CN102323353A

CN102323353A - 一种检测脂质体药物中有机溶剂残留的方法

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Publication number: CN102323353A
Application number: CN201110234565A
Authority: CN
Inventors: 陈玉双; 郑玉林; 沈宏一; 胡旭华; 黄君勤; 汤德平
Original assignee: Shanghai Xinya Pharmaceutical Industry Co Ltd; SHANGHAI XINXIANFENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Shanghai Xinya Pharmaceutical Industry Co., Ltd.
Priority date: 2011-08-16
Filing date: 2011-08-16
Publication date: 2012-01-18

Abstract

本发明涉及一种检测脂质体药物中有机溶剂残留的方法，尤其是涉及用气相色谱同时检测药物中甲醇、乙醇、三氯甲烷残留的方法，其中，采用内标法同时检测出脂质体制剂中甲醇、乙醇、三氯甲烷三种有机溶剂残留量，其中，色谱条件为：色谱柱HP-1（60m×0.53mm×5.0um），柱温170℃，进样口温度200℃，检测温度250℃，载气N₂，分流比12：1，柱头压6psi，采用顶空进样法的进样方式，孵化时间20min，孵化温度80℃；选用正丙醇为内标物。采用气相色谱法同时检测甲醇、乙醇、三氯甲烷含量，灵敏度高，重复性好，精确度高；本发明方法适合脂质体药物中甲醇，乙醇，三氯甲烷残留的检测。

Description

一种检测脂质体药物中有机溶剂残留的方法

技术领域

本发明涉及一种检测脂质体药物中有机溶剂残留的方法，尤其是涉及用气相色谱同时检测药物中甲醇、乙醇、三氯甲烷残留的方法。

背景技术

脂质体最初是由英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均为脂质的双分子层；囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为4纳米。后来，将这种具有类似生物膜结构的双分子小囊称为脂质体。

脂质体是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。它可以将药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的微粒中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。

脂质体常用辅料通常可分为3类：

1、在体内可生物降解、生物吸收的天然材料，如明胶、蛋白质、淀粉、磷脂、胆固醇等。

2、在体内不可生物降解的半合成材料，如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素盐、羟丙甲纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素等。

3、合成材料，分为在体内可生物降解与不可生物降解两类。可生物降解材料应用较广的如聚乳酸、聚氨基酸、聚羟基丁酸酯、乙交酯-丙交酯共聚物、聚氰基丙烯酸烷酯等；不可生物降解的材料如聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸树脂等。

在脂质体制剂的制备过程中，需要将辅料和活性成分药物溶解于有机溶剂中，辅料形成脂质体将活性成分药物包裹在内部，再将有机溶剂通过过滤、旋转蒸发或冻干等方式去除。

药品中的残留溶剂是指在原料药、制剂生产中所使用却没有完全除去的有机溶剂。如果药品中含有的残留有机溶剂浓度高于安全值，患者服用后会对人体产生危害。人用药物注册技术要求国际协调会（ICH）的指导原则中，将药品生产中常用的溶剂按照危害程度分为四类，并规定了每种溶剂的限值。我国2010版药典也规定了“在生产过程与贮藏期间控制质量应检查的项目”中，需要对有害有机溶剂限度进行检查，对甲醇、乙醇、三氯甲烷限度要求分别为不高于0.3%，0.5%，0.006%。

但是，对于有机溶剂残留的检测方法，我国2010版药典中只有指导方法并没有针对具体化合物的检测方法。此外，由于有机溶剂的种类众多，而且每种药物在制备成制剂的过程中所使用的有机溶剂种类有所不同。这就导致了针对不同的有机溶剂种类和数量，选择不同的色谱柱和不同的测定方法，会产生多种多样的色谱条件。

本发明针对在脂质体制剂中，由制备工艺引入的甲醇、乙醇、三氯甲烷三种有机溶剂残留，利用气相色谱法，并选择在合适的色谱条件下同时检测这三种有机溶剂的含量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种检测脂质体药物中有机溶剂残留的方法，利用气相色谱法简便、快速、准确的同时检测出存在于脂质体制剂中的甲醇、乙醇、三氯甲烷三种有机溶剂残留量。

本发明通过下列技术方案解决上述技术问题：

一种检测脂质体药物中有机溶剂残留的方法，用气相色谱同时检测脂质体制剂中甲醇、乙醇、三氯甲烷三种有机溶剂残留量，其步骤具体为：

1、色谱条件

色谱柱：HP-1（60m×0.53mm×5.0um）；

柱温：170℃；

进样口温度：200℃；

检测温度：250℃；

载气：N₂，分流比12：1，柱头压6psi；

进样方式：顶空进样法；

孵化时间：20min；

孵化温度：80℃；

2、样品测定，采用内标法，选用正丙醇为内标物，其具体步骤为：

（一）系统适用性实验

取甲醇、乙醇、三氯甲烷对照品溶液，正丙醇内标溶液和四者的混合对照品溶液，分别进样，绘制图谱；

（二）精密度实验

分别取甲醇、乙醇、三氯甲烷对照品溶液和正丙醇内标溶液混合，进样，计算各对照品与内标峰面积之比的相对标准偏差RSD；

（三）线性实验

分别取甲醇、乙醇、三氯甲烷对照品溶液，等比例稀释后，以正丙醇为内标物，进样，以甲醇，乙醇，三氯甲烷对照品的峰面积为纵坐标，以三者浓度为横坐标建立线性回归曲线；

（四）回收率实验

取脂质体药物适量，精密称量，分别加入甲醇，乙醇，三氯甲烷对照品溶液及正丙醇内标溶液作为回收率样品溶液，进样，记录色谱图，计算回收率；

回收率%=

（五）检测限及定量限实验

依次分别用25%N，N-二甲基甲酰胺稀释甲醇，乙醇，三氯甲烷对照品溶液，以信噪比S／N=3计算检测限，以信噪比S／N=10计算定量限；

（六）样品检验

取脂质体药物适量，精密称量，加入内标溶液，加二甲亚砜溶解制成供试品溶液，甲醇、乙醇、三氯甲烷对照品溶液和供试品溶液分别进样，记录色谱图，按内标法以峰面积计算药物中甲醇、乙醇、三氯甲烷的含量。

本发明的优点在于：

一、采用气相色谱法同时检测甲醇、乙醇、三氯甲烷含量，灵敏度高，重复性好，精确度高；

二、本发明方法适合脂质体药物中甲醇，乙醇，三氯甲烷残留的检测。

附图说明

图1 为甲醇系统适应性实验气相色谱图；

图2 为乙醇系统适应性实验气相色谱图；

图3 为三氯甲烷系统适应性实验气相色谱图；

图4 为正丙醇系统适应性实验气相色谱图；

图5 为甲醇、乙醇、三氯甲烷和正丙醇混合系统适应性实验气相色谱图；

图6 为精密度实验气相色谱图；

图7 为甲醇线性实验气相色谱图1；

图8 为乙醇线性实验气相色谱图1；

图9 为三氯甲烷线性实验气相色谱图1；

图10 为甲醇定量限实验气相色谱图；

图11 为甲醇检测限实验气相色谱图；

图12 为乙醇定量限实验气相色谱图；

图13 为乙醇检测限实验气相色谱图；

图14 为三氯甲烷定量限实验气相色谱图；

图15 为三氯甲烷检测限实验气相色谱图；

图16 为两性霉素B脂质体样品残留溶剂测定实验气相色谱图；

图17 为阿霉素脂质体样品残留溶剂测定实验气相色谱图；

图18 为多西他赛脂质体样品残留溶剂测定实验气相色谱图；

图19甲醇对照品浓度为横坐标建立线性回归线；

图20乙醇对照品浓度为横坐标建立线性回归线；

图21三氯甲烷对照品浓度为横坐标建立线性回归线。

具体实施方式

实施例1

1、仪器与试药

仪器：Agilent6890气相色谱仪，检测器FID；Agilent色谱工作站；

试药：所用试剂均为色谱纯；两性霉素B脂质体（批号：试LM101207，由上海新先锋药业有限公司提供）。

2、色谱条件

色谱柱：HP-1（60m×0.53mm×5.0um）；

柱温：170℃；

进样口温度：200℃；

检测温度：250℃；

载气：N₂，分流比12：1，柱头压6psi；

进样方式：顶空进样法；

孵化时间：20min；

孵化温度：80℃；

3、溶液配制

精密称取甲醇、乙醇、三氯甲烷各100mg、50mg、50mg，加25%N，N-二甲基甲酰胺溶解于100ml容量瓶中，制成浓度为每1ml中分别含甲醇1mg、乙醇0.5mg、三氯甲烷0.5mg的溶液，作为甲醇、乙醇、三氯甲烷的对照品贮备液。

精密称取正丙醇250mg，加25%N，N-二甲基甲酰胺溶解于100ml容量瓶中，制成每1ml中含正丙醇2.5mg的溶液，作为内标贮备液。

取甲醇、乙醇、三氯甲烷对照品贮备液和正丙醇内标贮备液各20ml，混合均匀，制成混合贮备液。

4、样品测定

1）系统适用性实验：

精密称取甲醇、乙醇、三氯甲烷、正丙醇贮备液、混合贮备液各4、4、4、2、16ml分别置于5 个100ml容量瓶内，用25%N，N-二甲基甲酰胺定容。各取10ml，顶空进样。

在上述色谱条件下各组分可以得到较好的分离，各组分保留时间及分离度见表1，系统适用性图谱见附图1 为甲醇系统适应性实验气相色谱图、图2 为乙醇系统适应性实验气相色谱图、图3 为三氯甲烷系统适应性实验气相色谱图、图4 为正丙醇系统适应性实验气相色谱图和图5为甲醇、乙醇、三氯甲烷和正丙醇混合系统适应性实验气相色谱图。

表1 各组分保留时间及分离度测定结果

组分名称	保留时间（min）	分离度
			甲醇	5.6	完全分离
乙醇	6.3	完全分离
			三氯甲烷	9.2	完全分离
正丙醇	7.8	完全分离

2）精密度实验：

精密称取甲醇、乙醇、正丙醇、三氯甲烷储备液各4、4、2、4ml置同一100ml容量瓶内，25%N，N-二甲基甲酰胺定容。取10ml，顶空进样。连续进样6针，计算各对照品与内标峰面积之比的RSD。图6 为精密度实验气相色谱图。

表2 精密度实验数据结果表

	1	2	3	4	5	6	平均值	RSD
									甲醇	6.81	6.72	6.64	6.72	6.78	7.04
乙醇	6.38	6.32	6.37	6.51	6.47	6.52
									正丙醇	19.71	19.67	19.80	19.98	20.00	20.29
三氯甲烷	27.94	29.71	30.65	31.15	29.98	29.18
									甲醇/正丙醇	0.335	0.337	0.335	0.332	0.337	0.340	0.336	0.73
乙醇 /正丙醇	0.325	0.321	0.325	0.327	0.327	0.321	0.324	0.77
									三氯甲烷/正丙醇	1.396	1.444	1.477	1.508	1.447	1.421	1.449	2.50

结果RSD（n=6）都在5％以内。

3）线性实验

精密取甲醇，乙醇，三氯甲烷，正丙醇对照品贮备液，用移液管在5个50ml容量瓶中依次加入0.5ml，1ml，2ml，4ml，8ml的甲醇，另5个50ml容量瓶中依次加入0.5ml，1ml，2ml，4ml，8ml的乙醇，又另外5个50ml容量瓶中依次加入0.5ml，1ml，2ml，4ml，8ml的三氯甲烷对照品贮备液，再在15个容量瓶中分别加入1ml正丙醇对照品贮备溶液，再用25%N，N-二甲基甲酰胺定容至刻度并混匀。顶空进样，每个溶液连续进样2次。以对照品峰面积为纵坐标，甲醇，乙醇，三氯甲烷对照品浓度为横坐标建立线性回归线。图7 为甲醇线性实验气相色谱图1，图8 为乙醇线性实验气相色谱图1，图9 为三氯甲烷线性实验气相色谱图1。

甲醇的回归方程为y = 0.0083x- 0.0016，相关系数为1，可见甲醇在浓度为10.5-168ug/ml范围内有良好的线性关系。见图19甲醇对照品浓度为横坐标建立线性回归线。

乙醇的回归方程为y = 0.136x- 0.0161，相关系数为0.9998，可见乙醇在浓度为5.32-212.8ug/ml范围内有良好的线性关系。见图20乙醇对照品浓度为横坐标建立线性回归线。

三氯甲烷的回归方程为y = 0.0756x+ 0.183，相关系数为0.9994，可见三氯甲烷在浓度为6.7-107.2ug/ml范围内有良好的线性关系。见图21三氯甲烷对照品浓度为横坐标建立线性回归线。

4）回收率实验

精密称量两性霉素 B脂质体100mg共9份，分别加入甲醇对照品贮备液2.5，5，10ml，乙醇对照品贮备液5，10，20ml，三氯甲烷对照品贮备液2.5，5，10ml及正丙烷内标贮备液5ml，用25%N，N-二甲基甲酰胺稀释后作为回收率样品溶液，顶空进样10ml。记录色谱图，由测得量和加入量计算回收率。可接受的回收率应在90-110%（100±10%）。测定结果见表3。

回收率%=

表3 回收率试验测定结果

Figure 2011102345652100002DEST_PATH_IMAGE003

回收率结果以及RSD均符合要求。

5）检测限及定量限实验

以信噪比S／N=3计算检测限，以信噪比S／N=10计算定量限，依次分别稀释甲醇、乙醇、三氯甲烷的对照品储备液至0.313*10^-6mg/ml，1.25*10^-6 mg/ml， 1.25*10^-6 mg/ml。见图10 为甲醇定量限实验气相色谱图、图11 为甲醇检测限实验气相色谱图、图12 为乙醇定量限实验气相色谱图、图13 为乙醇检测限实验气相色谱图、图14 为三氯甲烷定量限实验气相色谱图和图15 为三氯甲烷检测限实验气相色谱图。

表4 甲醇、乙醇、三氯甲烷检测限、定量限结果表

	检测限mg/ml	定量限mg/ml
			甲醇	0.625*10^-6mg/ml	2.5*10^-6
乙醇	2.5*10^-6 mg/ml	10.0*10^-6
			三氯甲烷	2.5*10^-6 mg/ml	10.0*10^-6

6）样品检验结果

取两性霉素B脂质体，精密称定，加入内标贮备液1ml，加二甲亚砜溶解并制成每1ml中含100mg的溶液，作为供试品溶液。精密吸取甲醇、乙醇、三氯甲烷对照品贮备液各2ml，内标溶液1ml，加25%N，N-二甲基甲酰胺定容到50ml容量瓶内，作为对照品溶液。精密吸取供试品和对照品溶液各10ml，顶空进样，记录色谱图，见图16 为两性霉素B脂质体样品残留溶剂测定实验气相色谱图，按内标法以峰面积计算，含甲醇不得过0.3%、乙醇不得过0.5%、三氯甲烷不得过0.006%。

照上述方法检测样品的残留溶剂，甲醇0.02%，乙醇0.02%，三氯甲烷0%。

实施例2

仪器：Agilent6890气相色谱仪，检测器FID；Agilent色谱工作站；

试药：所用试剂均为色谱纯；阿霉素脂质体（批号：试RM110502，由上海新先锋药业有限公司提供）。

取阿霉素脂质体，精密称定，加入内标贮备液1ml，加二甲亚砜溶解并制成每1ml中含100mg的溶液，作为供试品溶液。顶空进样10ml，记录色谱图，见图17 为阿霉素脂质体样品残留溶剂测定实验气相色谱图，按内标法以峰面积计算，含甲醇不得过0.3%、乙醇不得过0.5%、三氯甲烷不得过0.006%。

其他与实施例1相同。

按照上述方法检测样品的残留溶剂，甲醇0.03%，乙醇0.05%，三氯甲烷0%。

实施例3

仪器：Agilent6890气相色谱仪，检测器FID；Agilent色谱工作站；

试药：所用试剂均为色谱纯；多西他赛脂质体（批号：DX110104，由上海新先锋药业有限公司提供）。

取多西他赛脂质体，精密称定，加入内标贮备液1ml，加二甲亚砜溶解并制成每1ml中含100mg的溶液，作为供试品溶液。顶空进样10ml，记录色谱图，见图18 为多西他赛脂质体样品残留溶剂测定实验气相色谱图，按内标法以峰面积计算，含甲醇不得过0.3%、乙醇不得过0.5%、三氯甲烷不得过0.006%。

其他与实施例1相同。

按照上述方法检测样品的残留溶剂，甲醇0.06%，乙醇0.04%，三氯甲烷0%。

Claims

1.一种检测脂质体药物中有机溶剂残留的方法，用气相色谱内标法进行检测，其特征在于，同时检测出脂质体制剂中甲醇、乙醇、三氯甲烷三种有机溶剂残留量，其中，色谱条件为：色谱柱HP-1（60m×0.53mm×5.0um），柱温170℃，进样口温度200℃，检测温度250℃，载气N₂，分流比12：1，柱头压6psi，采用顶空进样法的进样方式，孵化时间20min，孵化温度80℃；选用正丙醇为内标物，进行样品测定的步骤为：

回收率%=

Figure 2011102345652100001DEST_PATH_IMAGE002

检测限及定量限实验，依次分别用25%N，N-二甲基甲酰胺稀释甲醇，乙醇，三氯甲烷对照品溶液，以信噪比S／N=3计算检测限，以信噪比S／N=10计算定量限；

2.根据权利要求1所述的检测脂质体药物中有机溶剂残留的方法，其特征在于，用色谱纯两性霉素B脂质体为样品，配制所述的甲醇、乙醇、三氯甲烷对照品溶液，取甲醇、乙醇、三氯甲烷各100mg、50mg、50mg，加25%N，N-二甲基甲酰胺溶解于100ml容量瓶中，制成浓度为每1ml中分别含甲醇1mg、乙醇0.5mg、三氯甲烷0.5mg的溶液，作为甲醇、乙醇、三氯甲烷的对照品溶液。

3.根据权利要求1所述的检测脂质体药物中有机溶剂残留的方法，其特征在于，所述的正丙醇内标溶液的配制，取正丙醇250mg，加25%N，N-二甲基甲酰胺溶解于100ml容量瓶中，制成每1ml中含正丙醇2.5mg的溶液。

4.根据权利要求1所述的检测脂质体药物中有机溶剂残留的方法，其特征在于所述的甲醇、乙醇、三氯甲烷和正丙醇的混合对照品溶液的配制，分别取甲醇、乙醇、三氯甲烷对照品溶液和正丙醇内标溶液各20ml，混合均匀制成四者的混合对照品溶液。