WO2020159171A2 - 스트렙토니그린 및 항암제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

스트렙토니그린 및 항암제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method or pharmaceutical composition for preventing or treating colon cancer using streptonigreen and an anticancer agent.
  • the present invention relates to a method or pharmaceutical composition for preventing or treating 5-FU resistant colon cancer using streptonigreen.
  • Cancer cells can perform regular and elastic proliferation and suppression as needed, whereas cancer cells proliferate indefinitely, which is also called a tumor as a cell mass composed of undifferentiated cells. These cancer cells penetrate into surrounding tissues and metastasize to other organs of the body, causing serious pain and eventually death.
  • a tumor as a cell mass composed of undifferentiated cells.
  • These cancer cells penetrate into surrounding tissues and metastasize to other organs of the body, causing serious pain and eventually death.
  • the number of cancer patients in Korea has continuously increased, increasing by about 44% in the last 10 years, and the market for anticancer drugs has also increased internationally, and has been reported to have a size of about 100 billion dollars per year.
  • Anticancer drugs are chemotherapy drugs, which are first-generation anti-cancer drugs, and targeted anti-cancer drugs, which are second-generation anti-cancer drugs.
  • immuno-cancer drugs have been developed as third-generation anti-cancer drugs and research is ongoing.
  • the biggest problem in the treatment of cancer is the recurrence of cancer, which is why it is difficult to target a specific cancer due to various mutations in cancer, and resistance to anticancer drugs used in the treatment of recurrent cancer occurs. This is because the case is non-existent.
  • a strategy to mix and treat the anti-cancer agent has been proposed.
  • Transglutaminase (Transglutaminase 2, TGase2) is an enzyme that promotes the binding between ⁇ -carboxamide groups of glutamine residues bound to specific peptides and various amines. It is primarily known to play a major role in the prevention of damage, and in promoting defense and repair, but recent studies have shown that abnormally overexpressed neurodegenerative diseases, atherosclerosis, inflammatory diseases, and autoimmune diseases It has been reported that it can provide a cause for disease outbreaks.
  • TGase2 polymerizes and destabilizes p53 and thus disappears, and accordingly, it has been reported that TGase2 may have an anti-cancer effect on re-expressed kidney cancer through inhibition of TGase2.
  • Republic of Korea Patent Publication No. 10-2016-0009146 provides a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease caused by an increase in transglutaminase 2 activity including streptonigreen, pancreatic cancer, uterine cancer to the disease It is disclosed that breast cancer is included.
  • the present inventors have used streptonigreen and oxaliplatin or 5-FU, respectively, to treat and treat cancer cell lines, particularly colon cancer cell lines, as a result of diligent efforts to research and provide substances capable of significantly increasing anti-cancer activity when used in combination. It was confirmed that the case can show a significantly increased anticancer activity compared to the treatment alone, and the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a method or pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer using streptonigreen and an anticancer agent.
  • Another object of the present invention is to provide a method or pharmaceutical composition for preventing or treating 5-FU resistant colorectal cancer using streptonigreen.
  • the present invention provides a method for preventing or treating colon cancer, comprising administering streptonigrin and an anticancer agent to a colon cancer patient.
  • the anti-cancer agent may be oxaliplatin or 5-FU.
  • the streptonigreen and anticancer agent may be administered in a molar concentration ratio of 1: 1 to 1: 10 5 .
  • the present invention also provides a method for preventing or treating 5-FU-resistant colorectal cancer, comprising administering streptonigrin to a 5-FU-resistant colorectal cancer patient.
  • the 5-FU-resistant colon cancer may be over-expressing transglutaminase 2 (Transglutaminase 2).
  • the method may be to administer Streptonigreen and 5-FU together.
  • the Streptomyces you green and 5-FU is from 1: may be administered in a molar concentration ratio of 10 6: 1 to 1.
  • the present invention also provides pharmaceutical compositions for use in the prevention or treatment of colorectal cancer, including streptonigrin and anticancer agents.
  • the anti-cancer agent may be oxaliplatin or 5-FU.
  • the streptonigreen and anticancer agent may be included in a molar concentration ratio of 1: 1 to 1: 10 5 .
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of 5-FU resistant colorectal cancer, including streptonigrin.
  • the composition may further include 5-FU.
  • the Streptomyces you green and 5-FU is from 1: may be included at a molar concentration ratio of 10 6: 1 to 1.
  • the 5-FU-resistant colon cancer may be over-expressing transglutaminase 2 (Transglutaminase 2).
  • the method or composition using streptonigreen and other anticancer agents according to the present invention significantly inhibits the growth or growth of cancer cell lines, particularly colorectal cancer-related cell lines, and thus has a synergistic effect on anticancer activity, and thus is used for the prevention or treatment of colorectal cancer It is effective as a method to pharmaceutical composition.
  • Streptonigrin of the present invention is a TGase2 inhibitor produced by Streptomyces floculus, and refers to an antibiotic that causes chromosomal cleavage.
  • Oxaliplatin of the present invention is a vaccine-based antitumor agent-based drug, and is known to have an effect of inhibiting DNA replication of cancer cells.
  • 5-FU of the present invention is also called fluorouracil, and is known to inhibit DNA production by inhibiting thymidylate synthase.
  • the present invention can provide a method for preventing or treating colon cancer, comprising administering streptonigrin and an anticancer agent to a patient with colorectal cancer.
  • the anticancer agent of the present invention is oxaliplatin or 5-FU. That is, the method for preventing or treating colon cancer may be administered with streptonigreen and oxaliplatin, or with streptonigreen and 5-FU. The administration may be that the streptonigreen and the anticancer agent are administered simultaneously or sequentially.
  • the streptonigreen and anticancer agent of the present invention is preferably administered in a molar concentration ratio of 1: 1 to 1: 10 5 , more preferably 1: 10 to 1: 10 4 in molar concentration ratio, most It is most preferably administered in a molar concentration ratio of 1: 30 to 1: 10 3 .
  • the present invention can provide a method for preventing or treating 5-FU-resistant colon cancer, comprising administering streptonigrin to a 5-FU-resistant colon cancer patient.
  • the 5-FU-resistant colorectal cancer of the present invention may be to overexpress Transglutaminase 2 (Transglutaminase 2).
  • the method may be to administer Streptonigreen and 5-FU together.
  • the administration may be that Streptonigreen and 5-FU are administered simultaneously or sequentially.
  • the Streptomyces you green and 5-FU is from 1: it is desirable to be administered in a molar concentration ratio of 10 6: 1 to 1. More preferably, it is preferably administered at a molar concentration ratio of 1: 10 to 1: 10 5 , most preferably it is administered at a molar concentration ratio of 1: 100 to 1: 10 4 .
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of colon cancer, including streptonigrin and anticancer agents.
  • the anticancer agent of the present invention is oxaliplatin or 5-FU.
  • the pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of colorectal cancer may include streptonigreen and oxaliplatin, or streptonigreen and 5-FU.
  • the streptonigreen and anti-cancer agent of the present invention is preferably included in a molar concentration ratio of 1: 1 to 1: 10 5 , more preferably 1: 10 to 1: 10 4 may be included in a molar concentration ratio, most preferably It is most preferably included in a molar concentration ratio of 1: 30 to 1: 10 3 .
  • the present invention can also provide a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of 5-FU resistant colorectal cancer, including streptonigrin.
  • the composition may further include 5-FU.
  • the Streptomyces you green and 5-FU is from 1: is preferably included at a molar concentration ratio of 10 6: 1 to 1. More preferably, it is preferably included in a molar concentration ratio of 1: 10 to 1: 10 5 , most preferably it is included in a molar concentration ratio of 1: 100 to 1: 10 4 .
  • the 5-FU-resistant colorectal cancer of the present invention may be to overexpress Transglutaminase 2 (Transglutaminase 2).
  • the pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of colorectal cancer of the present invention may be a variety of oral or parenteral formulations.
  • one or more buffers e.g. saline or PBS
  • antioxidants e.g. bacteriostatic agents
  • chelating agents e.g. EDTA or glutathione
  • fillers e.g., extenders, binders
  • adjuvants e.g., Aluminum hydroxide
  • suspending agents e.g., thickener wetting agents, disintegrating agents or surfactants, diluents or excipients.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include at least one excipient in one or more compounds, such as starch (corn starch, wheat starch, rice starch, potato Starch, etc.), calcium carbonate, sucrose, lactose, dextrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol maltitol, cellulose, methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylmethyl -It is prepared by mixing cellulose or gelatin. For example, tablets or dragees can be obtained by blending the active ingredient with a solid excipient and then grinding it and adding a suitable adjuvant to the granule mixture.
  • starch corn starch, wheat starch, rice starch, potato Starch, etc.
  • calcium carbonate sucrose, lactose, dextrose, sorbitol, mannitol, xylitol,
  • lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are used in addition to simple excipients.
  • Liquid preparations for oral administration include suspending agents, intravenous solutions, emulsions or syrups, etc.
  • simple diluents such as water and liquid paraffin
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, flavoring agents or preservatives, are included.
  • cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid, or sodium alginate may be added as a disintegrant, and may further include an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, and a preservative. .
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspension solutions, emulsions, lyophilized preparations or suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • injectable ester such as ethyl oleate
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerol, gelatin, etc. may be used.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and when applied parenterally, externally applied to the skin; Injections that are injected intraperitoneally, rectal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dura mater or cerebrovascular; Transdermal administration; Alternatively, nasal inhalants may be formulated according to methods known in the art.
  • suitable carriers for injections include, but are not limited to, water, ethanol, polyols (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycols, etc.), mixtures thereof and/or solvents or vegetable media comprising vegetable oils Can. More preferably, suitable carriers include Hanks' solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) with ethanol amine or sterile water for injection, isotonic solutions such as 10% ethanol, 40% propylene glycol and 5% dextrose. Etc. can be used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the injection may further include various antibacterial and antifungal agents such as paraben, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like.
  • the injection may additionally include an isotonic agent such as sugar or sodium chloride in most cases.
  • transdermal administration means that the pharmaceutical composition is topically administered to the skin, so that an effective amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition is delivered into the skin.
  • the compounds used according to the invention may be pressurized packs or, using suitable propellants, such as dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas. It can be conveniently delivered in the form of an aerosol spray from a nebulizer.
  • the dosage unit can be determined by providing a valve that delivers a metered amount.
  • gelatin capsules and cartridges used in inhalers or insufflators can be formulated to contain a powder mixture of a compound and a suitable powder base such as lactose or starch. Formulations for parenteral administration are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975.Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour, a prescription generally known to all pharmaceutical chemistries.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating colon cancer of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • a pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat the disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the patient's disease type, severity, drug activity, drug sensitivity, and administration time , The route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including co-drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple.
  • the total effective amount of the composition of the present invention can be administered to a patient in a single dose, and can be administered by a fractionated treatment protocol that is administered for a long time in multiple doses. . Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate, and disease severity.
  • a daily dose when administered parenterally, it is preferably administered in an amount of 0.01 to 50 mg per kg of body weight per day, more preferably 0.1 to 30 mg per kg of body weight per day, based on streptonigreen and an anticancer agent used in combination, and orally
  • it can be divided into 1 to several times to be administered in an amount of preferably 0.01 to 100 mg, more preferably 0.01 to 10 mg per 1 kg of body weight per day, based on the streptonigreen of the present invention and the anticancer agent used in combination with the present invention. have.
  • the dosage since the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormonal therapy, chemotherapy and biological response modifiers.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also be provided as a formulation of an external preparation containing streptonigreen and an anticancer agent used in combination therewith as an active ingredient.
  • an external preparation for skin fat substances, organic solvents, solubilizers, thickeners and gelling agents, emollients, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents ), fragrance, surfactant, water, ionic emulsifier, nonionic emulsifier, filler, metal ion blocker, chelating agent, preservative, vitamin, blocker, wetting agent, essential oil, dye, pigment, hydrophilic active agent, lipophilic active agent Or it may contain an adjuvant commonly used in the field of skin science, such as any other ingredients commonly used in external preparations for skin such as lipid vesicles.
  • the ingredients may be introduced in an amount commonly used in the field of skin science.
  • the pharmaceutical composition for preventing and treating colon cancer of the present invention is provided as an external preparation for skin
  • the present invention is not limited thereto, and may be a formulation such as ointment, patch, gel, cream or spray.
  • the present invention is to prevent or treat colorectal cancer because the effect of inhibiting growth against colorectal cancer cell lines is significantly increased compared to the case of treating each alone by including streptonigreen and oxaliplatin or streptonigreen and 5-FU. It may be provided as a method to a pharmaceutical composition.
  • anti-cancer activity is shown even when streptonigrin is treated alone, but synergism occurs when streptonigrin and 5-FU are used in combination, indicating a significantly increased anti-cancer activity. have.
  • Figure 1 is compared to the treatment of strepttonitrile (STN), oxaliplatin (Oxaliplatin), or 5-FU in colon cancer cell lines, respectively, compared to treatment with streptonigreen and oxaliplatin or streptonigreen and 5-FU, respectively.
  • STN strepttonitrile
  • Oxaliplatin oxaliplatin
  • 5-FU 5-FU
  • FIG. 2 shows that synergistic effects on anticancer activity did not occur even when streptonirin (STN) and cisplatin or streptonirin and paclitaxel were used in combination with colon cancer cell lines, respectively, but rather each alone was treated. It also indicates that anti-cancer activity is lower than in the case where it is performed.
  • STN streptonirin
  • cisplatin or streptonirin and paclitaxel were used in combination with colon cancer cell lines, respectively, but rather each alone was treated. It also indicates that anti-cancer activity is lower than in the case where it is performed.
  • TGase 2 transglutaminase 2
  • FR 5-FU resistant colorectal cancer cell line
  • HCT-15 wild-type colorectal cancer cell line
  • Figure 4 shows the survival rate of 5-FU-resistant colon cancer cell lines (Resistance) and wild-type colorectal cancer cell lines (WT) by treating 5-FU by concentration.
  • RST wild-type colorectal cancer cell lines
  • Figure 6 shows the volume change in the case of treating streptonigreen and/or 5-FU in the colon cancer cell line (HCT116). It was confirmed that the volume of the tumor was significantly reduced when the treatment was performed in combination with streptonigrin and 5-FU compared to the case where streptonigrin or 5-FU was treated alone.
  • Figure 7 shows the change in weight when treating streptonigreen and/or 5-FU in the colon cancer cell line (HCT116). It was confirmed that the weight of the tumor was significantly reduced when streptonigreen and 5-FU were used in combination, compared to the case of treating streptonigrin or 5-FU alone.
  • the COLO205, HCT-116, KM-12, HCT-15, HCT-8, SW-620 and HT29 cell lines were obtained from the National Cancer Institute (MTA: 2702-09), and the DLD1 cell line was obtained from a Korean cell line bank. .
  • Cells were cultured in complete RPMI 1640 medium (Hyclone, UT, USA) containing 10% fetal calf serum (Hyclone, UT, USA) in an environment of 37° C., 5% CO 2 and 100% humidity, respectively.
  • the 5-FU resistant colorectal cancer cell line HCT-15-FR was prepared by exposing the HCT-15 cell line to a 5-FU concentration gradient. Specifically, HCT-15 cells were cultured in RPMI 1640 medium without drugs for 24 hours, and then, the medium was replaced with complete medium to which 5 ⁇ M 5-FU was added and cultured for 72 hours. When the cells grew to 80% (confluence), the above steps were repeated several times. As a result, HCT-15 cells cultured until stable growth at 100 ⁇ M of 5-FU, that is, 5-FU resistant cell line HCT15-FR was obtained.
  • Cells (100 ⁇ l) were seeded in 96-well microtiter plates with plating density of 5000 to 40000 cells/well depending on the doubling time of individual cell lines. After incubation for 24 hours before drug addition, anticancer agents were added to each well and the culture was incubated at 37°C for 48 hours. Cells were fixed in 50% trichloroacetic acid (50 ⁇ l/well), and then incubated at 4° C. for 1 hour. The liquid was removed from the plate, then rinsed 5 times with water and dried at room temperature for about 12-24 hours.
  • the fixed cells were stained with 100 ⁇ l SRB for 5 minutes at room temperature, and then the plates were washed 3 times with 1% glacial acetic acid and dried for about 12 to 24 hours at room temperature. SRB staining was then solubilized in 10 mM Trizma base and absorbance read at 515 nm. The effect of the drug was expressed as GI50 (50% growth inhibition), TGI (total growth inhibition) or LC50 (lethal concentration).
  • Total cell lysates of wild-type HCT-15 cell line (WT) or 5-FU resistant colorectal cancer cell line HCT15-FR(FR) include 150 mM sodium chloride, 1.0% IGEPAL CA-630 (NP-40), in addition to 50 mM Tris-HCl. Prepared using RIPA buffer (pH 8.0) containing a mixture of 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, protease inhibitor and phosphatase inhibitor. Protein analysis was performed using BCA protein analysis (Thermo Fisher, IL, USA) to normalize the protein.
  • Proteins were analyzed by SDS-PAGE and transferred to a Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Merck Millipore, MA, USA).
  • PVDF Polyvinylidene difluoride
  • the membrane was blocked in 5% BSA for 1 hour at room temperature and incubated overnight at 4° C. with the indicated antibody.
  • the membrane was then washed with TBS-T for 1 hour at room temperature, and then incubated with horseradish peroxidase-binding secondary antibody for 1 hour at room temperature. After incubation, the membrane was washed with TBS-T for 1 hour at room temperature to confirm by enhanced chemiluminescence (ECL).
  • ECL enhanced chemiluminescence
  • the colon cancer cell lines COLO205, HCT-116, KM-12, HCT-15, HCT-8, SW-620, DLD1 and HT29 have streptonigreen (STN) of 20 nM, oxaliplatin of 1 ⁇ M, cisplatin ( cisplatin) was treated with 20 ⁇ M, paclitaxel with 20 nM and 5-FU with 5 ⁇ M, respectively, or in combination, and the survival rate of the colorectal cancer cell line was confirmed by the method of ⁇ Example 2>.
  • STN streptonigreen
  • oxaliplatin 1 ⁇ M
  • cisplatin cisplatin
  • streptonigreen and oxaliplatin or streptonigreen and 5-FU are used in combination with streptonigreen, oxaliplatin, or 5-FU, respectively, in colon cancer cell lines.
  • combi When treated with (combi), it was confirmed that the anticancer activity against colon cancer cell lines was effectively increased.
  • streptonigrin when used in combination with oxaliplatin, it is effective for HCT-116 and DLD1 cell lines, and when streptonigrin and 5-FU are used in combination, it is confirmed that HCT-116 cell line effectively exhibits anticancer activity.
  • the 5-FU resistant colon cancer cell line (HCT-15FR) and wild-type colorectal cancer cell line (WT) prepared in ⁇ Example 1> were treated with 20 nM and 50 ⁇ M of struttonigrin, respectively, or in combination with 5-FU 50 ⁇ M. After that, the survival rate of the colorectal cancer cell line was confirmed by the method of ⁇ Example 2>.
  • 5-FU resistant colorectal cancer cell line (HCT-15FR) is treated with streptonigrin or 5-FU, respectively, when treated in combination (combination), anticancer activity is significant. It was confirmed that the enemy increased.
  • mice were divided into 4 groups: solvent control (Control), streptonigrin, 5-FU, and 5-FU combination with streptonigrin (Streptonigrin + 5-FU, Combination).
  • Streptonigreen 0.1 mg/kg body weight
  • 5-FU 40 mg/kg body weight
  • solvent 1% DMSO + 99% PBS
  • the method or composition using streptonigreen and other anticancer agents according to the present invention significantly inhibits the growth or growth of cancer cell lines, particularly colorectal cancer-related cell lines, and thus has a synergistic effect on anticancer activity, and thus is used for the prevention or treatment of colorectal cancer It can be effective as a method to a pharmaceutical composition for industrial use.

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Abstract

본 발명은 스트렙토니그린 및 항암제를 이용하여 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 방법 내지 약학적 조성물에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 스트렙토니그린을 이용하여 5-FU 내성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 방법 내지 약학적 조성물에 대한 것이다. 본 발명은 스트렙토니그린과 옥살리플라틴 또는 스트렙토니그린과 5-FU를 포함함으로써 대장암 세포주에 대하여 생장을 억제하는 효과가 각각 단독으로 처리하는 경우에 비하여 유의적으로 상승하므로 대장암 예방 또는 치료하기 위한 방법 내지 약학적 조성물로 제공될 수 있다. 또한, 5-FU 내성 대장암 세포주의 경우 스트렙토니그린을 단독으로 처리하여도 항암 활성이 나타나지만 스트렙토니그린과 5-FU을 병용하여 처리하는 경우 시너지가 발생하여 유의적으로 증가한 항암 활성을 나타낼 수 있다.

Description

스트렙토니그린 및 항암제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 출원은 2019년 02월 01일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0013360호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 스트렙토니그린 및 항암제를 이용하여 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 방법 내지 약학적 조성물에 대한 것이다.
또한, 본 발명은 스트렙토니그린을 이용하여 5-FU 내성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 방법 내지 약학적 조성물에 대한 것이다.
정상세포는 필요에 따라 규칙적이고 탄력적인 증식과 억제를 할 수 있는 반면에 암세포는 무제한의 증식을 하며, 이는 미분화 세포로 구성된 세포덩어리로서 종양이라고도 한다. 이러한 암세포는 주위의 조직으로 침투하고 신체의 다른 기관으로 전이가 되어 심각한 고통을 수반하고 결국 죽음을 초래한다. 의학의 발전에도 불구하고, 국내 암환자 발생자수는 지속적으로 증가하여 최근 10년간 약 44%가 증가하였으며, 국제적으로도 항암제 시장 역시 증가하여 연간 약 1000억 달러의 규모를 가지는 것으로 보고된 바 있다.
항암제는 1세대 항암제인 화학항암제, 2세대 항암제인 표적항암제가 있으며, 이들의 부작용을 극복하고자 3세대 항암제로서 면역항암제가 개발되어 계속적으로 연구가 진행되고 있다. 그러나 현재 암 치료에서 가장 큰 문제가 되는 점은 암의 재발에 있는데 그 이유는 암의 돌연변이가 다양하여 특정 암을 표적으로 하는 것이 어려울 뿐더러, 재발된 암의 치료 과정에서 사용한 항암제에 내성이 발생하는 경우가 비일비재하기 때문이다. 결국, 원발암을 치료한 이후에도 전이 및 재발한 암에 의해 환자가 사망하는 경우가 대부분이다. 이에 따라, 항암제의 효과를 증진시키기 위해, 항암제를 혼합하여 병용치료하고자 하는 전략이 제시되고 있다.
트랜스글루타미나제(Transglutaminase 2, TGase2)는 특이 펩티드에 결합된 글루타민 잔기의 γ-카르복사미드기와 다양한 아민들 사이의 결합을 촉진하는 효소이다. 이는 일차적으로는 손상의 예방과 방어 및 복구를 촉진하는데 있어서 주요한 역할을 하는 것으로 알려졌으나, 최근 연구에 의하면 비정상적으로 과도한 발현이 나타나면 신경퇴행성 질환, 죽상동맥경화증, 염증성 질환, 및 자가면역 질환과 같은 질병의 발생에 원인을 제공할 수 있는 것으로 보고된 바 있다. 특히, TGase2의 발현이 p53을 중합화하고 불안정하게 하여 소멸시킨다는 것이 보고되었으며, 이에 따라 TGase2의 억제를 통해 TGase2가 과발현된 신장암에 대한 항암 효과를 나타낼 수 있음이 보고된 바 있다.
대한민국 공개특허 제 10-2016-0009146호 에서는 스트렙토니그린을 포함하는 트랜스글루타미나제2 활성 증가에 의해 초래되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제공하면서, 상기 질병에 췌장암, 자궁암 내지 유방암이 포함된다고 개시하고 있다.
그러나, 스트렙토니그린과 다른 항암제를 병용하여 암세포의 생장 억제 등 그 항암효과에 시너지 효과를 발생시키고자 하는 연구 내지 기재는 개시된바 없다.
이에, 본 발명자들은 병용하는 경우 유의적으로 상승한 항암 활성을 나타낼 수 있는 물질들을 연구 및 제공하고자 예의 노력한 결과 스트렙토니그린과 옥살리플라틴 또는 5-FU를 각각 병용하여 암세포주, 특히 대장암 세포주에 처리하는 경우 단독으로 처리하는 경우에 비하여 유의적으로 증가한 항암 활성을 나타낼 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 스트렙토니그린 및 항암제를 이용하여 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 방법 내지 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토니그린을 이용하여 5-FU 내성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 방법 내지 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 스트렙토니그린(streptonigrin) 및 항암제를 대장암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 대장암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin) 또는 5-FU인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 스트렙토니그린 및 항암제는 1 : 1 내지 1 : 105 의 몰농도비로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 스트렙토니그린(streptonigrin)을 5-FU 내성 대장암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 5-FU 내성 대장암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 5-FU 내성 대장암은 트랜스글루타미네이즈 2(Transglutaminase 2)를 과발현하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 방법은 스트렙토니그린과 5-FU를 함께 투여하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 스트렙토니그린 및 5-FU는 1 : 1 내지 1 : 106 의 몰농도비로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 스트렙토니그린(streptonigrin) 및 항암제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin) 또는 5-FU인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 스트렙토니그린 및 항암제는 1 : 1 내지 1 : 105 의 몰농도비로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 스트렙토니그린(streptonigrin)를 포함하는 5-FU 내성 대장암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 5-FU를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 스트렙토니그린 및 5-FU는 1 : 1 내지 1 : 106 의 몰농도비로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 5-FU 내성 대장암은 트랜스글루타미네이즈 2(Transglutaminase 2)를 과발현하는 것일 수 있다.
상술한 바와 같이, 종래 기술에서는 암 환자에 대하여 항암제를 사용하는 항암제에 대한 내성이 발생할 우려가 있다는 문제점이 존재하였으며, 스트렙토니그린의 트랜스글루타미나제(TGase2) 억제 효과를 이용하여 항암효과를 나타낼 수 있음을 확인하고 있었을 뿐 이와 병용하는 경우 유의적으로 항암효과가 증가하는 항암제와의 시너지 효과에 대한 연구 내지 기재는 개시된 바 없었다.
본 발명에 따른 스트렙토니그린과 다른 항암제를 이용하는 방법 내지 조성물은 암 세포주, 특히 대장암 관련 세포주들의 성장 내지 생장을 유의적으로 억제하여 항암 활성에 시너지 효과를 나타내므로, 대장암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 방법 내지 약학적 조성물로서 효과적이다.
본 발명의 스트렙토니그린(streptonigrin)은 스트렙토마이세스 플로쿨루스(Streptomyces floculus)에 의해 생산되는 TGase2 억제제로서, 염색체 절단을 일으키는 항생물질을 말한다.
본 발명의 옥살리플라틴(oxaliplatin)은 백신에 기초하는 항종양제제 계열의 약물로서, 암 세포의 DNA 복제를 억제하는 효과를 가지는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 5-FU는 플루오르아실(fluorouracil)로도 불리며 티미딜산합성효소(thymidylate synthase)를 억제하여 DNA 생산을 억제하는 것으로 알려져 있다.
대장암 세포주에 스트렙토니그린과 옥살리플라틴을 병용하거나, 스트렙토니그린과 5-FU를 병용하여 포함하는 조성물을 처리하는 경우 스트렙토니그린, 옥살리플라틴 또는 5-FU를 각각 단독으로 처리하는 경우에 비하여 유의적으로 상승한 대장암 세포주 생존 내지 성장을 억제하는 효과가 발생할 수 있다([도 1], [도 6] 및 [도 7]). 그러나 스트렙토니그린이 모든 항암제에 대하여 시너지 효과를 발생시킬 수 있는 것은 아니다. 스트렙토니그린과 시스플라틴 또는 스트렙토니그린과 파클리탁셀을 병용하는 경우에는 항암활성에 대하여 시너지 효과가 발생하지 않았으며 오히려 단독처리군에 비하여 항암활성이 감소할 수 있다(도 2).
항암제, 특히 5-FU에 대하여 내성을 갖는 대장암 세포주에 스트렙토니그린을 단독으로 처리하는 경우 효과적으로 그 생존을 억제할 수 있다. 그러나 상기 세포주에 스트렙토니그린 및 5-FU를 병용하여 처리하는 경우 유의적으로 시너지 효과가 발생하여 더욱 상승한 세포주 생존 억제 효과를 얻을 수 있다(도 5). 이는 5-FU에 대하여 내성을 갖는 대장암 세포주의 경우 트렌스글루타미나아제 2를 과발현하기 때문인 것으로 추측할 수 있다(도 4).
따라서, 본 발명은 스트렙토니그린(streptonigrin) 및 항암제를 대장암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 대장암 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 상기 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin) 또는 5-FU인 것이 바람직하다. 즉, 상기 대장암 예방 또는 치료방법은 스트렙토니그린과 옥살리플라틴을 투여하거나, 스트렙토니그린과 5-FU를 투여할 수 있다. 상기 투여는 스트렙토니그린과 항암제가 동시에 투여되거나 또는 순차적으로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 스트렙토니그린 및 항암제는 1 : 1 내지 1 : 105 의 몰농도비로 투여되는 것이 바람직하나, 더욱 바람직하게는 1 : 10 내지 1 : 104 의 몰농도비로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 : 30 내지 1 : 103 의 몰농도비로 투여되는 것이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명은 스트렙토니그린(streptonigrin)을 5-FU 내성 대장암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 5-FU 내성 대장암 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 상기 5-FU 내성 대장암은 트랜스글루타미네이즈 2(Transglutaminase 2)를 과발현하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 방법은 스트렙토니그린과 5-FU를 함께 투여하는 것일 수 있다. 상기 투여는 스트렙토니그린과 5-FU가 동시에 투여되거나 또는 순차적으로 투여되는 것일 수 있다.
상기 스트렙토니그린 및 5-FU는 1 : 1 내지 1 : 106 의 몰농도비로 투여되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 1 : 10 내지 1 : 105 의 몰농도비로 투여되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 1 : 100 내지 1 : 104 의 몰농도비로 투여되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 스트렙토니그린(streptonigrin) 및 항암제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 상기 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin) 또는 5-FU인 것이 바람직하다. 즉, 상기 대장암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물은 스트렙토니그린과 옥살리플라틴이 포함되거나, 스트렙토니그린과 5-FU가 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 스트렙토니그린 및 항암제는 1 : 1 내지 1 : 105 의 몰농도비로 포함되는 것이 바람직하나, 더욱 바람직하게는 1 : 10 내지 1 : 104 의 몰농도비로 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 : 30 내지 1 : 103 의 몰농도비로 포함되는 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 또한, 스트렙토니그린(streptonigrin)를 포함하는 5-FU 내성 대장암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 5-FU를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 스트렙토니그린 및 5-FU는 1 : 1 내지 1 : 106 의 몰농도비로 포함되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 1 : 10 내지 1 : 105 의 몰농도비로 포함되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 1 : 100 내지 1 : 104 의 몰농도비로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 5-FU 내성 대장암은 트랜스글루타미네이즈 2(Transglutaminase 2)를 과발현하는 것일 수 있다.
본 발명의 대장암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제; 경피 투여제; 또는 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 경피 투여는 약학 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다. 비경구 투여용 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 스트렙토니그린 및 이와 병용하는 항암제를 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여 시는 본 발명의 스트렙토니그린 및 이와 병용하는 항암제을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 스트렙토니그린 및 이와 병용하는 항암제를 유효성분으로 포함하는 외용제의 제형으로 제공할 수 있다. 본 발명의 대장암 예방 및 치료용 약학 조성물을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 대장암 예방 및 치료용 약학 조성물이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.
본 발명은 스트렙토니그린과 옥살리플라틴 또는 스트렙토니그린과 5-FU를 포함함으로써 대장암 세포주에 대하여 생장을 억제하는 효과가 각각 단독으로 처리하는 경우에 비하여 유의적으로 상승하므로 대장암 예방 또는 치료하기 위한 방법 내지 약학적 조성물로 제공될 수 있다. 또한, 5-FU 내성 대장암 세포주의 경우 스트렙토니그린을 단독으로 처리하여도 항암 활성이 나타나지만 스트렙토니그린과 5-FU을 병용하여 처리하는 경우 시너지가 발생하여 유의적으로 증가한 항암 활성을 나타낼 수 있다.
도 1은 대장암 세포주들에 스트렙토니그린(STN), 옥살리플라틴(Oxaliplatin) 또는 5-FU를 각각 단독으로 처리하는 경우에 비하여 스트렙토니그린과 옥살리플라틴 또는 스트렙토니그린과 5-FU를 각각 병용하여 처리하는 경우(combi) 대장암 세포주들에 대한 항암 활성이 효과적으로 증가하는 것을 나타낸다. 특히, 스트렙토니그린을 옥살리플라틴과 병용하는 경우 HCT-116 및 DLD1 세포주에 효과적이며, 스트렙토니그린과 5-FU를 병용하는 경우에는 HCT-116 세포주에 효과적으로 항암활성을 나타나는 것을 확인하였다.
도 2는 대장암 세포주들에 스트렙토니그린(STN)과 시스플라틴(cisplatin) 또는 스트렙토니그린과 파클리탁셀(paclitaxel)을 각각 병용하여 처리하더라도 항암 활성에 대한 시너지효과가 발생하지 않았으며 오히려 각각 단독으로 처리하는 경우에 비하여 항암 활성이 떨어지는 경우도 발생하는 것을 나타낸다.
도 3은 5-FU 내성 대장암 세포주(FR) 및 야생형 대장암 세포주(HCT-15, WT)의 트렌스글루타미나아제 2(TGase 2)의 발현 수준을 나타낸다. WT에 비하여 FR에서 TGase 2의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.
도 4는 5-FU 내성 대장암 세포주(Resistance) 및 야생형 대장암 세포주(WT)들에 5-FU를 농도별로 처리하는 경우 그 생존률을 나타낸다. 1μM의 5-FU를 처리하는 경우 생존률이 감소하기 시작하는 WT에 비하여, 5-FU 내성 대장암 세포주의 경우 100μM의 5-FU를 처리하여도 이의 세포 생존률에 영향이 없음을 확인할 수 있었다.
도 5는 5-FU 내성 대장암 세포주(HCT-15FR)에 스트렙토니그린 또는 5-FU를 각각 단독으로 처리하는 경우보다 병용하여 처리하는 경우(combination) 항암 활성이 유의적으로 증가하는 것을 나타낸다.
도 6은 대장암 세포주(HCT116)에 스트렙토니그린 및/또는 5-FU를 처리하는 경우 그 부피 변화를 나타낸다. 스트렙토니그린 또는 5-FU를 각각 단독으로 처리하는 경우에 비하여 스트렙토니그린 및 5-FU를 병용하여 처리하는 경우 종양의 부피가 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
도 7은 대장암 세포주(HCT116)에 스트렙토니그린 및/또는 5-FU를 처리하는 경우 그 무게 변화를 나타낸다. 스트렙토니그린 또는 5-FU를 각각 단독으로 처리하는 경우에 비하여 스트렙토니그린 및 5-FU를 병용하여 처리하는 경우 종양의 무게가 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 1]
대장암 세포주 배양
COLO205, HCT-116, KM-12, HCT-15, HCT-8, SW-620 및 HT29 세포주는 국립암센터(National Cancer Institute; MTA: 2702-09)에서, DLD1 세포주는 한국 세포주 은행에서 입수하였다. 세포들은 각각 37 ℃, 5 % CO2 및 100 % 습도의 환경에서 10 % 소태아 혈청(Hyclone, UT, USA)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지(Hyclone, UT, USA)에서 배양하였다.
5-FU 내성 대장암 세포주 HCT-15-FR는 HCT-15 세포주를 5-FU 농도 구배(gradient)에 노출시켜 제작하였다. 구체적으로, HCT-15 세포를 약물이 없는 RPMI 1640 배지에서 24 시간 동안 배양한 다음, 배지를 5μM 5-FU를 첨가한 완전 배지로 교체한 후 72시간 동안 배양하였다. 세포가 80 %(confluence) 정도 성장하면, 상기 단계를 수 회 반복하였다. 결과적으로, 100 μM의 5-FU에서 안정적으로 성장할 때까지 배양된 HCT-15 세포, 즉 5-FU 내성 세포주 HCT15-FR 를 수득하였다.
[실시예 2]
항증식 활성을 위한 SRB 분석
세포(100㎕)를 개별 세포주의 배가 시간(doubling time)에 따라 5000 내지 40000 세포/웰의 도금 밀도로 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 접종하였다. 약물 첨가 전까지 24 시간 동안 배양한 후 항암제를 각 웰에 첨가하고 배양액을 37 ℃ 에서 48 시간 동안 배양하였다. 세포를 50 % 트리클로로 아세트산(50㎕/웰)에 고정시킨 후, 4 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 액체를 플레이트에서 제거한 다음, 물로 5 회 헹구고 약 12-24 시간 동안 실온에서 건조시켰다. 고정된 세포를 100 ㎕ SRB로 5 분 동안 실온에서 염색한 후, 플레이트를 1 % 빙초산으로 3 회 세척하고 실온에서 약 12 내지 24 시간 동안 건조시켰다. 이어서, SRB 염색을 10 mM Trizma 염기에서 가용화시키고 515 nm에서 흡광도를 판독하였다. 약물의 효과는 GI50(50 % 성장 억제; 50 % growth inhibition), TGI(총 성장억제; total growth inhibition) 또는 LC50(치사 농도; lethal concentration)으로 나타냈다.
[실시예 3]
웨스턴 블랏팅
야생형 HCT-15 세포주(WT) 또는 5-FU 내성 대장암 세포주 HCT15-FR(FR)의 전체 세포 용해물은 50 mM Tris-HCl 외에 150 mM 염화나트륨, 1.0 % IGEPAL CA-630(NP-40), 0.5 % 나트륨 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 0.1 % 나트륨 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), 프로테아제 억제제 및 포스파타아제 억제제의 혼합제를 함유하는 RIPA 완충액(pH 8.0)을 이용하여 준비되었다. 단백질 분석은 단백질을 정상화하기 위해 BCA 단백질 분석(Thermo Fisher, IL, USA)을 사용하여 수행되었다. 단백질을 SDS-PAGE로 분석하고 Polyvinylidene difluoride (PVDF) 막(Merck Millipore, MA, USA)으로 옮겼다. 막은 실온에서 1 시간 동안 5 % BSA에서 블락되었으며, 표시된 항체와 함께 밤새 4 ℃에서 배양했다. 그 후 막을 실온에서 1 시간 동안 TBS-T로 세척한 후, 실온에서 1 시간 동안 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)-결합 2 차 항체와 함께 배양하였다. 배양 후, 막을 실온에서 1 시간 동안 TBS-T로 세척하여 ECL(enhanced chemiluminescence)로 확인하였다.
그 결과, [도 3]에서 나타나는 바와 같이 트렌스글루타미나아제 2(TGase 2)의 발현 수준이 WT에 비하여 FR에서 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 4]
스트렙토니그린 및 항암제의 병용 효과 확인
야생형 대장암 세포주, 즉 5-FU에 대하여 내성이 없는 대장암 세포주들에 스트렙토니그린 및 항암제(옥살리플라틴 또는 시스플라틴)를 병용하는 경우 항암 활성에 시너지가 발생하는지 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 대장암 세포주 COLO205, HCT-116, KM-12, HCT-15, HCT-8, SW-620, DLD1 및 HT29에 스트렙토니그린(STN)은 20nM, 옥살리플라틴(Oxaliplatin)은 1μM, 시스플라틴(cisplatin)은 20μM, 파클리탁셀(paclitaxel)은 20nM 및 5-FU는 5μM 씩 각각 또는 병용하여 처리하고 상기 <실시예 2>의 방법으로 대장암 세포주의 생존률을 확인하였다.
그 결과, [도 1]에서 나타나는 바와 같이 대장암 세포주들에 스트렙토니그린, 옥살리플라틴 또는 5-FU를 각각 단독으로 처리하는 경우에 비하여 스트렙토니그린과 옥살리플라틴 또는 스트렙토니그린과 5-FU를 각각 병용하여 처리하는 경우(combi) 대장암 세포주들에 대한 항암 활성이 효과적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 스트렙토니그린을 옥살리플라틴과 병용하는 경우 HCT-116 및 DLD1 세포주에 효과적이며, 스트렙토니그린과 5-FU를 병용하는 경우에는 HCT-116 세포주에 효과적으로 항암활성을 나타나는 것을 확인하였다.
다만, [도 2]에서 나타나는 바와 같이 대장암 세포주들에 스트렙토니그린과 시스플라틴 또는 스트렙토니그린과 파클리탁셀을 각각 병용하여 처리하는 경우에는 항암 활성에 대한 시너지효과가 발생하지 않았으며 오히려 각각 단독으로 처리하는 경우에 비하여 항암 활성이 떨어지는 경우도 발생하는 것을 확인하였다.
[실시예 5]
스트렙토니그린 및 5-FU의 병용 효과 확인
본 발명에서 제조한 5-FU 내성 대장암 세포주에 스트렙토니그린 및 5-FU를 병용하여 처리하는 경우 항암 활성에 시너지가 발생하는지 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 제조한 5-FU 내성 대장암 세포주(Resistance) 및 야생형 대장암 세포주(WT)에 5-FU를 농도별(1nM, 10nM, 100nM, 1μM, 10μM 및 100μM)로 처리한 후 세포의 생존률을 확인하였다. 또한, 상기 <실시예 1>에서 제조한 5-FU 내성 대장암 세포주(HCT-15FR) 및 야생형 대장암 세포주(WT)에 스트렙토니그린(streptonigrin) 20nM 및 5-FU 50μM를 각각 또는 병용하여 처리한 후 상기 <실시예 2>의 방법으로 대장암 세포주의 생존률을 확인하였다.
그 결과, [도 4]에서 나타나는 바와 같이 1μM의 5-FU를 처리하는 경우 생존률이 감소하기 시작하는 WT에 비하여, 5-FU 내성 대장암 세포주의 경우 100μM의 5-FU를 처리하여도 이의 세포 생존률에 영향이 없음을 확인하였다.
또한, [도 5]에서 나타나는 바와 같이 5-FU 내성 대장암 세포주(HCT-15FR)에 스트렙토니그린 또는 5-FU를 각각 단독으로 처리하는 경우보다 병용하여 처리하는 경우(combination) 항암 활성이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 6]
전임상 이종이식 종양 모델
본 발명의 실험은 실험실 동물연구소(Institute Of Laboratory Animals Research)를 따르는 미국 국립암센터 연구소(AAALAC International)의 인증을 받은 국립암센터 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회(IACUC)에 의해 검토 및 승인되었다. 6주령 내지 8주령의 Balb/c-nu 마우스(Orient, Seoul, Korea)에 HCT-116 세포(100 ㎕ PBS 중 5×106) 를 1-㎖ 주사기로 피하 접종 하였다. 일주일 후, 마우스를 용매 대조군(Control), 스트렙토니그린(Streptonigrin), 5-FU, 및 스트렙토니그린과 5-FU 병용(Streptonigrin + 5-FU, Combination)의 4 그룹으로 나누었다. 스트렙토니그린(0.1 mg/kg 체중), 5-FU(40 mg/kg 체중) 및 용매(1% DMSO + 99% PBS)를 경구로 5 일/주(스트렙토니그린), 또는 복강 내로 3 일/주(5-FU)로 투여하였다. 캘리퍼(Caliper)를 사용하여 매주 1 차 종양 크기를 측정 하였다. 종양 부피는 V = (A × B2)/2 로 계산하였다(V: 부피(mm3), A: 긴 직경, B: 짧은 직경).
그 결과, [도 6] 및 [도 7]에서 나타나는 바와 같이 스트렙토니그린 또는 5-FU를 각각 단독으로 처리하는 경우에 비하여 스트렙토니그린 및 5-FU를 병용하여 처리하는 경우 종양의 부피 및 무게가 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 스트렙토니그린과 다른 항암제를 이용하는 방법 내지 조성물은 암 세포주, 특히 대장암 관련 세포주들의 성장 내지 생장을 유의적으로 억제하여 항암 활성에 시너지 효과를 나타내므로, 대장암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 방법 내지 약학적 조성물로서 효과적일 수 있어 산업상 이용가능성이 크다.

Claims (14)

  1. 스트렙토니그린(streptonigrin) 및 항암제를 대장암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 대장암 예방 또는 치료방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin) 또는 5-FU인 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 스트렙토니그린 및 항암제는 1 : 1 내지 1 : 105 의 몰농도비로 투여되는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료방법.
  4. 스트렙토니그린(streptonigrin)을 5-FU 내성 대장암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 5-FU 내성 대장암 예방 또는 치료방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 5-FU 내성 대장암은 트랜스글루타미네이즈 2(Transglutaminase 2)를 과발현하는 것을 특징으로 하는 5-FU 내성 대장암 예방 또는 치료방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 방법은 스트렙토니그린과 5-FU를 함께 투여하는 것을 특징으로 하는 5-FU 내성 대장암 예방 또는 치료방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 스트렙토니그린 및 5-FU는 1 : 1 내지 1 : 106 의 몰농도비로 투여되는 것을 특징으로 하는 5-FU 내성 대장암 예방 또는 치료방법.
  8. 스트렙토니그린(streptonigrin) 및 항암제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin) 또는 5-FU인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 스트렙토니그린 및 항암제는 1 : 1 내지 1 : 105 의 몰농도비로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 스트렙토니그린(streptonigrin)를 포함하는 5-FU 내성 대장암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 5-FU를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 스트렙토니그린 및 5-FU는 1 : 1 내지 1 : 106 의 몰농도비로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 5-FU 내성 대장암은 트랜스글루타미네이즈 2(Transglutaminase 2)를 과발현하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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