレーション実用標準の調製。白金実用標準（１０００ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬ）を、１０００μｇ／ｍＬ標準溶液からの１％硝酸での段階希釈によって調製した。イリジウム（ｉｒｉｄｕｍ）内部標準原液（２００ｎｇ／ｍＬ）を１％硝酸中で調製した。キャリブレーション実用標準溶液を、１０ｎｇ／ｍＬのＰｔおよび１０００ｎｇ／ｍＬのＰｔ原液標準溶液および２００ｎｇ／ｍＬのＩｒ内部標準溶液を希釈することによって調製した。標準は、表９において概説されたように調製した。

試料の調製および分析。１０μＬの試料を５ｍＬの硝酸で希釈し、試料を７０℃で一晩加熱して、完全な消化を確実とした。次いで、試料を４５ｍＬの水で希釈し、その結果、５００倍希釈物が得られた。２００，０００倍希釈物を、１０％硝酸を用いて５００倍希釈物から調製し、イリジウム内部標準を所望の濃度で加えた。ＩＣＰ−ＭＳを、表１０において概説された操作パラメータを用いて行った。オキサリプラチンのパーセント放出を、オキサリプラチンの濃度（ｔ＝６時間）／オキサリプラチンの濃度（最終）として計算した。

ＨＴ２９細胞における、リポソームオキサリプラチンのイン・ビトロＩＣ_５０の決定。ＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌細胞（＃ＨＴＢ−３８、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、ＭｃＣｏｙ５Ａ（＃１０−０５０−ＣＶ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中の０．１ｍＬの１０％ウシ胎児血清の最終体積中、５×１０^３細胞／ウェルで、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３５９５）にまいた。規定のウシ胎児血清を、ＨｙＣｌｏｎｅ（＃ＳＨ３００７０．０３、ロット番号ＡＷＢ９６３９５、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）から得た。細胞を含有するプレートを、加湿空気中の５％ＣＯ_２中で３７℃で２４時間インキュベートした。選択された初期細胞プレーティング密度を、ヒト腫瘍細胞系の近似的な倍加時間に基づいて選択した。

テスト化合物を、原液から、ダルベッコ改変リン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、ロット番号２１０３１３３９、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中の２．２ミリモル／Ｌまで希釈し、次いで、ＤＰＢＳ中で３倍に段階希釈して、９点の用量反応曲線を作成した。１０マイクロリットルの希釈されたテスト化合物を三連でウェルに加えて、テスト化合物の所望の最終濃度を達成した。加えたテスト化合物を含む、および含まない細胞を含有するプレートを上記のインキュベーションに戻した。

２時間の細胞毒性評価のために、２時間の薬物曝露後に培地を取り出し、０．１ｍＬ／ウェル培養培地で置き換え、細胞を上記のようにさらに７０時間インキュベートした。

２４時間の細胞毒性評価のために、１日の薬物曝露後に培地を取り出し、０．１ｍＬ／ウェルの培養培地で置き換え、細胞をさらに４８時間のインキュベーションに戻した。引き続いて、アラマーブルーを用いて細胞生存率を評価した。この目的で、培養された細胞からのピペッティングによって培地を取り出し、適切な細胞培養培地中に希釈した０．１ｍＬ／ウェルの１０％（ｖ／ｖ）アラマーブルー（＃ＢＵＦ０１２Ａ、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）で置き換えた。次いで、適切な発色のために２〜４時間の間、プレートを元の通りにインキュベーションに戻した。

ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ４マイクロプレートリーダーを用いて、個々のプレートウェルの蛍光を５４５ｎｍ／５９０ｎｍ（励起／発光）で測定した。細胞生存率を、培養培地単独で処理した細胞に対して得られた、測定蛍光のパーセンテージとして計算した。非線形回帰分析および４パラメータロジスティックモデルを用いて、ＩＣ_５０値（マイクロモル／Ｌ）を三連の値の平均で決定した。

結果
０〜５６％コレステロール、５％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）、および残りのＰＯＰＣを含む試料で得られた結果を表１１にまとめる。

オキサリプラチンのリポソームからの放出を、リポソーム製剤の安定性の様々な態様に取り組む３つのイン・ビトロ放出アッセイを用いて決定した。生理学的放出を、イン・ビボ状態を模倣するために３７℃においてＰＢＳ ｐＨ７を用いて測定する。ＰＢＳのｐＨを５まで下げることによって、放出は、細胞内で観察されたエンドソーム状態を反映する。ＦＢＳを用いる生物学的放出は、関連するタンパク質濃度の存在下における放出データを提供する。

最終の時点（４８時間）で調べた３つの異なる培地について、結果を表１２に与える。時間放出挙動の例を、リポソームオキサリプラチン４ａについて、図４に示す。

リポソームの組成物に対するイン・ビトロ結果の相関。製剤中のモル％コレステロールの関数としての、ＰＯＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）よりなるリポソームからのオキサリプラチンの放出を、３７℃で４８時間後の、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で得られたデータについて、図５においてグラフで示す。

製剤中のモル％コレステロールの関数としての、ＰＯＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）よりなるリポソームオキサリプラチンから得られたＩＣ_５０値を、２４時間の曝露後のＨＴ２９細胞について、図６においてグラフで示す。

有効性テストを、６５：３０：５のモル比でＰＯＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）を含有するリポソームオキサリプラチン製剤を用いて行った。（腫瘍サイズ成長遅延および生存によって決定された）イン・ビボ研究からの結果は、エロキサチン（オキサリプラチンの現在の市販の製品）で得られたものよりも大きな有効性を示した。６５：３０：５のモル比の重要性を、ＰＯＰＣ：コレステロール比を変化させて調べた。有効性についての潜在的な代用物として、オキサリプラチン放出および細胞増殖阻害についてのイン・ビトロテストを、ＰＯＰＣ：コレステロールの７つの異なる比で行った。

得られた高い相関によって証明されるように、リポソームからのオキサリプラチンの放出速度およびＨＴ２９細胞に対するＩＣ_５０の両方は、コレステロールに対するＰＯＰＣのモル比に依存した。リポソームからのオキサリプラチンの放出は、該比が増加するにつれて増加する（ＰＯＰＣが高いほど、コレステロールは低い）。ＩＣ_５０効力は、該比が増加するに際して増強される（ＰＯＰＣが高いほど、コレステロールは低い）。従って、ＩＣ_５０は、図７に示されるように、オキサリプラチンのより高い放出速度と共に減少する。

いかなる特定の理論にも束縛されるつもりはないが、４８時間の期間にわたるより多量のオキサリプラチンの放出は、腫瘍における薬物の蓄積がより少ない（循環および排泄に対し失われた薬物）ために、より低い有効性でより高い毒性をもたらし得ると考えられる。４８時間にわたるオキサリプラチンのより低い放出の結果、生物学的に利用可能なオキサリプラチンの濃度が低すぎるために、より低い有効性をもたらし得る（リポソームに封入したオキサリプラチンは、生物学的に活性でないと考えられる）。

実施例５ リポソームオキサリプラチンの有効性のイン・ビボ研究
単一の剤の有効性研究
多数の市販および個人的に獲得した腫瘍細胞系を、最初に、オキサリプラチンを含めた種々の白金剤に対するそれらの感受性について調査した。テストされた市販されているヒト結腸腫瘍細胞系のパネルのうち、ＨＴ２９および数個の他の細胞系（約５〜１０ｕＭ ＩＣ_５０、７２時間）と比較して増強されたオキサリプラチンのイン・ビトロ細胞毒性を有するＨＣＴ−１１６細胞（０．４ｕＭ ＩＣ_５０、７２時間）が同定された。細胞系を５ＦＵに対する感受性についても調査した。７２時間における約７〜１０ｕＭのＩＣ_５０値を、ＨＴ２９（＞５０ｕＭ、ＩＣ_５０、７２時間）を除いてテストされた全ての細胞系について得た。全ての調査した細胞系について、イン・ビトロ相乗作用をオキサリプラチンおよび５ＦＵで評価したが、対にした剤の追加の結果、細胞毒性が顕著に改善された細胞系は同定されなかった。加えて、イン・ビトロで発生したオキサリプラチン耐性結腸直腸細胞系を探して文献調査を行って、リポソーム処置−対−遊離オキサリプラチン処置に対するこれらの細胞の改善された感受性を示す目的で、前臨床薬理学研究を潜在的に含めた。この調査から、３つの他のオキサリプラチン耐性結腸直腸腫瘍系が同定された；ＨＴ２９（Ｐｌａｓｃｅｎｃｉａら、２００６；Ｙａｎｇら、２００６）、およびＤＬＤ−１（Ｋａｓｈｉｗａｇｉら、２０１１）。

予備的なイン・ビトロ研究および調査した文献に基づいて、一連の異種移植片モデルにおける新規なリポソームオキサリプラチン製剤のリポソームオキサリプラチン５ａの最初のテストを行った。リポソームオキサリプラチン５ａは、６５：３０：５のモル比でＰＯＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）を含む。これらの研究は、単回および複数回投薬レジメンおよび複数の投与量レベルを含むものであった。

ＫＢ（ヒト口腔類表皮癌）細胞は、シスプラチンに対する固有の耐性を呈しながら、オキサリプラチンに対するそれらの感受性を保持することが報告されている。シスプラチン耐性細胞系の中で、オキサリプラチンについてのＩＣ_５０値は０．１９ｕＭ〜１４ｕＭの範囲であって、オキサリプラチン感受性は多くのシスプラチン耐性細胞系において維持される。異種移植片としてよく成長する、本実験で用いられたＫＢ細胞系は、他者によって報告されたものと比較して、シスプラチン（４μＭ）に対する同等の感受性およびオキサリプラチンに対する幾分低い感受性（ＩＣ_５０＝７２時間における５．４μＭ）を呈する。よって、遊離オキサリプラチをリポソームオキサリプラチン５ａと比較する単剤有効性研究を、まず、ＫＢ異種移植片腫瘍で行った。

この研究の開始に先立って、オキサリプラチンを、腫瘍を持たない免疫不全マウスにおける薬物耐性について評価した。１５ｍｇ／ｋｇを超える投薬（すなわち、２０ｍｇ／ｋｇ）の結果、脱水および許容され得ない著しい体重減少がもたらされた。オキサリプラチンについての最大耐性用量（ＭＴＤ）はマウスにおいて１５ｍｇ／ｋｇであると決定され、エロキサチン（登録商標）承認（ＮＤＡ ２１−４９２書類）についてＦＤＡに提供された前臨床データと合致した。本研究における１５ｍｇ／ｋｇのオキサリプラチンの投与は、生理食塩水対照と比較して腫瘍成長を有意に阻害せず、生存期間を有意に増加させなかった。本実験で用いたＫＢ細胞は、注射前の細胞毒性テストにおいてオキサリプラチンについて５．３ｕＭのＩＣ_５０を呈し、これは、オキサリプラチン処置に対して部分的に応答する他のヒト腫瘍細胞系で観察されたものよりも数倍高い。このことは、オキサリプラチンが単回投薬後にこのモデルで腫瘍成長を阻害できないことを部分的に説明し得る。オキサリプラチンは、０．５ｃｍ^３の大きさへの腫瘍成長を５日間だけ遅延させたが、この成長阻害効果は、より長期間の研究にわたって維持されなかった。

以下にリポソームオキサリプラチン５ａと呼ぶ封入オキサリプラチンを含有する新規なリポソームもまた、４０ｍｇ／ｋｇおよび６０ｍｇ／ｋｇの投与量で同じ経路を介して一回投与された。遊離オキサリプラチンとは異なり、リポソームオキサリプラチン５ａでの単回処置は、対照に対してＫＢ腫瘍において有意により大きな腫瘍成長の遅延を生じた（Ｐ＜０．０５）（図８）。テストされた両方の用量のリポソームオキサリプラチン５ａは、生理食塩水対照と比較して、腫瘍成長を６０％だけ阻害した。加えて、リポソームオキサリプラチン５ａは、生理食塩水で処置された対照と比較して、腫瘍の成長を１８および２４日間だけ遅延させた（各々、４０ｍｇ／ｋｇおよび６０ｍｇ／ｋｇ）。さらに、リポソームオキサリプラチン５ａ処置は、２つのテストされた投与量において、生理食塩水で処置された対照（図９および表１４参照）に対し、各々、１３（４３％）〜２４日（７７％）の間のメジアン生存期間を増加させた。重要なことには、１０匹のうち２匹のみ（２０％）の（より低い用量における）リポソームオキサリプラチン５ａで処置された動物が、不健康または著しい体重減少が除かれ、このことは、５０ｍｇ／ｋｇはリポソームオキサリプラチン５ａについてＭＴＤに近いことを示唆していた。

ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルは、細胞毒性アッセイにおいて低いｕＭ濃度のオキサリプラチンに対して感受性であるＨＴ２９細胞を主として用いて、オキサリプラチンベースの療法を評価するのに広く用いられてきた。オキサリプラチンに対して何倍も低い感受性である多数のＨＴ２９細胞系が作製されてきた。本研究で用いたＨＴ２９細胞系は、他者によって報告されたように、オキサリプラチン（ＩＣ_５０ ５．４ｕＭ）に対する同様な感受性を呈した。オキサリプラチンを含有する新規なリポソーム製剤の２つの研究をこの腫瘍モデルで行った。最初の研究（図１０）において、リポソームオキサリプラチン５ａおよびエロキサチンを３週間の間、毎週投与した。２２ｍｇ／ｋｇ／投薬で投与したリポソームオキサリプラチン５ａは、腫瘍成長を阻害し、遅延させ、同じスケジュールで１５ｍｇ／ｋｇ／投薬で投与されたオキサリプラチンと比較して、ＨＴ２９ヒト結腸直腸異種移植片腫瘍を持つマウスの生存期間を増加させた（図１１、図１２、および表１５参照）。

第二の研究において、ＨＴ−２９結腸直腸異種移植片を持つマウスを、３週間の間、毎週、１５、２５、または３５ｍｇ／ｋｇ／投薬のリポソームオキサリプラチン５ａで処置した。全ての用量レベルにおけるリポソームオキサリプラチン５ａでの処置は、ＭＴＤで投与したエロキサチンまたは生理食塩水処置よりも小さな腫瘍を生じた（図１３）。エロキサチンは生理食塩水と比較して腫瘍成長に対して効果を示さなかったが、体重の減少および罹患率によって分かるように毒性を生じた（図１４、図１５、および表１６参照）。

ＨＴ２９異種移植片を持つ免疫不全マウスにおけるリポソームオキサリプラチン５ａおよびエロキサチンでの生体内分布および薬物動態研究も行った。リポソーム（１５ｍｇ／ｋｇオキサリプラチン）での処置は、同じ用量のエロキサチンでの処置よりも６倍大きく全腫瘍白金曝露（ＡＵＣ）を増加させた（図１６）。この観察は、１）増強された腫瘍侵入および滞留（ＥＰＲ効果）、および２）循環および腫瘍ミクロ環境内での、遊離オキサリプラチンに対するリポソームオキサリプラチン５ａの持続した血漿中半減期と合致する。いかなる特定の理論にも束縛されるつもりはないが、白金に対する腫瘍の増加した曝露は、このＨＴ２９結腸直腸異種移植片モデルにおいて、リポソームで観察された有効性の増加に寄与したようであると考えられる。血漿中白金レベルを図１７に示す。薬物動態および組織分布を表１７および表１８にまとめる。

膵管腺癌は非常に致死的で、化学療法に対して耐性である。これらの腫瘍は、比較的血管欠損であり、密な間質マトリックスを有するが、これが、化学療法剤に対するそれらの耐性に寄与すると考えられる。最近、オキサリプラチンを含有するＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸレジメンは、転移性膵臓がんにおける第一選択の処置について、標準治療であるゲムシタビンと比較して同等な、またはわずかに改善された有効性を示した。良好な活性が、ゲムシタビンと比較してナノ医薬のアブラキサンについて、膵臓がんで報告されているが、進行した膵臓がんにおける処置の選択肢は非常に制限されたままである。異種移植片モデルでこれらの線維形成性腫瘍をモデル化する試みにおいて、研究者らは、ナノ粒子の生体内分布および有効性研究の評価のために、選択された乳腺細胞系または膵臓細胞系を使用してきた。本研究においては、低いｕＭ ＩＣ_５０値が、ＢｘＰＣ−３膵臓細胞の増殖を遮断する際にエロキサチンで観察された。リポソームオキサリプラチン５ａを、異種移植片モデルにおいてヒトＢｘＰＣ−３膵臓腺癌細胞に対する単剤の複数回投与活性について評価した。このモデルにおける毎週の投与において、有意な有効性はエロキサチン単独を用いて観察されなかったが、リポソームオキサリプラチン５ａの全てのテストした用量において、腫瘍成長における有意な遅延が観察された（図１８）。体重の変化および生存率を、各々、図１９および図２０に示す。

組合せ剤の有効性研究
リポソームオキサリプラチン５ａおよび数種の治療剤を、異種移植片モデルを使用する前臨床組合せ研究で用いて、例えば、５−ＦＵ、セツキシマブおよびゲムシタビンを含めた種々の臨床的に関連する処置状況における組合せ活性を評価することができる。

ＨＴ２９ヒト結腸直腸異種移植片を持つマウスにおいて５ＦＵ（５−フルオロウラシル）と共にリポソームオキサリプラチン５ａ製剤を用いる併用療法研究も行い、良好な結果を与えた。

実施例６ リポソームオキサリプラチンの有効性のさらなる評価
ＨＴ２９異種移植片に対する、リポソームオキサリプラチンの腫瘍成長を効果的に低下させる能力は、製剤で用いる脂質の組成に依存することが示された。組成の変化の結果、有効性、およびある場合には耐性（毒性）に関する差がもたらされた。比較的速いイン・ビトロオキサリプラチン放出製剤は、いくつかの比較（ＤＭＰＣ 対 ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ）において高い毒性効果を呈したが、速い放出は、ＰＯＰＣとＤＯＰＣとの間、もＰＯＰＣとＤＭＰＣとの間の差も説明しなかった。本明細書での結果でもって、グリセロ−ホスファチジルコリン上に少なくとも１つの飽和脂肪酸鎖を有する脂質は、低コレステロール製剤、または両方の脂肪酸鎖中の不飽和の部分を有する脂質を含有する製剤よりも好ましいことが判明した。

対照に対する有効性を示したリポソーム製剤は、以下の条件の組に絞り込むことができる：
ａ）炭素長≧Ｃ１４、または好ましくは＞Ｃ１４の２つの飽和脂肪酸、または鎖長≧Ｃ１４、または好ましくは＞Ｃ１４を持つ１つの飽和脂肪酸および１つのモノ不飽和脂肪酸のいずれかを含有する中性ジ−アルキル−グリセロ−ホスファチジルコリンを含む脂質組成物；
ｂ）上記の特定の中性ジ−アルキル−グリセロ−ホスファチジルコリンを持つ２５％〜４５％（モル％）のコレステロールを含有する製剤は対照に対して有効性を呈した；および
ｃ）ＰＥＧ化リポソームは、ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）成分としてＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）またはＤＳＰＥ−ＰＥＧ（５０００）のいずれかを含有し得た；しかしながら、コレステロール−ＰＥＧ（５０００）の使用は適切な利用性を示さなかった。

以下の研究は、本発明の有益な組成物に到達するために着手された実験を説明する。評価された特性は、粒径、薬物負荷（脂質／オキサリプラチン）、オキサリプラチンのイン・ビトロ放出、ＨＴ−２９細胞に対するＩＣ５０（イン・ビトロ）、およびＨＴ２９腫瘍異種移植片に対するイン・ビボ有効性を含む。脂質組成物は、ホスファチジルコリン上の脂肪酸鎖、添加されたコレステロールのモル％、およびＰＥＧ（長期の循環剤）に対する種々のアンカーの改変を含む。

実験：

オキサリプラチンの全てのリポソーム製剤を、以下の方法（オキサリプラチンを受動負荷したＥｔＯＨの注入）によって調製した。
実施例１：Ｅ０００２０１−０５１の調製

３０ｍＬの琥珀色ジャーに、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）を加えた。この脂質混合物を１０ｍＬのＥｔＯＨに溶解させた（脂質は６５℃においてＥｔＯＨに溶解した）。２５０ｍＬのセラムボトルに１．６ｇのオキサリプラチン（ＬＣ ｌａｂｓ、９９％ＦＷ＝３９７）および１００ｍＬの（使用前に０．２ミクロンのフィルターを通して濾過した）０．３Ｍスクロース水溶液を加えた。オキサリプラチン溶液を、磁気撹拌しながら、温度制御水浴中で６５℃まで加熱した。加熱された溶液（完全に溶解したオキサリプラチン）に、脂質のＥｔＯＨ溶液を加え、乳白色の懸濁液を得た。加熱を、水浴中、６５℃で３０分間継続した。

２００〜６００ｐｓｉｇの窒素下で、１００ｍＬのＬｉｐｅｘ^ＴＭ押出機を用いて、６５℃で、上記の小胞を０．１ミクロンの二重に重ねた膜（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ Ｔｒａｃｋ−Ｅｔｃｈｅｄ、押出しはアイソレーター中で行った）を通して５回押し出した。得られたリポソームを５℃で２日間冷却し、これにより、過剰のオキサリプラチンの結晶化が引き起こされた。リポソームを結晶のオキサリプラチンからデカントし、ｍＰＥＳ ５００ＫＤａ ＭＷＣＯホローファイバー（ＫｒｏｓＦｌｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＩモデル接線流透析濾過ユニット）を用いて、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）を含有する３００ｍＬの０．３Ｍスクロースに対して透析濾過した。１０容の透析濾液を回収した後、リポソーム保持物を約３０ｍＬの最終体積まで限外濾過した。限外濾過したリポソーム材料を、０．２ミクロンのシリンジフィルター（ナイロン）を通して琥珀色セラムバイアルに濾過し、５℃で貯蔵した。

Ｍａｌｖｅｒｎゼータサイザー（ＤＬＳ）を用いて、粒径およびゼータ電位を決定し（５０ｕＬをノーマルセーラインで１ｍＬまで希釈した）、ｎｍ単位で体積平均値として報告した。

脂質成分の同定および決定のための逆相ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ法

これは、リポソーム製剤中の脂質成分の同定および決定のための逆相ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ法である。この方法は、安定性の研究、イン・ビトロ放出アッセイ、またはイン・ビボ研究を受けている製剤および対照ビークルに適用することができる。

手法：
ｎ−プロパノールまたはメタノールなどの適切な有機溶媒中のリポソーム成分の２つの原液を調製する。溶液が透明であって、結晶を含まないことを確実にする。１つの原液を用いて、脂質定量のためのキャリブレーション標準の組を調製する。他のものを用いて、曲線検証のための品質管理基準を調製する。次いで、試料を標準曲線希釈剤と同一有機物中に希釈する。
ＨＰＬＣ条件：
カラム：ＸＳｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８、３．５μｍ、３．０×１５０ｍｍ
カラム温度：５０℃
オートサンプラー温度：１５℃
注入体積：１０μＬ
実行時間：２０分
ＥＬＳＤ：スプレイチャンバー４０℃、ドリフトチューブ６０℃、４においてＲＦフィルター
溶出プロフィール：
移動相Ａ：２５ｍＭギ酸アンモニウム
移動相Ｂ：ＭｅＯＨ：ＡＣＮ＝８０：２０
グラジエント条件

キャリブレーション曲線およびＱＣ試料を実行し、続いてあなたの試料を実行する。
ｍｇ／ｍＬで表した脂質濃度ならびに脂質モル比を報告する。

ＩＣＰ−ＭＳによる試料中の白金の定量

試薬：微量の金属グレードの濃硝酸；白金標準；イリジウム標準（Ｉｒ）；ＱＣ標準、およびミリＱ水

機器：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ誘導結合プラズマ質量分析計（ＮｅｘＩＯＮ３００ｑ ＩＣＰ−ＭＳ）。

合計および封入されていない白金の決定

以下の手法が約２ｍｇ／ｍＬ白金である製剤に適用される：５００マイクロリットルのテスト製剤をＡｍｉｃｏｎ、０．５ｍＬ、３０ｋＤ分子量カットオフ回転フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ５０３０９６）を通して９，０００ｒｐｍで１０分間回転させて、封入されていない試料を得る。１０マイクロリットルの封入されていない濾液および元のテスト製剤（各々、封入されていない白金および全白金決定用）を、各々、５ｍＬの濃硝酸中で消化し、７０℃、３５０ｒｐｍで加熱する。次いで、全ての試料を、２ｎｇ／ｍＬのＩｒ内部標準を含む水中で、封入されていないものについては５，０００倍および全体については２００，０００倍の最終希釈まで水で希釈する。試料をＩＣＰ−ＭＳで実行し、１０〜２０，０００ｐｇ／ｍＬ白金の範囲の８点線形標準曲線に当てはめる。

イン・ビトロ放出アッセイ

５００マイクロリットルのリポソーム製剤を１００ｋＤ透析デバイスであるＦｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｇ２に負荷する。次いで、負荷されたＦｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒを、１５ｍＬのｐＨ５のＰＢＳ、ｐＨ７のＰＢＳ、またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する５０ｍＬコニカルチューブに挿入する。次いで、管を３７℃、３５０ｒｐｍに設定されたサーモミキサーに入れる。試料を分析のために６、２４、および４８時間において採取する。

全ての時点および「全体の」試料が回収された後、１０μＬの各回収された試料を別の深い９６ウェルプレートのウェルに移し、４００μＬの濃硝酸を各々に加え、プレートをプレートシーラーで密閉し、（サーモミキサーを用いて）７０℃、３５０ｒｐｍで少なくとも１時間加熱する。最終濃度の２ｎｇ／ｍＬのＩｒ内部標準を含む水を用いて、試料を２００倍希釈する。全ての試料をＩＣＰ−ＭＳで実行し、１０〜２０，０００ｐｇ／ｍＬ白金の範囲の８点線形標準曲線に当てはめる。

ＨＴ２９細胞におけるＩＣ５０の決定

ＨＴ２９ヒト腫瘍細胞系を、ＭｃＣｏｙ５ａ培地中の０．１ｍＬの１０％ＦＢＳの最終体積中、５×１０^４細胞／ｍＬで、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３５９５）にまいた。全ての培地および成長補助剤を、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。規定のウシ胎児血清は、ＨｙＣｌｏｎｅ（＃ＳＨ３００７０．０３、ロット番号ＡＷＢ９６３９５、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）から得た。細胞を含有するプレートを加湿空気中の５％ＣＯ_２で３７℃、２４時間インキュベートした。選択された最初の細胞プレーティング密度を、個々のヒト腫瘍細胞系の近似した倍加時間に基づいて選択した。テスト組成物を、上記原液から、ダルベッコ改変リン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、ロット番号２１０３１３３９、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中２．２ミリモル／Ｌまで希釈し、次いで、ＤＰＢＳ中で段階的に３倍希釈して、９点濃度−反応曲線を作成した。１０ｕＬの希釈されたテスト組成物を三連でプレートに加えて、所望の最終濃度を達成した。加えたテスト組成物を含む、および含まない細胞を含有するプレートを上記のインキュベーションに合計して７２時間戻した。種々の処理時間の間、薬物含有培地を示された処理時間後に取り除き、薬物を含まない培地で置き換えた。引き続いて、アラマーブルーを用いて、細胞生存率を評価した。この目的では、培養された細胞からのピペッティングによって培地を取り除き、適切な細胞培養培地中に希釈された０．１ｍＬ／ウェルの１０％（ｖ／ｖ）アラマーブルー（＃ＢＵＦ０１２Ａ、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）で置き換えた。次いで、適切な発色のために２〜４時間の間、プレートを元の通りにインキュベーションに戻した。個々のプレートウェルの蛍光を、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ４マイクロプレートリーダーを用いて、５４５ｎｍ／５９０ｎｍ（励起／発光）で測定した。細胞生存率を、培養培地単独で処理された細胞に対する得られた測定蛍光のパーセンテージとして計算した。ＩＣ_５０値（μモル／Ｌ）を、非線形回帰分析および４パラメータ曲線適合モデルを利用するＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌマクロを用いて三連の値の平均で決定した。

実施例７ リポソームオキサリプラチンの有効性のイン・ビボ研究のさらなる評価
多様なリポソーム組成を持つリポソームオキサリプラチン製剤を、マウスにおける耐性、およびＨＴ２９ヒト結腸直腸異種移植片腫瘍を持つマウスにおける有効性について評価した。

研究デザイン
急性マウス耐性アッセイ。雌Ｈｓｄ：無胸腺Ｎｕｄｅ−ＦｏｘＮ１ ｎｕ／ｍｕマウスに、３０、３６または４５ｍｇ／ｋｇの単回静脈内（ＩＶ）用量の被験物質を与えた。全ての用量を、オキサリプラチン等価用量として与えた。注射に続いて、マウスを１４日間モニターし、秤量した。瀕死の状態にあることが判明した、または２０％を超えて体重が減少したマウスを研究から除いた。

マウス異種移植片有効性研究。雌Ｈｓｄ：無胸腺Ｎｕｄｅ−ＦｏｘＮ１ ｎｕ／ｍｕマウスに、各々、２．５×１０^６のＨＴ２９ヒト結腸直腸細胞を右側腹部に皮下移植した。一旦腫瘍が２００ｍｍ^３のメジアン体積に到達したところで、５０匹の動物を無作為に分け、腫瘍体積によって処置群に正規化した。腫瘍が無い動物は研究に含めなかった。各動物には、単回の静脈内（ＩＶ）用量のリポソームオキサリプラチン製剤の被験物質、エロキサチン陽性対照物質または生理食塩水を、３週間の間、各週に与えた（ｑ７ｄ×３）。被験物質を、オキサリプラチン等価用量として与えた。

測定および統計
腫瘍画像診断システム（Ｂｉｏｐｔｉｃｏｎ）を用いて、腫瘍体積を１週間当たり２〜３回決定した。体重は毎週測定した。腫瘍体積データを分析して、処置された腫瘍と対照腫瘍との体積比（％Ｔ／Ｃ）を決定した。マウスが最初の体重から２０％減少して瀕死の状態になった場合、または腫瘍体積が２５００ｍｍ^３を超えるか、または潰瘍になった場合、マウスを研究から除いた。マウスの最初のコホートの半分未満が残った場合、その群は、もはや、さらなる腫瘍分析に含めなかった。

処置された腫瘍と対照腫瘍との体積比（％Ｔ／Ｃ）を、対照群が研究で残存した元の動物の少なくとも半分を含んでいた最終日に計算した。％Ｔ／Ｃは、１００×（処置群の平均腫瘍体積）／（対照群の平均腫瘍体積）によって計算した。

腫瘍成長についての処置群の統計学的比較は、生理食塩水処置マウスの半分以上が研究に残っている最後の時点で、および研究に残っているマウスが５０％を下回ったためにさらなる群を取り除く直前に再度、各投与群の平均測定値についての一元配置ＡＮＯＶＡ比較を使用した。統計学的有意性（ｐ＜０．０５）が観察された場合、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後比較検定を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６を用いて、全ての統計学的分析を行い、統計学的有意性についての基準はｐ＜０．０５に設定した。

結果
表１中のリポソームオキサリプラチン製剤を、３０、３６、または４５ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量で耐性について評価した。５つの製剤は、２０％を超える体重の減少または罹患率を含む、重篤な毒性の兆候を呈した。表１中の５つの残りの製剤は、重篤な毒性の兆候なしに４５ｍｇ／ｋｇ用量のリポソームオキサリプラチンに耐性であった。

リポソームオキサリプラチン製剤（２５ｍｇ／ｋｇ）、エロキサチン（１０、１５ｍｇ／ｋｇ）、および生理食塩水を、３週間の間、毎週、ＨＴ２９ヒト異種移植片腫瘍を持つマウスに投与した。表２に示した６つのリポソームオキサリプラチン製剤は、重篤な毒性を生じたが、表３に示した２５の追加の製剤はこのレベルの投与に耐性であった。２５の耐性製剤のうち２４は、有効性を生じ、腫瘍体積は生理食塩水処置マウスからの腫瘍よりも有意に小さかった（ｐ＜０．０５）。これらの２４のリポソームオキサリプラチン製剤は、腫瘍成長を阻害し、２５％（最も有効）〜５８％（最も効力が低い）の範囲の処置された腫瘍と対照腫瘍との体積比（％Ｔ／Ｃ）を生じた。１つの耐性リポソームオキサリプラチン製剤（ＭＰ−３７９６）は、生理食塩水処置と比較して、有意に腫瘍成長を阻害せず、８１％の％Ｔ／Ｃを生じた。１０または１５ｍｇ／ｋｇのエロキサチン、比較細胞毒性剤の週１回の３回のＩＶ用量の投与は、４つの研究のうちただ１つにおいて、生理食塩水処置と比較して有意に腫瘍成長を阻害し（ｐ＜０．０５）、５３％〜８８％の範囲の％Ｔ／Ｃを生じた。

リポソームオキサリプラチン製剤を、本来「受動」封入方法であるＥｔＯＨ希釈法を用いて調製した。いくつかの特徴を満足する製剤は、潜在的な治療剤、注射材料として望ましかった。非経口適用では、形成された小胞の粒径が重要な検討事項であった。非経口リポソーム製剤についての粒径は、８０〜１２０ｎｍの範囲が最適であることが判明した。より大きな粒径は、細網内皮系（ＲＥＳ）によるより大きな取込みをもたらすと報告されており、他方、より小さな粒子は、封入した材料の放出に対して安定性が低い傾向がある。従って、本発明者らの選択プロセスにおける最初の基準は、８０〜１２０ｎｍの体積平均サイズを持つリポソーム粒子の生成であった。

小胞の水性内部内でのオキサリプラチンの封入は、ＥｔＯＨ中の脂質の濃度、および小胞形成プロセスの間における水相中のオキサリプラチンの濃度に依存した。加工中にオキサリプラチンを保持する小胞の能力は、最大の負荷効率を得る際に重要であった。製剤を、加工の完了の際に脂質濃度、全オキサリプラチン含有量および封入されていないオキサリプラチンについて分析した。２０〜１００の脂質対オキサリプラチン比を与えた製剤を、さらなる評価に対して許容できると見なした。より高い比を与えたものは、オキサリプラチンの滞留が加工中に大きく制限されたことを示し、従って、得られた材料は、有効な使用には十分ではないと見なされた濃度のオキサリプラチンを含有した。分析に際して、高レベルの封入されていないオキサリプラチンを含有した製剤は排除した。というのは、これらの製剤は、元来、貯蔵中にオキサリプラチン放出に対して不安定であったからである。一般に、＜Ｃ１４鎖長を持つ脂肪酸を含有するジ−アルキル−グリセロ−ホスファチジルコリンを含む、または少量のコレステロールを含有した製剤は、十分な量のオキサリプラチンを封入しなかった。

２０〜１００の薬物対脂質比を保有し、大きさが８０〜１２０ｎｍであるオキサリプラチン製剤を、イン・ビトロでのオキサリプラチン放出について評価した。イン・ビトロ放出方法は、小胞の熱安定性（３７℃）をテストし、製剤を、２つのｐＨ値（５および７．４）で評価した。オキサリプラチンの高い放出は、リポソームがオキサリプラチンを保有できないことを示し、過剰の放出は、安定性が乏しいことを示した。本発明者らがこれらのオキサリプラチン製剤をテストした期間中に、本発明者らは、いくつかの場合に、オキサリプラチンの放出の大きな（２倍を超える）差がより低いｐＨ（５）で起こったことを観察した。最大の差は、ジ−アルキル−グリセロ−ホスファチジルコリン成分中に少なくとも１つの不飽和脂肪酸を含有する組成物で観察された。このｐＨ感受性は予期されなかった。しかしながら、それはこの観察についての理由として明瞭でなく、またこれが性能に対して任意のイン・ビボの効果を有することも明らかでなかった。調製された製剤の多くは、オキサリプラチンのかなり遅い放出を呈した（３７℃において４８時間にわたり＜５％）。遅い放出を持つものは、循環において一定の低いレベルの封入されていないオキサリプラチンを維持し、かつ最小の毒性を呈する潜在的製剤であると見なされた。しかしながら、低い放出を持つ製剤は、イン・ビボでのオキサリプラチンの適切な生物学的利用性を提供し得ずに、最小の有効性を示し得る。

ｐＨ５および７．４におけるイン・ビトロ放出研究に加えて、オキサリプラチンの放出を、９０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）マトリックス中で、３７℃で、血清タンパク質および他の生物学的材料の存在下で評価した。この放出測定は、イン・ビボで潜在的放出を模倣することを意図するものであった。ＦＢＳ中のオキサリプラチンの迅速なまたは爆発的な放出は、小胞が長期間にわたってオキサリプラチンの送達を維持できないことを示し、他方、循環においては、それにも拘わらず、これは、循環へのイン・ビボのオキサリプラチンの放出と直接的に相関することが具体的には示されなかった。イン・ビトロ（ＦＢＳ培地）でのオキサリプラチンの速い放出の発生は、製剤のマイナス面として捉えられ、それらの製剤は、それに続くイン・ビボでの研究においてより問題がある毒性をもたらし得る。イン・ビトロで遅い放出（３７℃において４８時間にわたって＜５％）を示した製剤は、潜在的に低い毒性の材料であると見なされた。しかしながら、（イン・ビトロで観察された）放出速度が、（イン・ビボでの腫瘍成長の抑制によって測定された）有効性についての適切な量の利用可能なオキサリプラチンを提供するかどうかについては明らかでなかった。一般に、オキサリプラチンの放出は、より短い鎖の脂肪酸（ＤＬＰＣ）で、および（全脂質に基づいて）より低いモル％のコレステロールで増加することが観察された。同等の鎖長の脂肪酸を含有するジ−アルキル−グリセロ−ホスファチジルコリンについては、不飽和を持つものは、完全飽和のカウンターパートよりも高いオキサリプラチンの放出速度を示した。

８０〜１２０ｎｍの体積平均サイズ、１００未満の封入比（オキサリプラチンに対する脂質）の小胞を提供し、４８時間にわたって＜２５％のイン・ビトロ放出を示したオキサリプラチンの製剤を、イン・ビボの研究で研究した。潜在的な薬物生成物であると考えられるオキサリプラチン製剤は、２つの重要な基準を満足しなければならない：
１）製剤化されたオキサリプラチンは、腫瘍成長を抑制し、好都合にはエロキサチンに匹敵する能力を保持しなければならない；
２）製剤化されたオキサリプラチンは、エロキサチンを上回るさらなる毒性を示してはならず、好ましくは、それはエロキサチンよりも優れた患者の安全性に対する利点を示さなければならない。

上記のイン・ビトロ基準を満足した製剤を、マウスにおけるＨＴ２９ヒト結腸直腸異種移植片腫瘍モデルを用いてイン・ビボで評価した。

４５ｍｇ／ｋｇ（単回投薬）または２５ｍｇ／ｋｇ（週１回の３回の投薬）の規定の投薬において死または有意な体重減少を引き起こした製剤は、毒性であると考えられた。これらの製剤は、低いコレステロール、短鎖製剤（≦Ｃ１４）、およびＤＯＰＣまたはＤｉＰｅｔＰＣのいずれかを含有する全ての製剤を含むものであった。両方の製剤は、両方の脂肪酸鎖が不飽和を含有するジ−アルキル−グリセロ−ホスファチジルコリンを含有する。これらの製剤の毒性の性質は、よく理解されておらず、それらのイン・ビトロの特徴に基づいて予測されなかった。事実、イン・ビトロで観察された放出速度および得られたＩＣ５０の値は、これらの研究で許容された、ＰＯＰＣ（不飽和を含有する単一鎖）を含有する製剤と実質的に同一であった。

遅いイン・ビトロ放出を示した全ての製剤は、２５ｍｇ／ｋｇの週１回の３回の投与後にほとんどまたは全く体重の減少が無く、許容できるものであった。これは、Ｃ１４よりも大きな飽和脂肪酸鎖を含有するジ−アルキルホスファチジルコリンを含有し、かつ少なくとも２５％（モル％）のコレステロールを含有する全ての製剤を含んだ。（１つの飽和脂肪酸および１つの不飽和脂肪酸を持つ）ＰＯＰＣおよびＳＯＰＣを含有する製剤は、２５ｍｇ／ｋｇの週１回の３回の投薬においてやはり良好な結果を与え、体重減少／毒性がほとんど、または全くなかった。この投与計画は、許容されたが、これらの製剤の最大耐性用量は決定されず、週１回の３回の投与について２５ｍｇ／ｋｇを超え得る。用量の低下は、依然として、２５ｍｇ／ｋｇ（週１回の３回の投薬）において許容できない毒性を生起させた製剤での毒性事象の無い有効性を提供し得る。オキサリプラチンの市販の製剤であるエロキサチンは、１０〜１５ｍｇ／ｋｇ（週１回の３回の投薬）のＭＴＤを有すると決定された。上記の結果から判断して、少なくとも１つの飽和脂肪酸を含有し、最小２５重量％のコレステロールと共にＣ１４よりも大きな鎖を含有する全ての製剤は、エロキサチンの１６７％のオキサリプラチン等価投与レベルを達成することができた。

許容できるイン・ビトロ基準を満足したオキサリプラチンの製剤を、マウスにおけるＨＴ２９ヒト結腸直腸異種移植片腫瘍モデルにおける有効性について評価した。各研究群において、比較として含めたのは、対照としての生理食塩水および（現在の至適基準としての）エロキサチンであった。（％Ｔ／Ｃ；処置対生理食塩水対照の腫瘍体積比によって判断して）有効性を示した製剤は、ＰＥＧ含有部分がＤＳＰＥを含有する限り、エロキサチンよりも良好な安全性プロフィールを有することが示された全ての製剤を含んだ。コレステロールを係留したＰＥＧを含有する製剤は、このモデルにおいては有効性を示さなかった。全ての場合において統計学的に有意ではなかったが、エロキサチンとの区別は、コレステロールを係留したＰＥＧ製剤、および２５ｍｇ／ｋｇの週１回の３回の投薬に対して許容できない耐性を示した製剤を除いて、全ての製剤について示された。両方のアルキル鎖が飽和したＰＣ部分を含有する製剤は、不飽和を持つ１つの鎖を含有するもの（ＰＯＰＣおよびＳＯＰＣ）よりも高い％Ｔ／Ｃを与えたと結論づけることは魅力的であった。しかしながら、これは、統計学的有意性でもって確証されなかった傾向にすぎなかった。該傾向に対する１つの例外は、飽和Ｃ２０鎖を含有するＰＣの場合においてであった。このＰＣでのより大きな有効性（より低い％Ｔ／Ｃ）は予期されず、または任意のイン・ビトロの研究に基づいて、およびその任意の物理的／科学的特性からも予測できなかった。

小胞からのオキサリプラチンの放出は、生物学的活性に必要であり、放出の速度は、腫瘍成長の抑制において重要な役割を演じていると推定される。上記の製剤についてイン・ビトロで観察されたオキサリプラチン放出速度の多様な範囲は、イン・ビトロ放出のイン・ビボ活性に対する関連性について重要な問題を生起させる。イン・ビトロで２０％の高い放出速度を与える製剤（ＰＯＰＣ含有）、および１〜２％の低い放出速度を与える製剤（ＤＳＰＣ、ＨＳＰＣ）は、全て、腫瘍成長を阻害し、マウスにおいて罹患率または有害な体重の減少を引き起こすことなく、エロキサチンよりも低い（または統計学的分析からエロキサチンと同等の）％Ｔ／Ｃを与えた。どのようにしてこれらの製剤がイン・ビボでのオキサリプラチン放出の関数としての有効性を生起したかは、まだ決定されていない。先に概略を説明したように、ＰＯＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）製剤（ＭＰ−３６２８）からのオキサリプラチン放出は、イン・ビボで広く研究されており、循環におけるオキサリプラチンの延長された放出プロフィールを実証した。従って、エロキサチンよりも大きくないとしても、エロキサチンと少なくとも同等の有効性を維持しながら、エロキサチンよりもより許容され得る一連の製剤が、本明細書で提供される。この一連の製剤は、
１）長さがＣ１４よりも大きい少なくとも１つの飽和脂肪酸鎖を持つＰＣ
２）両方の飽和脂肪酸鎖の長さがＣ１４よりも大きいＰＣ
３）１つの不飽和結合を含有し、長さがＣ１４よりも大きい１つの脂肪酸鎖を持つＰＣ
４）少なくとも２５モル％を含有する、製剤中のコレステロール
５）７．５モル％未満のＰＥＧ化ＰＣ
を含む。

驚くべきことに、全てのコレステロールレベルにおけるＤＯＰＣの使用は、対応するＰＯＰＣシリーズよりも大きな毒性を引き起こすようであった。遅いイン・ビトロ放出プロフィールを持つ製剤（すなわち、ＤＳＰＣおよびＨＳＰＣ）の使用は、有効性、特に、ジＣ２０ ＰＣ製剤で観察された異常に高い有効性（低い％Ｔ／Ｃ）を示すことも驚くべきことであった。

ここまで、明瞭性および理解の目的で、説明および実施例によって幾分詳細に記載してきたが、当業者であれば、ある種の変形および変更を添付の特許請求の範囲内で実施することができることを十分に理解するはずである。加えて、本明細書中で提供された各文献は、あたかも各文献が引用により個々に組み込まれるのと同等な程度に、引用によりその全体が組み込まれる。

Claims (27)

1. （ａ）約５０モル％〜約７０モル％のホスファチジルコリン脂質またはホスファチジルコリン脂質の混合物、約２５モル％〜約４５モル％のコレステロール、および約２モル％〜約８モル％のＰＥＧ−脂質より実質的になる双性イオン性リポソーム；および
   （ｂ）オキサリプラチンであって、該オキサリプラチン重量に対する全脂質重量の比が約２０：１〜約６５：１であるような量の、該リポソームに封入したオキサリプラチン；を含み、
   ここで、該ホスファチジルコリン脂質またはホスファチジルコリン脂質の混合物は、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ）、およびＤｉＣ２０ＰＣからなる群から選択される、
   該リポソームからのオキサリプラチンの放出速度が、ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水中において３７℃で４８時間にわたって約５％未満である、がんの処置用の組成物。
2. オキサリプラチンが、該オキサリプラチン重量に対する全脂質重量の比が約３０：１〜約４５：１であるような量の前記リポソームに封入されている、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ホスファチジルコリン脂質またはホスファチジルコリン脂質の混合物が、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）でも、ＨＳＰＣを含む混合物でもない、請求項１に記載の組成物。
4. 前記ホスファチジルコリン脂質がＰＯＰＣである、請求項１に記載の組成物。
5. 前記ＰＥＧ−脂質が、ジアシル−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］である、請求項１に記載の組成物。
6. 前記ＰＥＧ−脂質が、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００）およびジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）５０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−５０００）よりなる群から選択される請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
7. 前記双性イオン性リポソームが、約５５モル％のＤＳＰＣ、約４０モル％のコレステロール、および約５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）を含む、請求項１に記載の組成物。
8. 前記双性イオン性リポソームが、約６５モル％のＤＳＰＣ、約３０モル％のコレステロール、および約５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）を含む、請求項１に記載の組成物。
9. 前記オキサリプラチン重量に対する前記全脂質重量の比が約５０：１である、請求項７または請求項８に記載の組成物。
10. 前記オキサリプラチン重量に対する前記全脂質重量の比が約３０：１〜約３５：１である、請求項７または請求項８に記載の組成物。
11. 前記双性イオン性リポソームが、約７５ｎｍ〜約１２５ｎｍの平均粒径を有する、請求項１に記載の組成物。
12. 前記双性イオン性リポソームが、約９０ｎｍの平均粒径を有する、請求項１に記載の組成物。
13. 請求項１に記載の組成物を調製する方法であって、該方法が、以下：
    ａ）前記ホスファチジルコリン脂質、前記コレステロール、前記ＰＥＧ−脂質、およびＣ_１−４アルカノールおよびＣ_１−４アルカノール／水混合物よりなる群から選択される溶媒を含む脂質溶液を形成し；
    ｂ）該脂質溶液を水性緩衝液と混合して、多層小胞（ＭＬＶ）を形成し；
    ｃ）該ＭＬＶを多孔性フィルターを通して押し出して、小型単層小胞（ＳＵＶ）を形成し；
    ｄ）透析濾過を行って、該リポソーム製剤から封入されていないオキサリプラチンを除去し；
    それにより、該双性イオン性リポソームを形成することを含み、
    該オキサリプラチンを工程（ａ）または（ｂ）において含ませる、方法。
14. 前記オキサリプラチンの封入が、該オキサリプラチンを前記ＭＬＶの形成中に前記水性緩衝液に含めることによって行われる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記方法が、さらに；
    ｅ）前記双性イオン性リポソームを滅菌濾過すること
    を含む、請求項１３に記載の方法。
16. がんを処置するための医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物の使用。
17. 前記がんが膀胱がん、結腸直腸がん、胃がん、食道がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、および前立腺がんよりなる群から選択される固形腫瘍がんである、医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物の使用。
18. 前記組成物が：
    ａ）約５５モル％のＰＯＰＣ、約４０モル％のコレステロール、および約５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）より実質的になる双性イオン性リポソーム；および
    ｂ）オキサリプラチンであって、該オキサリプラチン重量に対する全脂質重量の比が約５０：１であるような量の、該リポソームに封入したオキサリプラチン
    を含む、医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物の使用。
19. 前記双性イオン性リポソームが、５０／４５／５のモル比のＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）；５０／４５／５のモル比のＰＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）；５０／４５／５のモル比のＤｉＣ２０ＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）；および５０／４５／５のモル比のＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）よりなる群から選択されるリポソームである、請求項１に記載の組成物。
20. 前記双性イオン性リポソームが、７０／２５／５のモル比のＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）を含む、請求項１に記載の組成物。
21. 前記双性イオン性リポソームが、６０／３５／５のモル比のＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）；６０／３５／５のモル比のＰＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）；６０／３５／５のモル比のＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）；および６０／３５／５のモル比のＤｉＣ２０ＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）よりなる群から選択されるリポソームである、請求項１に記載の組成物。
22. 前記双性イオン性リポソームが、５５／４０／５のモル比のＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）リポソームである、請求項１に記載の組成物。
23. 前記リポソームからのオキサリプラチンの放出速度が、ｐＨ依存的である、請求項１に記載の組成物。
24. 前記リポソームからのオキサリプラチンの放出速度が、ｐＨ７においてよりｐＨ５において高い、請求項２３に記載の組成物。
25. イン・ビボにおいて約５０未満の処置された腫瘍と対照腫瘍との体積比（％Ｔ／Ｃ）をもたらす、請求項１に記載の組成物。
26. イン・ビボにおいて少なくとも５０％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を示す、請求項１に記載の組成物。
27. 少なくとも約１０００μｇ／ｍｌの全白金濃度を含む、請求項１に記載の組成物。

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