CN102349944B - 一种黄芩提取物鼻用温敏型原位凝胶及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种黄芩提取物鼻用温敏型原位凝胶。本发明还提供了该黄芩提取物鼻用温敏型原位凝胶的制备方法和用途。本发明还提供该黄芩提取物制备的磷脂复合物亚微乳。本发明药物药效明确、可控性强,安全稳定,黄芩磷脂复合物适合于鼻腔给药,药效明确,且药效明显优于黄芩苷纯品,制备方法简便,便于大生产,以鼻用温敏型原位凝胶和亚微乳两种制剂形式,能更好的发挥黄芩提取物的药效。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄芩提取物鼻用温敏型原位凝胶。
背景技术
黄芩(Radix Scutellariae)是唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi(Lamiaceae)的干燥根,在我国分布极广,黑龙江、吉林、辽宁、河南、河北、山东、四川、云南、山西、陕西、甘肃和内蒙古等省均为产地。功能与主治:清热燥湿,泻火解毒,止血,安胎。用于湿热、暑热胸闷呕恶,湿热痞满,泻痢,黄疸,肺热咳嗽,高热烦渴,血热吐衄,痈肿疮毒,胎动不安。黄芩具有抗炎抗变态反应、抗微生物作用、解热作用、降压、利尿作用,对血脂及血糖的作用,利胆、解痉作用,镇静作用等。目前黄芩提取物的制备方法较多,如专利申请号:200610014770.7,发明名称:双黄连滴丸及其制备方法,该方法公开了黄芩提取物的制备方法。也有提取高纯度的黄芩中活性成分黄芩苷的文献报道。目前还有黄芩苷磷脂复合物的报道,如:黄芩苷磷脂复合物经鼻给药脑内递药特性的研究,成都中医药大学,2009-04-01。黄芩中成分复杂,黄芩苷仅是其中的活性成分之一,当黄芩苷的含量较低时,由于其中多种成分包括杂质存在,制备成制剂(如磷脂复合物)较困难;而采用黄芩苷纯品制剂,它是理化性质明确的化合物,制剂容易,但黄芩中成分黄芩苷的含量为不得少于9.0%《中国药典》2010年版,提取分离黄芩苷纯品成本高,不便于大生产用药,不能满足制剂的需求。
原位凝胶(in situ gel)或称在体凝胶、环境敏感凝胶,是随着药用高分子材料学的发展而产生的新颖剂型,是指以溶液状态给药后立即在用药部位发生胶凝,从而形成非化学交联的半固体制剂。原位凝胶具有凝胶制剂高度亲水性的三维网络结构及良好的组织相容性,同时,独特的溶液--凝胶转变性质使其兼有制备简单、使用方便、与用药部位尤其是豁膜组织亲和力强、滞留时间长等优点。近年来,原位凝胶给药系统己经引起了各国学者的广泛关注,成为药剂学领域的研究热点之一。温敏型原位凝胶,贮藏条件和用药部位的温度差异可以使某些高分子溶液发生溶液凝胶的转变,形成凝胶。这些聚合物在结构上均包含一定比例的疏水和亲水嵌段,其热敏型的胶凝行为与不同性质的嵌段间、以及嵌段与溶剂间的相互作用有关。利用对热敏感的聚合物,可以研制成黏膜给药的制剂,如口腔,鼻腔,阴道,直肠等部位的给药。
亚微乳是一种乳滴粒径在100~1000m之间的乳剂,早在1961年,瑞典人已经用大豆油和蛋黄磷脂制成脂肪乳剂,但早期的亚微乳中不加入药物,仅作为脂肪乳剂用于高能量的胃肠外营养,为人体提供能量。近年来,亚微乳作为一种载药体系日益受到重视,人们将药物溶解于油相中制成亚微乳,不仅将其用于静脉给药,而且将这种载药体系用于眼部给药,或其它局部用药。乳剂一般分为O/W型和W/O型乳剂,由于黄芩提取物磷脂复合物具有较强的亲脂性,其在油中的溶解度远大于水中(是其在水中溶解度的40多倍),因此拟选择制成O/W型乳剂。同时黄芩苷制备成磷脂复合物以后,其在水及油中的溶解性能比黄芩苷及物理混合物均有明显的改善,因而认为其既改善了黄芩苷的亲水性,又改善了亲脂性,且亲脂性改善程度更大。制成O/W型亚微乳后药物呈现微小乳滴分散在水中,改善了其分散性能,而外相的水与鼻粘液也具有较强的亲和性,从而使亚微乳产生极好的吸收效果。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种黄芩提取物鼻用温敏型原位凝胶。本发明还提供了该黄芩提取物鼻用温敏型原位凝胶的制备方法和用途。
本发明提供了一种黄芩提取物鼻用温敏型原位凝胶,它由黄芩提取物磷脂复合物制备而成。
其中,所述的黄芩提取物中含有黄芩苷的重量百分含量为85%以上。
其中,所述的黄芩提取物的制备包括如下步骤:取黄芩药材,加水煎煮提取,滤液浓缩成清膏,加盐酸调节pH值至1.0~2.0,70-80℃保温1h,静置,滤过,沉淀物加水搅匀,用40%氢氧化钠溶液调节pH值至7.0,搅拌使溶解,滤过,滤液用盐酸调节pH值至1.0~2.0,60-70℃保温0.5-1小时,静置,滤过,沉淀用水洗或乙醇洗至pH值至7.0,减压干燥,即得黄芩提取物。
其中,所述的黄芩提取物磷脂复合物它是由下述重量配比的黄芩提取物与大豆卵磷脂为原料制备而成:
黄芩提取物1-3份、大豆卵磷脂1-4份。
进一步优选地,所述的黄芩提取物磷脂复合物它是由下述重量配比的黄芩提取物与大豆卵磷脂为原料制备而成:
黄芩提取物1份、大豆卵磷脂2份。
其中,所述的黄芩提取物磷脂复合物的制备方法,包括如下步骤:
a、取下述重量配比的原料:黄芩提取物1-3份、大豆卵磷脂1-4份;
b、加入脱水无水乙醇,黄芩提取物药物浓度为2.5-7.5mg/ml,在20-70℃恒温水浴中60-240转/min磁力搅拌1-4小时,减压回收溶剂,真空干燥,即得黄芩提取物磷脂复合物。
进一步地,它包括如下步骤:
a、取下述重量配比的原料:黄芩提取物1份、大豆卵磷脂1-3份;
b、加入脱水无水乙醇,黄芩提取物药物浓度为5.0mg/ml,在55℃恒温水浴中120转/min磁力搅拌2小时,减压回收溶剂,真空干燥,即得黄芩提取物磷脂复合物。
本发明鼻用温敏型原位凝胶,是由下述重量配比的原料药制备而成:
泊洛沙姆40716%-24%、泊洛沙姆1880%-12%、PEG60000%-2%、甘露醇5%、苯扎氯胺0.02%、三乙醇胺0.1%。
本发明还提供了所述的鼻用温敏型原位凝胶在制备治疗脑缺血的药物中的用途。
本发明还提供了所述的鼻用温敏型原位凝胶在制备用于鼻腔给药的治疗脑缺血的药物中的用途。
本发明提供了一种黄芩提取物亚微乳,它是由下述百分含量的原料药及辅料制备而成:
黄芩提取物磷脂复合物1~10g,卵磷脂0.6%,辅助乳化剂F-68为0.3%,0.1%油酸钠为pH调节剂和稳定剂,10~20%油相,2.5%甘油。
本发明还提供了一种制备所述的黄芩提取物亚微乳的方法,将黄芩提取物磷脂复合物加入到大豆油中、立即剪切分散,溶解后加入卵磷脂等油溶性成分,得油相;甘油、等水溶性成分溶于水中,得水相;将油相和水相加热到一定温度后,油相缓慢加入到水相中,高剪切乳化分散制备初乳;初乳迅速冷却至室温,再经两步高压乳匀机均质数次(700bar的压力),热压灭菌,即得亚微乳。
由于血脑屏障的存在,传统的口服及静脉给药,药物很难到达脑内,对于缺血性脑损伤的治疗效果不佳,为此寻找一种新型的给药途径成为了黄芩提取物磷脂复合物治疗缺血性脑损伤的必然,根据药效试验证明,本发明药物药效明确、可控性强,安全稳定,黄芩磷脂复合物更适合于鼻腔给药,药效明确,且药效明显优于黄芩苷纯品,制备方法简便,便于大生产,以鼻用温敏型原位凝胶和亚微乳两种制剂形式,能更好的发挥黄芩提取物的药效。
附图说明
图1黄芩提取物磷脂复合物制备工艺流程图
图2黄芩提取物磷脂复合物温敏凝胶制备工艺流程图
图3剪切时间考察,其中,①剪切3min ②剪切6min ③剪切9min ④剪切12min ⑤剪切15min
图4剪切时间考察,其中,①13000rpm剪切 ②16000rpm剪切 ③16000rpm剪切 ④22000rpm剪切
图5HE染色后光镜观察鼻黏膜形态(×200),其中,A.空白(生理盐水)组;B.药物组
具体实施方式
实施例1本发明黄芩提取物制备
取黄芩药材,加水煎煮三次,每次1小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至适量,加入盐酸适量调节pH值至1.0~2.0,70℃保温,静置,滤过,沉淀加适量水搅匀,用40%氢氧化钠溶液调节pH值至7.0,加等量乙醇,搅拌使溶解,滤过,滤液用盐酸调节pH值至1.0~2.0,70℃保温30分钟,静置,滤过,沉淀用47.5%乙醇洗至pH值6.0~7.0,挥尽乙醇,减压干燥,即得。
通过此方法制备得到的黄芩提取物中黄芩苷含量为82%~88%%之间。(根据中国药典2010版一部黄芩药材项下方法测定)
实施例2本发明黄芩提取物磷脂复合物的制备
称取一定量的黄芩提取物和PC含量为80的大豆卵磷脂(重量比为1:2,w/w),加入无水乙醇,黄芩提取物药物浓度为5.0mg/ml,在55℃恒温水浴中120转/min磁力搅拌2小时,减压回收溶剂,真空干燥,即得黄芩提取物磷脂复合物。
实施例3黄芩提取物磷脂复合物制备工艺实验
制备工艺流程见图1
1单因素考察
1.1反应溶剂的选择
以大豆卵磷脂PC含量为80、反应温度为50℃,磁力搅拌速度为120转/min,磁力搅拌时间为2h、反应浓度为5mg/ml、黄芩提取物与磷脂投料重量比为1:2制备磷脂复合物,分别考察四氢呋喃、无水乙醇、石油醚(30~60):无水乙醇(7:3)、脱水无水乙醇作为反应溶剂对复合反应的影响,以磷脂复合物结合率为评价指标,考察反应溶剂对于黄芩提取物磷脂复合物的制备的影响。
表1 不同反应溶剂的考察
实验结果表明:以四氢呋喃和脱水无水乙醇为反应溶剂时,平均复合率均较高,说明脱水无水乙醇和四氢呋喃均能为反应提供较好的质子体系,无水乙醇为反应溶剂时其次,可能是由于无水乙醇中存在少量水有关,石油醚(30~60):无水乙醇=7:3为反应溶剂时最低,表明石油醚和无水乙醇的混合溶剂不能提供较好的质子体系。综合反应溶剂的安全性和复合率考虑,选用脱水无水乙醇为反应溶剂。
1.2不同PC含量的考察
以脱水无水乙醇作为反应溶剂,分别以大豆卵磷脂中PC(磷脂酰胆碱)含量为60、70、80、90时,反应浓度为5mg/ml、反应温度为50℃,磁力搅拌速度为120转/min,磁力搅拌时间为2h,黄芩提取物与磷脂投料重量比为1:2制备磷脂复合物,以磷脂复合物结合率为评价指标,考察不同PC含量对于黄芩提取物磷脂复合物的制备影响。实验结果见表2。
表2 不同PC含量的考察
结果表明:随着大豆卵磷脂PC含量的增高,反应复合率随之增高,PC含量为80时,复合反应完全,大豆磷脂PC含量不同对复合反应影响重大,因此,选择PC含量为80的大豆磷脂作为实验反应原料。
1.3反应药物浓度
以脱水无水乙醇作为反应溶剂,分别以反应药物浓度为2.5、5.0、7.5、10mg/ml时,大豆卵磷脂PC含量为80、反应温度为50℃,磁力搅拌速度为120转/min,搅拌时间为2h、黄芩提取物与磷脂投料重量比为1:2制备磷脂复合物,以磷脂复合物结合率为评价指标,考察反应药物浓度对于黄芩提取物磷脂复合物的制备的影响。结果见表3。
表3 不同浓度的考察
实验结果表明:随着提取物药物浓度的提高复合率降低,说明浓度对复合反应影响较大,但是浓度为2.5mg/ml、5.0mg/ml时均具有较高的复合率,浓度为10.0mg/ml时浓度过大,复合率较低。同时反应浓度增大,可以降低反应溶剂用量,不论是为生产设备选型,还是成本的节约等都会带来便利,综合考虑得出5.0mg/ml为较优浓度。
1.4黄芩提取物与磷脂的投料比(质量比)
以脱水无水乙醇作为反应溶剂,分别对黄芩与磷脂的投料重量比为1:4、1:2、1:1、3:2、2:1、5:2、3:1,反应温度为50℃,大豆卵磷脂PC含量为80、磁力搅拌时间为2h、磁力搅拌速度为120转/min,反应浓度为5mg/ml,以结合率为评价指标,考察黄芩提取物与磷脂重量比,以及增大黄芩提取物的投料对于黄芩提取物磷脂复合物的制备的影响。结果见表4。
表4 不同药物与磷脂之间比例的考察
实验结果表明:随着药脂比的提高,反应复合率降低,说明药脂比对于复合反应影响重大。当药脂比小于1时都具有较优的复合率,由于大豆磷脂价格较为昂贵,且药脂比较小时,会使得复合物的载药量较低,综合考虑得出1:3、1:2、1:1为单因素结果的较优范围。
1.5反应温度
以脱水无水乙醇作为反应溶剂,分别对反应温度为20℃、40℃、50℃、60℃、70℃,大豆卵磷脂PC含量为80、磁力搅拌时间为2h、磁力搅拌速度为120转/min,反应浓度为5mg/ml,黄芩提取物与磷脂投料重量比为1:2制备磷脂复合物,以结合率为评价指标,考察反应温度对于黄芩提取物磷脂复合物的制备的影响。结果见表5。
表5 不同温度的考察
实验结果表明:随着温度的提高,反应复合率增大,但增大幅度并不大,且当温度为60、70℃时磷脂性状较差,有文献报道温度超过60℃时,大豆磷脂氧化加快,但是较高温度有利于复合反应进行,所以温度对复合反应有较大的影响,综合考虑得出40、50、60℃为较优范围,为减小磷脂氧化,初步选择以55℃为最高温度。
1.6反应时间
以脱水无水乙醇作为反应溶剂,分别对反应时间为1.0、2.0、3.0、4.0h,大豆卵磷脂PC含量为80、反应浓度为5mg/ml、反应温度为50℃,磁力搅拌速度为120转/min,黄芩提取物与磷脂投料重量比为1:2制备磷脂复合物,以磷脂复合物结合率为评价指标,考察反应时间对于黄芩提取物磷脂复合物的制备的影响。结果见表6。
表6 不同时间的考察
实验结果表明:随着反应时间的延长,反应复合率增加,但增加到2h后,反应复合率变化并不大,说明反应已较为完全。所以时间对反应的影响较小,同时可以得出2h为最佳反应时间。
1.7磁力搅拌速度
以脱水无水乙醇作为反应溶剂,分别对磁力搅拌速度为60转/min、120转/min、180转/min、240转/min,大豆卵磷脂PC含量为80、反应浓度为5mg/ml、反应重量比为1:2,反应温度为50℃,反应时间为2h,以结合率为评价指标,考察磁力搅拌速度对于黄芩提取物磷脂复合物的制备的影响。结果见表7。
表7 不同磁力搅拌速度的考察
实验结果表明:随着磁力搅拌速度的提高,反应复合率变化并不大,说明磁力搅拌速度对反应的影响较小,转速超过120转/min时,复合率变化不大,且高转速会增加机械做功,成本会相应增加,所以得出转速为120转/min时为最佳转速。
2正交试验
2.1黄芩提取物大豆磷脂复合物反应条件的优化
上述单因素实验结果表明:黄芩提取物与大豆卵磷脂的投料比(A)、反应温度(B)以及反应物的浓度(C)对于评价指标的影响较大,故以这3个水平进行正交设计。以脱水无水乙醇为反应溶剂,磁力搅拌速度为120转/min,PC含量为80%,其余条件采用L9(34)表对其进行正交实验,并对测定试验结果进行方差分析。正交设计见表8、9。
表8 因素与水平表
表9 正交表试验结果
表10 方差分析表
注:F1-0.10(2,2)=9.00,F1-0.50(2,2)=19.00,F1-0.10(2,2)=99.0
2.2正交试验结果分析
根据上述从表上数据分析及方差分析结果表明,以药物复合率为考察指标,由极差分析显示,各因素作用主次为B>A>D>C,根据方差分析结果,B因素的影响有显著性意义,A,D因素没有显著性意义,但PA1<PA2<PA3,PB1>PB2>PB3,PD1<PD2<PD3。故应选择A因素较高水平,即较高的药脂重量比为1:3,选择B因素较低的水平,即反应浓度为2.5mg/ml,选择C因素较高水平,即较高的温度为55℃。所以正交试验结果得出,黄芩提取物与大豆卵磷脂的比例为1:3(w/w)、黄芩提取物浓度为2.5mg/ml、反应温度为55℃、反应时间为2h,为较优反应条件,即B1A3D3C2。
2.3验证试验
对优选出来的最佳工艺条件B1A3D3C2进行验证试验,重复三次实验,结果见表11。
表11 验证试验(n=3)
可见,验证试验结果与正交试验结果一致,说明正交试验确定的工艺稳定。
2.4载药量和反应浓度的提高
由于大豆卵磷脂成本较高,且从单因素实验可以得出,药脂重量比为1:2(w/w)、反应浓度为5mg/ml时均具有较高的复合率,所以尝试将药脂重量比调整为1:2(w/w)、反应浓度为5mg/ml,其余条件不变考察复合率的大小,结果见表12。
表12 验证试验(n=3)
实验结果表明:药脂比为1:2(w/w)、反应浓度为5mg/ml时,其余条件不变的情况下,复合率与正交实验结果较为接近且较高,所以最终确定药脂比为1:2(w/w)、反应浓度为5mg/ml,即B2A2D3C2。
3.实验结论
综合上述研究结果,黄芩苷磷脂复合物最佳制备工艺为:称取一定量的黄芩提取物和PC含量为80的大豆卵磷脂(重量比为1:2,w/w),加入脱水无水乙醇,黄芩提取物药物浓度为5.0mg/ml,在55℃恒温水浴中120转/min磁力搅拌2小时,减压回收溶剂,真空干燥,即得黄芩提取物磷脂复合物。
实施例4本发明黄芩提取物磷脂复合物复合率等理化性质的测定
1.评价指标的建立
1.1黄芩提取物溶解性实验(实施例1制备的黄芩提取物)
实验目的:掌握黄芩提取物的溶解性能,为复合物评价方法的建立提供依据。
研究溶剂:正己烷、石油醚(30~60)、乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、无水乙醇、水、四氢呋喃、甲醇、正辛醇、pH5.8缓冲液、丙酮。
实验方法:
沉淀法(评价指标为:溶解百分率)按05版《中国药典》方法进行:
分别称取已经研磨成细粉的提取物1g,分别加入20ml溶剂,置于25℃水浴锅中,每隔5分钟振摇30秒钟,滤过,滤液用恒重后的坩埚收集,置于放于80℃水浴锅上挥干,转移至烘箱烘至恒重,计算溶解百分率。
计算公式:溶解百分率={(W1-W2)/W3}*100%
(注:W1为坩埚与溶解物重,W2为坩埚重,W3为称取的黄芩提取物量)
表13 黄芩提取物在不同溶剂中的溶解量
实验结果表明:黄芩提取物在氯仿以及正己烷中的溶解百分率比较低,约为0.5%,所以可以选择该两种溶剂作为建立制备提取物磷脂复合物工艺评价标准的优选溶剂。
1.2最佳溶剂的确定
通过对黄芩提取物在不同溶剂中溶解度的考察,得出黄芩提取物在氯仿、正己烷中溶解百分率较低,因此设计两种溶剂的不同配比考察黄芩提取物、大豆卵磷脂、黄芩提取物与磷脂(1:2,w/w)的物理混合物以及黄芩提取物磷脂复合物在不同溶剂中的溶解百分率,从而得出建立制备黄芩提取物磷脂复合物工艺评价指标--结合率的最佳溶剂。
实验方法:分别称取黄芩提取物磷脂复合物、大豆卵磷脂、物理混合物、黄芩提取物各1g,分别溶于20ml的氯仿、氯仿:正己烷(1:1,v/v)、正己烷,按照药典溶解方法,每隔5分钟强力振摇30秒,30min后分别用滤纸过滤,滤液用恒重后的坩埚收集,置于放于55℃水浴锅上挥发干后,转移至55℃减压干燥12小时,称重,计算溶解百分率。
表14 最佳溶剂的确定
实验结果表明:用正己烷和二者的复合溶剂作为溶剂溶解时,提取物的溶解性低,但同时对于复合物的溶解性也相对较低,用氯仿作为溶剂时,提取物在氯仿中的溶解百分率低,同时磷脂复合物在氯仿中的溶解百分率也较高,所以最终选择氯仿为最佳溶剂。
1.3最佳溶剂最小用量的确定
根据上述实验结果最佳溶剂为氯仿,设计以下实验确定出对黄芩提取物溶解百分率极小的同时,而对黄芩提取物磷脂复合物的溶解百分率基本保持不变的氯仿的最小用量。
实验方法:分别称取黄芩提取物磷脂复合物、大豆卵磷脂、物理混合物、黄芩提取物各1g,分别溶于15ml、10ml的溶剂中,按照药典溶解方法,每隔5分钟强力振摇30秒,30min后分别用滤纸过滤,滤液用恒重后的坩埚收集,马上放于55℃水浴锅上挥发干后,转移至55℃减压干燥5小时,称重,分别计算溶解百分率。
表15 最小溶剂量的确定
实验结果表明:溶剂氯仿容积为15ml时,对磷脂复合物溶解性较好,对提取物的溶解性较低,容积为10ml时,尽管对提取物的溶解性低,但对磷脂复合物的溶解性相对也较差,所以确定最佳溶剂的用量为15ml。
1.4黄芩提取物磷脂复合物制备工艺评价指标-复合率的测定
利用黄芩提取物不溶于氯仿,而磷脂和黄芩提取物磷脂复合物均易溶于氯仿的特性,将一定量的黄芩提取物和磷脂在一定条件下反应后,减压除去反应溶剂,再加入适量的氯仿,充分溶解其中的磷脂及复合物,去除上清液,再用少量氯仿洗涤,收集沉淀,干燥并称重,黄芩提取物的初始投药量与沉淀量的差值即为与磷脂复合的黄芩提取物的量,从而计算出黄芩提取物与磷脂的结合百分率,即复合率。精密称取一定量的磷脂复合物,按照复合物制备初始投料比算出黄芩提取物投料量W1,加入15ml氯仿充分溶解,过滤,弃去滤液,收集沉淀,干燥并称重得W2。计算出黄芩提取物与磷脂的复合百分率。计算公式如下:
黄芩提取物与磷脂复合率(%)={W1-W2)/W1×100%
(注:W1为黄芩提取物初始投料量,W2为沉淀量)。
实施例2所述的单因素和正交实验复合率的测定均按照以上测定方法进行。
实施例5黄芩提取物磷脂复合物鼻用温敏型原位凝胶的制备工艺研究
1.仪器与试药:
85-2型数显恒温磁力搅拌仪(上海君竺仪器厂);高效液相色谱仪(P680四元泵,TCC-100型柱温箱,ASI-100型自动进样器,UVD170U型紫外检测器)(戴安Dionex中国有限公司);色谱柱:Kromasil Cl8柱(4.6mm×150mm,5μm)(爱尔兰Bridge公司);FA1104型上皿电子天平(上海精科仪器厂);DJ-1000A电子天平(亚太电子天平厂);SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂);RE-53C型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DEF-1B型真空干燥箱(上海跃进医疗器械厂);KQ400-DB型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司);Franz扩散池精密温度计,烧杯,移液管,容量瓶,圆底烧瓶等;黄芩苷纯品(含量97.2%,重庆国光药业有限公司);黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110715-200514);大豆卵磷脂(含氮量>99.8%,成都市科龙化工试剂厂);泊洛沙姆407(P407,F-127)(德国BASF公司,批号:50011254);泊洛沙姆188(P188,F-68)(德国BASF公司,批号:50011388);聚乙二醇6000(PEG6000)(西垅化工,批号:911128);四氢呋喃(成都市科龙试剂厂,批号:20081123);三乙醇胺(TEA)(成都市科龙试剂厂,批号:20081001);苯扎氯胺(BKC)(成都市科龙试剂厂,批号:20080925);氯化钠(NaCl)(成都市科龙试剂厂,批号:20071130);葡萄糖(Glucose)(成都化学试剂厂,批号:860906);甘露醇(Mannitol)(成都市科龙试剂厂,批号:080308);甲醇(色谱纯);磷酸(成都市科龙试剂厂,批号:20080114);生理盐水(四川科伦药业股份有限公司);去离子水(实验室自制)
2.方法与结果
2.1温敏凝胶的制备
黄芩磷脂复合物的制备:按实施例2的方法制备
0.1%(v/v)TEA溶液的配制:精密量取1.0ml三乙醇胺,加入1000ml去离子水中,充分搅拌使混匀,备用。
空白凝胶的制备:取适量P407、P188、PEG6000加入0.1%TEA溶液,冰浴4℃磁力搅拌下使其分散均匀,放入4℃冰箱冷藏24h以上,使凝胶充分溶胀,得到澄明溶液。
含药凝胶的制备:先将药物溶于0.1%TEA溶液中,再加入P407、P188、PEG6000,冰浴4℃磁力搅拌下使其分散均匀,然后置于4℃冰箱中保存24h以上,直至聚合物完全溶解得到澄明溶液。见图2
2.2胶凝温度的考察
制备鼻用温敏凝胶的目的主要是使制剂在室温下为自由流动的液体,而滴入鼻腔内能够遇热发生胶凝变化,形成半固体凝胶。因此本实验主要能否获得适于鼻用的胶凝温度,通常鼻腔内温度为(33-34℃)作为处方选择的出发点,期望所得制剂的胶凝温度在32-34℃。
测定方法:目前胶凝温度的考察方法多为搅拌子法,即在西林瓶中装入储存于冰箱中的不同浓度泊洛沙姆温敏凝胶溶液l0g和搅拌子,插入精度为0.1℃的精密温度计,温度计的水银球完全浸没在凝胶溶液中。将其放入低温(10℃)水浴中,转速300rpm,保持水浴持续缓慢升温,使凝胶的温度上升速率约为1-2℃/min,将磁力搅拌子完全停止转动的温度定义为胶凝温度Tgel。每一样品平行测定3次,结果平均值。
2.3基质筛选
以甘油明胶、淀粉甘油、明胶、果胶为基质,加热后虽可形成粘度较低的溶液,但需冷却至体温以下才能成凝胶。泊洛沙姆(Poloxamer)为聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)组成的ABA型的嵌段共聚物,其商品名为普罗流尼克(,BASF公司出品),通式为HO(CH4O)a-(C3H6O)n-(C2H4O)aH。是研究最深入的制备温度敏感凝胶的高分子辅料。其中P407的胶凝温度比泊洛沙姆系列的其他都低,而且P407具有受热反向胶凝的性质,即较低温度时为澄清溶液,可自由流动,但过了一定温度后粘度迅速增加,流动性迅速降低,很快转变成半固体透明凝胶;并且该凝胶可在固液两相间互变,当温度降低后又可转变成澄明溶液。因此选用P407为凝胶基质。P407的胶凝温度随其浓度增大而降低。这可能是因为浓度越高,聚合物所占溶液的体积分数就越大,胶束数量及相互间接触和缠结的几率均增大,因而胶凝温度呈现浓度依赖性。
此外选择P188和PEG6000作为胶凝温度调节剂。三乙醇胺(TEA)作为pH调节剂,苯扎氯胺(BKC)作为防腐剂。
2.4单因素考察辅料对胶凝温度的影响
2.4.1泊洛沙姆P407浓度对胶凝温度的影响
配制14%、16%、18%、20%、22%(w/w)的P407溶液,记录形成凝胶的温度,即为该样品的胶凝温度。
2.4.2泊洛沙姆P188浓度对P407胶凝温度的影响
由于在P407温敏凝胶中加入一定浓度P188可起到调节胶凝温度的作用,在20%的P407溶液中加入2%,4%,6%,8%等不同量的P188,以考察P188对胶凝温度的影响。
2.4.30.9%NaCl、5%葡萄糖和5%甘露醇对P407胶凝温度的影响
研究黄芩苷磷脂复合物温敏凝胶在初滴到鼻腔的时候仍为液态的,而按照普通滴鼻液的要求应等渗或略高渗,所以在后面的凝胶处方中需要加入渗透压调整剂,鼻用制剂常用的渗透压调整剂有氯化钠(NaCl)、葡萄糖(Glucose)、甘露醇(Mannitol)等。根据文献报道,三种等渗调节剂均对P407胶凝温度有一定影响,故选择0.9%NaCl、5%葡萄糖和5%甘露醇三种等渗溶液,配制18%、22%的P407水溶液,考察对P407胶凝温度的影响,以筛选合适的等渗调节剂。
2.4.40.02%BKC对P407胶凝温度的影响
在18%、22%的P407水溶液中加入0.02%的BKC,考察其对P407胶凝温度的影响。
2.4.5BP对P407胶凝温度的影响
考察模型药物对温敏凝胶热力学性质的影响,配制不同浓度(16%、18%、20%)P407空白和载药凝胶,载药量0%、0.2%、0.8%、1.2%、1.5%(w/w),并测定Tgel。
2.5实验结果
在P407浓度超过15%的条件下,才能形成半固体状的凝胶,而P407低于14%不能胶凝,且胶凝温度随着浓度的增大而降低。当P407的浓度在16%-24%时,可形成较理想的凝胶
凝胶的形成受泊洛沙姆P188浓度的影响显著,即胶凝温度随浓度增大而增大,当增大到一定程度后,随浓度增大而降低。当P188的浓度在2-14%时,可形成较理想的凝胶。
由下表可知,凝胶形成受PEG6000影响较大,且胶凝温度随着其浓度的增加而升高;当PEG6000浓度为3%时,P407溶液己经失去形成半固体凝胶的能力。当PEG6000的浓度在0-2%时,可形成较理想的凝胶。
表18 不同浓度PEG6000对胶凝温度的影响
由结果可知,葡萄糖、甘露醇均对P407的胶凝温度有一定影响,与文献报道相符,相对来说,甘露醇对P407的影响小于葡萄糖,而加入NaCl后,可见瓶底析出黄白色沉淀,影响制剂外观,故选择甘露醇作为等渗调节剂。
由下表可知,0.02%的BKC对胶凝温度无显著影响,故可以应用其作为凝胶的防腐剂。
模型药物黄芩磷脂复合物对胶凝温度无显著影响。从实验成本、黄芩磷脂复合物溶解度和制剂黏度出发,故暂时选择1mg/10ml凝胶的载药量。
表21 不同浓度的黄芩磷脂复合物对胶凝温度的影响
3.小结
通过参考前人对黄芩磷脂复合物理化性质的研究,得到黄芩磷脂复合物在正辛醇-水中的油水分配系数,证实黄芩磷脂复合物是适合于鼻腔给药的。在对黄芩磷脂复合物鼻用原位凝胶的处方筛选和胶凝温度的考察中,以P407为基质,以P188和PEG6000为胶凝温度调节剂是完全可行的,基本确定黄芩磷脂复合物鼻用原位凝胶的处方为:P40716%-24%(w/w);P1880%-12%(w/w);PEG60000%-2%(w/w);Mannitol5%(w/w);BKC0.02%(w/w);TEA0.1%(v/v);加去离子水至全量。
实施例6黄芩提取物磷脂复合物亚微乳制备工艺研究
1、试验仪器与主要试药
仪器
磁力搅拌器(金坛市大地自动化仪器厂)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、光学显微镜(上海光学仪器厂)、高速剪切仪器(Fluko)、高压均质机(加拿大)、纳米粒度仪Nano-S(英国马尔文公司)、紫外分光光度计(日本岛津)、高效液相色谱仪(日本岛津)、渗透压仪OSMOMAT030、电子天平(赛多利斯)
试剂及药用辅料
黄芩提取物(自制)、大豆卵磷脂(上海精细化工有限公司)、中链油(铁岭北亚药用油有限公司)、大豆油(龙游县田雨山大豆油开发有限公司)、油酸(德国Lipoid)、泊洛沙姆188(德国BASF)、S-75(德国Lipoid)、注射用甘油(江西益普生药业有限公司)、乙二胺四乙酸二钠(成都科龙化工试剂厂)、无水乙醇(成都科龙化工试剂厂)
2、处方因素研究
亚微乳制备的一般步骤是将药物等油溶性成分溶于油中,得油相;水溶性部分溶于水,得水相,油相和水相分别加热到一定温度;制备初乳;初乳迅速冷却,均质机乳化,制备亚微乳剂;调整pH值,充氮,热压灭菌。考虑要药物性质和制备工艺过程对制剂成型和制剂的稳定性的影响,需要进行处方因素研究。
黄芩提取物磷脂复合物是制备亚微乳的中间体,它的溶解性、稳定性、刺激性对亚微乳处方筛选有着至关重要的作用。故需要测定复合物在水、大豆油、中链油中的溶解度。
一、磷脂复合物表观溶解性测定
1、黄芩苷含量测定方法
对照品溶液制备
精密称定在60℃条件下干燥4小时至恒重的黄芩苷对照品,精密称定0.05670g于10ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀;取1ml稀释液移至干燥的10ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度即可,配制成浓度为56.7ug/ml的黄芩苷标准品。
色谱条件
色谱柱:安捷伦(4.6mm×250mm),甲醇-水-磷酸(47:53:0.2)为流动相,检测波长280nm,柱温:35℃,流速1ml/min,进样量10ul
二、黄芩提取物磷脂复合物水中溶解度测定
称定过量的黄芩提取物,黄芩提取物和大豆磷脂的物理混合物,黄芩提取物磷脂复合物,分别移至三角锥形瓶中,分别精密量取50ml蒸馏水至锥形瓶中,在控温(25℃)磁力搅拌器2h,取样,6000r/min条件下进行离心10min,取上清液,甲醇稀释,过微孔滤膜,注入液相色谱仪,测定。测定结果见表22。
结果表明,在黄芩提取物、黄芩提取物和磷脂的物理混合物、黄芩提取物磷脂复合物三者中,磷脂复合物在水中溶解度最高,物理混合物次之,黄芩提取物最低。磷脂复合物的溶解度约为黄芩提取物的2倍。
表22 水中溶解度的测定结果
正辛醇中溶解度测定
溶解平衡时间的确定
称取黄芩提取物磷脂复合物0.08011mg,测定溶解平衡时间,测定结果见表23。
结果表明,以黄芩苷为指标成分,复合物在正辛醇中2h就可达到溶解平衡。
表23 复合物在正辛醇中平衡时间测定结果
正辛醇中溶解度的测定
测定三种状态的黄芩提取物在正辛醇中溶解度,测定结果见表24。
表24 正辛醇中溶解度的测定结果
结果表明,在黄芩提取物、黄芩提取物和磷脂的物理混合物、黄芩提取物磷脂复合物三者中,磷脂复合物在正辛醇中溶解度最高,物理混合物次之,黄芩提取物最低。磷脂复合物的溶解度约为黄芩提取物的26.7倍,为物理混合物的20.2倍,同时,磷脂复合物在正辛醇中的溶解度是其在水中的16.3倍。
根据以上数据不难看出,黄芩提取物制备成磷脂复合物以后能显著改善其水溶性和脂溶性,同时脂溶性改善更为明显。为此,将黄芩提取物磷脂复合物制备成O/W的亚微乳制剂。
二、磷脂复合物亚微乳的评价指标
1、粒径及粒径分布(PDI)
亚微乳的物理稳定性主要取决于粒子的粒径及分布。亚微乳是热力学不稳定体系,具有自动聚合的趋势,即发生絮凝和聚集。因此,均匀的分散体系是该体系物理稳定性的基本要求。
2、zeta电位
zeta电位是微粒表面荷电性质与大小的标志,它不仅影响制剂的物理稳定性,往往还影响其体内分布与体内药物动力学。
3、载药量
本制剂是原料是黄芩提取物(由实施例1制备,含黄芩苷85%),载药量测定时以黄芩苷为指标成分进行测定。
色谱条件:色谱柱:安捷伦(4.6mm×250mm),甲醇-水-磷酸(47:53:0.2)为流动相,检测波长280nm,柱温:35℃,流速1ml/min,进样量10ul
供试品制备:精密量取黄芩提取物磷脂复合物亚微乳1ml于25ml量瓶,加入甲醇-乙醚(8:2)混合溶液定容,超声1min。取5ml溶液,甲醇定容至25ml。滤过,即得。
4、稳定性参数
乳剂的物理稳定性可用稳定性参数进行评价,稳定性参数越小,乳剂越稳定。稳定性参数Ke采用离心分光光度法进行测定,具体方法如下:精密吸取待测乳液20μL,将其置于5ml容量瓶中,用超纯水稀释至刻度,混合均匀后于500nm处测定吸收值。吸取同批次的待测乳液1mL,将其置于1.5mLEP管中,3000rpm离心10min,弃去上层液,精密吸取底层液20μL,将其置于5mL容量瓶中,以超纯水稀释至刻度,混合均匀后于500nm处测定吸收值。稳定性参数Ke的计算公式如下:
公式中A0为乳剂稀释液的吸收度,A为乳剂离心后下层稀释液的吸收度
若分散油滴上浮A<Ao,应用公式4-1,
若分散油滴下沉A>Ao,应用公式4-2。
Ke值越小,说明分散液滴在离心力的作用下上浮或下沉的很少,因此乳剂越稳定,故可用Ke值的大小来评价乳剂的物理稳定性,筛选出最优处方。
5、主要辅料的优选
5.1油的组成及用量的选择
目前常用的注射用油有大豆油(LCT)、中链甘油三酯(MCT)、棉籽油、红花油、芝麻油、玉米油、鱼油、海狗油等。其中,粘度较大的油所制成的乳剂稳定性较差,且本次试验是新药研究,综合考虑注射用油的粘度、安全性及目前注射用油的市场情况,选用大豆油(LCT)和中链甘油三酯(MCT)作为本制剂的实验研究。
同时,FDA推荐在乳剂中使用的油相也是长链甘油三酯(LCT,如蓖麻油、棉籽油、大豆油等)和中链甘油三酯(MCT)。而国内使用的多以大豆油为油相,但多数难溶性药物在大豆油中的溶解度很低,不足以达到临床使用的剂量要求,或者使注射体积过大超出了临床上可接受的范围。MCT与LCT相比,分子量小而极性大,对于那些在LCT中溶解度低的药物又多了一种选择。首先,测定复合物在两种油溶液中的溶解度
5.1.1溶解平衡时间的确定
称取过量的磷脂复合物,测定其在中链油中的溶解平衡时间,由于中链油是长链的脂肪酸酯,药物在其中溶解需要较长时间,故本次平衡时间的测定选取的时间跨度较长,同时稀释溶剂采用乙醚-甲醇(2:8)的混合溶剂,结果见表25
结果表明,以黄芩苷为指标成分,复合物在中链油中60h才可达到溶解平衡。
表25 复合物在中链油中平衡时间测定结果
5.1.2中链油中溶解度的测定
测定三种状态的黄芩提取物在中链油中溶解度,测定结果见表26。
结果表明,在黄芩提取物、黄芩提取物和磷脂的物理混合物、黄芩提取物磷脂复合物三者中,磷脂复合物在中链油中溶解度最高,物理混合物与黄芩提取物基本一致。磷脂复合物的溶解度约为黄芩提取物的5.8倍。
表26 中链油中溶解度的测定结果
5.1.3大豆油中溶解度测定
溶解平衡时间的确定
称取过量的磷脂复合物,测定其在大豆油中的溶解平衡时间,由于大豆油是中链的脂肪酸酯,药物在其中溶解需要较长时间,故本次平衡时间的测定选取的时间跨度较长,同时稀释溶剂采用乙醚-甲醇(2:8)的混合溶剂,结果见表27。
结果表明,以黄芩苷为指标成分,复合物在中链油中60h才可达到溶解平衡。
表27 复合物在大豆油中平衡时间测定结果
大豆油中溶解度的测定
测定三种状态的黄芩提取物在大豆油中溶解度,测定结果见表28。
结果表明,在黄芩提取物、黄芩提取物和磷脂的物理混合物、黄芩提取物磷脂复合物三者中,磷脂复合物在中链油中溶解度最高,物理混合物次之,黄芩提取物最低。磷脂复合物的溶解度约为黄芩提取物的4.2倍。
表28 中链油中溶解度的测定结果
溶解度实验结果表明,复合物在MCT中溶解度与其在LCT中溶解度相比较大,然而,研究表明MCT有一定的代谢毒性,故本次试验将MCT:LCT的比例定在2:1,目的在提高载药量的同时降低不必要的代谢毒性,提高制剂安全性和有效性。
5.2油的用量筛选
亚微乳油相的一般浓度为10~30%左右,因药物主要溶于油相中,若油相比例过小,载药量受限制,但若油相比例过大,则使得油滴的数量增加,因而油水界面的面积增加;在乳化剂用量一定的条件下,乳化剂不能充分的将油滴包裹,从而导致乳化效率下降,因此乳滴的粒径增大,稳定性降低。因此适宜的油相比例即有利于药物疗效的充分发挥,又有利于制剂的稳定性,起着至关重要的作用。
本次试验分别考察油相浓度为15%、20%、25%、30%时乳剂的粒径、PDI、稳定性常数等指标,以选择油的浓度。结果见表29:
表29 油相用量筛选结果
根据上述实验结果吗,同时考虑到本研究的目的之一是提高制剂载药量,选择油相用量为25%,既能保证制剂质量又能提高载药量。
正交试验优选主要的处方因素
根据文献以及预实验的结果,影响亚微乳成型的主要因素包括以下几个方面:
载药量
载药量是成型的关键因素,载药量过高制剂的稳定性受影响,载药量过低则难以保证药物的有效性,同时该剂型的优势得不到充分的体现,本试验通过预实验,最终设计考察的载药量分别为4%、5%、6%
乳化剂及其用量
乳化剂是油水两相的桥梁,能够降低油水两相之间的表面张力,使两种互相不能混溶的液体均匀分散。乳化剂选择不仅要考虑初乳制备时的乳化能力及乳剂本身的物理稳定性和化学稳定性,还要考虑制成乳剂后油水界面膜的稳定性和电势,以保证乳剂的稳定。
昙点高的乳化剂能够耐受较高的温度,有利于乳剂的稳定性。MuhannadJumaa等选择泊洛沙姆188、SolutolH15、吐温80、聚氧乙烯氢化蓖麻油四种乳化剂制备亚微乳剂,经过高压灭菌考察乳剂稳定性,只有泊洛沙姆188制备的亚微乳剂灭菌前后粒径变化较小,其它亚微乳剂粒径都有较大变化。
使用辅助乳化剂可以提高亚微乳剂的稳定性,通常将离子型乳化剂与非离子型乳化剂联合使用,离子型乳化剂可以增强zeta电位,增强乳剂的稳定性,而非离子乳化剂乳化能力强,可以提高乳化效率,减少乳滴粒径,提高界面膜的稳定性,联合使用,可以弥补单一使用一种乳化剂的不足。
本次试验将S-75与最常用的吐温-80,在相同用量的情况下以相同处方,做比较,以Ke,粒径、PDI为指标,结果见表30
表30 两种乳化剂比较结果
上述结果表明,以吐温做乳化剂的处方,粒径过小、PDI及Ke相对较大,不利于制剂稳定性,而且文献报道中也基本没有将吐温做为亚微乳乳化剂。
综上所述,本次试验选择大豆卵磷脂(S-75)和泊洛沙姆188(F-68)为乳化剂和辅助乳化剂。
乳剂pH值
pH值不仅影响着模型药物本身的稳定性,也影响着乳剂的电位,进一步影响制剂的稳定性。同时还要将pH值控制在鼻腔耐受的范围以内(4.5~6.5)。本次试验使用0.1mol/L的NaOH或者盐酸溶液调pH值至5.0~7.0
正交试验优化处方
根据上述内容已经预实验的结果设计正交试验,见表31、32,试验结果见表35
表31 因素水平表
表32 正交试验表
表33 正交试验结果
分别将三个指标作极差和方差分析,结果见表34、35、36
表34 粒径正交极差分析
表35 PDI正交极差分析
表36 Ke正交极差分析
对上述数据进行方差分析,发现均没有显著性,故没有列出方差分析表,从表上数据分析结果中,对粒径及PDI中影响的大小均为C>A>D>B,两者的最佳工艺均为A1B3C1D3;对Ke影响的大小为A>D>B>C,最佳工艺为A1B3C2D3。考虑到因素对实验结果影响的大小及原料成本问题,综合最佳工艺,得到本次试验的最佳工艺为A1B1C1D3,即载药量为4%,S-75用量为1.5%,F-68用量为1%,调pH至5。
稳定剂的选择
处方中加入药物后,亚微乳的两相界面往往会发生变化,这时就需要加入可定位于两相界面上的物质作为稳定剂,通过加大分子间力和乳滴表面静电荷来提高膜的稳定性。常用的稳定剂有油酸、油酸钠、胆酸及胆酸钠等。虽然油酸钠降低油水界面张力的能力显著强于油酸,但是有文献报道,油酸钠的水溶性太强,不易固定在油水界面膜上,且油酸钠适宜于中性或弱碱性制剂,不适合鼻腔给药,考虑到制剂体系为一弱酸性体系,所以处方中选用油酸作稳定剂,存在于乳化剂界面膜上的油酸使乳滴带负电,这种结构使乳滴之间产生了静电斥力,防止了乳滴的聚集,从而增强了脂质微球的稳定性。
本次试验主要考察不同油酸用量为0、0.05%、0.1%、0.2%对乳剂稳定性的影响。结果见表37,最终选定油酸用量为0.1%
表37 油酸用量考察结果
等渗调节剂的考察
鼻腔用药的药液应与鼻粘液等渗(为280-300mOsmol/Kg)或略高渗。低渗药液可加重鼻粘膜水肿,不利于炎症消退,低渗和高渗均可降低鼻纤毛运动频率。
本次实验采用的是渗透压仪OSMOMAT030,该仪器的原理是冰点降低法:纯水冰点为0℃,而浓度1Osmol/Kg食盐水冰点为-1.858℃。总渗透压值计算,就是测量样本溶液与纯水冰点之不同,将两者冰点值作比较,即可精确计算结果。结果见表38
表38 甘油用量考察结果
试验结果表明,采用经典脂肪乳的甘油用量会导致本制剂高渗,这可能是因为试验中加入的药物和辅料也有一定的渗透压,经过多次试验最终测得当甘油用量为1%.时,制剂渗透压符合要求。
处方优化工艺验证试验
根据上述试验结果确定最佳处方为:
复合物4%、MCT17%、LCT8%、油酸0.1%、S-751.5%、P-1881%、甘油1%、加水至全量。
根据上述处方,制备100ml乳剂,测定其相关指标,结果见表39。结果表明,上述处方合理可行,有待于中试进一步的验证。
表39 处方验证试验测定结果
制备工艺参数考察
制备亚微乳剂的常用的方法有组织捣碎法、超声法、高压乳匀法等。高压乳匀法所制得的纳米粒粒径小且分布范围窄,并且可以避免使用对人体有害的附加剂和有机溶剂,是目前进行大规模生产的首选方法。其工作原理是利用高压(10~200MPa)推动液体通过一个狭窄的管道,液体通过很短的距离获得了很大的速度(超过1000km·h-1),所产生的撞击力、高剪切力和空穴作用力使粒子分裂成纳米粒及小粒子,分散效果取决于液体的流速和压力。
基本工艺流程
将药加入到大豆油中、立即剪切分散,溶解后加入磷脂等油溶性成分,得油相;甘油、等水溶性成分溶于水中,得水相;将油相和水相加热到60℃后,水相缓慢加入到油相中,高剪切乳化分散制备初乳;初乳迅速冷却至室温,再经两步高压乳匀机均质,即得亚微乳。
制备工艺考察时,根据处方因素研究所得的较佳处方进行。
初乳制备考察
高压均质亚制备微乳的工艺第一步要制备初乳,初乳的质量对最终成品的质量有较大影响,有必要对初乳的各项制备参数进行考察。
乳化通常是通过机械能量来获得,开始,两相之间的表面变形形成大液滴,然后大液滴碎成小液滴,乳化过程中,两种液体之间的表面积增加,而液体趋向于减小表面积,因此,需要机械能来完成乳化,而不同的搅拌强度对亚微乳的稳定性是有一定的影响。故需考察高速剪切的剪切时间以及剪切转速
剪切时间考察
根据基本工艺流程中的方法,以及剪切强度为13000rpm,剪切时间3、6、9、12、15min制备初乳,在显微镜下观察油滴的情况。结果见图3。
结果表明,剪切时间再9min以后,再增加剪切时间,粒径无明显变化,所以选择剪切时间为9min
剪切转速的考察
根据基本工艺流程中的方法,以及剪切为10min,剪切转速分别为13000、16000、、22000rpm制备初乳,在显微镜下观察油滴的情况。结果见图4。
结果表明,剪切转速在19000rpm以后,再增加剪切转速,粒径无明显变化,所以选择剪切转速为19000rpm
高压均质条件的考察
正交试验优化均质条件
影响高压均质效果的因素有均质压力、均质次数、均质温度,采用正交试验队三个因素进行优化。均质压力由两个阀门控制,一般情况下二级阀的压力为一级阀的十分之一;同时,研究表明,高压后采用一定次数的低压由于利于样品的稳定,本次试验在高压后采用60bar低压均质3次以使样品稳定,对此不另做考察。正交试验设计见表40、41,试验结果见表42
表40 因素水平表
表41 正交设计表
表42 正交试验结果
表43 粒径正交极差分析
表44 PDI正交极差分析
表45 Ke正交极差分析
分别将三个指标作极差和方差分析,结果见表43、44、45。方差分析结果显示,发现均没有显著性,故没有列出方差分析表,综合三个参数从表上数据分析结果,均质最佳条件为A1B3C2,即为600bar均质12次,均质温度为40℃
验证试验
根据上述最佳工艺,制备亚微乳,测定其Ke、粒径及PDI等参数,结果见表46
表46 均质条件正交验证试验结果
结果表明,所得最佳工艺合理可行,有待于中试的验证
膜过滤的考察
考虑到原辅料中可能存在的部分杂质,制剂过程中由于剪切机、均质机等仪器的磨损都会对制成的亚微乳进行微孔滤膜滤过,根据亚微乳的粒径规格,取同一批亚微乳剂适量,一部分经0.45um微孔滤膜过滤,另一部分不经过滤,考察亚微乳剂各项指标。结果见表47
表47 膜过滤考察结果
可见,过滤对乳剂的主要指标基本没有影响,同时还可除去在乳剂制备过程中由于机械磨损而引人的一些杂质
初步稳定性试验
放大量试验
根据上述试验所得的最佳处方以及最佳工艺,进行放大量试验,制备黄芩提取物亚微乳6L,并测定相关指标,结果见表48。
表48 放大量试验测定结果
放大量试验结果表,试验研究所得出的最佳处方和工艺是合理可行的。
影响因素试验
影响因素试验是为探讨药物的固有稳定性、了解影响其稳定性的因素及可能的降解途径与降解产物,为制剂生产工艺、包装、贮存条件和建立降解产物分析方法提供科学依据。
本次试验,将上述亚微乳分别置于光照(4500Lx)、冰箱冷藏(4℃)、室温(25℃、40℃环境下留样10天,分别于第0天、第5天、第10天取样,考察样品的粒径、PDI、含量、Ke等相关检测项目。评价各因素对对制剂的影响。结果见表49、50、51、52
结果表明,四种保存方式对粒径及含量均无较大影响,而40℃条件以及光照下保存,Ke值有一定的变化,特别是在光照条件下,本制剂在低温(4~8℃)避光的条件下保存,有利于制剂的稳定性。
表49 冷藏(4℃)稳定性结果
表50 室温(25℃)稳定性结果
表51 40℃稳定性结果
表52 光照稳定性结果
亚微乳制备工艺小结
根据上述实验结果,最终确定亚微乳处方为
黄芩提取物1.33%、大豆磷脂2.67%、MCT17%、LCT8%、油酸0.1%、S-751.5%、P-1881%、甘油1%。
加水至全量
称取处方所述黄芩提取物、大豆卵磷脂,置于反应容器中,加入相当于黄芩提取物200倍量的无水乙醇,60℃水浴回流反应,反应时间为2h,搅拌速度为120转/min,充分复合。
结束后,将反应溶剂于60℃减压回收溶剂,至有物质析出时(无水乙醇剩余量约20%),暂停回收,加入中链甘油三酯、大豆油、油酸,继续减压回收溶剂至无醇味,即得油相。将甘油、泊洛沙姆、乙二胺四乙酸钠等水相成分溶于适量预热的蒸馏水中,即得水相。将两相均加热到60℃后,将水相加入油相中,使混匀。
将初乳保持在60℃的条件下,以19000转/min的剪切速度,高速剪切10min。冷却至室温后,于高压均质机上进行高压均质,高压均质压力为400bar,次数为9次,低压均质压力为50bar,次数为3次,完后收集得黄芩提取物磷脂复合物亚微乳溶液,加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至5,滤过。
影响因素试验结果表明,该制剂适宜贮存的条件为低温(4~8℃)避光保存。
以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。
试验例1本发明黄芩提取物给药途径筛选试验
一、实验材料
1、实验动物
SD大鼠,SPF级,体重250±50g,由达硕生物科技有限公司提供。
2、实验器材与主要试药
水浴锅、电子天平、眼科镊、手术剪、止血钳、缝合针线、不同规格尼龙线、水合氯醛、TTC、PBS缓冲液、黄芩提取物磷脂复合物(自制)
二、试验方法及内容
1、试药的配制
pH=5.8磷酸盐缓冲液的配置:称取磷酸二氢钾0.834g与磷酸氢二钾0.087g,加水使溶解成100ml;
pH=7.4磷酸盐缓冲液的配置:称取磷酸二氢钾1.7g与氢氧化钠0.395g,加水使溶解成250ml;
黄芩提取物磷脂复合物混悬液制备:取实施例2制备的黄芩提取物磷脂复合物适量于研钵中,以磷酸盐缓冲液(PH=5.8)对药物进行溶解混悬,制备成相应浓度;
实施例1制备的黄芩提取物(黄芩提取物中黄芩苷含量为85%),以蒸馏水溶解(调节pH约6.0)成溶液;
TTC染色剂的配制:称取TTC染色剂2g,用磷酸盐缓冲液(PH=7.4)定容至100ml
2、试验方法
试验动物分组:
多年实践表明,静脉给药时治疗突发性疾病最有效地方式。然而,静脉给药由于血脑屏障(BBB)的存在,药物很难到达脑内,而且静脉给药需要一定的医疗条件,加大患者的身体和精神伤害。鼻腔给药由于鼻脑通路的存在,可避开血脑屏障,药物能快速到达脑内,对于脑内疾病的治疗有较好的效果,且与静脉给药相比,没有安全隐患,更容易被患者所接受。本次试验主要是将鼻腔给药与常用的灌胃给药、注射给药进行对比,优选出适合模型药物给药的较佳给药途径。
故将试验动物分为鼻腔原料组,磷脂复合物灌胃组,磷脂复合物鼻腔组、磷脂复合物腹腔组以及模型组五个组别,每组动物15只,动物分组见表53。黄芩提取物制备成磷脂复合物以后,可提高其膜透过性,提高其生物利用度,并有可能增强其药理作用,故本次试验中,将实施例2制备的黄芩提取物制备成磷脂复合物来进行实验。
表53 给药途径筛选动物分组
3、试验及给药方法
按照每种给药方式每次给药相同的原则,预防药五天,每天分别于早上9:0,中午15:00,晚上21:00给药,每天给药三次;第六天进行线栓法模型的制作,手术当天于术前、术后2h、4h分别给药,术后使其存活48h,照预防给药方法给药;处死动物,取出其脑组织,用TTC染色测定其梗死率,利用SPSS对各组数据进行单因素方差分析,优选较佳给药途径。
4、血管内栓线阻断法建立大鼠局灶性脑缺血模型
大鼠用10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉。仰卧位固定,碘伏擦拭消毒,腹侧颈正中线切口皮肤。沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜,分离到气管前肌后,沿右侧胸锁乳突肌腱向下分离,见到颈动脉鞘后可上拉钩。分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA,然后近心端结扎CCA、ECA。在距CCA分叉部4mm处剪一小口,将拴线插入到ICA。然后用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。用眼科镊轻推拴线,这时从血管分叉处开始算距离,当插入深度在18mm时,轻柔地紧紧系牢CCA远心端的细线。常规缝合伤口。假手术组只进行麻醉和血管分离术,不结扎血管和导入栓线。2小时后将栓先向外拔出5mm,再灌注。
5、脑梗死率的测定
脑梗死率的测定采用红四氮唑(TTC)染色法。大鼠于再灌注48小时断头取脑,去除嗅球、延髓和小脑,在4℃的生理盐水条件下,去除组织中的脂肪,血丝等杂质,并拭干水分,准确称取全脑重,于-4℃冰箱中冷冻24小时左右,间隔2mm连续做5-6个脑冠状切片,加入2%TTC溶液,浸没切片,置于37℃烘箱中孵育30min,每隔5-10min翻动脑片,使均匀接触染色液。TTC被线粒体过氧化氢酶还原,可使正常脑组织染色呈红色,梗死组织呈白色。用眼科镊分离苍白区(梗死区)和非苍白区(正常区),分别准确称取重量,计算梗死百分比,即梗死率=苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)×100%。
三、试验结果
根据上述试验方法,最终测得各组梗死率见表54。从表上数据分析则看出,鼻腔原料组,复合物灌胃组对于缺血性脑损伤基本没有治疗作用,而复合物鼻腔组、复合物腹腔组对于改善缺血性脑损伤有一定的作用,然而在实验过程中由于腹腔注射的实验动物有一定量的死亡,同时考虑到近年来中药注射剂的安全问题,最终选择鼻腔给药为较佳给药方式。
表54 给药途径筛选试验结果
试验例2不同浓度黄芩提取物药效对比试验
一、实验材料
1、实验动物
SD大鼠,SPF级,体重250±50g,由达硕生物科技有限公司提供
2、实验器材与主要试药
水浴锅、电子天平、眼科镊、手术剪、止血钳、缝合针线、不同规格尼龙线、水合氯醛、TTC、PBS缓冲液、黄芩提取物磷脂复合物(自制)
二、试验方法及内容
1、试验动物分组
将专利申请号:200610014770.7所述的方法制备的黄芩提取物(测定其中黄芩苷含量为62%)、本发明实施例1制备的黄芩提取物(黄芩苷含量为85%)及市售黄芩苷(纯度95%以上)进行对比;本次试验是将各种提取物指标成磷脂复合物以后,以各种浓度的磷脂复合物进行的药效筛选,因为线栓法模型存在一定的死亡率,每组动物聚15只,试验动物具体分组情况见表55。
表55 提取物浓度筛选试验动物分组
2、试验及给药方法
按照每种给药方式每次给药相同的原则,预防药五天,每天分别于早上9:0,中午15:00,晚上21:00给相应药物,每天给药三次;第六天进行线栓法模型的制作,手术当天于术前、术后2h、4h分别给药,术后使其存活48h,照预防给药方法给药;处死动物,取出其脑组织,用TTC染色测定其梗死率,利用SPSS对各组数据进行单因素方差分析,优选较佳提取物浓度。
三、试验结果
根据上述试验方法,最终测得各组梗死率见表56。从表上数据分析可以看出,85%黄芩苷含量组相对于其他组对于缺血性脑损伤有较好的治疗效果。中药每味药本身就是一个复杂的系统,各成分之间就存在着一定的协同作用,黄芩总黄酮是治疗缺血性脑损伤的主要成分,但并不是说黄芩苷纯度越高其疗效就越好,总黄酮所含的其他黄酮成分可能本身就会对缺血性脑损伤有一定的疗效,或者这些成分可增强黄芩苷的疗效,所以黄芩苷含量较低的提取物反而有较好的治疗效果。
表56 不同提取物浓度筛选试验结果
试验例3本发明黄芩提取物有效剂量筛选试验
一、实验材料
1、实验动物
SD大鼠,SPF级,体重250±50g,由达硕生物科技有限公司提供
2、实验器材与主要试药
水浴锅、电子天平、眼科镊、手术剪、止血钳、缝合针线、不同规格尼龙线、水合氯醛、TTC、PBS缓冲液、黄芩提取物磷脂复合物(自制)
二、试验方法及内容
1、试验动物分组
本次试验在给药途径筛选及不同浓度黄芩提取物筛选的基础上的基础上,将实验动物分为了高、中、低三个剂量组,实施例2制备的黄芩提取物磷脂复合物浓度分别为60mg/ml、40mg/ml、20mg/ml,每组动物15只,试验动物情况见表57;给药时,每次给药体积相同。
表57 有效剂量探索试验动物分组
2、试验及给药方法
按照每种给药方式每次给药相同的原则,预防药五天,每天分别于早上9:0,中午15:00,晚上21:00给相应药物,每天给药三次;第六天进行线栓法模型的制作,手术当天于术前、术后2h、4h分别给药,术后使其存活48h,照预防给药方法给药;处死动物,取出其脑组织,用TTC染色测定其梗死率,利用SPSS对各组数据进行单因素方差分析,探索有效剂量。
3、试验结果
根据上述试验方法,最终测得各组梗死率见表58。从表上数据分析可以看出,高剂量组对于缺血性脑损伤有较好的治疗效果,但是三个剂量组之间不存在明显的量效关系。
表58 有效剂量探索试验结果
综上,根据上述试验结果,在注射、口服以及鼻腔给药中,鼻腔给药及腹腔注射给药对于线栓法复制的脑缺血模型有较佳的治疗效果,同时考虑到用药的安全,最终选择鼻腔给药为其较佳给药途径;不同浓度黄芩提取物筛选结果表明,本发明黄芩苷提取物(含量为85%)相对于其他组对于缺血性脑损伤有较好的治疗效果,可能是因为黄芩总黄酮所含的其他黄酮成分本身就会对缺血性脑损伤有一定的疗效,或者这些成分可增强黄芩苷的疗效,所以与黄芩苷纯品相比,本发明黄芩提取物中黄芩苷含量较低,反而有较好的治疗效果;有效剂量探索结果表明,高剂量组对于缺血性脑损伤有较好的治疗效果。
试验例4本发明药物抗脑缺血损伤致大鼠脑水肿和神经功能损伤的实验研究
1分组及给药
动物随机分为7组,即假手术组、模型组、溶液型制剂给药组、温度敏感原位凝胶鼻腔给药组、温度敏感原位凝胶鼻腔给药组、温度敏感原位凝胶鼻腔给药组、每组大鼠给三次药(甘露醇组再灌注前舌下静脉给药一次1000mg/kg),每次双鼻共给药0.1ml/200g或舌下静脉注射1ml/200g,分别是手术前给药一次、术后两小时灌注前给第二次、第二天术后23小时给第三次,第三次给药后1小时处死大鼠,取脑,称湿重。
2大鼠局灶性脑缺血模型的建立
采用线栓法制成大鼠右侧大脑中动脉阻塞(1eft middle cerebralartery occlusion,LMCAO)模型。实验鼠用10%水合氯醛(0.35ml/l00g)麻醉后仰卧位固定于手术台上,经颈正中切口,分离暴露颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA),结扎CCA近心端及ECA根部,顺CCA经ICA将栓线送至颅内,遇阻力而止,栓线插入深度为(18.5±0.5)mm,此时栓线头端正好位于MC起始部,阻断了MCA的血流,2小时后拔出栓线再灌注。假手术组只分离、暴露血管,不结扎颈总动脉及颈外动脉,不插入尼龙鱼线。选择苏醒后右上肢屈曲、行走时向右侧旋转或右侧肢体瘫痪的大鼠为栓堵成功者进行实验,否则视为栓堵失败,弃之不用。手术过程中监测大鼠直肠温度,并保持在36.5~37.5℃。
3统计方法
数据用x±s表示,采用SPSS13.0统计软件包,以One-way A_NOVA和t(t‘)检验作差异的显著性分析。
4检测指标及结果
4.1神经功能评分
大鼠脑缺血2小时、再灌注22小时后,参照Longa方法对大鼠进行5分制神经行为学评分:肢体活动正常为0分;不能完全伸展右前肢为1分;身体向右侧旋转为2分;行走时向右侧倾倒为3分;无自主行走并伴有意识抑制为4分,结果见表59。
注:与假手术组比较△△P<0.01,与模型组比较**P<0.01,*P<0.05。
由上表结果可见,模型组大鼠的神经功能评分为(2.34±0.28),与假手术组比较有极显著性差异,说明造模后大鼠表现出明显的神经功能损伤现象,造模成功。经给药治疗后可见,三种温度敏感型鼻腔给药组神经功能评分与模型组比较有极显著性差异(P<0.01),说明温度敏感原位凝胶经鼻腔给药后对线栓法造成的大鼠脑缺血损伤致神经功能损伤具有显著的防治作用同时,溶液型制剂鼻腔给药组的神经功能评分与模型组比较均有显著性差异(P<0.05),说明也有以较好的防治效果。从数据上看,温敏凝胶效果更佳。
4.2脑组织含水量
术后24小时神经行为学评分后处死大鼠,取大脑组织称湿重,105℃烤箱中烘烤至恒重后称取干脑,脑组织含水量(%)=(湿重-干重)÷湿重×100%。结果见表60。
注:与假手术组比较*P<0.05;与模型组比较#P<0.05;与温度敏感原位凝胶组比较※P<0.05。
由上表结果可见,与假手术组比较,模型组大鼠的脑含水量明显升高(脑含水量增加了3.28%),说明造模成功;与模型组比较,温敏凝胶与离子感凝胶鼻腔给药组明显降低,其它与模型组比较没有差异,说明温度敏感原位凝胶经鼻腔给药对脑缺血损伤具有保护作用。鼻腔给药组中,原位凝胶组与溶液型比较有显著性差异,说明原位凝胶组后经鼻给药对脑水肿的防治作用明前强于溶液型。
试验例5鼻黏膜毒性评价(组织切片)
将空白(生理盐水)组、药物组经大鼠鼻腔给药2h后,鼻腔解剖,组织切片(纵切)和HE染色后光镜观察鼻黏膜形态变化。结果见图5。
组织切片的制备:将鼻黏膜样本于10%甲醛溶液中脱钙48h,取出切成2~3mm的组织块,以冷的0.2mol/L二甲砷酸钠缓冲液(pH=7.6)漂洗20min,继而于-20℃经60%→70%→80%→95%→100%乙醇脱水,每次20min。将组织块移置于盛有Hemapun948甲液的模具底部,置-20℃浸泡过夜,取出包埋模具滴加Hemapun948乙液2~3滴使成全包埋液,再放入-20℃冰箱中聚合48h直至硬的树脂块形成。包埋块经修饰后用切片机切成5μm厚的切片,蒸馏水展开,常规贴片。滴加碘化丙啶染色10min,PBS漂洗2次,每次3min,室温晾干。
由图5可知,空白组对照,鼻黏膜结构清楚,黏膜上纤毛整齐浓密,黏膜下腺体、血管清晰可见;药物组给药侧(右)大鼠鼻黏膜均完整,结构清楚,细胞密度不变,黏膜上纤毛整齐浓密,黏膜下腺体、血管清晰可见,与未给药侧(左)及空白对照组无差别。可初步判定此制剂无明显的鼻纤毛毒性。
现有技术中已有黄芩苷磷脂复合物的报道,通过上述试验可知,本发明黄芩提取物中黄芩苷含量范围内特定,在黄芩苷重量百分含量为82%~88%范围内,制备成磷脂复合物的治疗效果明显好于更高含量或更低含量的提取物,且制备工艺简便,成本低,制备成鼻用温敏型原位凝胶和亚微乳两种制剂形式后,能发挥黄芩提取物的最佳功效,为临床提供了一种新的药物选择。
Claims (4)
1.一种黄芩提取物鼻用温敏型原位凝胶,其特征在于:它是以黄芩提取物为活性成分,制备成黄芩提取物磷脂复合物,再加入温敏型原位凝胶辅料制备而成,活性成分与辅料的重量百分比为:
黄芩提取物磷脂复合物0.2-1.5%、泊洛沙姆407 16%-24%、泊洛沙姆188 0%-12%、PEG6000 0%-2%、甘露醇5% 、苯扎氯胺0.02% 、三乙醇胺0.1%,余量为水;
该原位凝胶的制备包括如下步骤:
a、制备0.1%v/v三乙醇胺TEA溶液的配制:精密量取1.0ml三乙醇胺,加入1000ml去离子水中,充分搅拌使混匀,备用;
b、空白凝胶的制备:取P407、P188、PEG6000加入0.1%TEA溶液,冰浴4℃磁力搅拌下使其分散均匀,放入4℃冰箱冷藏24 h以上,使凝胶充分溶胀,得到澄明溶液;
c、含药凝胶的制备:先将黄芩提取物磷脂复合物溶于0.1%TEA溶液中,再加入b步骤制备的澄明溶液中;
所述的黄芩提取物是由下述方法制备而成:
取黄芩药材,加水煎煮三次,每次1小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至适量,加入盐酸适量调节pH值至1.0~2.0, 70℃保温,静置,滤过,沉淀加适量水搅匀,用40%氢氧化钠溶液调节pH值至7.0,加等量乙醇,搅拌使溶解,滤过,滤液用盐酸调节pH值至1.0~2.0,70℃保温30分钟,静置,滤过,沉淀用47.5%乙醇洗至pH值6.0~7.0,挥尽乙醇,减压干燥,即得;
其中,所述的黄芩提取物磷脂复合物是由下述重量配比的黄芩提取物与大豆卵磷脂为原料制备而成:
黄芩提取物1-3份、大豆卵磷脂或蛋黄磷脂1-4份;
所述的黄芩提取物磷脂复合物的制备包括如下步骤:
a、取下述重量配比的原料:黄芩提取物1-3份、大豆卵磷脂或蛋黄磷脂1-4份;
b、加入脱水无水乙醇,黄芩提取物药物浓度为2.5-7.5mg/ml,在20-70℃恒温水浴中60-240转/min磁力搅拌1-4小时,减压回收溶剂,真空干燥,即得黄芩提取物磷脂复合物。
2.根据权利要求1所述的鼻用温敏型原位凝胶,其特征在于:所述的黄芩提取物磷脂复合物是由下述重量配比的黄芩提取物与大豆卵磷脂为原料制备而成:
黄芩提取物1份、大豆卵磷脂或蛋黄磷脂2份。
3.根据权利要求1或2所述的鼻用温敏型原位凝胶,其特征在于:所述的黄芩提取物中含有黄芩苷的重量百分含量为82~88%。
4.根据权利要求1所述的鼻用温敏型原位凝胶,其特征在于:所述的黄芩提取物磷脂复合物的制备方法,包括如下步骤:
a、取下述重量配比的原料:黄芩提取物1份、大豆卵磷脂1-3份;
b、加入脱水无水乙醇,黄芩提取物药物浓度为5.0mg/ml,在55℃恒温水浴中120转/min磁力搅拌2小时,减压回收溶剂,真空干燥,即得黄芩提取物磷脂复合物。
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