CN102341121A - 抗猕因子d单克隆抗体 - Google Patents

抗猕因子d单克隆抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN102341121A
CN102341121A CN201080010868XA CN201080010868A CN102341121A CN 102341121 A CN102341121 A CN 102341121A CN 201080010868X A CN201080010868X A CN 201080010868XA CN 201080010868 A CN201080010868 A CN 201080010868A CN 102341121 A CN102341121 A CN 102341121A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
heavy chain
compositions
carrier
sudden change
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201080010868XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN102341121B (zh
Inventor
克里斯汀·高切尔
希尔维·约里尤科斯
克里斯托弗·德罗穆夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB SA
Original Assignee
LFB Biotechnologies SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LFB Biotechnologies SAS filed Critical LFB Biotechnologies SAS
Publication of CN102341121A publication Critical patent/CN102341121A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102341121B publication Critical patent/CN102341121B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/34—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood group antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及抗RhD单克隆抗体，其由具有两条重链和两条轻链的四聚体IgG1免疫球蛋白构成，所述重链包含在68位处带有苯丙氨酸残基的氨基酸序列SEQ ID No.2，和所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID No.4。

Description

抗猕因子D单克隆抗体
本发明涉及针对猕因子D抗原的抗体(抗RhD抗体)。
技术背景
“猕因子阳性”或“Rh阳性”是通常用于指其红血球被针对D抗原(Rh系统的一个抗原)的同种异体抗体凝集的个体的术语，而“猕因子阴性”或“Rh阴性”是指其红血球不被所述同种异体抗体凝集的个体。
新生儿溶血病在大多数情况下是由于在Rh阴性的母亲中存在抗RhD同种异体抗体(对抗Rh系统中其它抗原的同种异体免疫要罕见得多)，这种情况在Rh阳性胎儿中引起溶血性贫血，需要宫内输血或在严重情况下出生时需要换血。
母亲的同种异体免疫一般发生在以前的产育期间胎儿红血球进入母体循环时，如果胎儿是Rh阳性的话，则诱导免疫。
预防新生儿溶血病在于给Rh阴性母亲在产后或流产/小产后立即注射抗RhD抗体。
当前用于这种目的的抗猕因子抗体是来源于猕因子阴性志愿供体的多克隆免疫球蛋白，所述供体已针对Rh阳性红血球被免疫了若干次。
这就产生了问题，首先是关于需要能够满足需求的足够数量的供体，其次是由于被获自志愿者供体血液的免疫球蛋白制剂中可能存在的病毒或其它病原体污染的风险。
虽然已经生产了几种抗RhD单克隆抗体来代替多克隆抗体，但还都不能够供临床应用之用(Sibéril等，Clincial Immunology，2006，118：170-179)。
Sibéril等，同上(和专利申请WO2001/77181)，描述了由大鼠骨髓瘤YB2/0细胞产生的T125克隆(被称为T125 YB2/0克隆)，这是一种有希望的候选物，但由于分子内重排，可能相对不稳定。
发明概述
本发明人现在已经开发出一种新的抗RhD单克隆抗体，其具有改善的稳定性。
所述抗体是IgG1免疫球蛋白，其包含由核苷酸序列SEQ ID No.1编码的重链。更具体是，所述抗体是由两个重链和两个轻链构成的四聚体免疫球蛋白，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID No.2，和所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID No.4。
在本说明书中，所述抗体应命名为R593抗体。
所述R593抗体通过R297抗体的突变得到，所述R297抗体产自EBV-转化的B淋巴细胞产生的T125 A2克隆。与R297抗体一样，R593抗体是由两个重链和两个轻链构成的四聚体IgG1，其包含32个半胱氨酸残基，在重链内(每链4个)、轻链内(每链2个)和链之间(每链4个)形成了16个二硫键。本发明的R593抗体与R297抗体的不同之处在于，在重链的68位处由苯丙氨酸残基代替半胱氨酸残基。
其抗原特异性同样良好，并且稳定性改善，因为不再可能有不利的分子内重排。
本发明的另一个目的是包含所述抗体与可药用赋形剂相组合的药物组合物。
优选，所述组合物包含柠檬酸盐缓冲剂。
有利地，它可以包含多元醇、例如甘露糖醇作为赋形剂。
更优选，它包含非离子型表面活性剂。
特别优选的组合物包含所述抗体与30mM pH6.5的柠檬酸盐缓冲剂、聚山梨醇酯80、甘露糖醇和NaCl的组合。例如，所述组合物包含30mM pH6.5的柠檬酸盐缓冲剂、400ppm聚山梨醇酯80、17g/L甘露糖醇和3.25g/L NaCl。另一种组合物包含30mM pH6.5的柠檬酸盐缓冲剂、301ppm泊洛沙姆188、17g/L甘露糖醇和3.25g/L NaCl。
发明的具体说明
抗体的产生
本发明的单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如通过在宿主细胞中重组，所述宿主细胞用使编码所述抗体重链或轻链的核苷酸序列能够表达和/或分泌的一个或多个载体进行了转化。所述载体一般包含启动子、翻译起始和终止信号、以及适当的转录调节区。它稳定地保留在宿主细胞中，并可以任选拥有供翻译的蛋白分泌之用的特定信号。选择这些不同的组分，并根据所使用的宿主细胞由本领域技术人员进行优化。
因此，本发明的具体目的是编码抗体重链的核酸，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID No.2。
本发明的另一个目的是包含核酸例如本文限定的核酸的表达载体，例如病毒或质粒载体。所述载体可以在选定的宿主细胞中自主复制，或者它可以是所讨论的宿主细胞的整合型载体。包含编码所述抗体轻链的核酸的表达载体也同样有用。本发明的另一个目的是包含编码所述抗体的重链和轻链的核酸、例如本文限定的重链和轻链的核酸的表达载体。
这样的载体通过本领域技术人员熟悉的方法制备，所产生的克隆可以通过标准方法导入合适的宿主细胞，所述方法例如脂质转染法、电穿孔法、使用聚阳离子剂、热冲击或者化学方法。
本发明的另一个目的是用所述载体转染的宿主细胞。宿主细胞可以选自原核或真核生物系统，例如细菌细胞还有酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。昆虫细胞或植物细胞也可以使用。
在另一个方面，本发明的目的在于本发明抗体的生产方法，所述方法包含以下步骤：a)在适当的培养基和条件下培养表达重链和轻链、例如本文限定的重链和轻链的宿主细胞；和b)回收从所述培养基或从所述培养细胞如此产生的所述抗体。
生产方法的具体例子是在昆虫细胞中生产，如同例如国际专利申请WO 96/07740所述。为此，使用的表达盒包含编码单克隆抗体轻链可变区的序列、或编码单克隆抗体重链可变区的序列，所述序列置于适当的启动子、例如杆状病毒启动子的转录控制之下。
杆状病毒启动子的例子包括AcMNPV或SIMNPV杆状病毒的多角体蛋白和P10启动子，或杆状病毒启动子的衍生物，所述衍生物由从杆状病毒启动子获得的合成或重组启动子构成，并在昆虫细胞中具有功能。
本发明还提供了重组载体，其包含至少一个表达盒，例如在上文限定的表达盒；在这点上，本发明特别包涵允许表达R593抗体的重组杆状病毒，以及允许构建所述重组杆状病毒的转移质粒。
为了允许同时表达重链(H链)和轻链(L链)并将它们重新联合以形成重组抗体分子，人们可以在同一表达载体中使用两个盒。在这样的方式中，例如，双重组杆状病毒可以制备成其中编码各H和L链的序列处于强启动子的控制之下。为此，人们可以依照下列步骤：
1分别制备两个种转移质粒，一种用于H链，一种用于L链；
2然后用这样构建的转移载体的DNA和杆状病毒的DNA共转染昆虫细胞。这种共转染用两步发生：使用包含轻链基因表达盒的转移质粒，所述表达盒侧翼带有包围野生型杆状病毒的多角体蛋白基因的区域，所述转移质粒与野生型AcMNPV杆状病毒的DNA一起，共转染培养的昆虫细胞。通过病毒和质粒DNA之间的同源重组，将编码重组免疫球蛋白轻链的序列转移到病毒基因组中。
3病毒DNA在细胞中复制后，人们接下来选择整合了重组免疫球蛋白轻链序列的重组杆状病毒。
4在接下来的步骤中，将所述细胞用上面获得的重组杆状病毒的DNA和用转移质粒的DNA共转染，所述转移质粒包含携带重组抗体重链的编码基因的表达盒，表达盒的侧翼带有包围杆状病毒P10基因的区域。通过如前所述的同源重组，将重链基因转移到病毒DNA中。
5然后选择能够同时生产免疫球蛋白轻链和重链的双重组病毒。
生产方法的另一个例子是使用在哺乳动物细胞中表达单克隆抗体的病毒或质粒表达载体。
表达单克隆抗体的优选哺乳动物细胞是大鼠YB2/0细胞系，仓鼠CHO细胞系、特别是CHO dhfr-和CHO Lec13细胞系，PER.C6TM(Crucell)，293，K562，NS0，SP2/0，BHK或COS。
另一种生产方法是在转基因生物中表达重组抗体，例如在植物中表达(Ayala M，Gavilondo J，Rodríguez M，Fuentes A，Enríquez G，PérezL，Cremata J，Pujol M.Production of plantibodies in Nicotiana plants(在烟草植物中生产植物抗体).Methods Mol.Biol.2009；483：103-34)或是在转基因动物例如兔子、山羊或猪的乳汁中表达(Pollock，D.P.，J.P.Kutzko，E.Birck-Wilson，J.L.Williams，Y.Echelard and H.M.Meade.(1999)Transgenic milk as a method for the production of recombinantantibodies(转基因乳汁作为生产重组抗体的方法).Journal ofImmunological Methods.231：147-157).
治疗应用
本发明的抗RhD抗体可以用作药物，特别是用于预防Rh阴性个体的猕因子同种异体免疫。抗D免疫球蛋白在体内的作用方式是所述抗体与Rh(D)阳性红血球的D抗原特异性结合，然后在脾中从循环中基本上清除掉这些红血球。这种清除与抑制个体初次免疫应答的动态机制相联系，因此防止免疫作用。
因此本发明的抗体通过向Rh-D阴性女性施用，特别可用于预防新生儿溶血病。
事实上，本发明的抗体可以预防性使用，用于预防猕因子阴性女性在刚娩出猕因子阳性孩子后的同种异体免疫，并在以后妊娠时预防新生儿溶血病(HDN)；在猕因子D不相容的情况下发生流产或宫外孕时使用，或在猕因子D不相容的情况下因羊膜穿刺术、绒毛膜活组织检查或创伤性产科操作而导致经胎盘出血时使用。
另外，本发明的抗体可以在用血液或不稳定的血液衍生物进行Rh不合输血的情况下使用。
本发明的抗体还可用于预防或治疗特发性血小板减少性紫癜(ITP)。
制剂
本发明的另一个目的因此涉及包含所述抗体作为活性成分与一种或多种可药用赋形剂组合的药物组合物。
在本说明书中，可药用赋形剂应该理解为是指加入药物组合物的化合物或化合物的组合，其不引起副反应并例如便于施用活性成分、增加活性成分在身体内的半衰期和/或效力、增加活性成分在溶液中的溶解度或改善其储存。
这些可药用赋形剂是公知的，并将由本领域技术人员根据性质和所选的活性化合物的施用方法进行采用。
优选，所述制剂以液体形式或冻干形式储存。
可以使用缓冲化合物，例如以碳酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷[(2-氨基-2-羟甲基-1，-3-丙二醇)，TRIS]、甘氨酸和赖氨酸的形式(PDA Journal of Pharmaceutical Science andTechnology，Vol.51(4)，1997：Excipients and their use in injectableproducts(赋形剂及其在可注射产品中的应用)(SANDEEP NEMA，R.J.WASHKUHN，R.J.BRENDEL，pp166-171)。
柠檬酸盐缓冲剂(例如大约30mM)中的抗体组合物已显示出特别稳定。优选制剂的pH为大约5.5至小于7，优选大约6至大约6.5。
发明人已经证明，添加甘露糖醇和NaCl将增加所述抗体的溶解度。一般对甘露糖醇和NaCl的量进行选择，使得得到克分子渗透压浓度为大约300mOsm/kg。
添加非离子聚合物型的表面活性剂、例如聚山梨醇酯80(Tween
Figure BPA00001426321700071
80)或泊洛沙姆188型的泊洛沙姆(Pluronic F68
Figure BPA00001426321700072
或LutrolF68
Figure BPA00001426321700073
)也是有利的，例如以大约200至大约600ppm的量，优选大约300至大约500ppm，优选大约300至大约400ppm。
更具体而言，本发明提供的药物组合物在30mM pH 6.5的柠檬酸盐缓冲剂、甘露糖醇、NaCl和聚山梨醇酯80或泊洛沙姆例如泊洛沙姆188存在下，包含本发明的抗体。
优选的药物组合物在30mM pH6.5的柠檬酸盐缓冲剂、400ppm聚山梨醇酯80或301ppm泊洛沙姆188存在下，令甘露糖醇和NaCl浓度足以达到克分子渗透压浓度300mOsm/kg下，包含本发明的抗体。
在优选的方式中，药物组合物包含大约0.2至大约5g/L抗体，优选大约0.3g/L抗体。
优选，所述抗体通过全身途径施用，特别是通过静脉途径、肌内途径、皮内、腹膜内或皮下途径、或通过口服途径施用。更优选，包含本发明抗体的组合物施用数次，随着时间展开。
施用的方法、其剂量和最佳药物形式可以在要为患者建立定制治疗时通常要考虑的依据的基础上加以确定，例如患者的年龄或体重、他的一般状态的严重度、治疗的耐受性和观察到的副作用。
给出以下实施例和图是为了说明而并非作为限制。
附图说明
图1：载体T125-H26的限制酶图谱。
图2：载体T125-DHFR的限制酶图谱。
图3：载体H416-24的限制酶图谱。
图4：载体T125-Phe68的限制酶图谱。
图5：载体H416-30的限制酶图谱。
图6：载体K416-23的限制酶图谱。
图7：载体HK463-18的限制酶图谱。
图8：构建载体T125-Phe68的示意图。
实施例
实施例1：R297抗体不稳定性的鉴定
R297抗体是由两条重链和两条轻链构成的IgG1四聚体，其包含32个半胱氨酸残基，在重链内(每链4个)、轻链内(每链2个)和链之间(每链4个)形成16个二硫键。R297抗体的重链N-末端还带有Cys68位处的未配对半胱氨酸。这种与链内二硫桥Cys22-Cys96接近的高度反应性游离SH基团的存在，可以引起竞争和分子重排，导致形成新的二硫桥。
发明人现在已经鉴定了R297的二硫桥和可能的分子重排。
这种研究通过在非还原条件下的肽作图而进行，使得其完整性得以保持，并通过MALDI-TOF质谱法(基质辅助激光解吸/飞行质谱的电离时间)鉴定了所生成的肽。
结果导致鉴定了以下二硫桥：轻链的Cys23-Cys88、Cys134-Cys194；重链的Cys22-Cys96、Cys153-Cys209、Cys270-Cys330和Cys376-Cys434。
MALDI质谱揭示了质量为1771.79Da的肽对应于含有二硫桥Cys22-Cys68的二肽[20LSCTASGFTFK30]-[68CTFSR72](SEQ ID No.5)(理论质量1771.81Da)。1771.797Da的亲体离子的MS-MS分析证实了这种二肽的序列是LSCTASGFTFK(SEQ ID No.6)和CTFSR(SEQ IDNo.7)。最后，原位还原之后，该峰减小，代之以613.28和1161.56Da处的两种离子，分别对应于肽[68CTFSR72](SEQ ID No.7)和[20LSCTASGFTFK30](SEQ ID No.6)的理论质量(理论质量：613.28和1161.57Da)。还鉴定了包含未配对Cys96的肽。这些结果加在一起，证明了存在二硫桥Cys22-Cys68。
以相同的方式，MALDI谱揭示了存在质量3658.54Da的肽，对应于含有二硫桥Cys22-Cys96的二肽[73DNSQDTLYLQLNSLRPEDTAVYYCAR99]-[68CTFSR72](SEQ IDNo.8)(理论质量：3658.58Da)。亲体离子的MS-MS分析证实了所述二肽的序列。所述靶标还原后该峰减小，代之以两种质量的离子，对应于肽[68CTFSR72](SEQ ID No.7)和[73DNSQDTLYLQLNSLRPEDTAVYYCAR99](SEQ ID No.9)。还鉴定了包含游离Cys22的肽。这些结果合在一起，证明了存在二硫桥Cys68-Cys96。
MALDI-MS结构分析鉴定了R297的所有链内二硫桥。注意到未配对的Cys68与相邻二硫桥Cys22-Cys96相互作用，形成桥键Cys22-Cys68和Cys68-Cys96。这些分子内重排可以诱导Fab N-末端区域三维结构的改变，并影响对抗原的亲合性和蛋白的免疫原性。这些不同形式的存在因此将需要对它们进行量化，并在开发期间系统控制这些形式在最终产品中的再现性和稳定性。
实施例2：突变抗体的产生
材料和方法
使用传统的分子生物学方法。通过PCR进行诱变，然后通过PCR扩增带有突变的区域，并克隆到居间载体中。最终的载体通过将重链载体克隆到轻链载体中而构建。然后将这样获得的重组质粒导入细菌(细菌的转化)并筛选符合预期序列的序列，然后扩增(细菌培养)选定的克隆，从而得到足够的载体用于转染。然后将细菌培养期间产生的载体进行纯化和线性化，用于转染YB2/0细胞系。
使用以下引物：
引物A2VH11
5’-CTATATCATATGATGGAAGGAATATACAATATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATCACCTTCTC-3’(SEQ ID No.10)
下划线核苷酸：NdeI限制性位点
加框核苷酸：突变的碱基，TGC密码子(编码氨基酸半胱氨酸)突变成TTC密码子(编码氨基酸苯丙氨酸)
这种5′引物位于T125 A2的VH区域，导入G→T突变。
引物GSP2ANP
5’-GGAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG-3’(SEQ ID No11)
这种3′引物(反义)位于T125 A2的G1恒定区的5′部分。
使用以下载体：
-载体T125-H26
该载体包含克隆T125 A2的H转录单位(参见载体图，图1)。
-载体T125-DHFR
该载体包含克隆T125 A2的H和κ转录单位，以及DHFR TU(参见载体图，图2)。
-载体H416-24
该居间重链载体包含克隆T125 A2的H转录单位(参见载体图，图3)。
-H416-30
该重链表达载体在抗体VH可变区中携带C68F突变。它从带有C68F突变的质粒T125-Phe68(载体图，图4)和无内含子的居间载体(载体图，图5)获得。
-载体K416-23
该轻链表达载体包含克隆T125 A2的κ转录单位和DHFR转录单位(参见载体图，图6).
结果：
对来源于克隆T125 A2(来自免疫供体的EBV转化B淋巴细胞)的R297抗D抗体的测序显示了重链可变区(VH)在68位带有半胱氨酸{按照Kabat命名法为67位[Kabat等，″Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学重要的蛋白质的序列)″，NIH Publication，91-3242(1991)]，位于构架区3(FWR3，from Kabat)}。因此所述抗体除了在22和96位(Kabat命名法中的22和92位)上参与二硫桥的两个半胱氨酸之外，还包含另一个半胱氨酸残基。
借助于前面描述的引物，通过对重链载体T125-H26上来自VH序列的3’区域的片段进行PCR扩增，进行诱变。编码氨基酸半胱氨酸的TGC密码子被编码氨基酸苯丙氨酸的TTC密码子替代。
如此获得的VH的这个3′片段与市场上可买到的居间载体(包含来自T125-26的VH 5′片段)中VH的5′片段连接。所产生的Phe68VH片段对应于突变的VH片段，然后将其插入载体T125 DHFR中，产生最终的表达载体T125-Phe68(在图8中图解概括)。
因此载体T125-Phe68包含T125 A2的κ转录单位(TU)和突变的H(F68)转录单位。突变的存在通过测序四个克隆进行验证。
最终表达载体HK463-18(参见载体图，图7)包含T125 A2抗D抗体的突变的H(F68)和κ转录单位(TU)，其通过将轻链载体K416-23(含有用于κ和DHFR的TU)克隆到优化的重链载体H416-30(编码在VH区中带有C68F突变的重链)中而构建。这两种表达载体以前已经用于共转染YB2/0细胞系。
实施例3：突变抗体的功能表征
本研究评价了C68F突变对T125抗D抗体功能活性的作用。
将志愿者供体血液收集到由Rungis的Etablissement Francais duSang(EFS)供应的7mL柠檬酸盐试管中。
-猕因子D阴性红血球(无关ABO血型)。
-猕因子D阳性红血球组O R1R1(最佳抗原密度)。
3.1.研究与Fab片段特定关联的功能
研究D表位识别的特异性
在所用的分析条件下，与非特异性自体荧光对照比较，没有观察到未突变(C68)或突变(F68)抗-D抗体对来自猕因子阴性供体的红血球的结合。这证实了这两种抗体对D表位识别的特异性。
流式细胞术确定抗D特异性活性
未突变(C68)和突变(F68)抗体的特异性活性一致(15％置信区间)。测试的两种抗体的Fab片段功能相似。
用抗D抗体饱和或没有用该抗体的O+R1R1红血球之间的流式细胞术体外竞争研究
在竞争试验条件下，测试的三种抗体的解离常数等同。因此可以得出结论，C68F突变没有影响解离常数。
结论
根据这些数据，未突变(C68)和突变(F68)抗D抗体的抗原特异性和特异性抗D活性一致。因此，Fab片段的功能性(抗原-抗体识别部位)没有表现出被所述C68F突变而改变。
3.2.抗D抗体的Fc和fab片段的体外功能试验
在两个试验中评价未突变(C68)和突变(F68)抗D抗体，所述试验测量了抗体与抗原的结合以及它们的Fc片段与CD16(Fc RIII受体)的接合。
ADCC活性(抗体-依赖性细胞毒性)
未突变(C68)和突变(F68)抗体之间的ADCC活性没有重大差异；用所有这些抗体观察到的溶胞百分比在R297抗体和WinRho多克隆抗体的溶胞百分比之间。为了更准确比较抗体活性，曲线必须借助于PRISM软件来模拟。
未突变(C68)和突变(F68)抗体的Emax值(最大活性时的抗体浓度)分别是46±7ng/mL和48±2ng/mL。未突变(C68)和突变(F68)抗体的EC50(产生50％最大活性时的抗体浓度)分别是20±3ng/mL和21±2ng/mL。
曲线模拟以及Emax和EC50值表明C68F突变对抗体的ADCC活性没有影响。
CD16活化
未突变(C68)和突变(F68)抗体的CD16活化百分比分别是104±7％和100±16％。
结论
这些数据表明ADCC活性和CD16活化不因C68F突变而改变。
这些不同试验的结果表明，由Fab结构域(特异性，特异性活性，解离)和Fc结构域(ADCC，CD16活化)所携带的T125A2抗D抗体功能不因C68F突变而改变。
实施例4：突变和未突变克隆的比较性结构研究
未突变(C68)和突变(F68)抗D抗体中聚糖的表征通过HPCE-LIF(高效毛细管电泳-激光感生荧光)进行。
未突变(C68)和突变(F68)抗D抗体的聚糖图谱具有类似特征，显示出两个分支的、非唾液酸化、非半乳糖基化、岩藻糖基化或未岩藻糖基化的形式(G0F，G0)和单半乳糖基化的、岩藻糖基化或未岩藻糖基化的形式(G1F，G1)。主要的形式总是非半乳糖基化类型(G0)。岩藻糖基化形式的百分比有差异，在突变(F68)抗D抗体中较低。所述突变结构在二等分位置、即两个分支之间还包含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基。这些二等分GlcNAc结构在未突变(C68)抗D抗体中不存在。
这些结构在岩藻糖基化程度上有差异，并且二等分GlcNAc没有影响ADCC活性或CD16活化。糖基化特征中的差异可能与所述突变无关。事实上，在YB2/0细胞系中产生的不同单克隆抗体的研究表明，糖基化特征在不同的克隆中、而且对于相同的克隆而言根据培养时间而广为改变。
通过PCR产生在T125 A2克隆的重链可变区中68位半胱氨酸→苯丙氨酸突变(C68F)。从T125-Phe68质粒扩增带有G→T点突变的重链可变区序列，并且克隆到优化的重链载体H416-30中。然后，从H416-30重链载体和K416-23轻链载体构建单一表达载体HK463-18。通过FDA质量测序检查突变的存在。因此可以在YB2/0细胞系中产生来源于这种单一载体的突变F68抗体。
功能分析显示，抗原识别的特异性、抗D特异性活性和解离常数没有因C68F突变而改变。此外，ADCC活性和CD16活化没有受到影响。
在未突变(C68)和突变(F68)克隆之间有一些结构差异。突变(F68)克隆在二等分位置中的岩藻糖基化程度较低并具有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。糖基化特征中的这种差异没有影响抗体功能性，因此可能与C68F突变无关。
总之，带有C68F突变的本发明抗D抗体与T125 A2克隆的R297抗体具有相似的功能性。
实施例5：抗体制剂
制备以下制剂。
Figure BPA00001426321700161
  成分   浓度
  本发明抗体   0.3g/L
  柠檬酸盐缓冲剂   30mM
  甘露糖醇   17g/L
  NaCl   3.25g/L
  聚山梨醇酯80   400ppm
pH＝6.5
Figure BPA00001426321700162
pH＝6,5
所述制剂进行为期数月的稳定性试验。稳定性判据包括经常目测检查包含所述制剂的瓶子(评价颜色、乳浊度和可能存在的颗粒物质)、控制pH、克分子渗透压浓度、评价抗体降解(在还原和非还原条件下通过SDS PAGE)、控制可能的抗体聚集。还通过IEF(等电聚焦)和HPSEC(高效体积排阻色谱法)进行了纯度试验。通过RP-HPLC测定氧化状态。
所述制剂在5℃下稳定12个月，在25℃下稳定至少4个月。
Figure IPA00001426321200011
Figure IPA00001426321200031
Figure IPA00001426321200041
Figure IPA00001426321200061
Figure IPA00001426321200071
Figure IPA00001426321200081
Figure IPA00001426321200101
Figure IPA00001426321200111
Figure IPA00001426321200121

Claims (16)

1.抗RhD单克隆抗体，其是由两条重链和两条轻链构成的四聚体IgG1免疫球蛋白，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID No.2，和所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID No.4。
2.编码抗体重链的核酸，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID No.2。
3.表达载体，其包含如权利要求2中限定的核酸。
4.宿主细胞，其用权利要求3的载体转染。
5.生产权利要求1的抗体的方法，所述方法包含以下步骤：a)在适当的培养基和培养条件中培养表达包含序列SEQ ID No.2的抗体重链、和包含序列SEQ ID No.4的抗体轻链的宿主细胞；和b)从培养基或从所述培养细胞回收所述产生的抗体。
6.权利要求1的抗体，其作为药物。
7.药物组合物，其包含权利要求1的抗体与可药用赋形剂的组合。
8.权利要求7的组合物，其包含柠檬酸盐缓冲剂。
9.权利要求7或8的组合物，其包含非离子型表面活性剂。
10.权利要求7至9任一项的组合物，其包含30mM pH 6.5的柠檬酸盐缓冲剂、聚山梨醇酯80或泊洛沙姆、甘露糖醇和NaCl。
11.权利要求10的组合物，其包含30mM pH 6.5的柠檬酸盐缓冲剂、400ppm聚山梨醇酯80、17g/L甘露糖醇和3.25g/L NaCl。
12.权利要求10的组合物，其包含30mM pH 6.5的柠檬酸盐缓冲剂、301ppm泊洛沙姆188、17g/L甘露糖醇和3.25g/L NaCl。
13.权利要求10至12任一项的组合物，其中抗体浓度是0.3g/L。
14.权利要求1的抗体，其用于预防Rh阴性个体的猕因子同种异体免疫。
15.权利要求14的抗体，其通过向RhD阴性女性施用，用于预防新生儿溶血病。
16.权利要求1的抗体，其用于预防或治疗特发性血小板减少性紫癜(ITP)。
CN201080010868.XA 2009-03-06 2010-03-05 抗猕因子d单克隆抗体 Expired - Fee Related CN102341121B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0951412A FR2942799B1 (fr) 2009-03-06 2009-03-06 Anticorps monoclonal anti-rhesus d
FR0951412 2009-03-06
PCT/FR2010/050376 WO2010100383A1 (fr) 2009-03-06 2010-03-05 Anticorps monoclonal anti-rhesus d

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102341121A true CN102341121A (zh) 2012-02-01
CN102341121B CN102341121B (zh) 2015-07-08

Family

ID=40902101

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080010868.XA Expired - Fee Related CN102341121B (zh) 2009-03-06 2010-03-05 抗猕因子d单克隆抗体

Country Status (16)

Country Link
US (1) US8404241B2 (zh)
EP (1) EP2403529B1 (zh)
JP (1) JP5474100B2 (zh)
KR (1) KR101297343B1 (zh)
CN (1) CN102341121B (zh)
AR (1) AR076083A1 (zh)
AU (1) AU2010219518B2 (zh)
BR (1) BRPI1009241B1 (zh)
CA (1) CA2753700C (zh)
DK (1) DK2403529T3 (zh)
ES (1) ES2533528T3 (zh)
FR (1) FR2942799B1 (zh)
IL (1) IL214755A (zh)
PL (1) PL2403529T3 (zh)
TW (1) TWI441921B (zh)
WO (1) WO2010100383A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2830658T (pt) * 2012-03-26 2018-12-28 Sanofi Sa Formulações de agente de ligação igg4 estável
US9592289B2 (en) 2012-03-26 2017-03-14 Sanofi Stable IgG4 based binding agent formulations
CN105121471A (zh) * 2013-04-16 2015-12-02 豪夫迈·罗氏有限公司 帕妥珠单抗变体及其评估
CN114409791B (zh) * 2022-01-26 2023-01-24 南京医科大学 一种全人源抗人红细胞RhD全分子IgG及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6171586B1 (en) * 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2807767B1 (fr) * 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
FR2861079B1 (fr) * 2003-10-20 2007-09-28 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation de cations metalliques divalents pour l'amelioration de l'activite fonctionnelle des anticorps.
EP1967529A1 (en) * 2004-07-20 2008-09-10 Symphogen A/S Anti-rhesus D recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture
UY29504A1 (es) * 2005-04-29 2006-10-31 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos contra el péptido amiloide beta y métodos que utilizan los mismos.
WO2006127517A2 (en) * 2005-05-20 2006-11-30 Genentech, Inc. Pretreatment of a biological sample from an autoimmune disease subject
BRPI0610470A2 (pt) * 2005-05-26 2010-06-22 Seattle Genetics Inc anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antìgeno que especificamente se liga a cd40 humano, kit, composição farmacêutica, e, polinucleotìdeo isolado
JP5456658B2 (ja) 2007-03-30 2014-04-02 メディミューン，エルエルシー 抗体製剤

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6171586B1 (en) * 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RÉMI URBAIN ET AL.: "Les anticorps EMABling® De la prophylaxie de l’allo-immunisation foeto-maternelle au traitement de la leucémie lymphoïde chronique", 《MEDECINE/SCIENCE》, vol. 25, no. 12, 15 December 2009 (2009-12-15), pages 1141 - 1143 *
TONI PRICE ET AL.: "GUIDANCE EXECUTIVE (GE) ：Review of TA156 pregancy-routine anti-D prophylaxis for rhesus negative women(review of TA41)", 《NATIONAL INSTITUTE FOR HEALTH AND CLINICAL EXCELLENCE》, 31 August 2008 (2008-08-31), pages 2 - 7 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL2403529T3 (pl) 2015-07-31
CN102341121B (zh) 2015-07-08
KR20110140125A (ko) 2011-12-30
IL214755A0 (en) 2011-11-30
CA2753700C (fr) 2014-04-22
DK2403529T3 (en) 2015-04-13
AU2010219518B2 (en) 2012-09-20
JP5474100B2 (ja) 2014-04-16
AU2010219518A1 (en) 2011-10-20
TW201043693A (en) 2010-12-16
IL214755A (en) 2017-03-30
KR101297343B1 (ko) 2013-08-20
US8404241B2 (en) 2013-03-26
AR076083A1 (es) 2011-05-18
US20110311556A1 (en) 2011-12-22
TWI441921B (zh) 2014-06-21
FR2942799B1 (fr) 2011-02-25
EP2403529A1 (fr) 2012-01-11
ES2533528T3 (es) 2015-04-10
BRPI1009241A2 (pt) 2016-10-11
WO2010100383A1 (fr) 2010-09-10
CA2753700A1 (fr) 2010-09-10
JP2012519478A (ja) 2012-08-30
FR2942799A1 (fr) 2010-09-10
BRPI1009241B1 (pt) 2019-11-05
EP2403529B1 (fr) 2014-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2359585T3 (es) Método para la producción de anticuerpos en un animal inmunodeficiente en el que se han inyectado células madre de hígado fetal humano.
TW201726166A (zh) 對人類cd19具專一性之抗體藥劑及其用途
JP2019536734A (ja) ヘテロダイマーＦｃ融合サイトカインおよびそれを含む医薬組成物
JP2015522526A5 (zh)
TW201311893A (zh) 使用包含第一型ｍｈｃ之複合體透過循環病毒特異性毒殺ｔ細胞以移除標的細胞之方法
CN109963876A (zh) 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备
US11414496B2 (en) Anti-CD38 binding domains
CN102341121B (zh) 抗猕因子d单克隆抗体
WO2023274183A1 (zh) Cd16抗体及其应用
CN107108750A (zh) 细胞表面上非共价含Fc结构域的蛋白质展示的方法
EP2951284B1 (en) Recombinant yeast transformant and process for preparing immunoglobulin fc fragment employing the same
CN104350068B (zh) 生产型细胞系的增强子
CN116648256A (zh) 稳定化的tcr构建体及使用方法
CN105531289A (zh) 抗cd83抗体及其用途
CA3214757A1 (en) Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
JP2022531552A (ja) プラスモジウムスポロゾイト周囲タンパク質に結合する抗体、及びその使用
US20220040232A1 (en) Materials and methods for producing bioengineered virus specific lymphocytes
Lam et al. A high frequency of hybridomas from M54 μ heavy chain transgenic mice initially co-express transgenic and rearranged endogenous μ genes
CN111253486A (zh) 抗pd-1抗体及其用途
US20240209107A1 (en) Cd28/ox40 bispecific antibodies
PAYAM et al. Immunologic basis and immunoprophylaxis of RhD induced hemolytic disease of the newborn (HDN)
JP2024526122A (ja) 抗イヌｃｄ２０抗体
WO2024081381A1 (en) Multifunctional molecules binding to tcr and uses thereof
CN118146376A (zh) Hla-g抗体及其制备方法和用途
CN115947855A (zh) 抗cd24抗体的制备及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: FRENCH LABORATORY FOR FRACTIONATION AND BIOTECHNOL

Free format text: FORMER OWNER: LFB BIOTECHNOLOGIES

Effective date: 20130802

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20130802

Address after: French les ouless

Applicant after: LABORATOIRE FRANCAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES

Address before: The French Lai Li

Applicant before: LFB Biotechnologies

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150708