CN102343258A - 三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类通过点击反应制备三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的方法及其应用。本发明在通过对环糊精6位的选择性叠氮化和硅胶的炔基化，利用新开发的催化剂通过点击反应，进而制备了化学稳定性优异的三唑基键合的环糊精-硅胶手性固定相，丰富了环糊精的结构设计。该类三唑基键合的环糊精手性固定相在液相色谱中展现了对氨基酸、酸性和中性消旋体药物的优异手性拆分能力，可望作为手性固定相应用于各种色谱技术的药物手性拆分领域。

Description

三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相及其制备方法

技术领域

本发明属于药物外消旋体的手性拆分领域，成功制备了一类三唑基键合的环糊精-硅胶手性固定相，可应用于各种色谱技术的药物手性拆分和制备中。 

背景技术

环糊精(Cyclodextrin, CD)是由7个D-葡萄糖分子利用α-(1,4)糖苷键连接的，形状呈圆台形的环状寡聚糖分子。其空腔内侧由两圈氢原子(H-3和H-5)及一圈糖苷键的氧原子处于C-H键的屏蔽之下，所以环糊精内腔是疏水的，而环糊精分子的外侧边框则由于羟基的聚集而呈亲水性。基于环糊精的穴状疏水腔，在空间效应影响下由范德华力、静电引力、氢键力、 π-π相互作用及疏水相互作用使其成为具有分子识别能力的超分子体系。分子识别是类似“锁和钥匙”的分子间专一性结合，可以理解为底物与给定受体间选择性键合。最近二十多年来，大量的化学修饰环糊精被合成出来，从而扩展了对客体分子的识别能力和选择性。双取代双正电中心β-环糊精正是在此基础上对环糊精进行进一步的化学修饰和结构优化，使其具有更好的手性拆分性能。 

具有手性的药物往往以外消旋体的形式出现，即含有等量的左旋体和右旋体。对映体往往具有不同的药理作用：1、药物的作用完全或者主要取决于其中一种对映体；2、两种对映体的药理作用完全相反；3、一种对映体具有强烈的毒副作用。由于这些不同，单一异构体药物的开发迅速发展，目前世界正在开发和已经批准生产的新药中有一半以上是单一异构体。目前理想的合成单一异构体药物的方法尚未形成，常用方法为不对称合成和生物酶法，这两种方法普遍存在成本高、收率低等问题。因此，手性拆分成为人们用来解决单一异构体制备问题的最主要途径。 

高效液相色谱法(HPLC)、超临界流体色谱法(SFC)、毛细管电泳(CE)等分析仪器被大量应用于手性分离。在色谱分离技术中，HPLC技术是目前发展最快、应用最为广泛的一种分析分离技术，正越来越多地应用于手性样品的纯度测定和手性样品的制备分离，已成为生物和化学实验室不可缺少的高效、快速、灵敏的分析分离手段。利用HPLC进行药物手性拆分，手性色谱柱的开发至关重要，其核心在于手性固定相，即填料基质化学键合手性选择剂的开发。 

环糊精 (CD)及其衍生物在手性固定相 (Chiral stationary phase, CSP)中占有重要的地位。环糊精手性固定相主要通过化学方法将手性选择剂如CD及其衍生物通过化学键键连于适当的填料上。CD及其衍生物对药物的拆分机理是基于CD疏水空腔与对映体间形成主-客体络合物，其包合作用的差异提供了手性拆分的基础。通过取代CD上单个或多个羟基，大量的CD手性拆分剂被开发出来，这些衍生物有效改变了CD的空腔尺寸，增加了CD与药物对眏体间的包结络合作用，同时还可通过引入带电型基团带来了额外的静电作用，更增加CD与手性分子的相互作用，从而提高了对手性分子的手性识别和拆分能力。 

环糊精CSPs的发展可追溯到1983年开发的酰胺基和尿烷基键合硅胶环糊精手性固定相；这些CSPs可实现对芳香化合物的有效选择性分离，但胺基和尿烷基的水解性使其无法用于水性流动相。为此，Armstrong开发醚基键连的羟丙基-β-环糊精手性固定相 (USP 4539399)，并提出了CD CSPs手性拆分的包合作用机理。这些早期开发的CD衍生物大多由取代基随机取代CD环上羟基而获得，取代基位置及数量很难控制，因此获得的CSPs在手性分离中重复性和稳定性难于保证，而且不同批次的CD衍生物在结构上存在差异，给实际应用带来了诸多不便。此外，CD结构的不确定性限制了对拆分过程及拆分机理的深入研究。因此结构确定、单一异构体CD手性拆分剂就显得尤为重要。 

近年来色谱工作者开发了多种结构确定的CD CSPs。其中吴小聪 （Ng Siu-Choon）课题组长期致力于结构确定CD CSPs开发，通过改变CD衍生物与不同粒径硅胶间的化学键和方式，获得了胺基和脲基键连的多个系列CD CSPs （USP 6017458，USP 6720285，USP 6296768）成功实现了对多种芳香醇、β-阻断剂、碱性、中性和弱酸性药物的手性拆分。我国中科院大连化物所、中科院兰州化物所、武汉大学、北京理工大学、南开大学等科研院所陆续开发了酰胺基、亚胺基等键连的CSPs，对一些手性化合物取得了较好的拆分效果。 

针对目前开发的环糊精手性固定相键合的不稳定性、手性拆分药物种类有限、手性拆分能力有待提高。我们开发了化学稳定性优异的三唑基键合的环糊精-硅胶手性固定相的点击反应合成方法，并利用HPLC为手段探索了其对氨基酸类化合物、酸性和中性消旋体药物手性拆分性能，验证了其广谱的手性拆分能力。本发明通过对β-环糊精6位的选择性叠氮化和硅胶的炔基化，利用新开发的催化剂通过点击反应，进而制备了化学稳定性优异的三唑基键合的环糊精-硅胶手性固定相，验证了其在宽广的pH范围内对氨基酸类化合物、酸性和中性消旋体药物的高效手性拆分能力。 

发明内容

发明目的

本发明的目的在于提供一种对通过叠氮化环糊精与炔基官能化硅胶在三苯基膦-碘化铜配位化合物的催化下，通过点击反应制备三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的方法。本发明所要解决的问题是通过以下的技术解决方案来实现的。

技术方案

1、三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相，其特征在于按以下步骤获得：

第一步，将对甲基苯磺酰氯和咪唑反应得到产物对甲基苯磺酰基咪唑，其中甲基苯磺酰氯与咪唑反应当量比1:2~1:3；

第二步，将第一步所得产物对甲基苯磺酰基咪唑置于溶解环糊精的水溶液中，搅拌后加入氢氧化钠溶液，过滤取滤液加入氯化铵调节pH 6~9，得到产物6-对甲基苯磺酰基-环糊精(Ts-CD)，真空干燥产物；其中β-环糊精与对甲基苯磺酰基咪唑反应当量比1:1~1:2；

第三步，将第二步的产物6-对甲基苯磺酰基-环糊精(Ts-CD)溶于去离子水，接着向溶液中加入叠氮化钠，搅拌回流，浓缩，浓缩液加入1,1,2,2-四氯乙烷中，析出固体，真空干燥得6-叠氮基-环糊精；其中6-对甲基苯磺酰基-β-环糊精与叠氮化钠反应当量比1:15~1:25；

第四步，将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶于无水二氯乙烷中，加入丙炔酸，搅拌，将反应混合物冷却后，缓慢加入二环己基碳二亚胺，在相同温度下反应，过滤，取滤液用旋蒸仪去除二氯乙烷，再用甲苯稀释，旋蒸去除甲苯，重复两次后，真空干燥，得到黄色油状产物N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺；其中3-氨基丙基三乙氧基硅烷与丙炔酸反应当量比1:1~1:3；

第五步，将圆底烧瓶中加入真空干燥过的硅胶，先抽真空然后通氮气两次，在氮气保护下依次将第四步产物N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺与无水甲苯加入烧瓶，搅拌回流，过滤，用甲苯洗涤，采用丙酮进行索氏提取纯化，经真空干燥得产物炔基官能化硅胶；其中N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺与硅胶重量比为1:3~1:8，

第六步，将碘化铜和乙腈依次加入反应烧瓶中，再向溶液中加入三苯基膦的乙腈溶液，搅拌反应，过滤，用乙腈洗涤，真空干燥得产物三苯基膦-碘化铜配合物；其中三苯基膦与碘化铜反应当量比为1:1~1:1.5；

第七步，将第五步产物炔基官能化硅胶加入反应烧瓶中，先抽真空然后通氮气两次，在氮气保护下在依次向其中加入第二步产物6-叠氮基-环糊精、N,N-二甲基甲酰胺和第六步产物三苯基膦-碘化铜配合物，搅拌回流，冷却过滤，用DMF洗涤，采用甲醇进行索氏提取纯化，真空干燥，得到产物：三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相；其中6-叠氮基-β-环糊精与炔基官能化硅胶当量比为1:1.2~1:2；6-叠氮基-β-环糊精与三苯基膦-碘化铜配合物的当量比为1:0.05~1:0.15；

第一步中溶液为二氯甲烷，在室温和无氧无水反应体系下进行；

第二步中搅拌2~4 h，加入的氢氧化钠溶液质量分数为10~30%；所述环糊精的CD为α-环糊精，β-环糊精或γ-环糊精；

第二步中加入氯化铵调节pH到6~9；

第三步中搅拌回流温度为80~90℃，反应时间为8~12 h；

第四步反应在-5~10^oC下进行，反应时间为1~4 h，粗产物经低沸点溶剂如甲苯等稀释和纯化；

第五步中搅拌回流温度70~140^oC，反应在无氧无水环境下进行；

第六步中体系先将三苯基膦溶解于乙腈，在25℃反应1~4 h；

第七步中搅拌回流温度为80~160^oC，反应时间为24~36小时。

第五步所述的硅胶的粒径为1.8 μm、3 μm、5 μm、10 μm、20 μm、50 μm，其孔径为60、 100、120、200、300?。 

有益效果

本发明通过对β-环糊精的6位羟基进行叠氮化，再与炔基官能化的硅胶在三苯基膦-碘化铜配位化合物的催化下通过点击反应，最终制备出三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相。三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相可广泛应用于各种色谱技术中外消旋体药物的手性分离和制备领域。

本发明与现有技术相比，其显著优点：(1) 通过点击反应，可在任意粒径的硅胶上制备三唑基键合的环糊精-硅胶手性固定相；(2) 利用点击反应制备三唑基键合的环糊精，其中环糊精可适用于任何叠氮化的环糊精及其衍生物包括：α-环糊精，β-环糊精和γ-环糊精；(3)本发明中制备的三苯基膦-碘化铜配合物可成功实现环糊精体系的点击反应，而常见的点击反应催化剂不能催化上述反应；(4)三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的制备具有高度的化学选择性，因此结构具有确定性；(5) 三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相具有比其他报道的环糊精手性固定相更优异的酸碱稳定性，三唑基在色谱通常使用的缓冲液中均能保持化学稳定；(6) 三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相在拆分过程中，可在宽广的缓冲液pH范围同时实现对氨基酸类双性化合物、酸性和中性消旋体药物实现的广谱高效拆分；(7) 三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相可利用液相色谱、超临界色谱、气相色谱和电色谱等技术在药物手性分离领域中获得广泛应用。 

附图说明

附图是本发明所报道的点击反应制备三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的结构以及制备方法的流程示意图。 

图1、2为基于5μm 和3μm 硅胶的CCNCSP 对4种中性药物在HPLC中的手性拆分比较。 拆分条件: (a) 4′-hydroxyflavanone, 流动相ACN/H2O (40/60 体积比), 流速 0.5 ml min-1; (b) 4′-hydroxyflavanone, 流动相ACN/H2O (40/60体积比), 流速 0.4 ml min-1; (c) clopidogrel, 流动相 ACN/H2O (35/65体积比), 流速 0.5 ml min-1; (d) clopidogrel, 流动相 ACN/H2O (35/65体积比), 流速 0.4 ml min-1; (e) flavanone, 流动相 ACN/H2O (40/60体积比), 流速 0.5 ml min-1; (f) flavanone, 流动相ACN/H2O (40/60体积比), 流速0.4 ml min-1; (g) Nimodipine, MeOH/H2O (50/50体积比), 流速0.4 ml min-1; (h) Nimodipine, 流动相MeOH/H2O (55/45体积比), 流速 0.4 ml min-1； 

图3为本发明所报道的点击反应制备三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的结构以及制备方法的流程示意图。

  

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。 

实施例1：以β-环糊精为例 

结合附图，本发明双取代双正点中心-β-环糊精的制备方法，包括以下步骤：

第一步，将对甲基苯磺酰氯和咪唑在二氯甲烷中室温反应得到对甲基苯磺酰基咪唑；

第二步，将第一步所得产物对甲基苯磺酰基咪唑置于溶解β-环糊精的水溶液中，室温搅拌反应 2~4 h后加入氢氧化钠溶液，过滤去除产生的少量沉淀物；往滤液中加入氯化铵调节其pH值至6~9获得白色固体物质，过滤得到产物对甲基苯磺酰基-β-环糊精(Ts-CD)，真空干燥产物；

第三步，取双口圆底烧瓶，将第二步的产物6-对甲基苯磺酰基-β-环糊精(Ts-CD)溶于去离子水，接着向溶液中加入叠氮化钠，搅拌回流，反应过夜，用旋转蒸发仪将溶液浓缩，浓缩液加入1,1,2,2-四氯乙烷中，析出固体，真空干燥得6-叠氮基-β-环糊精；

第四步，将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶于无水二氯乙烷中，加入丙炔酸，搅拌，将反应混合物冷却后，缓慢加入二环己基碳二亚胺，在相同温度下反应，过滤，取滤液用旋蒸仪去除二氯乙烷，再用甲苯稀释，旋蒸去除甲苯，重复两次后，真空干燥，得到黄色油状产物N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺；

第五步，将圆底烧瓶中加入真空干燥过的硅胶，先抽真空然后通氮气两次，在氮气保护下依次将第四步产物N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺与无水甲苯加入烧瓶，搅拌回流，过滤，用甲苯洗涤，采用丙酮进行索氏提取纯化，经真空干燥得产物炔基官能化硅胶；

第六步，将碘化铜和乙腈依次加入反应烧瓶中，再向溶液中加入三苯基膦的乙腈溶液，搅拌反应，过滤，用乙腈洗涤，真空干燥得产物三苯基膦-碘化铜配合物；

第七步，将第五步产物炔基官能化硅胶加入反应烧瓶中，先抽真空然后通氮气，重复操作两次，在氮气保护下在依次向其中加入第三步产物6-叠氮基-β-环糊精、DMF和第六步产物三苯基膦-碘化铜配合物，搅拌回流，冷却过滤，用DMF洗涤，采用甲醇进行索氏提取纯化，真空干燥，得到产物：三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相；

本发明三唑基单键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，甲基苯磺酰氯与咪唑反应当量比1:2~1:3。

本发明三唑基单键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，β-环糊精与对甲基苯磺酰基咪唑反应当量比1:1~1:2。 

本发明三唑基单键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，6-对甲基苯磺酰基-β-环糊精与叠氮化钠反应当量比1:15~1:25。 

本发明三唑基单键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，3-氨基丙基三乙氧基硅烷与丙炔酸反应当量比1:1~1:3。 

本发明三唑基单键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺与硅胶重量比为1:3~1:8，硅胶的粒径可为1.8 μm，3 μm，5 μm，10 μm，20 μm甚至50 μm，其孔径可为60, 100, 120, 200, 300?。 

本发明三唑基单键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，三苯基膦与碘化铜反应当量比为1:1~1:1.5。 

本发明三唑基单键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，6-叠氮基-β-环糊精与炔基官能化硅胶重量比为1:1.2~1:2，6-叠氮基-β-环糊精与三苯基膦-碘化铜配合物的当量比为1:0.05~1:0.15；。 

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。 

本发明三唑基单键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，包括以下步骤： 

第一步，取250 mL双口圆底烧瓶先抽真空然后通氮气，称取对甲基苯磺酰氯 (6.57 g, 34.5 mmol)加入烧瓶中，再加入30 mL干燥二氯甲烷，磁力搅拌溶解，再称咪唑 (5.3 g，77.8 mmol)溶解在30 mL干燥的二氯甲烷溶液中，转移至滴液漏斗中，将上述溶液逐滴滴入烧瓶中(1~2滴/秒)，室温搅拌过夜。反映结束过滤，滤液浓缩至~10 mL滴入40 mL正己烷溶液中，析出白色固体，减压过滤，沉淀用正己烷洗涤，真空干燥得到产物对甲基苯磺酰基咪唑 (7.6 g，产率95%)；其结构表征数据如下，Mp: 77-78^oC；¹H NMR (300 MHz CDCl₃) δ: 8.03(1H, s, N-CH=N)， 7.10 (1H, s, N-CH=C), 7.31(1H, s, N-CH=C), 7.35(2H, d, H-Ar), 7.83(2H, d, H-Ar) 2.46 (3H, s, CH₃); ¹³CNMR (75 MHz, CDCl₃) δ: 146.5，136.8, 134.9, 131.6, 130.5, 127.4, 117.9, 21.2; FTIR (KBr，cm^-1): 3159, 3103, 3032, 1595, 1516, 1383, 1151; ESI-MS (m/z): 223.03 [M+H]⁺, calcd 223.05；其反应方程式为：

第二步，β-环糊精需先在50℃活化5 h，取250 mL锥形瓶，称取干燥的β-环糊精(4.72 g，4.16 mmol)加入到瓶中，注入100 mL去离子水，搅拌0.5~2 h，加入第一步所得产物对甲基苯磺酰基咪唑 (1.2 g，5.40 mmol)，搅拌下室温反应2~4 h。之后再加入质量分数20%的氢氧化钠溶液 (8 mL)，搅拌0.5小时，过滤，取滤液，加入氯化铵，调节pH值直至6~9，过滤，沉淀真空干燥得到产物对甲基苯磺酰基-β-环糊精(Ts-β-CD)；其结构表征数据如下，Mp: 165-167^oC; FTIR (KBr, cm^-1): 3400, 2935, 1647, 1367, 1159, 1080, 1031, 582; ¹HNMR (300 MHz, DMSO-_d6) δ: 7.73-7.76 (2H, d, H-Ar), 7.41-7.44 (2H, d, H-Ar), 5.62-5.84 (14H, m, OH-3 and OH-2), 4.83 (5H, d, H-1), 4.76 (2H, d, H-1), 4.41-4.48 (4H, m, OH-6), 4.28-4.35 (1H, m, OH-6), 4.15-4.2 (1H, m, OH-6), 3.3-3.6 (overlap with HDO, 42H, m, H-2, H-3, H-4, H-5 and H-6), 2.50 (3H, s, CH₃); ¹³CNMR (75MHz DMSO-_d6) δ: 144.8, 132.7, 129.9, 127.6, 102.1, 101.9, 80.7, 81.5, 73.0, 72.0, 72.4, 69.7, 68.9, 59.9, 21.3. ESI-MS (m/z): 1311.2 [M+H]⁺, calcd 1311.6；其反应方程式为：

第三步，取100 mL双口烧瓶，称取对甲基苯磺酰基-β-环糊精 (2.5 g，1.9 mmol)置于双口烧瓶中，加入去离子水(150 mL)，接着称取叠氮化钠 (2.5 g，38.4 mmol) 加入到双口烧瓶中，80~90℃回流过夜，反应结束后，过滤取滤液，反应结束后，减压蒸馏浓缩至10 mL左右，浓缩液逐滴滴入1,1,2,2-四氯乙烷 (3 mL)中，析出白色固体，过滤，干燥沉淀得产物6-叠氮基-β-环糊精 (1.9 g, 产率85%)；其结构表征数据如下，Mp: 208^oC；FTIR (KBr, cm^-1): 3,394 (O-H, str), 2,932 (C-H, m), 2,104 (–N3, str)；¹HNMR (300 MHz, DMSO- _d6 ) δ: 5.62–5.77 (m, 14H), 4.83–4.87 (m, 7H), 4.44–4.54 (m, 6H), 3.55–3.64 (m, 14H), 3.32–3.40 (s, 28H); ¹³CNMR (75 MHz, DMSO- _d6 ) δ: 102.2, 101.6, 82.4, 81.2, 73.4, 73.0, 72.1, 70.7, 60.1, 51.4; ESI-MS (m/z): calculated, 1,159; found, 1,182.5 [M+Na]⁺; Anal. Calcd. for C₄₂H₇₁O₃₉N, C 43.6, H 6.02, N 3.18; found C 43.1, H 6.21, N 3.09；其反应方程式为：

第四步，将50 mL双口烧瓶反应器冷却至-10~5^oC，称取3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (2.4 g, 10.8 mmo)加入烧瓶中，用注射器加入15mL干燥的二氯乙烷，搅拌，依次接着加入丙炔酸 (0.87 g, 11.9 mmol)和二环己基碳二亚胺(2.46 g, 12.0 mmol)，同样低温下反应2h。溶液过滤，过滤，取滤液用旋蒸仪去除二氯乙烷，再用甲苯稀释，旋蒸去除甲苯，重复两次后，真空干燥，得到黄色油状产物N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺 (2.4 g, 产率80%)；其结构表征数据如下，FTIR (KBr, cm^-1): 2120 (-C≡CH, str)；¹HNMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7.11 (m, 1H), 3.72-3.79 (s, 6H), 3.21-3.27 (s, 2H), 2.28 (s, 1H), 1.58-1.63 (s, 2H), 1.14-1.19 (s, 9H), 0.56-0.61 (s, 2H); ESI-MS (m/z): calculated, 273; found, 296.1 [M+Na]⁺；其反应方程式为：

第五步，取150 mL双口烧瓶，称取160^oC真空干燥12 h的5μm硅胶 (4 g) 加入烧瓶中，将反应体系先抽真空然后通氮气，反复操作两次，在氮气保护下依次将N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺(1 g，3.66 mmol)与无水甲苯(50 mL)加入烧瓶，在120^oC下搅拌回流 12~20 h，过滤，用甲苯洗涤，采用丙酮进行索氏提取纯化，经真空干燥得产物炔基官能化硅胶；其结构表征数据如下，FTIR (KBr, cm^-1): 2121 (-C≡CH str); Anal. found: C 5.32%, H 0.986%, N 0.846%；其反应方程式为：

第六步，取25 mL双口烧瓶，称取三苯基磷 (0.69 g, 2.63 mmol) 加入到烧瓶中，接着加入乙腈 (10 mL)，之后向反应体系中缓慢加入50 mL的CuI (0.50 g, 2.63 mmol)乙腈溶液，在20~40℃下反应1 h；过滤经乙腈洗涤，真空干燥得三苯基磷与碘化铜的配位化合物(0.95 g，产率 80%)；其结构表征数据如下，IR (KBr, cm^-1): 1479, 1434, 1097, 748, 695, 521, 503; Anal. Calcd. for C₁₈H₁₅PCuI: C 47.6 , H 3.31; Found: C, 47.2; H, 3.29；其反应方程式为：

第七步，取100 mL双口烧瓶，向其中加入炔基官能化硅胶(4 g)，将反应体系先抽真空然后通氮气，反复操作两次，在氮气保护下在依次向其中加入第二步产物6-叠氮基-β-环糊精(3 g, 2.47 mmol)、DMF(40 mL)和第六步产物三苯基膦-碘化铜配合物 (0.1 g，0.22 mmol)，搅拌回流，冷却过滤，用DMF洗涤，采用甲醇进行索氏提取纯化，真空干燥，得到产物：三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相；其结构表征数据如下，FTIR (cm^-1, KBr): 2940, 3400；Anal. found: C 14.35%, H 2.639%, N 1.49%；环糊精在5 μm硅胶表面的负载率为0.48 μmol m^-2，其反应方程式为：

实施例2 以α-环糊精为例

具有广谱手性拆分能力的三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相制备方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，基于亲核取代的机理，对甲基苯磺酰氯1 mol和咪唑3 mol在二氯甲烷中，25 ^oC反应过夜得到对甲基苯磺酰基咪唑；

第二步，将第一步所得产物对甲基苯磺酰基咪唑2 mol置于溶有1 molα-环糊精的水溶液中，25^oC搅拌反应4 h后加入质量百分含量为30 %氢氧化钠水溶液，过滤；往滤液中加入氯化铵调节其pH值至8获得白色固体物质，过滤得到产物对甲基苯磺酰基-α-环糊精Ts-CD，真空干燥产物；

第三步，将第二步的产物6-对甲基苯磺酰基-α-环糊精(3.1 g，2.4 mmol)溶于去离子水(150 mL)，接着向溶液中加入叠氮化钠 (2.34 g，36.0 mmol)，80~90℃回流，反应结束后，过滤取滤液，减压蒸馏浓缩至10 mL左右，浓缩液逐滴滴入1,1,2,2-四氯乙烷 (3 mL)中，析出白色固体，过滤，干燥沉淀得产物6-叠氮基-α-环糊精；

第四步，将反应器冷却至5^oC，称取3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (2.4 g, 10.8 mmol)加入烧瓶中，加入干燥二氯乙烷(15 mL)，搅拌，依次接着加入丙炔酸 (0.87 g, 11.9 mmol)和二环己基碳二亚胺(4.43 g, 21.6 mmol)，同样温度下反应2 h。溶液过滤，过滤，取滤液用旋蒸仪去除二氯乙烷，再用甲苯稀释，旋蒸去除甲苯，重复两次后，真空干燥，得到黄色油状产物N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺；

第五步，称取160^oC真空干燥12 h的粒径为5μm、孔径为100?硅胶 (4 g) 加入烧瓶中，将反应体系先抽真空然后通氮气，反复操作两次，在氮气保护下依次将N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺(1 g，3.66 mmol)与无水甲苯(50 mL)加入烧瓶，在120^oC下搅拌回流 12~20 h，过滤，用甲苯洗涤，采用丙酮进行索氏提取纯化，经真空干燥得产物炔基官能化硅胶 (粒径 5μm)；

第六步，称取三苯基磷 (0.69 g, 2.63 mmol) 加入到烧瓶中，加入乙腈 (10 mL)，然后向反应体系中缓慢加入50 mL的CuI (0.50 g, 2.63 mmol)乙腈溶液。几秒钟有沉淀析出。在20~40℃下反应1 h，过滤经乙腈洗涤，真空干燥得三苯基磷与碘化铜的配位化合物；

第七步，称取炔基官能化硅胶(4 g)，将反应体系先抽真空然后通氮气，反复操作两次，在氮气保护下在依次向其中加入第二步产物6-叠氮基-α-环糊精(3 g, 2.3 mmol)、DMF(40 mL)和第六步产物三苯基膦-碘化铜配合物 (0.1 g，0.22 mmol)，搅拌回流，冷却过滤，用DMF洗涤，采用甲醇进行索氏提取纯化，真空干燥，得到产物：三唑基键合环糊精硅胶手性固定相 (CCNCSP)；

实施例3

具有广谱手性拆分能力的三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相制备方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，基于亲核取代的机理，对甲基苯磺酰氯1 mol和咪唑3 mol在二氯甲烷中，25 ^oC反应过夜得到对甲基苯磺酰基咪唑；

第二步，将第一步所得产物对甲基苯磺酰基咪唑2 mol置于溶有1 mol γ-环糊精的水溶液中，25^oC搅拌反应4 h后加入质量百分含量为30 %氢氧化钠水溶液，过滤；往滤液中加入氯化铵调节其pH值至8获得白色固体物质，过滤得到产物对甲基苯磺酰基-γ-环糊精Ts-CD，真空干燥产物；

第三步，将第二步的产物6-对甲基苯磺酰基-γ-环糊精(3.1 g，2.4 mmol)溶于去离子水(150 mL)，接着向溶液中加入叠氮化钠 (2.34 g，36.0 mmol)，80~90℃回流，反应结束后，过滤取滤液，减压蒸馏浓缩至10 mL左右，浓缩液逐滴滴入1,1,2,2-四氯乙烷 (3 mL)中，析出白色固体，过滤，干燥沉淀得产物6-叠氮基-γ-环糊精；

第四步，将反应器冷却至5^oC，称取3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (2.4 g, 10.8 mmo)加入烧瓶中，加入干燥二氯乙烷(15mL)，搅拌，依次接着加入丙炔酸 (0.87 g, 11.9 mmol)和二环己基碳二亚胺(2.46 g, 12.0 mmol)，同样温度下反应2h。溶液过滤，过滤，取滤液用旋蒸仪去除二氯乙烷，再用甲苯稀释，旋蒸去除甲苯，重复两次后，真空干燥，得到黄色油状产物N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺；

第五步，称取160^oC真空干燥12 h后粒径为3μm、孔径为100?硅胶 (4 g) 加入烧瓶中，将反应体系先抽真空然后通氮气，反复操作两次，在氮气保护下依次将N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺(1 g，3.66 mmol)与无水甲苯(50 mL)加入烧瓶，在120^oC下搅拌回流 12~20 h，过滤，用甲苯洗涤，采用丙酮进行索氏提取纯化，经真空干燥得产物炔基官能化硅胶 (粒径 3 μm)；

第六步，称取三苯基磷 (0.69 g, 2.63 mmol) 加入到烧瓶中，加入乙腈 (10 mL)，然后向反应体系中缓慢加入50 mL的CuI (0.50 g, 2.63 mmol)乙腈溶液。几秒钟有沉淀析出。在20~40℃下反应1 h，过滤经乙腈洗涤，真空干燥得三苯基磷与碘化铜的配位化合物；

第七步，称取炔基官能化硅胶(4 g)，将反应体系先抽真空然后通氮气，反复操作两次，在氮气保护下在依次向其中加入第二步产物6-叠氮基-γ-环糊精(3 g, 2.3 mmol)、DMF(40 mL)和第六步产物三苯基膦-碘化铜配合物 (0.1 g，0.22 mmol)，搅拌回流，冷却过滤，用DMF洗涤，采用甲醇进行索氏提取纯化，真空干燥，得到产物：三唑基键合-γ-环糊精3 μm硅胶手性固定相，环糊精在3 μm硅胶表面的负载率为0.59 μmol m^-2；

实施例4 将实施例1-3中获得三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相进行色谱柱填充试验：

1、 将空不锈钢色谱柱(Φ4.6×250 mm)一端密封，另一端与前置柱连接，之后再将前置柱一端通过一个储罐与HPLC泵连接；

2、将三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相 (其中硅胶粒径为3μm或5μm，孔径为100?) 分散于甲醇中制备固定相浆料，将搅拌均匀的浆料加入上述储罐中，开启HPLC泵、向色谱柱填装体系施以8,000 psi 的压力30 min。

3、关闭HPLC泵，等体系压力减为零，取下填充好的色谱柱，两端封存，该色谱柱可在密封状态下保存6个月。 

实施例5 将实施例1-3中获得三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相色谱柱进行药物手性拆分试验： 

1、1%的三乙基醋酸铵 (TEAA)缓冲液由1% 三乙基胺水溶液配制而成， 其pH值通过添加冰醋酸来调节，TEAA/MeOH缓冲液通过添加不同体积比的1% TEAA和MeOH来配制，其他流动相由乙腈和水(ACN/H₂O)，或甲醇和水(MeOH/H₂O)按一定体积比进行混合配置，所有缓冲液和流动相均现用现配，经过滤，并利用DEGASYS DG-2410 degasser 排除其中的空气。

2、将选定的消旋体化合物溶解于甲醇/水 (50/50 v/v) 配制0.2 g/mL标准溶液，采用同样的方法配制其他所有的消旋体溶液，选定拆分的消旋体药物如下： 

3、利用由Waters 2695 HPLC泵, Waters 2996 双整列管检测器 (254 nm) 组成的HPLC系统，采用三唑基键合环糊精-硅胶 (3 μm和5 μm)手性固定相色谱柱，对15种消旋体进行手性拆分，在不同pH下均对酸性药物和丹酰类氨基酸消旋体展现了优异的手性拆分，结果如表1所示， 

 表.1 基于5 μm硅胶CCNCSP对酸性药物、丹酰类氨基酸消旋体的拆分数据

拆分条件: a, 1% TEAA 缓冲液 (pH 4.11)/ MeOH 70/30 (v/v), 流速 0.3 mL/min;  b, 1% TEAA 缓冲液 (pH 4.11)/MeOH 70/30 (v/v), 流速0.4 mL/min; c, 1% TEAA 缓冲液 (pH 5.11)/ MeOH (50:50 v/v), 流速0.7 mL/min. 注：分离选择性(a)，分离度(R _s ) 

 三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相对中性药物同样展现了优异的手性拆分能力；不过，在相同拆分条件下，3 μm硅胶键合制备的CCNCSP 较5 μm硅胶键合所得CCNCSP展现了对中性药物更强的拆分能力，拆分效果比较如图1、2所示：

 综上所述，我们开发了三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的点击反应制备方法，探索了其在高效液相色谱中作为手性拆分剂对氨基酸类消旋体、酸性和中性药物手性分离性能，实验证明其对氨基酸类消旋体、酸性和中性药物具有广谱的优异手性拆分能力。本发明通过点击反应将6位叠氮化-α-环糊精和不同粒径炔基化硅胶通过化学稳定性优异的三唑基键合，最终制备出三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相，并在宽广的pH范围内对多种氨基酸双向化合物和酸性消旋体药物展现了高效的广谱手性拆分能力。该手性拆分剂可广泛应用于HPLC、CE、SFC甚至SMB技术中，实现对氨基酸类消旋体、酸性和中性消旋体药物的广谱拆分。

Claims (10)

1.三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相，其特征在于按以下步骤获得：

第一步，将对甲基苯磺酰氯和咪唑反应得到产物对甲基苯磺酰基咪唑，其中甲基苯磺酰氯与咪唑反应当量比1:2~1:3；

第二步，将第一步所得产物对甲基苯磺酰基咪唑置于溶解环糊精的水溶液中，搅拌后加入氢氧化钠溶液，过滤取滤液加入氯化铵调节pH 6~9，得到产物6-对甲基苯磺酰基-环糊精；其中环糊精与对甲基苯磺酰基咪唑反应当量比1:1~1:2；

第三步，将第二步的产物6-对甲基苯磺酰基-环糊精溶于水，接着向溶液中加入叠氮化钠，搅拌回流，浓缩，浓缩液加入1,1,2,2-四氯乙烷中，析出固体，得6-叠氮基-环糊精；其中6-对甲基苯磺酰基-环糊精与叠氮化钠反应当量比1:15~1:25；

第四步，将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶于无水二氯乙烷中，加入丙炔酸，搅拌，将反应混合物冷却后，加入二环己基碳二亚胺，在相同温度下反应，过滤，取滤液去除二氯乙烷，再用甲苯稀释，去除甲苯，得到黄色油状产物N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺；其中3-氨基丙基三乙氧基硅烷与丙炔酸反应当量比1:1~1:3；

第五步，将圆底烧瓶中加入真空干燥过的硅胶，在氮气保护下依次加入第四步产物N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺与无水甲苯，搅拌回流，过滤，用甲苯洗涤，得产物炔基官能化硅胶；其中N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺与硅胶重量比为1:3~1:8，

第六步，将碘化铜和乙腈依次加入，再向溶液中加入三苯基膦的乙腈溶液，搅拌反应，过滤，用乙腈洗涤，真空干燥得产物三苯基膦-碘化铜配合物；其中三苯基膦与碘化铜反应当量比为1:1~1:1.5；

第七步，将第五步产物炔基官能化硅胶加入，在氮气保护下在依次向其中加入第二步产物6-叠氮基-环糊精、N,N-二甲基甲酰胺和第六步产物三苯基膦-碘化铜配合物，搅拌回流，冷却过滤，用DMF洗涤，采用甲醇纯化，得到产物三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相；其中6-叠氮基-β-环糊精与炔基官能化硅胶当量比为1:1.2~1:2；6-叠氮基-环糊精与三苯基膦-碘化铜配合物的当量比为1:0.05~1:0.15。

2.三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，其特征在于按以下步骤获得：

第一步，将对甲基苯磺酰氯和咪唑反应得到产物对甲基苯磺酰基咪唑，其中甲基苯磺酰氯与咪唑反应当量比1:2~1:3；

第二步，将第一步所得产物对甲基苯磺酰基咪唑置于溶解环糊精的水溶液中，搅拌后加入氢氧化钠溶液，过滤取滤液加入氯化铵调节pH 6~9，得到产物6-对甲基苯磺酰基-β-环糊精，真空干燥产物；其中环糊精与对甲基苯磺酰基咪唑反应当量比1:1~1:2；

第三步，将第二步的产物6-对甲基苯磺酰基-环糊精溶于去离子水，接着向溶液中加入叠氮化钠，搅拌回流，浓缩，浓缩液加入1,1,2,2-四氯乙烷中，析出固体，真空干燥得6-叠氮基-环糊精；其中6-对甲基苯磺酰基-环糊精与叠氮化钠反应当量比1:15~1:25；

第四步，将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶于无水二氯乙烷中，加入丙炔酸，搅拌，将反应混合物冷却后，缓慢加入二环己基碳二亚胺，在相同温度下反应，过滤，去除二氯乙烷，再用甲苯稀释，去除甲苯，重复两次后，真空干燥，得到黄色油状产物N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺；其中3-氨基丙基三乙氧基硅烷与丙炔酸反应当量比1:1~1:3；

第五步，将圆底烧瓶中加入真空干燥过的硅胶，在氮气保护下依次将第四步产物N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺与无水甲苯加入烧瓶，搅拌回流，过滤，用甲苯洗涤，采用丙酮纯化，经真空干燥得产物炔基官能化硅胶；其中N-[3-(三乙氧硅基)丙基-2-丙炔酰胺与硅胶重量比为1:3~1:8，

第六步，将碘化铜和乙腈依次加入反应烧瓶中，再向溶液中加入三苯基膦的乙腈溶液，搅拌反应，过滤，用乙腈洗涤，真空干燥得产物三苯基膦-碘化铜配合物；其中三苯基膦与碘化铜反应当量比为1:1~1:1.5；

第七步，将第五步产物炔基官能化硅胶加入反应烧瓶中，在氮气保护下在依次向其中加入第二步产物6-叠氮基-环糊精、N,N-二甲基甲酰胺和第六步产物三苯基膦-碘化铜配合物，搅拌回流，冷却过滤，用DMF洗涤，采用甲醇纯化，得到产物：三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相；其中6-叠氮基-环糊精与炔基官能化硅胶当量比为1:1.2~1:2；6-叠氮基-环糊精与三苯基膦-碘化铜配合物的当量比为1:0.05~1:0.15。

3.根据权利要求2所述的三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，其特征在于第一步中溶液为二氯甲烷，在室温和无氧无水反应体系下进行。

4.根据权利要求2所述的三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，其特征在于第二步中搅拌2~4 h，加入的氢氧化钠溶液质量分数为10~30%，所述环糊精的CD为α-环糊精，β-环糊精或γ-环糊精。

5.根据权利要求2所述的三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，其特征在于第三步中搅拌回流温度为80~90℃，反应时间为8~12 h。

6.根据权利要求2所述的三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，其特征在于第四步反应在-5~10^oC下进行，反应时间为1~4 h，粗产物经低沸点溶剂如甲苯稀释和纯化。

7.根据权利要求2所述的三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，其特征在于第五步中搅拌回流温度70~140^oC，反应在无氧无水环境下进行。

8.根据权利要求2所述的三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，其特征在于第六步中体系先将三苯基膦溶解于乙腈，在25℃反应1~4 h。

9.根据权利要求2所述的三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，其特征在于第七步中搅拌回流温度为80~160^oC，反应时间为24~36小时。

10.根据权利要求2所述的三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相的制备方法，其特征在于第五步所述的硅胶的粒径为1.8 μm、3 μm、5 μm、10 μm、20 μm、50 μm，其孔径为60、 100、120、200、300?。

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