CN105451720A - 用于癌症疗法的脂质体奥沙利铂组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于治疗癌症的组合物，其包括基本上由50-70mol％的磷脂酰胆碱脂质、25-45mol％的胆固醇和2-8mol％的PEG-脂质组成的两性离子脂质体；和奥沙利铂。奥沙利铂以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约20:1至约65:1的量包封在所述脂质体中。还公开了用于制备脂质体奥沙利铂和治疗癌症的方法。

Description

用于癌症疗法的脂质体奥沙利铂组合物

相关申请的交叉引用

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发明背景

基于铂的药物(或“铂类”)是有效的抗癌药物，其形成阻断癌细胞中DNA和RNA合成的DNA加合物并诱导细胞凋亡。顺铂、卡铂和奥沙利铂是用于治疗多种实体瘤，包括卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、胃癌、黑色素瘤和头颈癌的主要铂类。然而，铂类的主要缺点是毒性。常见的副作用包括肾和神经损伤、高端听力损失、持久恶心和呕吐。尤其是，顺铂在血液中具有非常短的半衰期，由于药物通过肾排泄而导致急性肾毒性。

奥沙利铂是具有1,2-二氨基环己烷(DACH)载体配体的基于铂的化疗剂。奥沙利铂不同于顺铂之处在于顺铂的胺基团被二氨基环己烷(DACH)取代且两个氯化物被双齿草酸盐部分取代。奥沙利铂的分子量为397.3g/mol。奥沙利铂(I)和顺铂(II)的化学结构如下所示。

已显示奥沙利铂在体外和体内对多种肿瘤细胞系均有效。尽管奥沙利铂的作用机理尚未完全阐明，但已显示由奥沙利铂的生物转化所产生的水(aqua)衍生物与DNA相互作用形成链间和链内交联，造成DNA合成破坏，从而导致细胞毒性和抗肿瘤作用(Raymond等人AnnalsofOncology.9:1053-1071.1998)。据认为，活化的奥沙利铂所保留的庞大DACH环导致形成铂-DNA加合物，其似乎更有效地阻断DNA复制且比由顺铂形成的加合物更具细胞毒性。奥沙利铂在治疗对顺铂或卡铂的一线治疗表现出抗性的癌症中是特别重要的(Boulikas&Vougiouka.OncologyReports.10:1663-1682.2003)。与顺铂相反，未观察到肾毒性，并且在其给药过程中不需要水化。很少观察到肾小管坏死。研究还证实了与许多其他化合物的加和和/或协同作用，表明了奥沙利铂在组合疗法中例如在体外和体内与氟尿嘧啶组合中的可能用途。(Ibrahim，A.等人TheOncologist.9:8-12.2004)。

不同于顺铂，由于草酸盐基团的取代，血浆中的奥沙利铂迅速经非酶促转化成反应性化合物，这一过程使其药代动力学曲线(profile)复杂化。大多数化合物似乎是无药理学活性的，但二氯(DACH)铂络合物进入细胞，在那里它们具有细胞毒性特性。尽管奥沙利铂在体外和体内已经显示出广泛的抗肿瘤作用以及比顺铂更好的安全性曲线，但主要的不良反应是神经毒性及血液和胃肠(GI)毒性(Ibrahim等人)。

脂质体已用作铂类的传送载体以试图减少药物的毒性。脂质体是包括分离外部和内部水相的磷脂双层的囊泡。脂质体能够在脂质双层中运载疏水性药物和/或在水性核心中运载亲水性药物以用于药物递送。脂质体尺寸通常在直径为50至250nm的范围内，其中50至150nm的直径特别优选用于某些应用。脂质体铂类(包括奥沙利铂)的使用已呈现出巨大的挑战。与游离药物相比，脂质体铂类证实有分布、代谢和从体内排泄的独特模式，以及不同的毒性水平和独特的副作用。特别地，优化脂质体铂类的释放速率在体内半衰期与释放之间或在安全性与效力之间难以维持平衡。通常，泄漏的脂质体将使包封的药物更容易获得，但会造成与天然药物类似的更大的毒性风险。另一方面，较少泄漏的脂质体可以减少毒性，但它们不能为足够的效力提供充足的药物释放。这种挑战反映在空间上稳定的脂质体顺铂(SPI-77)在II期临床研究试验中的有限体内效力中(Feng等人CancerChemother.Pharmacol.54:441–448.2004)。

因此，希望开发于现有的脂质体和非脂质体铂疗法相比具有改善性质的脂质体奥沙利铂。存在平衡效力和安全性并改善奥沙利铂对靶向癌细胞的生物利用度的制剂的需求。本发明解决了这些和其他需求。

发明概述

在一个方面，本发明提供用于治疗癌症的组合物。该组合物包括：(a)基本上由50-70mol％的磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物、25-45mol％的胆固醇和2-8mol％的PEG-脂质组成的两性离子脂质体；和(b)奥沙利铂，其以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约20:1至约65:1的量包封在脂质体中。

在第二方面，本发明提供治疗癌症的方法。该方法包括向需要其的受试者给予本发明的组合物。

附图说明

图1显示奥沙利铂从具有不同脂质含量的脂质体中的体外释放。

图2显示在pH＝7.4和pH＝5，顺铂从含有二硬脂酰磷脂酰胆碱(A)或棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(B、C)的脂质体中的体外释放。

图3显示在pH＝7.4和pH＝5，奥沙利铂从含有棕榈酰油酰磷脂酰胆碱的脂质体中的体外释放。

图4显示在PBS(pH7.4和5)和FBS中，奥沙利铂从POPC/Chol/DSPE-PEG2000脂质体中的释放速率。

图5显示在POPC/Chol/DSPE-PEG2000脂质体中％奥沙利释放与摩尔％胆固醇的相关性。

图6显示在POPC/CHOL/DSPE-PEG2000脂质体中IC₅₀与摩尔％胆固醇的相关性。

图7显示在POPC/Chol/DSPE-PEG2000脂质体中IC₅₀与奥沙利铂释放速率的相关性。

图8显示脂质体奥沙利铂(脂质体奥沙利铂5a)以40和60mg/kg、游离奥沙利铂以15mg/kg(MTD)或盐水(对照)单次静脉内给药后测量的平均KB肿瘤体积。与给药后第27天的奥沙利铂(#，P<0.05)和给药后第31天的对照(*，P<0.05)相比，测试的两种剂量的脂质体奥沙利铂5a均显著抑制肿瘤生长。单向ANOVA后进行Neuman-Keuls事后检验。5-10只小鼠/组的值为平均值±SEM。

图9显示经脂质体奥沙利铂5a(POPC65:30:5)、奥沙利铂或盐水处理的具有KB异种移植瘤的裸小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。

图10显示在具有HT29人结肠直肠癌异种移植物的小鼠中，与乐沙定(Eloxatin，奥沙利铂)相比，脂质体奥沙利铂5a的抗肿瘤作用。脂质体奥沙利铂5a以22mg/kg/剂量、游离奥沙利铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次(threeweekly)后测量平均肿瘤体积。5-10只小鼠/组的值为平均值±SEM。

图11显示脂质体奥沙利铂5a以22mg/kg/剂量、游离奥沙利铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次后，具有HT29结肠直肠异种移植瘤的无胸腺裸小鼠的体重变化。5-10只小鼠/组的值为平均值±SEM。

图12显示Kaplan-Meier曲线，其显示经脂质体奥沙利铂5a以22mg/kg/剂量、游离奥沙利铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次处理的具有HT29结肠直肠异种移植瘤的无胸腺裸小鼠的存活百分数。与乐沙定和盐水相比，脂质体奥沙利铂5a显著增加存活率，p<0.05，Mantel-Cox，log-rank检验。各组以10只具有肿瘤的雌性小鼠开始。

图13显示在研究II具有HT29人结肠直肠异种移植物的小鼠中，与乐沙定相比，脂质体奥沙利铂5a的抗肿瘤作用。用脂质体奥沙利铂5a以15、25、35mg/kg/剂量、游离奥沙利铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次，测量平均肿瘤体积。与初始给药后30天乐沙定或盐水处理相比，脂质体奥沙利铂5a处理显著抑制肿瘤生长，p<0.05，单向ANOVA，Newman-Keuls事后检验。5-10只小鼠/组的值为平均值±SEM。

图14显示用脂质体奥沙利铂5a以15、25、35mg/kg/剂量、游离奥沙利铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次的具有HT29结肠直肠异种移植瘤的无胸腺裸小鼠的体重变化。5-10只小鼠/组的值为平均值±SEM。

图15显示Kaplan-Meier曲线，其显示经脂质体奥沙利铂5a以15、25、35mg/kg/剂量、游离奥沙利铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次处理的具有HT29结肠直肠异种移植瘤的无胸腺裸小鼠的存活百分数。各组以10只具有肿瘤的雌性小鼠开始。

图16显示无胸腺裸小鼠用乐沙定和脂质体奥沙利铂5a给药后随时间推移的肿瘤铂水平。所有剂量均以奥沙利铂摩尔当量给予。数据表示为三只小鼠的平均值±标准误差。

图17显示无胸腺裸小鼠用乐沙定和脂质体奥沙利铂5a给药后随时间推移的血浆铂水平。所有剂量均以奥沙利铂摩尔当量给予。数据表示为三只小鼠的平均值±标准误差。

图18显示在具有BxPC-3人胰腺异种移植物的小鼠中，与乐沙定相比，脂质体奥沙利铂5a的抗肿瘤作用。用脂质体奥沙利铂5a以15、25、35mg/kg/剂量、游离奥沙利铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次，测量平均肿瘤体积。5-10只小鼠/组的值为平均值±SEM。

图19显示用脂质体奥沙利铂5a以15、25、35mg/kg/剂量、游离奥沙利铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次的具有BxPC-3胰腺异种移植瘤的无胸腺裸小鼠的体重变化。5-10只小鼠/组的值为平均值±SEM。

图20显示Kaplan-Meier曲线，其显示经脂质体奥沙利铂5a以15、25、35mg/kg/剂量、游离奥沙利铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次处理的具有BxPC-3胰腺异种移植瘤的无胸腺裸小鼠的存活百分数。各组以10只具有肿瘤的雌性小鼠开始。

发明详述

I.概述

本发明涉及用于癌症疗法的脂质体奥沙利铂组合物。本文所述的脂质体组合物基本上由磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇(PEG)缀合的脂质和包封的奥沙利铂组成。所公开的组合物通常具有低于约20℃的凝胶-流体相变温度并在酸性介质中显示出人意料地迅速的pH依赖性奥沙利铂释放。还描述了用于制备该组合物和用该组合物治疗癌症的方法。该组合物特别有用于增强癌细胞中细胞内的奥沙利铂生物利用度和改善癌症治疗的整体安全性。该组合物可广泛适用于预防和控制癌症，为患者和临床医生提供多种益处。

II.定义

如本文所用，术语“脂质体”涵盖由脂质双层包围的任何隔室(compartment)。术语脂质体包括单层囊泡，其由单一的脂质双层构成，且直径通常在约20至约400nm范围内。脂质体也可以是多层的，其直径通常在1-10μm范围内。在一些实施方式中，脂质体可包括多层囊泡(MLV；尺寸为约1μm至约10μm)、大单层囊泡(LUV；尺寸为几百纳米至约10μm)和小单层囊泡(SUV；尺寸为约20nm至约200nm)。

如本文所用，术语“两性离子脂质体”是指含有在同一脂质分子中具有带正电荷和带负电荷的官能团的脂质的脂质体。两性离子脂质体的整个表面电荷将根据外部介质的pH而变化。通常，两性离子脂质体的整个表面电荷在生理pH(即，pH～7.4)下是中性的或阴性的。

如本文所用，术语“脂质体尺寸”和“平均粒径”是指脂质体的外径。平均粒径可通过多种技术，包括动态光散射(DLS)、准弹性光散射(QELS)和电子显微镜来确定。

如本文所用，术语“摩尔百分数”和“mol％”是指给定的脂质组分的摩尔数除以所有脂质组分的总摩尔数。除非明确说明，当计算脂质体的脂质组分的mol％时，不包括活性剂、稀释剂或其它组分的量。

如本文所用，术语“磷脂酰胆碱脂质”是指具有胆碱头基的二酰基甘油酯磷脂(即，1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)。磷脂酰胆碱脂质中的酰基通常衍生自具有6-24个碳原子的脂肪酸。磷脂酰胆碱脂质可包括合成的和天然来源的1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。

如本文所用，术语“胆固醇”是指2,15-二甲基-14-(1,5-二甲基己基)四环[8.7.0.0^2,7.0^11,15]二十七碳-7-烯-5-醇(化学文摘服务登记编号57-88-5)。

如本文所用，术语“PEG-脂质”是指共价结合至疏水性或两性脂质部分的聚(乙二醇)聚合物。脂质部分可包括油脂、蜡、类固醇、脂溶性维生素、甘油一酯、甘油二酯、磷脂和鞘脂。优选的PEG-脂质包括二酰基-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]和N-酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]}。PEG-脂质中的PEG的分子量通常为约500至约5000道尔顿(Da；g/mol)。PEG-脂质中的PEG可具有直链或支链结构。

如本文所用，术语“奥沙利铂”是指[(1R,2R)-环己烷-1,2-二胺](乙二根合-O,O')铂(II)(化学文摘服务登记编号63121-00-6)。

如本文所用，术语“组合物”是指包含特定量的特定成分的产品，以及由特定量的特定成分的组合直接地或间接地产生的任何产品。本发明的药物组合物通常含有如本文所述的脂质体奥沙利铂和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。“药学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成分相容且对其接受者无害。

如本文所用，术语“烷醇”是指具有至少一个羟基的C_1-4烷烃。烷醇包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇和叔丁醇。

如本文所用，术语“多孔过滤器”是指含有具有限定的直径(例如，30-1000nm)的孔的聚合物或无机膜。多孔过滤器可由聚合物，包括但不限于聚碳酸酯和聚酯，以及无机底物，包括但不限于多孔氧化铝制成。

如本文所用，术语“无菌过滤”是指通过使组合物穿过具有从滤液中排除微生物和/或病毒的能力的过滤器进行的组合物的灭菌。通常，用于灭菌的过滤器含有足够大以使脂质体穿过过滤器进入滤液，但足够小以阻止微生物例如细菌或真菌通过的孔。

如本文所用，术语“癌症”是指包括人类癌症(cancers)和癌(carcinoma)、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病以及实体瘤和淋巴癌的病症。不同类型的癌症的实例包括但不限于肺癌(例如，非小细胞肺癌或NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌(即，肝癌(hepatocarcinoma))、肾癌(即，肾细胞癌)、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、胸膜癌、胰腺癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、肛门癌、胰腺癌、胆道癌、胃肠道类癌肿瘤、食管癌、胆囊癌、阑尾癌、小肠癌、胃(胃部)癌、中枢神经系统的癌症、皮肤癌、绒毛膜癌、头颈癌、血癌、骨原性肉瘤、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、单核细胞性白血病、髓细胞性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病和多发性骨髓瘤。

如本文所用，术语“治疗或处理(treat/treating/treatment)”是指在治疗或改善癌症或癌症症状中的任何成功指标，包括任何客观的或主观的参数，例如症状的减少；缓解；消退或使癌症或癌症症状对于患者更加可容忍；或者，在一些情况下，预防癌症的发作。症状的治疗或改善可基于任何客观的或主观的参数，包括例如，体检或临床试验的结果。

如本文所用，术语“给予或给药(administer/administered/administering)”是指给予本发明的脂质体组合物的方法。本发明的脂质体组合物可以各种方式给予，包括胃肠外、静脉内、皮内、肌内或腹膜内。脂质体组合物也可作为组合物或制剂的一部分给予。

如本文所用，术语“受试者”是指在生命的任何阶段的任何哺乳动物，尤其是人。

如本文所用，术语“约”表示用于修改该特定值时数值附近的闭合范围(closerange)。如果“X”为所述值，例如，“约X”将表示0.9X至1.1X的值，且更优选地，0.95X至1.05X的值。任何提及“约X”特别表示至少值X、0.9X、0.91X、0.92X、0.93X、0.94X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、1.05X、1.06X、1.07X、1.08X、1.09X和1.1X。

III.发明实施方案

脂质体

在一个方面，本发明提供用于治疗癌症的组合物。该组合物包括：(a)基本上由约50mol％至约70mol％的磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物、约25mol％至约45mol％的胆固醇和约2mol％到约8mol％的PEG-脂质组成的两性离子脂质体；和(b)奥沙利铂，其以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约20:1至约65:1的量包封在脂质体中。在一些实施方案中，磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物具有14个碳原子或更多的脂肪酸链，并且两个脂肪酸链中不多于一个是不饱和的(nomorethanoneofthetwofattyacidchainsisunsaturdated)。

本发明的脂质体可含有任何合适的磷脂酰胆碱脂质(PC)或PC混合物。合适的磷脂酰胆碱脂质包括饱和的PC和不饱和的PC。

饱和的PC的实例包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(二硬脂酰磷脂酰胆碱；DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(二棕榈酰磷脂酰胆碱；DPPC)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(MPPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PMPC)、1-肉豆蔻酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(MSPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PSPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SPPC)和1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SMPC)。

不饱和的PC的实例包括但不限于1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SOPC)、1-硬脂酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-油酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OMPC)、1-油酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OPPC)和1-油酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OSPC)。

脂质提取物，例如蛋黄PC、心脏提取物、脑提取物、肝脏提取物、大豆PC和氢化大豆PC(HSPC)也可用于本发明中。在一些实施方案中，脂质体中的磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱的混合物不是氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)或不是包含HSPC的混合物。

在一些实施方案中，磷脂酰胆碱脂质选自POPC、DSPC、SOPC和DPPC。在一些实施方案中，磷脂酰胆碱脂质是POPC。

通常，本发明的组合物包括含有50-70mol％的磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物的脂质体。脂质体可含有，例如，50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70mol％磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，脂质体含有50-55mol％磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，脂质体含有55-70mol％磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，脂质体含有65mol％磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，脂质体含有60mol％磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，脂质体含有55mol％磷脂酰胆碱。

本发明组合物中的脂质体还含有25-45mol％的胆固醇(即，2,15-二甲基-14-(1,5-二甲基己基)四环[8.7.0.0^2,7.0^11,15]二十七碳-7-烯-5-醇)。脂质体可含有，例如，25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45mol％胆固醇。在一些实施方案中，脂质体含有25-40mol％胆固醇。在一些实施方案中，脂质体含有40-45mol％胆固醇。在一些实施方案中，脂质体含有30mol％胆固醇。在一些实施方案中，脂质体含有35mol％胆固醇。在一些实施方案中，脂质体含有40mol％胆固醇。

本发明的脂质体可包括任何合适的聚(乙二醇)-脂质衍生物(PEG-脂质)。在一些实施方案中，PEG-脂质为二酰基-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)。PEG-脂质中的聚(乙二醇)的分子量通常在约500Da至约5000Da的范围内。聚(乙二醇)可具有例如750Da、1000Da、2000Da或5000Da的分子量。在一些实施方案中，PEG-脂质选自二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-2000)和二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](DSPE-PEG-5000)。在一些实施方案中，PEG-脂质为DSPE-PEG-2000。

通常，本发明的组合物包括含有2-8mol％的PEG-脂质的脂质体。该脂质体可含有，例如，2、3、4、5、6、7或8mol％PEG-脂质。在一些实施方案中，脂质体含有4-6mol％PEG-脂质。在一些实施方案中，脂质体含有5mol％PEG-脂质。

在一些实施方案中，两性离子脂质体包括约55mol％POPC、约40mol％胆固醇和约5mol％DSPE-PEG(2000)。在一些实施方案中，两性离子脂质体包括约60mol％POPC、约35mol％胆固醇和约5mol％DSPE-PEG(2000)。在一些实施方案中，两性离子脂质体包括约65mol％POPC、约30mol％胆固醇和约5mol％DSPE-PEG(2000)。

通常，本发明的组合物含有脂质体包封的奥沙利铂，其量为使得治疗有效剂量的奥沙利铂可以方便的剂量体积递送至受试者。给定制剂的奥沙利铂含量可表示为绝对浓度(例如，mg/mL)或相对于脂质体中的脂质的相对量。通常，总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约20:1至约65:1。脂质:奥沙利铂比例可以为，例如，20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1或65:1。在一些实施方案中，奥沙利铂以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约30:1至约45:1的量包封于所述脂质体中。在一些实施方案中，本发明的组合物包括脂质体，该脂质体含有奥沙利铂，其以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约50:1的量包封于脂质体中。在一些实施方案中，本发明的组合物包括脂质体，该脂质体含有奥沙利铂，其以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约30:1至约35:1的量包封于脂质体中。

脂质体尺寸可通过本领域技术人员已知的多种方法来确定。脂质体尺寸可例如，通过动态光散射(DLS)、准弹性光散射(QELS)、分析超速离心或电子显微镜来确定。脂质体尺寸可以脂质体直径、脂质体体积、光散射强度或其它特征来报告。在一些实施方案中，脂质体的平均粒径对应于脂质体的体积平均值。在一些实施方案中，本发明的组合物包括具有约75至约125nm的平均粒径(直径)的两性离子脂质体。例如，脂质体可具有75、85、90、95、100、105、110、115、120或125nm的直径。在一些实施方案中，脂质体具有80-120nm的平均粒径。在一些实施方案中，脂质体具有90-120nm的平均粒径。在一些实施方案中，本发明的组合物含有具有90nm的平均粒径的脂质体。

制备脂质体奥沙利铂的方法

可使用本领域技术人员已知的多种技术来制备脂质体并装载奥沙利铂。脂质囊泡可例如，通过用水或水性缓冲液水合干燥的脂质膜(通过在合适的容器中蒸发脂质和有机溶剂的混合物而制备)来制备。脂质膜的水合通常得到多层囊泡(MLV)的悬浮液。或者，MLV可通过用水或水性缓冲液在合适的溶剂例如C_1-4烷醇中稀释脂质溶液来形成。单层囊泡可由MLV通过超声处理或经具有限定的孔径的膜挤出来形成。奥沙利铂的包封可通过将药物包括在用于在MLV形成期间膜水合或脂质稀释的水溶液中来进行。

因此，本发明的一些实施方案提供含有如上所述的两性离子脂质体的组合物，其中脂质体通过包括以下步骤的方法制备：a)形成含有磷脂酰胆碱脂质、胆固醇、PEG-脂质和选自C_1-4烷醇和C_1-4烷醇/水混合物的溶剂的脂质溶液；b)将脂质溶液与水性缓冲液混合以形成多层囊泡(MLV)；和c)通过多孔过滤器挤出MLV以形成小单层囊泡(SUV)。在一些实施方案中，奥沙利铂的包封通过在MLV形成期间将奥沙利铂包括在水性缓冲液中来进行。或者，奥沙利铂的包封可在挤出后进行以在胆固醇的量低至基本上为零时形成SUV。在一些实施方案中，脂质体制备进一步包括无菌过滤两性离子脂质体。

制剂和给药

在一些实施方案中，本发明的组合物可包括如上所述的脂质体和生理学上(即，药学上)可接受的载体。术语“载体”是指用作脂质体奥沙利铂的稀释剂或媒介物(vehicle)的通常的惰性物质。该术语也包括赋予组合物粘着特性的通常的惰性物质。通常，生理学上可接受的载体以液体形式存在。液体载体的实例包括生理盐水、磷酸盐缓冲液、生理缓冲盐水(135-150mMNaCl)、水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、提供增强的稳定性的糖蛋白(例如，白蛋白、脂蛋白、球蛋白等)等。在一些实施方案中，载体包括碳水化合物，例如但不限于蔗糖、葡萄糖、乳糖、直链淀粉或淀粉。因为生理学上可接受的载体部分通过所给予的具体组合物以及通过用于给予组合物的具体方法来决定，因此有很多种本发明的药物组合物的合适制剂(参见，例如Remington'sPharmaceuticalSciences，17^thed.，1989)。

本发明的组合物可通过常规的、众所周知的灭菌技术进行灭菌或可在无菌条件下制备。水溶液可被包装使用或在无菌条件下过滤并冻干，该冻干制剂在给药前与无菌水溶液合并。该组合物可按需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾和氯化钙。可包含糖以稳定组合物，例如用于冻干的脂质体组合物的稳定剂。

适合肠胃外给药的制剂，例如，通过关节内、静脉内、肌内、瘤内、皮内、腹膜内和皮下途径，包括水性和非水性、等渗无菌注射溶液。该注射溶液可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。注射溶液和悬浮液也可由无菌粉末，例如冻干的脂质体制备。在本发明的实践中，组合物可例如，通过静脉内输注、腹膜内、膀胱内或鞘内给药。肠胃外给药和静脉内给药是优选的给药方法。脂质体组合物的制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器，例如安瓿和小瓶中。

该药物制剂优选以单位剂型形式。在该形式中，制剂细分为含有适当量的活性成分的单位剂量，例如，脂质体组合物。该单位剂型可以是包装的制剂，含有离散量的制剂的包装。如果需要的话，该组合物也可含有其他相容的治疗剂

治疗癌症的方法

在另一个方面，本发明提供治疗癌症的方法。该方法包括向需要其的受试者给予含有如上所述的脂质体奥沙利铂的组合物。在一些实施方案中，该方法包括给予含有以下的组合物：(a)基本上由约50mol％至约70mol％的磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物、约25mol％至约45mol％的胆固醇和约2mol％至约8mol％的PEG-脂质组成的两性离子脂质体；和(b)奥沙利铂，其以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约20:1至约65:1的量包封在脂质体中。在一些实施方案中，该方法包括给予含有以下的组合物：a)基本上由55mol％POPC、40mol％胆固醇和5mol％DSPE-PEG(2000)组成的两性离子脂质体；和b)奥沙利铂，其以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约50:1的量包封在脂质体中。在一些实施方案中，该方法包括给予含有以下的组合物：a)基本上由65mol％POPC、30mol％胆固醇和5mol％DSPE-PEG(2000)组成的两性离子脂质体；和b)奥沙利铂，其以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约30:1至约40:1的量包封在脂质体中。

在癌症治疗的治疗使用中，可给予本发明的脂质体组合物使得奥沙利铂的初始剂量在每日约0.001mg/kg至约1000mg/kg的范围内。可使用约0.01-500mg/kg，或约0.1-200mg/kg，或约1-100mg/kg，或约10-50mg/kg，或约10mg/kg，或约5mg/kg，或约2mg/kg，或约1mg/kg的每日剂量范围。

剂量可根据患者的需要、所治疗的癌症的严重程度和类型以及所采用的脂质体组合物而变化。例如，可考虑在特定患者中诊断的癌症的类型和阶段凭经验确定剂量。给予至患者的剂量应足以随着时间的推移在患者中实现有益的治疗反应。剂量的大小还将通过伴随特定脂质体组合物的给药在特定患者中的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。具体情况的适当剂量的确定在执业医师的技能范围内。通常，治疗以小于脂质体组合物的最佳剂量的较小剂量开始。此后，小幅度增加剂量，直至在环境下达到最佳效果。为方便起见，如果需要的话，可将总的每日剂量分开并在一天期间分批给药。

本文所述的方法特别适用于实体瘤癌症(实体瘤)，其是器官和组织的癌症(与血液恶性肿瘤相反)，且理想上适用于上皮癌。实体瘤癌症的实例包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌(CRC)、食道癌、胃癌、头颈癌、肝细胞癌、肺癌、黑色素瘤、神经内分泌癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肾癌。在一组实施方案中，适用于根据本发明的方法治疗的实体瘤癌症选自CRC、乳腺癌和前列腺癌。在另一组实施方案中，本发明的方法适用于治疗血液恶性肿瘤，包括例如多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞性白血病和慢性髓细胞性白血病。

上述方法中使用的组合物可以单独或与其他治疗剂组合给药。其他药剂可以是抗癌剂或细胞毒素剂，包括但不限于阿瓦斯丁、多柔比星、顺铂、奥沙利铂(以非脂质体形式)、卡铂、5-氟尿嘧啶、吉西他滨或紫杉烷，如紫杉醇和多西他赛。另外的抗癌剂可包括但不限于20-epi-1,25-二羟基维生素D3,4-甘薯苦醇、5-乙炔基尿嘧啶、9-二氢紫杉醇、阿比特龙、阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿考达唑、阿克罗宁、acylfulvene、腺环戊醇、阿多来新、阿地白介素、all-tk拮抗剂、六甲蜜胺、氨莫司汀、安波霉素、醋酸阿美蒽醌、amidox、氨磷汀、氨鲁米特、氨基乙酰丙酸、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、穿心莲内酯、血管发生抑制剂、拮抗剂D、拮抗剂G、安雷利克斯、安曲霉素、抗背部化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizingmorphogeneticprotein-1)、抗雌激素药、抗瘤酮、反义寡核苷酸、阿非迪霉素甘氨酸盐、凋亡基因调节剂、凋亡调节剂、脱嘌呤核酸、ARA-CDP-DL-PTBA、精氨酸脱氨基酶、门冬酰胺酶、曲林菌素、asulacrine、阿他美坦、阿莫司汀、海洋环肽(axinastatin)1、海洋环肽2、海洋环肽3、阿扎胞苷、阿扎司琼、阿扎毒素、重氮酪氨酸、阿扎替派、阿佐霉素、浆果赤霉素III衍生物、balanol、巴马司他、苯并二氢卟酚(benzochlorins)、苯佐替派、苯甲酰基十字孢碱(benzoylstaurosporine)、β内酰胺衍生物、β-alethine、β克拉霉素B(betaclamycinB)、桦木酸、BFGF抑制剂、比卡鲁胺、比生群、盐酸比生群、双吖丙啶基精胺(bisaziridinylspermine)、双奈法德、二甲磺酸双奈法德(bisnafidedimesylate)、bistrateneA、比折来新、博来霉素、硫酸博来霉素、BRC/ABL拮抗剂、breflate、布喹那钠、溴匹立明、布多替钛、白消安、丁硫氨酸亚矾胺(buthioninesulfoximine)、放线菌素C、卡泊三醇、卡弗他丁C(calphostinC)、卡普睾酮、喜树碱衍生物、金丝雀痘IL-2(canarypoxIL-2)、卡培他滨、卡醋胺、卡贝替姆、卡铂、甲酰胺-氨基-三唑、羧基酰胺基三唑、carestM3、卡莫司汀、cam700、软骨衍生的抑制剂(cartilagederivedinhibitor)、盐酸卡柔比星、卡折来新、酪蛋白激酶抑制剂、澳粟精胺、杀菌肽B、西地芬戈、西曲瑞克、苯丁酸氮芥、绿素类(chlorins)、氯喹喔啉磺酰胺、西卡前列素、西罗霉素、顺铂、顺-卟啉、克拉屈滨、氯米芬类似物、克霉唑、collismycinA、collismycinB、考布他汀A4、考布他汀类似物、conagenin、crambescidin816、克立那托、甲磺酸克立那托、念珠藻素8(cryptophycin8)、念珠藻素A衍生物、curacinA、环戊蒽醌(cyclopentanthraquinones)、环磷酰胺、环钼(cycloplatam)、cypemycin、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸钠(cytarabineocfosfate)、溶细胞因子、磷酸己烷雌酚、达卡巴嗪、达昔单抗、放线菌素D、盐酸柔红霉素、地西他滨、脱氢膜海鞘素B(dehydrodidemninB)、地洛瑞林、右异环磷酰胺、右奥马铂、右雷佐生、右维拉帕米、地扎呱宁、甲磺酸地扎呱宁、地吖醌、代代宁B、didox、二乙基去甲精胺(diethylnorspermine)、二氢-5-氮胞苷、dioxamycin、二苯基螺莫司汀、多西他赛、二十二烷醇、多拉司琼、去氧氟尿苷、多柔比星、盐酸多柔比星、屈洛昔芬、柠檬酸屈洛昔芬、屈他雄酮丙酸酯、屈大麻酚、达佐霉素(duazomycin)、duocarmycinSA、依布硒、依考莫司汀、依达曲沙、依地福新、依决洛单抗、依氟鸟氨酸、盐酸依氟鸟氨酸、榄香烯、依沙芦星(elsamitrucin)、乙嘧替氟、恩洛铂、恩普氨酯(enpromate)、依匹哌啶、表柔比星(epirubicin)、盐酸表柔比星、爱普列特、厄布洛唑、红细胞基因治疗载体体系、盐酸依索比星、雌莫司汀、雌莫司汀类似物、雌莫司汀磷酸酯钠、雌激素激动剂、雌激素拮抗剂、依他硝唑、依托泊苷、磷酸依托泊苷、氯苯乙嘧胺、依西美坦、法倔唑、盐酸法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、非格司亭、非那雄胺、夫拉平度、氟卓斯汀、氟尿苷、fluasterone、氟达拉滨、磷酸氟达拉滨、盐酸氟代柔红霉素(fluorodaunorunicinhydrochloride)、氟尿嘧啶、fluorocitabine、福酚美克、福美司坦(formestane)、磷喹酮、福司曲星、福司曲星钠、福莫司汀、钆替沙林(gadoliniumtexaphyrin)、硝酸镓、加洛他滨、加尼瑞克、明胶酶抑制剂、吉西他滨、盐酸吉西他滨、谷胱甘肽抑制剂、hepsulfam、heregulin、六亚甲基双乙酰胺、羟基脲、金丝桃素、伊班膦酸、伊达比星、盐酸伊达比星、艾多昔芬、伊决孟酮、异环磷酰胺、伊莫福新(ilmofosine)、伊洛马司他、咪唑并吖啶酮、咪喹莫特、免疫刺激剂肽、胰岛素样生长因子-1受体抑制剂、干扰素激动剂、干扰素α-2A、干扰素α-2B、干扰素α-N1、干扰素α-N3、干扰素β-IA、干扰素γ-IB、干扰素、白细胞介素、碘苄胍、碘阿霉素、异丙铂、伊立替康、盐酸伊立替康、伊罗普拉、伊索拉定、伊苯加峻(isobengazole)、isohomohalicondrinB、伊他司琼、jasplakinolide、kahalalideF、lamellarin-Ntriacetate、兰瑞肽、醋酸兰瑞肽、leinamycin、来格司亭、硫酸香菇多糖、leptolstatin、来曲唑、白血病抑制因子、白细胞α干扰素、醋酸亮丙瑞林、亮丙瑞林/雌激素/孕酮、亮丙瑞林、左旋咪唑、利阿唑、盐酸利阿唑、线性多胺类似物、亲脂二糖肽、亲脂铂化合物、lissoclinamide7、洛铂、胍乙基磷酸丝氨酸、洛美曲索、洛美曲索钠、洛莫司汀、氯尼达明、洛索蒽醌、盐酸洛索蒽醌、洛伐他汀、洛索立宾、勒托替康、lutetiumtexaphyrin、lysofylline、裂解肽、美坦辛、mannostatinA、马立马司他、马索罗酚、maspin、基质溶解因子抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、美登素、盐酸氮芥、乙酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑(melphalan)、美诺立尔、美巴龙(merbarone)、疏基嘌呤、美替瑞林(meterelin)、蛋氨酸酶、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、甲氧氯普胺、氯苯氨啶、美妥替哌、微藻蛋白激酶C抑制剂、MIF抑制剂、米非司酮、米替福新、米立司亭、错配双链RNA、米丁度胺、米托卡星(mitomalcin)、丝裂红素、米托洁林、米托胍腙、二溴卫矛醇、米托马星、丝裂霉素、丝裂霉素类似物、米托萘胺、米托司培、米托坦、mitotoxin成纤维细胞生长因子-皂草素、米托蒽醌、盐酸米托蒽醌、莫法罗汀、莫拉司亭、单克隆抗体、人绒毛膜促性腺激素、单磷酰脂质a/分支杆菌细胞壁SK、莫哌达醇、多重抗药性基因抑制剂、基于多重肿瘤抑制因子1的治疗、芥子抗癌剂、美卡普罗B(mycaperoxideB)、分枝杆菌细胞壁提取物、霉酚酸(mycophenolicacid)、迈普隆(myriaporone)、正乙酰基地那林、那法瑞林、那瑞替喷(nagrestip)、纳洛酮/喷他佐辛、napavin、萘萜二醇、那托司亭、奈达铂、奈莫柔比星、奈立膦酸、中性肽链内切酶、尼鲁米特、nisamycin、一氧化氮调节剂、硝基氧抗氧化剂(nitroxideantioxidant)、nitrullyn、诺考达唑、诺加霉素(nogalamycin)、n-取代的苯甲酰胺、06-苄基鸟嘌呤、奥曲肽、奥康斯恩(okicenone)、寡核苷酸、奥那司酮、昂丹司琼、oracin、口腔细胞因子诱导剂、奥马铂、奥沙特隆、奥沙利铂、oxaunomycin、奥昔舒仑、紫杉醇、紫杉醇类似物、紫杉醇衍生物、palauamine、棕榈酰基根霉素、帕米膦酸、人参炔三醇、帕诺米芬、parabactin、帕折普汀、培门冬酶、培得星、培利霉素、戊氮芥、木聚硫钠(pentosanpolysulfatesodium)、喷司他丁、pentrozole、硫酸培洛霉素、全氟溴烷、培磷酰胺、紫苏醇、phenazinomycin、乙酸苯酯、磷酸酶抑制剂、溶链菌素、盐酸毛果云香碱、哌泊溴烷、哌泊舒凡、吡柔比星、吡曲克辛、盐酸吡罗蒽醌、placetinA、placetinB、纤溶酶原激活物抑制剂、铂络合物、铂化合物、铂-三胺络合物、普卡霉素、普洛美坦、卟吩姆钠、泊非霉素、泼尼莫司汀(prednimustine)、盐酸丙卡巴肼、丙基双吖啶酮、前列腺素J2、前列腺癌抗雄激素、蛋白酶体抑制剂、基于蛋白质A的免疫调节剂、蛋白质激酶C抑制剂、蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂、嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂、嘌呤霉素、嘌呤霉素盐酸盐、红紫素、吡唑呋喃菌素、吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)、吡哆酰基化血红蛋白聚氧乙烯缀合物(pyridoxylatedhemoglobinpolyoxyethyleneconjugate)、RAF拮抗剂、雷替曲塞、雷莫司琼、RAS法尼基蛋白质转移酶抑制剂、RAS抑制剂、RAS-GAP抑制剂、脱甲基瑞替普汀、铼RE186依替膦酸盐(rheniumRE186etidronate)、根霉素、利波腺苷、核酶、RII维甲酰胺(retinamide)、RNAi、罗谷亚胺、罗希吐碱、罗莫肽、罗喹美克、rubiginoneB1、ruboxyl、沙芬戈、盐酸沙芬戈、saintopin、sarcnu、sarcophytolA、沙格司亭、SDI1模拟物、司莫司汀、老化衍生的抑制剂1、正义寡核苷酸、信号转导抑制剂、信号转导调节剂、辛曲秦、单链抗原结合蛋白质、sizofuran、索布佐生、硼卡钠、苯基乙酸钠、索尔醇(solverol)、生长调节素结合蛋白质、索纳明、磷乙酰天冬氨酸钠、膦门冬酸、司帕霉素(sparsomycin)、spicamycinD、盐酸螺旋锗、螺莫司汀、螺铂、脾脏五肽、海绵抑制素1(spongistatin1)、角鲨胺、干细胞抑制剂、干细胞分裂抑制剂、斯提酰胺(stipiamide)、链黑菌素、链佐星、基质分解素抑制剂、sulfinosine、磺氯苯脲、强效血管活性肠肽拮抗剂、suradista、苏拉明、苦马豆素、合成糖胺聚糖、他利霉素、他莫司汀、他莫昔芬甲碘化物、牛磺莫司汀、他扎罗汀、替可加兰钠、替加氟、tellurapyrylium、端粒酶抑制剂、替洛蒽醌盐酸盐、替莫泊芬、替莫唑胺、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酯酮(testolactone)、四氯十氧化物、tetrazomine、thaliblastine、沙利度胺、硫咪嘌呤、噻可拉林(thiocoraline)、硫鸟嘌呤、塞替派、血小板生成素、血小板生成素模拟物、胸腺法新、胸腺生成素受体激动剂、胸腺曲南、甲状腺刺激激素、噻唑羧胺核苷、本紫红素乙酯锡(tinethyletiopurpurin)、替拉扎明、二氯二茂钛、盐酸拓扑替康、topsentin、托瑞米芬、柠檬酸托瑞米芬、全能干细胞因子、翻译抑制剂、醋酸曲托龙、维甲酸(tretinoin)、三乙酰基尿苷、曲西立滨、磷酸曲西立滨、三甲曲沙、葡萄糖醛酸三甲曲沙、曲普瑞林、托烷司琼、盐酸妥布氯唑、妥罗雄脲、酪氨酸激酶抑制剂、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostins)、UBC抑制剂、乌苯美司、尿嘧啶氮芥、乌瑞替派、泌尿生殖窦衍生的生长抑制因子、尿激酶受体拮抗剂、伐普肽、variolinB、维拉雷琐、藜芦明、verdins、维替泊芬、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸长春罗新、长春瑞滨、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春罗定(vinrosidinesulfate)、vinxaltine、硫酸长春利定、vitaxin、伏氯唑、扎诺特隆、折尼铂、亚苄维C、净司他丁、净司他丁斯酯或盐酸佐柔比星。在一些实施方案中，该方法可包括给予选自氟尿嘧啶、亚叶酸(leucovorin)的药物及其混合物。

实施例

实施例1.脂质体铂组合物的制备

奥沙利铂脂质体的包封通过溶剂稀释程序进行。将脂质混合物在100-mL玻璃瓶中称重并溶于叔丁醇(t-BuOH)、乙醇(EtOH)和水的溶液中，并在70℃加热直至澄清。溶液通常含有1:1t-BuOH:EtOH(v:v)或49:49:2t-BuOH:EtOH:水(v:v:v)，但水含量根据所使用的脂质的具体量进行调整。在70℃将奥沙利铂溶于预热的蔗糖/乙酸盐缓冲液(10mM乙酸钠，300mM蔗糖，pH5.5；无菌过滤)中。需要时使用超声处理。在快速搅拌下将脂质溶液加入到奥沙利铂溶液中以形成多层囊泡(MLV)。制备实施例概括在表1中。

使用加热至70℃的LIPEX^TM挤出机(NorthernLipidInc.)将所述MLV通过聚碳酸酯过滤器。挤出通常使用3x80nm堆叠(stacked)的聚碳酸酯过滤器和漏盘(draindisc)在800mL挤出机中进行。过滤器的数量在必要时根据所挤出的脂质组合物进行调整。每次通过挤出机后，使用准弹性光散射(QELS)粒度分析仪测定囊泡尺寸和尺寸分布。达到90-120nm的平均体积直径后停止挤出。挤出后，将脂质体用冷(2-15℃)蔗糖/乙酸盐缓冲液稀释10倍。将400mL的脂质体用3600mL冷缓冲液稀释。稀释可预防在随后的处理过程中任何未包封的奥沙利铂沉淀。然后将脂质体通过超滤浓缩至约50mg/mL脂质的浓度。

表1.奥沙利铂多层囊泡的制备

脂质溶液
		总脂质(g)	20.00
t-BuOH:EtOH:H2O(49:49:2v/v/v)(mL)	40.0
		总脂质/溶剂(mg/mL)	500
奥沙利铂溶液
		奥沙利铂(g)	4.32
300mM蔗糖/乙酸盐缓冲液(mL)	360.0
		奥沙利铂溶液(mg/mL)	12.0
MLV溶液
		最终体积(mL)	400.0
最终药物(mg/mL)	10.8
		最终脂质(mg/mL)	50
总溶剂(v/v％)	10％

进行渗滤以交换外部缓冲液和浓缩脂质体，以及去除未包封的奥沙利铂和残留的有机溶剂。渗滤系统包括具有L/S泵头和36-测量管(gaugetubing)的Masterflex泵。通常，可在筒(cartridge)的入口处使用能够维持10psig的蠕动泵。渗滤系统还包括500-kDa筒，其具有每克脂质大约55cm²表面积。例如，两个串联的SpectrumM4-500S-260-01NPS615cm²筒可为含有20克脂质的制剂的过滤提供足够的表面积。用至少500mL纯净水，然后用至少200mL的1300mM蔗糖/乙酸盐缓冲液彻底清洗该系统。基于所用的筒的尺寸调整体积。将浓缩的脂质体(50mg/mL)用10洗涤体积的缓冲液(10mM乙酸盐，300mM蔗糖pH5.5)进行渗滤。再次进行超滤以获得大约90mg/mL的脂质浓度。保留部分制剂用于颗粒测量和分析。

使用装备有乙酸纤维素膜(例如，0.20μmMiniSart，表面积＝6.2cm²；0.20μmSartoriusSartobran150，表面积＝150cm²)的0.2-μm注射器式过滤器进行组合物的无菌过滤。必要时更换过滤器；通常，发现1平方厘米的膜可足以过滤3至10mL的组合物。必要时，在无菌过滤前，用无菌缓冲液进行组合物的稀释以获得所需的奥沙利铂浓度(例如，1mg/mL)。使用无菌移液管将无菌去热原的小瓶装满组合物。将小瓶用经高压灭菌处理的丁基瓶塞和螺纹(crimped)铝密封圈加盖并在2-8℃储存。

上述方法用于制备表2中总结的组合物。

表2.脂质体奥沙利铂组合物

^aPEG分子量＝2000Da。

上述方法也用于制备表3中总结的奥沙利铂和顺铂组合物。

表3.脂质体铂组合物

^aPEG分子量＝2000Da。

实施例2.铂类药物从脂质体中的体外释放

在pH7.1研究实施例1a-1e(表2)中的奥沙利铂从脂质体中的体外释放。如图1所示，释放曲线表明，与使用饱和脂质的其他制剂相比，基于POPC的制剂1d具有最高的释放速率。其他四种奥沙利铂制剂未观察到显著差异。

比较含有顺铂或奥沙利铂(表3)的实施例1f-1j的铂释放率。在pH5.0和pH7.1测定体外释放。如表4所示，含有奥沙利铂的基于POPC的制剂(1i和1j)表现出pH依赖的释放速率，而含有顺铂的其他制剂则并非如此。奥沙利铂制剂也表现出比顺铂制剂更快和更高的释放。表4中的数据绘制在图2和图3中。

将基于POPC的制剂的释放数据合在一起，在48小时时在pH7.1含有POPC:Chol:DSPE-PEG(55:40:5)的脂质体的奥沙利铂释放速率为约10％，但在pH5.0含有POPC:Chol:DSPE-PEG(分别为60:35:5和65:30:5)的脂质体的奥沙利铂释放速率为20％和30％。如此处所示，已发现脂质体的POPC含量和POPC/胆固醇比例，以及奥沙利铂的pH依赖特性有助于增强奥沙利铂在酸性介质中释放。

表4.随时间推移铂类药物从脂质体组合物中的体外释放(％)。

实施例3.脂质体组合物的物理特性

测定具有不同脂质含量的脂质体的凝胶-流体相变的相变温度(T_m)，如表5所示。检测含有55-95％饱和磷脂酰胆碱(DPPC、DSPC或HSPC)、0-40mol％胆固醇和5mol％DSPE-PEG的混合物的不同相变温度。T_m值在约41-56℃的范围内，远高于环境温度或生理温度。相反，基于POPC的制剂没有可检测到的转变峰。POPC的凝胶-液体结晶热转变温度为约-2℃。已报道POPC和胆固醇的二元混合物的转变温度远低于0℃。

表5.脂质体制剂的相变温度

^aPEG分子量＝2000Da。

总体而言，考虑到所选脂质体组合物的铂释放数据和相变行为，相信本发明组合物的有利性质至少部分源于膜力学和pH依赖性电荷状态的组合。

脂质体纳米颗粒特别适合于通过“增强的渗透和保留”(EPR)效应将治疗剂递送至实体瘤部位(V.P.Torchilin.TheAAPSJournal.9(2):Article15.2007)。实体瘤在维持癌细胞中对氧和营养物质的高需求中很大程度上依赖于极度活跃的血管生成。众所周知，这些肿瘤在其脉管系统的膜状结构内部表现出多孔开窗，为一定尺寸范围内的纳米颗粒提供了优先递送至肿瘤部位的极好途径。约50-150nm的尺寸范围内的脂质体纳米颗粒特别适合于利用这一现象用于药物递送。

拒信内体-溶酶体过程是负责纳米颗粒如脂质体的内化和细胞内消化的主要途径(Desnick,R.J.&Schuchman,E.H.NatureReviewsGenetics.3:954-966.2002)。作为该过程的结果，最细胞外的纳米颗粒通过内吞作用内化以形成早期内体，其从细胞质膜向细胞核移动。因其这样做，它们变为酸性并产生“晚期”内体。该增加的酸性导致溶酶体酶从甘露糖-6-磷酸受体解离。晚期内体还与初级溶酶体(其含有溶酶体水解酶和来自高尔基体的幼芽)融合以形成次级溶酶体。晚期内体和溶酶体之间的区别主要基于pH。溶酶体是酸性更强的隔室，大多数大分子的降解发生在其中。本发明的组合物中的脂质体的尺寸，加上奥沙利铂在酸性介质中出人意料地快速释放，特别有用于利用EPR效应和内体-溶酶体内化过程以选择性地递送奥沙利铂至癌组织。

实施例4.脂质体组合物对奥沙利铂释放速率和效力的影响。

方法

奥沙利铂制剂E000201-001的制备。向20mL闪烁小瓶中加入581mgPOPC(1-十六酰-2-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱，类脂，FW＝760，0.76mmol)、407mg胆固醇(Fisher，FW＝386.7，1.05mmol)和263mgDSPE-PEG(2000)(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]，类脂，FW＝2749，0.10mmol)。将其溶于2.5mLEtOH(脂质在65℃溶于EtOH且在环境温度下为糊状物)。

向60mL琥珀色瓶中加入400mg奥沙利铂(LC实验室，99％FW＝397，1mmol)和25mL的0.3M蔗糖水溶液。将奥沙利铂溶液在温度控制的水浴中加热至65℃。向加热的溶液中加入脂质的EtOH溶液，产生乳白色悬浮液。在水浴中在65℃继续加热30min。

在200-600psig氮气下在65℃使用100mLLipex^TM挤出机经0.1微米双层叠膜挤出上面的囊泡5X(Whatman，NucleporeTrack-Etched，挤出在隔离器中进行)。

将所得的脂质体在5℃冷冻过夜，导致过量的奥沙利铂发生结晶。使用0.45微米尼龙过滤器将脂质体从结晶奥沙利铂中滤出。使用mPES500KDaMWCO空心纤维(KrosFlo研究II模型切向流动渗滤单元)将滤液用300mL含有20mM乙酸盐的0.3M蔗糖缓冲液(pH6.1)渗滤。保留的脂质体的最终体积为约15mL并在5℃储存于琥珀色玻璃血清小瓶(胶塞)中。

使用Malvernzeta分级机(DLS)测定颗粒尺寸和zeta电位(用pH7PBS将50μL稀释至1mL)并以nm报告体积平均值。

通过HPLC对脂质进行分析而通过ICP-MS对Pt进行定量。“游离”Pt通过获自30KDaAmicon离心过滤器的滤液的ICP-MS进行测定(在环境温度下9000rpm10min)。

奥沙利铂制剂E000201-002至005以及E000201-008和009的制备。脂质体E000201-002至005以及E000201-008和009的制备程序与用于制备具有不同脂质量的E000201-001的那些相同，以获得POPC与胆固醇的可变比例同时保持5％(摩尔)量的DSPE-PEG(2000)。

奥沙利铂脂质体制剂的分析程序：POPC、胆固醇、DSPE-PEG(2000)。使用反相HPLC方法(使用具有ELSD检测器的WatersXselect反相柱)测定脂质体药物产品制剂中的胆固醇、POPC、DSPE-PEG(2000)和溶血-DSPC的浓度(μg/mL)。柱为XSelectCSHC18，3.5μm，3.0x150mm(PN：186005263)。柱温为50℃且自动进样器温度为10℃。注射10μL并使用25-min色谱程序以1.0mL/min的流速进行分离。TotalChrom中的电压范围为2伏。在80℃使用1.5L/min的气压(增益设置为4)用漂移管操作AlltechELSD。流动相A(H₂O中的25mM甲酸铵)和流动相B(甲醇中的20％乙腈)用于表6中概述的梯度程序。

表6.梯度HPLC条件

将制剂的20μL等分试样称入已称重的微量离心小瓶中并加入80μL正丙醇。将小瓶涡旋并超声处理20分钟。使用正丙醇作为稀释剂制备1:50和1:100的稀释液。在正丙醇中制备脂质储备标准品和工作标准品。通过连续稀释制备脂质标准曲线(每个系列6个样品)。上限(S1)浓度为：磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油900μg/mL；胆固醇700μg/mL；DSPE-PEG(2000)400μg/mL；和溶血磷脂150μg/mL。根据表7进行稀释。

表7：脂质标准品的制备

奥沙利铂从脂质体中的释放。奥沙利铂从脂质体药物产品中的释放速率通过膜透析，随后ICP-MS分析进行测定。此方法使用透析膜将游离(释放的)奥沙利铂与包封的奥沙利铂分离。然后通过ICP-MS分析接收机流体以确定转化成奥沙利铂等价物的铂浓度。三种体外释放分析针对脂质体制剂的不同稳定性方面。使用PBSpH7在37℃来模拟体内条件测定生理释放。通过将PBS的pH降低至5，该释放反映了细胞内的内体条件。使用FBS的生物释放提供相关蛋白浓度存在下的释放数据。

通过将0.5mLPBSpH7加入到膜中对Float-A-Lyzer膜进行预处理。在加入制剂前，允许预处理该膜预至少10min。将膜定期反转以确保对整个膜区域进行预处理。将恒温振荡器预热至37℃并将振荡速度设置为400rpm。

将0.5mL脂质体制剂载入Float-A-Lyzer膜中。将释放溶液的15-mL部分(PBSpH7、PBSpH5或FBS)加入到50-mL锥形管中。将Float-A-Lyzer插入锥形管中，并将组件置于恒温振荡器中。使用表8中总结的样品收集时间表定期收集样品。将每个时间点的100μL的样品转移到预标记的深孔板上。将深孔板密封并在收集时间点之间储存于冰箱中。

表8：样品收集时间表

时间(小时)

6

24

30

48

体积(μL)

100

100

100

100

通过ICP-MS测定样品中的总铂。通过使用装备有样品导入系统(包括Meinhard同心雾化器、低容量石英气旋喷雾室和石英炬)、RF发电机励磁源、具有金金属化的陶瓷四极和同步扫描双阶段检测器(电子倍增器)的质谱仪和S10自动进样器的PerkinElmer电感耦合等离子体质谱仪(NexION300qICP-MS)的ICP-MS(电感耦合等离子体质谱法)测定铂(Pt)的浓度。

校准工作标准品的制备。通过用1％硝酸从1000μg/mL标准溶液连续稀释制备铂工作标准品(1000ng/mL和10ng/mL)。在1％硝酸中制备铱内部标准储备溶液(200ng/mL)。通过稀释10ng/mLPt&1000ng/mLPt储备标准溶液和200ng/mLIr内部标准溶液制备校准工作标准溶液。标准品如表9中所概述进行制备。

表9.ICP标准品的制备

样品制备和分析。用5mL硝酸稀释10μL的样品，并将样品在70℃加热过夜以确保完全消化。然后用45mL的水稀释样品以产生500x稀释液。使用10％硝酸从500x稀释液制备200,000x稀释液，并加入所需浓度的铱内部标准品。使用表10中所概述的操作参数进行ICP-MS。奥沙利铂的释放百分数计算为：ConcOxal(t＝6hr)/ConcOxal(最终)

表10.ICP-MS操作参数

脂质体奥沙利铂在HT29细胞中的体外IC₅₀的确定。将HT-29人结肠直肠腺癌细胞(#HTB-38，ATCC，Manassas，VA)以5x10³个细胞/孔铺板于96孔组织培养板(Costar#3595)中，10％胎牛血清在McCoy’s5A(#10-050-CV，Mediatech，Manassas，VA)中的最终体积为0.1mL。所限定的胎牛血清获自Hyclone(#SH30070.03，批号#AWB96395，Logan，UT)。将含有细胞的板在37℃在5％CO₂的湿润空气中温育24hr。基于人肿瘤细胞系的大约倍增时间选择所选的初始细胞铺板密度。

将试验化合物在Dulbecco改良磷酸盐缓冲盐水(DPBS；Mediatech,Inc.，批号#21031339，Manassas，VA)中从储存溶液稀释至2.2mmol/L，然后在DPBS中连续稀释3倍以产生9点剂量-响应曲线。将10微升的稀释的试验化合物加入到孔中，一式三份，以实现试验化合物的所需最终浓度。将加入和不加入试验化合物的含有细胞的板送回如上所述的温育。

对于两小时的细胞毒性评估，在药物暴露两小时后移除介质并替换成0.1mL/孔培养基，并将细胞如上所述温育另外70小时。

对于二十四小时的细胞毒性评估，在药物暴露一天后移除介质并替换成0.1mL/孔培养基，并将细胞送回温育另外48小时。随后，使用AlamarBlue评估细胞活力。为此目的，通过移液从培养的细胞中移除介质并替换成0.1mL/孔的在适当细胞培养介质中稀释的10％(v/v)AlamarBlue(#BUF012A，AbDSerotec，Raleigh，NC)。然后将板送回如前所述的温育2至4小时以用于适当的显色。

使用BioTekSynergy4酶标仪在545nm/590nm(激发/发射)测量各板孔的荧光。细胞活力计算为相对于仅用培养介质处理的细胞所获得的测量的荧光的百分数。IC₅₀值(μmol/L)使用非线性回归分析和四参数逻辑模型以一式三份的平均值来确定。

结果

包含0至56％的胆固醇、5％的DSPE-PEG(2000)且其余为POPC的样品所获得的结果总结于表11中。

表11.具有组成分析值的脂质体的物理性质

使用针对脂质体制剂的不同稳定性方面的三种体外释放分析来确定奥沙利铂从脂质体中的释放。使用PBSpH7在37℃模拟体内条件来测量生理释放。通过降低PBS的pH至5，该释放反映细胞内观察到的内体条件。使用FBS的生物释放提供相关蛋白质浓度存在下的释放数据。

表12中给出了在最终时间点(48hr)检测的三种不同介质的结果。脂质体奥沙利铂4a的时间释放行为的实例示于图4中。

表12.POPC:胆固醇:DSPE-PEG(2000)脂质体的奥沙利铂释放和IC ₅₀ 值

体外结果与脂质体组合物的相关性。对于在37℃，48hrs后在PBS、pH7.4中获得的数据，奥沙利铂从由POPC、胆固醇和DSPE-PEG(2000)组成的脂质体中的释放作为制剂中摩尔％胆固醇的函数图示于图5中。

对于暴露24hrs后的HT29细胞，由POPC、胆固醇和DSPE-PEG(2000)组成的脂质体奥沙利铂作为制剂中摩尔％胆固醇的函数所获得的IC₅₀值图示于图6中。

使用含有65:30:5摩尔比的POPC、胆固醇和DSPE-PEG(2000)的脂质体奥沙利铂制剂进行效力测试。来自体内研究的结果(如通过肿瘤尺寸生长延迟和存活所测定)表明比用乐沙定(奥沙利铂的当前市售品)所获得的效力更好。65:30:5的摩尔比的重要性通过POPC:胆固醇比例的变化进行研究。作为效力的潜在替代物，对七个不同比例的POPC:胆固醇进行奥沙利铂释放和细胞增殖抑制的体外试验。

如获得的高相关性所证实，奥沙利铂从脂质体中的释放速率和对HT29细胞的IC₅₀均依赖于POPC与胆固醇的摩尔比。奥沙利铂从脂质体中的释放随比例增加(较高的POPC，较低的胆固醇)而增加。随比例增加(较高的POPC，较低的胆固醇)，IC₅₀效力增强。因此，IC₅₀因较高的奥沙利铂释放速率而下降，如图7中所示。

不希望受任何特定理论束缚，认为在48hrs的跨度内，由于药物在肿瘤处较少蓄积(循环和消除损失的药物)，较大量的奥沙利铂的释放可导致较高的毒性和较低的效力。由于生物可利用的奥沙利铂的浓度太低(包封在脂质体中的奥沙利铂被认为是无生物活性的)，在48hrs内较低的奥沙利铂的释放可导致较低的效力。

实施例5.脂质体奥沙利铂效力的体内研究

单一试剂效力研究

首先研究多种市售的和私下获得的肿瘤细胞系对各种铂试剂，包括奥沙利铂的敏感性。在一组测试的市售人结肠肿瘤细胞系中，鉴定了HCT-116细胞(0.4μMIC₅₀，72h)，与HT29和几个其他细胞系(～5-10μMIC₅₀，72h)相比，其具有增强的奥沙利铂体外细胞毒性。还调查了该细胞系对5FU的敏感性。获得所有测试细胞系的～7-10μM72h的IC₅₀值，除HT29之外(>50μM，IC₅₀，72h)。对于所有调查的细胞系，评价奥沙利铂和5FU的体外协同作用，然而，未鉴定了其中配对试剂的加入导致显著改善的细胞毒性的细胞系。此外，进行文献调查以寻找体外生成的奥沙利铂抗性结肠直肠细胞系，从而潜在地包括临床前药理学研究以试图显示与游离奥沙利铂处理相比，这些细胞对脂质体奥沙利铂处理的改进的敏感性。从此次调查中，鉴定了其他三个奥沙利铂抗性结肠直肠肿瘤系；HT29(Plascencia等人，2006；Yang等人，2006)和DLD-1(Kashiwagi等人，2011)。

基于初步的体外研究和调查的文献，在一系列异种移植物模型中进行新型脂质体奥沙利铂制剂脂质体奥沙利铂5a的初始测试。脂质体奥沙利铂5a包括摩尔比65:30:5的POPC、胆固醇和DSPE-PEG(2000)。这些研究包括单剂量和多剂量方案和多剂量水平。

表13.脂质体奥沙利铂5a在人异种移植物模型中的单药效力和生物分布研究

已报道KB(表皮样口腔癌人肿瘤)细胞保留它们对奥沙利铂的敏感性同时对顺铂表现出固有的抗性。在顺铂抗性的细胞系中，奥沙利铂的IC₅₀值在0.19μM至14μM的范围内，且在许多顺铂抗性的细胞系中维持奥沙利铂敏感性。用于本试验的KB细胞系，其作为异种移植物生长良好，与其他人所报道的相比，表现出对顺铂相当的敏感性(4μM)和对奥沙利铂稍小的敏感性(在72h，IC₅₀＝5.4μM)。因此，首先在KB异种移植瘤中进行比较游离奥沙利铂与脂质体奥沙利铂的单一试剂效力研究。

在此研究开始之前，在非肿瘤携带免疫缺陷小鼠中评价奥沙利铂的药物耐受性。15mg/kg以上(即，20mg/kg)的剂量导致脱水和不可接受的总体重减轻。确定奥沙利铂在小鼠中的最大耐受剂量(MTD)为15mg/kg，与用于 批准提供给FDA的临床前数据(NDA21-492文件)一致。与盐水对照相比，本研究中奥沙利铂以15mg/kg给药没有显著抑制肿瘤生长或增加存活。在注射前的细胞毒性测试中，用于此实验的KB细胞对奥沙利铂表现出5.3μM的IC₅₀，其是其他部分响应于奥沙利铂处理的人肿瘤细胞系所观察到的数倍高。这可以部分解释在该模型中单一给药后奥沙利铂不能抑制肿瘤生长。虽然奥沙利铂延迟肿瘤生长至五天0.5cm³的尺寸，但此生长抑制效果在较长时期的研究中未能维持。

含有包封的奥沙利铂的新颖脂质体，以下称为脂质体奥沙利铂5a，也通过相同途径以40和60mg/kg的剂量给药一次。不像游离奥沙利铂，经脂质体奥沙利铂5a单一处理在KB肿瘤中产生比对照显著更强的肿瘤生长延迟(P<0.05)(图8)。与盐水对照相比，所测试的两种剂量的脂质体奥沙利铂5a将肿瘤生长抑制了60％。此外，与盐水处理的对照相比，脂质体奥沙利铂5a将肿瘤生长延迟了18和24天(分别为40和60mg/kg)。此外，与盐水处理的对照相比，脂质体奥沙利铂5a处理在两个测试剂量下还分别增加了13(43％)和24天(77％)的中位存活(参见，图9和表14)。重要地，10只中仅有两只(20％)脂质体奥沙利铂5a处理的动物(以较低的剂量)因健康状况不佳或总体重损失而移除，表明50mg/kg接近脂质体奥沙利铂5a的MTD。

表14.经脂质体奥沙利铂5a或奥沙利铂处理的具有KB异种移植物的小鼠的肿瘤生 长抑制(TGI)和延迟(TGD)及中位存活。

人结肠肿瘤异种移植物模型已被广泛用于评估基于奥沙利铂的疗法，主要使用HT29细胞，其在细胞毒性分析中对低μM浓度的奥沙利铂敏感。已产生许多HT29细胞系，其对奥沙利铂的敏感性少很多倍。在本研究中使用的HT29细胞系表现出如其他人所报道的对奥沙利铂相似的敏感性(IC₅₀5.4μM)。在该肿瘤模型中进行含有奥沙利铂的新颖脂质体制剂的两项研究。在第一项研究中(图10)，脂质体奥沙利铂5a和乐沙定每周给药达三周。按照相同的时间表，与以15mg/kg/剂量给予奥沙利铂相比，以22mg/kg/剂量给予脂质体奥沙利铂5a抑制和延迟肿瘤生长并增加具有HT29人结肠直肠异种移植肿瘤的小鼠的存活(参见，图11、图12和表15)。

表15.经脂质体奥沙利铂5a或奥沙利铂处理的具有HT29异种移植物的小鼠的肿瘤 生长抑制(TGI)和延迟(TGD)及存活。

在第二项研究中，具有HT-29结肠直肠异种移植物的小鼠经脂质体奥沙利铂5a以15、25或35mg/kg/剂量每周处理达三周。经所有剂量水平的脂质体奥沙利铂5a处理产生的肿瘤比以MTD给药的乐沙定或盐水处理小(图13)。与盐水相比，乐沙定显示对肿瘤生长没有影响，但产生毒性，如体重降低和病态所见的(参见，图14、图15和表16)。

表16.经脂质体奥沙利铂5a或乐沙定处理的具有HT29异种移植物的小鼠的肿瘤生 长抑制(TGI)和存活。

还进行了脂质体奥沙利铂5a和乐沙定在具有HT29异种移植物的免疫缺陷小鼠中的生物分布和药代动力学研究。经脂质体(15mg/kg奥沙利铂)处理增加总肿瘤铂暴露(AUC)比经相同剂量的乐沙定处理大6倍(图16)。该观察结果与1)增强肿瘤渗透和滞留(EPR效应)和2)循环和肿瘤微环境内的脂质体奥沙利铂5a与游离奥沙利铂的持续血浆半衰期一致。不希望受任何特定理论束缚，相信暴露于铂的肿瘤增加可能促成该HT29结肠直肠异种移植物模型中的脂质体所观察到的效力增加。血浆铂水平示于图17中。药代动力学和组织分布总结于表17和表18中。

表17.乐沙定和脂质体奥沙利铂5a的药代动力学

化合物	乐沙定	脂质体奥沙利铂5a	脂质体奥沙利铂5a
				剂量(mg/kg)a	15	15	45
AUC(hr*μg/ml)	55	5952	260623
				Cmax(μg/ml)	12	141	351
CL(ml/hr/kg)	129	1.2	0.8
				t1/2(hr)	38	17	18
Vz(ml/kg)	7026	30	22

^a所有剂量以奥沙利铂摩尔等价物给出。

表18.乐沙定和脂质体奥沙利铂5a的组织分布

^a所有剂量以奥沙利铂摩尔等价物给出。^b样品未测量

胰腺导管腺癌是高致命性的并对化疗具有抗性。这些肿瘤是相对血管不足的，并具有致密的间质基质，这被认为有助于其抵抗化疗药物。最近，与转移性胰腺癌的一线治疗的护理标准品吉西他滨相比，含有奥沙利铂的FOLFIRINOX方案已显示出相当的或稍有改善的效力。已报道，与吉西他滨相比，纳米药物Abraxane在胰腺癌中具有有利的活性，但晚期胰腺癌的治疗选择仍然是非常有限的。为了试图在异种移植物模型中模拟这些促结缔组织增生性肿瘤，研究人员已采用所选的乳腺或胰腺细胞系用于评价纳米颗粒生物分布和效力研究。在本研究中，观察到乐沙定阻断BxPC-3胰腺细胞增殖的低μMIC₅₀值。评价脂质体奥沙利铂5a在异种移植物模型中对人BxPC-3胰腺癌细胞的单一试剂多剂量活性。尽管在该模型中每周给药时单独使用乐沙定未观察到显著效力，但在所有测试剂量的脂质体奥沙利铂5a中观察到肿瘤生长的显著延迟(图18)。体重变化和存活率分别示于图19和图20中。

组合制剂效力研究

脂质体奥沙利铂5a和几种治疗剂可用于采用异种移植物模型的临床前组合研究中以评价各种临床相关的治疗方案中的组合活性，包括例如，5-FU、西妥昔单抗和吉西他滨。

还进行了在具有HT29人结肠直肠异种移植物的小鼠中使用脂质体奥沙利铂5a制剂与5FU(5-氟尿嘧啶)的组合疗法研究并给出了良好的结果。

实施例6.脂质体奥沙利铂效力的进一步评价

显示脂质体奥沙利铂有效减少HT29异种移植物的肿瘤生长的能力依赖于制剂中所使用的脂质的组合物。组合物的变化导致效力和在一些情况下耐受性(毒性)的差异。虽然在一些比较中(DMPC与DPPC、DSPC)，相对快的体外奥沙利铂释放制剂显示增高的毒性作用，但快速释放既没有解释POPC与DOPC之间的差异，也没有解释POPC与DMPC之间的差异。根据本文的结果，发现在甘油-磷脂酰胆碱上具有至少一种饱和脂肪酸链的脂质优选于低胆固醇制剂或在两个脂肪酸链中都含有具有不饱和位点的脂质的制剂。

显示与对照的效力的脂质体制剂可缩小至以下一组条件：

a)包含中性二-烷基-甘油-磷脂酰胆碱的脂质组合物，所述二-烷基-甘油-磷脂酰胆碱含有碳长≥C14，或优选>C14的两种饱和脂肪酸，或一种饱和脂肪酸和一种链长≥C14，优选>C14的单不饱和脂肪酸；

b)显示与对照的效力的含有25％至45％(mole％)胆固醇和上述特定的中性二-烷基-甘油-磷脂酰胆碱的制剂；和

c)PEG化脂质体可能含有DSPE-PEG(2000)或DSPE-PEG(5000)作为隐性组分；然而，胆固醇-PEG(5000)的使用没有表现出足够的效用。

下面的研究说明开展的实验以得到本发明的有益组合物。评估的性质包括粒径、载药量(脂质/奥沙利铂)、奥沙利铂的体外释放、HT-29细胞的IC₅₀(体外)和HT29肿瘤异种移植物的体内效力。脂质组合物包括磷脂酰胆碱上的脂肪酸链、加入的胆固醇的摩尔％和PEG(长循环剂)的各种锚点的改变。

实验：

奥沙利铂的所有脂质体制剂通过以下方法进行制备(奥沙利铂被动加载的EtOH注射)。

实施例1：E000201-051的制备

向30mL琥珀色瓶中加入DSPC、胆固醇和DSPE-PEG(2000)。将该脂质混合物溶于10mLEtOH(脂质在65℃溶于EtOH)。向250mL血清瓶中加入1.6g奥沙利铂(LC实验室，99％FW＝397)和100mL的0.3M蔗糖水溶液(在使用前经0.2微米过滤器过滤)。在温度控制的水浴中在磁力搅拌下将奥沙利铂溶液加热至65℃。向加热的溶液(完全溶解的奥沙利铂)中加入脂质的EtOH溶液，得到乳白色悬浮液。在65℃在水浴中继续加热30min。

将上面的囊泡在65℃使用100mLLipex^TM挤出机在200-600psig氮气下通过0.1微米双层叠膜(Whatman，NucleporeTrack-Etched，在隔离器中进行挤出)挤出5X。将所得的脂质体在5℃冷冻2天，其造成过量的奥沙利铂结晶。将脂质体从结晶的奥沙利铂中倾析出并用300mL含有20mM乙酸盐缓冲液(pH6.5)的0.3M蔗糖使用mPES500KDaMWCO空心纤维(KrosFlo研究II型切向流渗滤单元)进行渗滤。收集10体积的渗滤液后，将脂质体滞留物超滤至约30mL的最终体积。将超滤的脂质体材料经0.2微米注射过滤器(Nylon)过滤至琥珀色血清小瓶中并在5℃储存。

使用Malvernzeta分级机(DLS)测定粒径和zeta电位(用生理盐水将50μL稀释至1mL)并以nm报告体积平均值。

用于鉴定和测定脂质组分的反相HPLC-ELSD方法

这是用于鉴定和测定脂质体制剂中的脂质组分的反相HPLC-ELSD方法。该方法可适用于进行稳定性研究、体外释放分析或体内研究的制剂和对照媒介物。

程序：

在适当的有机溶剂例如正丙醇或甲醇中制备两种脂质体组分的储备溶液。确保溶液是清澈的且不含晶体。使用一种储备溶液制备一组用于脂质定量的校准标准品。使用另一种制备用于曲线验证的质量控制标准品。然后在与标准曲线稀释剂相同的有机物中稀释样品。

HPLC条件：

柱：XSelectCSHC18，3.5μm，3.0x150mM

柱温：50℃

自动进样器温度：15℃

进样体积：10μL

运行时间：20min

ELSD：雾化室40℃，漂移管60℃，RF滤波器4

洗脱曲线：

流动相A：25mM甲酸铵

流动相B：MeOH:ACN＝80:20

梯度条件

时间(min)	流速(mL/min)	％A	％B
				0.0	1.0	15	85
15.0	1.0	0	100
				16.0	1.0	0	100
16.1	1.0	15	85
				20.0	1.0	15	85

运行校准曲线和QC样品，随后您的样品。

报告脂质浓度(mg/mL)和脂质摩尔比。

通过ICP-MS定量样品中的铂类

试剂：痕量金属级浓硝酸；铂标准品；铱标准品(Ir)；QC标准品和Milli-Q水。

设备：PerkinElmer电感耦合等离子体质谱仪(NexION300qICP-MS)。

总的和未包封的铂类的测定

以下程序适用于～2mg/mL铂类的制剂：500微升的测试制剂通过Amicon，0.5mL，30kD分子量的截止旋转过滤器(Millipore，目录#UFC503096)以9000rpm旋转10分钟以获得未包封的样品。将10微升的未包封滤液和最初的测试制剂(分别用于未包封的和总的铂类测定)分别在5mL的浓硝酸中消化并在70℃、350rpm下加热。然后将所有样品在含有2ng/mLIr内标的水中用水稀释至5,000x(未包封的)和200,000x(总的)的最终稀释液。在ICP-MS上运行样品并拟合为10-20,000pg/mL铂类范围的八点线性标准曲线。

体外释放分析

将500微升的脂质体制剂加载到100kD透析设备Float-A-LyzerG2上。然后将加载的Float-A-Lyzer插入到含有15mL的pH5PBS、pH7PBS或胎牛血清(FBS)的50mL锥形管中。然后将管置于设定为37℃、350rpm的热混合器中。在6、24和48小时采集样品用于分析。

在收集所有时间点和“总”样品后，将10μL的每个收集的样品转移至另一96-深-孔板的孔中，将400μL的浓硝酸加入到每个中，并将板用板密封器密封并在70℃、350rpm下加热至少1小时(使用热混合器)。使用含有最终浓度为2ng/mL的Ir内标的水将样品稀释至200x。在ICP-MS上运行所有样品并拟合为10-20,000pg/mL铂类范围的八点线性标准曲线。

HT29细胞中IC50的测定

将HT29人肿瘤细胞系以5x10⁴个细胞/mL接种在96孔组织培养板(Costar#3595)上，10％FBS在McCoy’s5a培养基中的最终体积为0.1mL。所有培养基和生长添加剂获自Mediatech(Manassas，VA)。所限定的胎牛血清获自Hyclone(#SH30070.03，批号#AWB96395，Logan，UT)。将含有细胞的板在37℃在5％CO₂的湿润空气中温育24hr。基于各人肿瘤细胞系的大约倍增时间选择所选的初始细胞接种密度。将试验组合物用上面的储备溶液稀释至在Dulbecco’s改良的磷酸盐缓冲盐水(DPBS；Mediatech,Inc.，批号#21031339，Manassas，VA)中为2.2mmol/L，然后在DPBS中连续稀释3倍以产生9点浓度-响应曲线。将10μL的稀释的试验组合物一式三份加入到平板中以达到所需的最终浓度。将加入和不加入试验组合物的含有细胞的板送回如上所述的温育共72hr。对于各种处理时间，在指示的处理时间后移除含药物的培养基并替换为不含药物的培养基。随后，使用AlamarBlue评估细胞活力。为此目的，通过移液从培养的细胞中移除介质，并替换为在适当的细胞培养介质中稀释的0.1mL/孔的10％(v/v)AlamarBlue(#BUF012A，AbDSerotec，Raleigh，NC)。然后将板送回如前所述的温育2-4hr以用于适当的显色。使用BioTekSynergy4酶标仪在545nm/590nm(激发/发射)测量各板孔的荧光。细胞活力计算为获得的测量荧光相对于仅经培养基处理的细胞的百分数。IC₅₀值(μmol/L)使用MicrosoftExcel宏通过一式三份值的均值来确定，所述宏利用非线性回归分析和四参数曲线拟合模型。

实施例7.脂质体奥沙利铂效力的进一步评价体内研究

评估具有可变脂质体组合物的脂质体奥沙利铂制剂在小鼠中的耐受性和在具有HT29人结肠直肠异种移植瘤的小鼠中的效力。

研究设计

急性小鼠耐受分析。雌性Hsd：无胸腺裸-FoxN1nu/mu小鼠以30、36或45mg/kg给予单次静脉内(IV)剂量的测试品。所有剂量以奥沙利铂等效剂量给出。在注射后监测小鼠并称重14天。将发现为奄奄一息的或已损失大于20％的体重的小鼠从研究中移除。

小鼠异种移植物效力研究。雌性Hsd：无胸腺裸-FoxN1nu/mu小鼠分别皮下植入2.5x10⁶个HT29人结肠直肠细胞至右侧腹。一旦肿瘤达到200mm³的中值体积，将50只动物随机并利用肿瘤体积归一化至处理组。无肿瘤的动物没有包括在该研究中。每只动物每周给予单次静脉内(IV)剂量的脂质体奥沙利铂制剂测试品、乐沙定阳性对照品或盐水达三周(q7dx3)。测试品以奥沙利铂等效剂量给出。

测量和统计

使用肿瘤成像系统(Biopticon)每周测定肿瘤体积2-3次。每周测量体重。分析肿瘤体积数据以测定处理的与对照肿瘤体积的比例(theratiooftreatedversuscontroltumorvolumes)(％T/C)。如果小鼠损失其初始体重的20％、变为奄奄一息的，或如果其肿瘤体积超过2500mm³或溃烂，则将其从该研究中移除。如果留下不到一半的初始队列的小鼠，则该组不再包括在进一步的肿瘤分析中。

在对照组至少有一半的初始动物留在研究中的最后一天计算处理的与对照肿瘤体积的比例(％T/C)。％T/C通过如下计算：100X(平均肿瘤体积处理组)/(平均肿瘤体积对照组)。

处理组的肿瘤生长的统计学比较采用每个剂量组的平均测量值(在研究中保留一半或更多盐水处理的小鼠的最后时间以及刚好在研究中脱落小于50％小鼠的其他组移除前)的单向ANOVA比较。观察到统计学意义(p<0.05)时，进行Newman-Keuls事后比较试验。使用GraphPadPrism6进行所有统计分析，并将统计学意义的标准设定为p<0.05。

结果

评价了表1中的脂质体奥沙利铂制剂的30、36或45mg/kg单次静脉内剂量的耐受性。五种制剂表现出严重毒性迹象，包括体重损失大于20％或病态。表1中的其余五种制剂耐受45mg/kg剂量的脂质体奥沙利铂而无严重毒性迹象。

将脂质体奥沙利铂制剂(25mg/kg)、乐沙定(10，15mg/kg)和盐水每周给予具有HT29人异种移植瘤的小鼠达三周。表2所示的六种脂质体奥沙利铂制剂产生严重毒性，而表3所示的其他二十五种制剂耐受此给药水平。二十五种耐受的制剂中有二十四种产生肿瘤体积显著小于盐水处理小鼠的肿瘤体积的效力(p<0.05)。这些二十四种脂质体奥沙利铂制剂抑制肿瘤生长，产生25％(效果最大)至58％(效果最小)范围内的处理与对照肿瘤体积比(％T/C)。与盐水处理相比，一种耐受的脂质体奥沙利铂制剂(MP-3796)没有显著抑制肿瘤生长并产生81％的％T/C。与盐水处理相比，每周给予10或15mg/kgIV剂量的乐沙定(比较细胞毒性剂)三次仅在四个研究中有一个显著抑制肿瘤生长(p<0.05)并产生53％至88％范围内的％T/C。

表1.急性小鼠耐受分析

表2.在具有肿瘤的小鼠中多剂量后严重毒性的制剂

表3.

^a盐水处理的小鼠的平均肿瘤体积的统计比较，单向ANOVA，Neuman-Keuls事后检验。ns＝不显著。

使用EtOH稀释方法制备脂质体奥沙利铂制剂，所述EtOH稀释方法本质上是“被动”的包封方法。满足几个特征的制剂可作为潜在的治疗、可注射材料。对于肠胃外施用，关键的考虑因素是形成的囊泡的粒径。已发现肠胃外脂质体制剂的粒径最佳在80-120nm的范围内。已报道，更大的粒径导致网状内皮系统(RES)吸收更多，而较小的颗粒倾向于稳定性较差，易于释放包封物质。因此，在我们的选择过程中初始标准是产生体积平均尺寸在80-120nm的脂质体颗粒。

囊泡的水性内部中的奥沙利铂的包封依赖于囊泡形成过程中EtOH中的脂质浓度和水相中的奥沙利铂浓度。囊泡在处理过程中保留奥沙利铂的能力对于获得最大的包封率是至关重要的。对加工完成后制剂的脂质浓度、总奥沙利铂含量和未包封的奥沙利铂进行了分析。给出20至100的脂质奥沙利铂比例的那些制剂被视为可接受用于进一步的评估。给出更高比例的那些表明奥沙利铂的保留在处理过程中严重受限，因此，获得的物质含有不被认为足够用于有效使用的浓度的奥沙利铂。将分析后含有高水平的未包封的奥沙利铂的制剂排除，因为这些制剂在储存时本质上是不稳定的，易于释放奥沙利铂。通常，具有含有<C14链长的脂肪酸的二-烷基-甘油-磷脂酰胆碱或含有低胆固醇量的那些制剂没有包封足够量的奥沙利铂。

对具有20-100的药物脂质比例且尺寸在80-120nm的奥沙利铂制剂的奥沙利铂体外释放进行了评价。体外释放法测试囊泡的热稳定性(37℃)并在两个pH值(5和7.4)评价制剂。高的奥沙利铂释放表示脂质体不能保留奥沙利铂且过量释放表示稳定性差。在我们的这些奥沙利铂制剂的测试过程中，我们观察到，在几种情况下，在较低的pH(5)下发生奥沙利铂释放的较大(大于2X)差异。在二-烷基-甘油-磷脂酰胆碱组分中含有至少一种不饱和脂肪酸的组合物观察到最大的差异。未预料到该pH值敏感性；然而，这一观察结果的原因还不清楚，其对性能有任何体内作用也不是显而易见的。许多制备的制剂显示相当缓慢的奥沙利铂释放(在37℃经48hr<5％)。缓慢释放的那些被视为在循环中保持恒定低水平的未包封的奥沙利铂和可能显示最小毒性的潜在制剂。然而，缓慢释放的那些制剂可能不会在体内提供充足的奥沙利铂生物利用度且可能表现出最小的效力。

除了pH5和7.4下的体外释放研究以外，还在90％胎牛血清(FBS)基质中在37℃在血清蛋白和其他生物材料存在下评价奥沙利铂的释放。该释放测量旨在模拟潜在的体内释放。奥沙利铂在FBS中的快速或突发释放将指示囊泡不能在延长的时间段中维持奥沙利铂递送，而在循环中，尽管这未明确显示与体内奥沙利铂释放入循环直接相关。奥沙利铂在体外(FBS介质)的快速释放的发生被视为制剂的消极方面且那些制剂在后续的体内研究中可能导致更多成问题的毒性。体外显示缓慢释放(在37℃经48hr<5％)的那些制剂被视为潜在的低毒性材料；然而，不清楚释放速率(如体外所观察到的)是否将为效力(通过体内肿瘤生长抑制所测定的)提供足够量的可用的奥沙利铂。通常，观察到脂肪酸链越短(DLPC)和胆固醇的摩尔％(基于总脂质)越低，奥沙利铂的释放增加。对于含有相等链长的脂肪酸的二-烷基-甘油-磷脂酰胆碱，具有不饱和度的那些显示比完全饱和的对应物更大的奥沙利铂释放速率。

提供体积平均粒径为80-120nm的囊泡、包封率小于100(脂质与奥沙利铂)和经48hrs显示<25％的体外释放的奥沙利铂制剂被考虑用于体内研究。被认为是潜在的药物产品的奥沙利铂制剂必须满足两个重要标准：

1)所配制的奥沙利铂必须保留抑制肿瘤生长和与乐沙定相媲美的能力；和

2)所配制的奥沙利铂相对于乐沙定不应显示额外的毒性，且优选地其相对于乐沙定应显示有利的患者安全性。

使用小鼠的HT29人结肠直肠异种移植瘤模型来评价满足如上所述的体外标准的制剂。

在45mg/kg(单剂量)或25mg/kg(3-弱剂量)的特定剂量下造成死亡或显著重量损失的制剂被认为是有毒的。这些制剂包括低胆固醇、短链制剂(≤C14)和含有DOPC或DiPetPC的所有制剂。两种制剂均含有二-烷基-甘油-磷脂酰胆碱，其具有两个含有不饱和度的脂肪酸链。这些制剂的毒性性质不能很好地理解并且是基于其体外特征不可预测的。事实上，体外观察到的释放速率和获得的IC50值基本上与含POPC(具有不饱和度的单链)的制剂相同，其在这些研究中耐受。

显示缓慢体外释放的所有制剂在以25mg/kg每周3次剂量后很少至无体重减轻都是可以接受的。这包括所有包含含有大于C14的饱和脂肪酸链的二-烷基磷脂酰胆碱和含有至少25％(摩尔％)胆固醇的制剂。含有POPC和SOPC(具有一种饱和脂肪酸和一种不饱和脂肪酸)的制剂以25mg/kg每周3次剂量也得到很少至无体重减轻的良好结果。虽然这种给药方案是可耐受的，但未测定这些制剂的最大耐受剂量且对于每周3次剂量可能高于25mg/kg。剂量的减少仍可提供效力而没有在25mg/kg下(每周3次剂量)产生不可接受的毒性的那些制剂的毒性事件。测定乐沙定(奥沙利铂的商业制剂)具有10至15mg/kg的MTD(每周3次剂量)。如从上述结果所判断，含有至少一种饱和脂肪酸且含有大于C14的链以及至少25重量％的胆固醇的所有制剂均能达到乐沙定的167％水平下的奥沙利铂等效剂量水平。

在小鼠的HT29人结肠直肠异种移植瘤模型中评价满足可接受的体外标准的奥沙利铂制剂的效力。作为比较纳入每个研究组的是作为对照的盐水和乐沙定(作为目前的金标准)。显示效力(如通过％T/C所判断；处理的与盐水对照的肿瘤体积比)的那些制剂包括显示具有大于乐沙定的安全性的所有制剂，只要含PEG的部分含有DSPE。含胆固醇锚定的PEG的制剂在该模型中不显示效力。虽然在所有情况下都无统计学意义，但除胆固醇锚定的PEG制剂和对以25mg/kg每周3次剂量表现出不可接受的耐受性的那些制剂外的所有制剂均显示出与乐沙定的差异化。我们可以推出结论：含有具有两个饱和烷基链的PC部分的制剂比含有一种不饱和链的那些(POPC和SOPC)得到更高的％T/C。然而，这仅是未经统计学意义验证的趋势。该趋势的一个例外是在含有饱和C20链的PC的情况下。该PC的较大效力(较低的％T/C)是未预料到的，也不是基于任何体外研究或从它的任何物理/化学性质可预测的。

猜想奥沙利铂从囊泡中的释放对于生物活性是必要的且释放速率在肿瘤生长抑制中起重要作用。上述制剂在体外所观察到的奥沙利铂释放速率的不同范围对体外释放与体内活性的相关性提出重要问题。在体外给予高达20％的释放速率(含有POPC)的制剂和低至1-2％(DSPC、HSPC)的那些制剂均抑制肿瘤生长并给予低于(或统计分析等于)乐沙定的％T/C，而不会在小鼠中导致病态或不利的重量减轻。这些制剂如何产生作为体内奥沙利铂释放的函数的效力尚未确定。如前面所概述的，已在体内广泛研究了奥沙利铂从POPC:胆固醇:DSPE-PEG(2000)制剂(MP-3628)中的释放，并已证实循环中奥沙利铂的延长释放曲线。因此，本文提供一组制剂，其比乐沙定更可耐受，同时维持至少相当的(如果不大于)乐沙定的效力。这组制剂包括：

1)具有至少一个长度大于C14的饱和脂肪酸链的PC

2)具有两个长度大于C14的饱和脂肪酸链的PC

3)具有一个含有一个不饱和键且长度大于C14的脂肪酸链的PC

4)制剂中含有至少25mole％的胆固醇

5)小于7.5mole％的PEG化PC

令人惊讶的是，在所有胆固醇水平下使用DOPC似乎引起比相应的POPC系列大的毒性。还令人惊讶的是，使用具有缓慢体外释放曲线(即，DSPC和HSPC)的制剂将显示效力，尤其是二C20PC制剂所见的不寻常的高效力(低％T/C)。

虽然为了清楚和理解的目的，已通过说明和实例的方式详细地描述了上述发明，但本领域技术人员应理解，可在所附的权利要求的范围内进行某些改变和修饰。此外，本文提供的各参考文献通过引用整体并入，如同各参考文献通过引用各自并入一样。

Claims (25)

1.用于治疗癌症的组合物，其包含：

(a)基本上由约50mol％至约70mol％的磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物、约25mol％至约45mol％的胆固醇和约2mol％至约8mol％的PEG-脂质组成的两性离子脂质体；和

(b)奥沙利铂，其以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约20:1至约65:1的量包封在所述脂质体中；

其中所述磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物具有14个碳原子或更多的脂肪酸链，并且两个脂肪酸链中不多于一个是不饱和的。

2.权利要求1的组合物，其中奥沙利铂以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约30:1至约45:1的量包封在所述脂质体中。

3.权利要求1的组合物，其中所述磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物不是氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)或不是包含HSPC的混合物。

4.权利要求1的组合物，其中所述磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物具有15个碳原子或更多的脂肪酸链。

5.权利要求1的组合物，其中所述磷脂酰胆碱脂质选自棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱(SOPC)和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。

6.权利要求1的组合物，其中所述磷脂酰胆碱脂质为POPC。

7.权利要求1的组合物，其中PEG-脂质为二酰基-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]。

8.权利要求1至7中任一项的组合物，其中PEG-脂质选自二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-2000)和二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](DSPE-PEG-5000)。

9.权利要求1的组合物，其中两性离子脂质体包含约55mol％POPC、约40mol％胆固醇和约5mol％DSPE-PEG(2000)。

10.权利要求1的组合物，其中两性离子脂质体包含约65mol％POPC、约30mol％胆固醇和约5mol％DSPE-PEG(2000)。

11.权利要求9或权利要求10的组合物，其中总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约50:1。

12.权利要求9或权利要求10的组合物，其中总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约30:1至约35:1。

13.权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体具有约75至约125nm的平均粒径。

14.权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体具有约90nm的平均粒径。

15.权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体通过包括以下步骤的方法制备：

a)形成脂质溶液，该脂质溶液包含磷脂酰胆碱脂质、胆固醇、PEG-脂质和选自C_1-4烷醇和C_1-4烷醇/水混合物的溶剂；

b)将脂质溶液与水性缓冲液混合以形成多层囊泡(MLV)；和

c)通过多孔过滤器挤出MLV以形成小单层囊泡(SUV)；

d)渗滤以从脂质体制剂中除去未包封的奥沙利铂；

由此形成所述两性离子脂质体。

16.权利要求15的组合物，其中奥沙利铂的包封通过在MLV形成期间将奥沙利铂包括在水性缓冲液中来进行。

17.权利要求15的组合物，其中所述方法进一步包括：

e)无菌过滤所述两性离子脂质体。

18.治疗癌症的方法，所述方法包括向需要其的受试者给予权利要求1至17中任一项的组合物。

19.权利要求18的方法，其中所述癌症为选自膀胱癌、结肠直肠癌、胃癌、食道癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌的实体瘤癌症。

20.权利要求18的方法，其中所述组合物包含：

a)基本上由55mol％POPC、40mol％胆固醇和5mol％DSPE-PEG(2000)组成的两性离子脂质体；和

b)奥沙利铂，其以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约50:1的量包封在所述脂质体中。

21.权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体为选自以下的脂质体：HSPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，65/30/5；POPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，65/30/5；和DPPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，65/30/5脂质体。

22.权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体为选自以下的脂质体：POPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，50/45/5；PSPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，50/45/5；DiC20PC/Chol/DSPE-PEG(2000)，50/45/5；HSPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，50/45/5；DPPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，50/45/5；DSPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，50/45/5；和SOPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，50/45/5脂质体。

23.权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体为选自以下的脂质体：POPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，70/25/5；PSPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，70/25/5；HSPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，70/25/5；DSPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，70/25/5；和SOPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，70/25/5脂质体。

24.权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体为选自以下的脂质体：POPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，60/35/5；PSPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，60/35/5；HSPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，60/35/5；DSPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，60/35/5；DPPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，60/35/5；DiC20PC/Chol/DSPE-PEG(2000)，60/35/5；和SOPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，60/35/5脂质体。

25.权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体为POPC/Chol/DSPE-PEG(5000)，65/30/5脂质体。