CN102307907A - 胺化的半纤维素分子及其产生方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水溶性碳水化合物还原性胺化的方法。胺化的水溶性碳水化合物是进一步修饰纤维素的先决条件。该分子的合成包括提供水溶性碳水化合物、胺和还原剂，使其在酸性条件下反应，分离得到胺化的水溶性碳水化合物，其产率大于60％。本发明还涉及分子量至少为1kDa的胺化的半纤维素分子，特别是木葡聚糖(xyloglucan)。

Description

胺化的半纤维素分子及其产生方法

技术领域

本发明涉及水溶性碳水化合物还原性胺化的方法。该分子的合成包括提供水溶性碳水化合物、胺和还原剂，使其在酸性条件下反应以得到胺化的水溶性碳水化合物，其产率大于60％。本发明还涉及分子量至少为1.0kDa的胺化的半纤维素分子，特别是木葡聚糖。

发明背景

还原性胺化是涉及羰基通过中间体亚胺转化为胺的化学反应。羰基最常为酮或醛。具有还原性末端(半缩醛)的碳水化合物也可进行还原性胺化，见方案1。

具有还原性末端的碳水化合物的还原性胺化可以一锅法(one pot)进行，其中亚胺形成与还原同时发生。这被称为直接还原性胺化，并用在水中稳定并且在酸性条件下具有反应性的还原剂进行，例如氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)，见方案1。

许多应用中需要碳水化合物还原性胺化的方法。一个实例是用还原性胺化修饰木葡聚糖(xyloglucan)和木葡聚糖寡糖(xyloglucanoligosaccharide)，其可进一步用于纤维素或纤维素材料的修饰。

在专利文献(如Charmot等的发明US7030187)中，描述了用聚合物修饰纤维素材料的方法。该专利讨论了一种还原性胺化的途径，其中纤维素材料的末端葡萄糖残基用硼氢化钠或氰基硼氢化钠转化为胺，并在高压下用氢还原(根据4篇参考文献：Danielsson等、Larm等、WO98/15566和EP 0725082)。

佐治亚大学的发明人证明，可用化学连接至木葡聚糖的染料将织物染色(US2006/0242770)。该方法通过还原性胺化将氨基染料连接至木葡聚糖寡糖(xyloglucan oligosaccharide，XGO)的还原性末端。

在所有获得修饰的纤维素材料的已描述方法中，均需要通过还原性胺化得到还原性末端被修饰的木葡聚糖(xyloglucan，XG)或木葡聚糖寡糖(XGO)。该方法必须非常有效，具有高产率和低成本。方案2显示了木葡聚糖片段的还原性胺化。

碳水化合物还原性胺化的现有方法

用于将分子引入碳水化合物的常用标准方法是还原性胺化，其中碳水化合物的还原性末端通过过量的伯胺转化成亚胺，然后亚胺还原得到胺。

为了一步得到还原性末端的游离伯胺(1-氨基-1-脱氧糖)，通常用铵盐和还原剂(例如氰基硼氢化钠)处理所述碳水化合物。方案3显示了用碳酸铵和氰基硼氢化钠进行的木葡聚糖片段的还原性胺化。

这些将木葡聚糖寡糖进行还原性胺化的方法产率低(2-50％)，而且反应时间长约为6-20天。Danielsson和Grey，1986；Fry等，Plant J.1997；Bourquin等，Plant cell.，2002；和Brumer等，J.Am.Chem.Soc.2004。

纯化方法也耗时并昂贵，而且不适于大规模合成。XGO的还原性胺化通常在水中用大量过量的铵盐和还原剂(100-150当量的碳酸氢铵和10-20当量的氰基硼氢化钠)进行，Brumer等，J.Am.Chem.Soc.2004。这些盐必须通过离子交换层析、体积排阻层析或透析从反应混合物中去除，在大型工业情况下应用这些很昂贵。

一些作者指出使用有机伯胺时初始反应物的pH很重要。在US2006/0242770中，用醋酸使反应变为酸性获得3-4的pH，在该美国专利申请的一个实验中，使用了3.85的pH。根据Evangelista等，1996，pH应在低于3，这通过添加醋酸达到。Yoshida和Lee 1994使用冰醋酸在他们的反应设置中达到6-9的pH，最佳pH为7。此外，Schwartz和Gray 1977证明最佳pH范围是8-9。这部分的反应在升高的温度下进行。

这些步骤的每一步均被酸催化，并且酸存在时速度提高(Evangelista等，1996)本身并不是出人意料的。然而，对糖进行有效的还原性胺化所需的酸性程度比简单的醛所需的大得多，这提示酸催化是必须的。在酸性条件下还原剂(例如氰基硼氢化钠)的反应性也提高。

应注意，文献中许多还原性胺化是对单糖(如甘露糖、葡萄糖、NAc-葡萄糖、半乳糖)或二糖(如乳糖)进行的。仅有几个实例使用了更大的寡糖，如三糖和四糖。

表1是一些几个现有方法的概要。

没有现有方法具有在可接受的低成本下对工业规模而言充足的产率。因此，需要以生产高再现性和高产率生产还原性末端被胺化的碳水化合物的方法。而且碳水化合物的还原性胺化需要以低成本完成。

发明概述

开发了一种水溶性碳水化合物还原性胺化的新方法，其比现有的标准方法更佳。所述合成是一锅法方法，其中溶解所述碳水化合物，然后在还原条件下将其与胺(如苄胺、4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸(一种荧光增白剂(optical brightening agent，OBA))、4-硝基苯胺、十二烷胺或烯丙胺)反应。在该方法开发过程中，意想不到的是产率会高于60％，甚至高至89％-98％。生成了分子量至少为1kDa的胺化的半纤维素分子，特别是木葡聚糖。

本发明参照以下附图描述：

图1.现有技术的反应方案1

图2.本发明的反应方案2

图3.现有技术的反应方案3

图4.本发明的反应方案4

图5.木葡聚糖的实例

发明详述

发明了一种在还原条件下在反应混合物中生成胺化的水溶性碳水化合物的方法，所述反应混合物包含水溶性碳水化合物和胺，

I)其中使所述反应混合物为酸性(调整至pH＜7)，然后孵育，

II)孵育后可沉淀所产生的胺化的水溶性碳水化合物，

反应中的伯胺具有式R₁NH₂。根据方案2它会生成仲胺。

R₁是可从胺上去除或不可去除的化学基团。

根据一个实施方案，去除R₁基团并在碳水化合物上生成伯胺基团。这可通过使胺化的碳水化合物水解或通过使胺化的碳水化合物异构化并水解来完成。

因此，本发明还涉及一种方法，其还包括通过以下来去除所述R₁基团并在所述碳水化合物上生成伯氨基的步骤，

III)通过以下使所产生的胺化的碳水化合物氢解，

a)将所产生的胺化的碳水化合物溶于水和酸中，并将其在升高的压力中在催化剂存在下与氢气反应，

b)去除所述催化剂，

c)其后可沉淀所述胺化的水溶性碳水化合物产物。

或者

IV)通过以下使所述胺化的碳水化合物异构化并水解，

a)将所产生的胺化的碳水化合物溶于水和酸中，并使其在催化剂存在下反应，

b)去除所述催化剂，

c)其后可沉淀所述胺化的水溶性碳水化合物产物。

本发明还涉及一种方法，其还包括去除R₁基团和在碳水化合物上生成伯氨基团的步骤(方案4)。R₁为苄基时通过以下进行：

III)通过以下使所产生的胺化的碳水化合物氢解，

a)将所产生的胺化的碳水化合物溶于水和酸中，并使其在升高的压力中在催化剂存在下与氢气反应，

b)去除所述催化剂，

c)其后可沉淀所述胺化的水溶性碳水化合物产物。

R₁为烯丙基时，本发明方法的另一个变化形式为：

IV)通过以下将所述烯丙基异构化为烯胺并水解，

a)将所产生的胺化的碳水化合物溶于水和酸中，并使其在催化剂存在下反应，

b)去除所述催化剂，

c)其后可沉淀所述胺化的水溶性碳水化合物产物。

上述方法的处理步骤I的实施中未添加盐，例如未添加铵盐。

可使用其他可在酸性条件下被切割的胺(例如2，4-二甲氧基苄胺、4-甲氧基苄胺，或2，4，6-三甲氧基苄胺)替代苄胺或丙烯胺以引入其他可去除的R₁基团。

可使用本领域技术人员能认识到的具有可切割之R₁基团的其他胺。

可直接使用反应混合物中获得的步骤I)的仲胺，或者在步骤III)或IV)进一步反应以转化为伯胺之前将其沉淀并分离。

在生成胺化的水溶性碳水化合物的本发明方法的一个优选实施方案中，生成的胺化水溶性碳水化合物的产率高于60％。这涉及产生所述仲胺的步骤I)本身，并且还涉及步骤I)与将仲胺转化为伯胺的步骤III)或IV)的组合。

在本发明方法的一个实施方案中，步骤I)中的还原条件可以是氢气氛和催化剂(例如铂、铂衍生物)或优选地在水中稳定的还原剂(如氰基硼氢化钠、连二亚硫酸钠或胺硼烷复合物(如吡啶硼烷、二甲基胺硼烷或2-甲基吡啶硼烷))。

所用的还原剂和碳水化合物的当量比可以是100比1、90比1、80比1、70比1、60比1、50比1、40比1、30比1、20比1、10比1、9比1、8比1、7比1、6比1、5比1、4比1、3比1、2比1、1.5比1、1.2比1、1.1比1、1比1，优选1.2比1。

在生成胺化的水溶性碳水化合物的本发明方法的一个优选实施方案中，步骤I)中的胺是有机伯胺。本发明的伯胺具有式R₁H₂N，其中R₁代表烷基和芳基。所述烷基可选自具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个碳原子的烷基。所述烷基可以是直链、支链或环状的，它们可以是饱和或不饱和(如烯烃和炔烃)的，例如具有上述碳原子数。所述烷基可以是具有六个环原子(可包含一个或多个杂原子，例如O)的环状饱和基团。一个或多个这种具有六个环原子(可包含一个或多个杂原子，例如O)的环状饱和基团可以结合在一起。它们可以稠合在一起或通过糖苷键互相连接。

所述芳基可选自具有3-14个环原子的芳基。它们可为单环、双环和多环，并且仅包含碳原子作为环原子或包含一个或多个选自N、S和O的杂原子。

杂芳基的实例是呋喃、苯并呋喃、异苯并呋喃、吡咯、吲哚、异吲哚、噻吩、苯并噻吩、苯并[c]噻吩、咪唑、苯并咪唑、嘌呤、吡唑、吲唑、

唑、苯并

唑、异唑、苯并异

唑、噻唑、苯并噻唑。它们可为六元，例如苯、吡啶、吡嗪、嘧啶和哒嗪。它们可为稠合双环(例如萘、喹啉、喹喔啉、异喹啉、喹唑啉和噌啉)和稠合多环(例如蒽、吖啶和吖啶)。

所述烷基和芳基可取代有选自以下的一个或多个基团：OH、NH₂、Cl、I、Br、F、具有上述碳原子数的烷基、具有上述碳原子数的烷氧基(例如甲氧基)。

R₁还可以是含羰基衍生物、含磷衍生物、含硅化合物、含硼化合物、含硒衍生物、含硫衍生物、含醇衍生物、含醚衍生物、含环氧化物衍生物、杂环、含缩醛化合物、-NH-烷基衍生物、-NH-芳基衍生物、-NH-苄基衍生物、-NH-CO-烷基衍生物、-NH-CO-芳基衍生物、-NH-CO-苄基衍生物。例如，4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸(OBA)、苄胺、丙烯胺、十二烷胺或4-硝基苯胺。

在生成胺化的水溶性碳水化合物的本发明方法的一个优选实施方案中，所述水溶性碳水化合物是半纤维素，特别是木葡聚糖。

在生成胺化的水溶性碳水化合物的本发明方法的一个优选实施方案中，所述水溶性碳水化合物是木葡聚糖寡糖。

在生成胺化的水溶性碳水化合物的本发明方法的另一实施方案中，所述碳水化合物包含至少三个单糖，例如三糖。

在生成胺化的水溶性碳水化合物的本发明方法的另一实施方案中，所述水溶性碳水化合物是可溶碳水化合物，其包含至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个单糖，例如4至10500、4至13500个单糖。

在生成胺化的水溶性碳水化合物的本发明方法的另一实施方案中，所述水溶性碳水化合物是木葡聚糖，其分子量为至少1kDa、至少1.35kDa、至少1.4kDa、至少2kDa、至少3kDa、至少4kDa或至少10kDa，如1kDa至1,500,000，例如1kDa至1,500,000、1.35kDa至1,500,000、1.4kDa至1,500,000、2kDa至1,500,000、3kDa至1,500,000、4kDa至1,500,000、10kDa至1,500,000。

在生成胺化的水溶性碳水化合物的本发明方法的另一实施方案中，所述水溶性碳水化合物是木葡聚糖，其分子量为1kDa至1,500,000Da，例如1350Da至50kDa。

测量多糖的分子量通常很困难。以上数字表示平均分子量。

在本发明的一些实施方案中，水溶性碳水化合物不包括淀粉、右旋糖苷、糊精、琼脂糖或琼脂糖凝胶(sepharose)。

在生成胺化的水溶性碳水化合物的本发明方法的一个实施方案中，I)中反应混合物的pH被调整至约5。

在本发明方法的另一实施方案中，步骤I)中反应混合物的pH应为4.0至6.0，例如pH 4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、pH 4.7、pH 4.8、pH 4.9、pH 5.0、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH 5.4、pH 5.5、pH 5.6、pH5.7、pH 5.8或pH 5.9。

在本发明方法的另一实施方案中，步骤I)中反应混合物的pH不应为4.5或低于4.5。在本发明方法的另一实施方案中，步骤I)中反应混合物的pH不应为6或高于6。

本发明方法的另一实施方案中，步骤I)中反应混合物的pH高于4.5并且低于6。

在本发明的一个实施方案中，步骤I后可使反应混合物呈碱性(pH＞7)，其后可沉淀所产生的胺化的水溶性碳水化合物。

可将步骤1)后的反应混合物的pH调整至高于质子化胺pK_a值的pH，例如pH7至pH12，如约pH 7、pH 7.5、pH 8、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5或pH 12，例如pH9-10，如pH9。可以采用氨水。

用于步骤I)和III)a)以及IV)a)中的酸可以是任何无机酸(例如HCl)或任何有机酸(例如醋酸)。

在步骤I、II、III和IV中，反应溶剂可以是水或基本上是水，其溶解绝大部分成分。

在生成胺化的水溶性碳水化合物的本发明方法的又一实施方案中，孵育前将具有1-4个碳原子的醇(例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、3-丁醇，优选甲醇)加入步骤I)的反应混合物中。

优选用醇和水的混合物作为溶剂，因为它提供高产率。可使用比例为1-10∶1，特别是4∶1的醇和水。根据一个实施方案，使用比例为4∶1的甲醇和水。

任选地将醇(优选甲醇)加入步骤I)的反应混合物后以及反应基本完成后，可将醇去除，例如通过蒸发。如果使pH成为碱性，可以在将pH调整成碱性之前去除醇。

可以通过如TLC(薄层层析)、MALDI-TOF、NMR、IR或GPC来确定步骤I)、III)和IV)的反应的基本完成。

在一个优选的实施方案中，产率为至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或甚至接近100％，例如在60％至100％之间，或通过组合任何上述百分数值而产生的任何区间内。

在本方法的另一实施方案中，步骤I)和IV)在升高的温度下进行。因此，温度可为约室温25℃，还可为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃。温度可在室温至100℃之间或通过组合任何上述百分数值而产生的任何区间内。

在本发明方法的一个优选实施方案中，I)的温度约为55℃。

在本发明方法的另一实施方案中，I)的孵育时间为过夜。

在本发明方法的另一实施方案中，I)的孵育时间在1至100小时之间，例如约12、14、16、18、20、22、24、48、60、72或84小时。

在本发明方法的另一实施方案中，I)的孵育时间为约18小时。

在本发明方法的一个优选的实施方案中，在步骤IIIa)和IVa)中加入催化剂。

在本发明方法的一个优选的实施方案中，步骤IIIa)和IV)的催化剂可以是活性炭上的钯。所述催化剂可在活性炭上包含2-25％的钯。

在本发明方法的一个优选的实施方案中，在步骤IIIa)和IV)中加入的催化剂是活性炭上10％的钯。

在本发明方法的一个优选的实施方案中，在步骤IIIb)和IVb)中加入的催化剂在沉淀化合物前去除。

在本发明方法的一个实施方案中，沉淀可以用非质子有机溶剂(例如丙酮)或质子有机溶剂(例如任何醇，特别是乙醇)进行。

合成方法可包含碳水化合物与伯胺缩合(例如还原条件下与苄胺或丙烯胺)的反应混合物。

优选将1.5当量的伯胺与1.5当量的氰基硼氢化钠一起使用，而不使用大量的伯胺。优选使用醇(例如甲醇)和水的混合物作为溶剂，因为它提供高产率。这些溶剂之间4∶1的比率使起始原料良好溶解并使产率最高。

特别地，反应在微酸条件下实施，这比在碱性条件下得到的结果更好。通过添加醋酸获得为5的pH时结果最佳。几乎无盐的反应条件简化了纯化，而且反应物和副产物通过提取和蒸发去除。产物通过沉淀分离，通过离心收集白色固体。

其他的还原剂(例如三乙酰氧基硼氢化物，胺硼烷如吡啶硼烷、二甲胺硼烷或2-甲基吡啶硼烷，连二亚硫酸钠或氧化铂)与氢气氛一起可以替代氰基硼氢化钠产生的还原条件。

合成步骤包含碳水化合物与胺(例如苄胺或丙烯胺)在还原条件下缩合的反应混合物。在另一反应中，苄基和烯丙基可以分别通过例如水解和/或催化作用被切割从而生成具有伯胺基团的碳水化合物，见方案4。优选将活性炭上催化量的钯用作切割步骤的催化剂，而且该催化剂可以重复使用以保护环境并减少该步骤的生产成本。

在步骤IIIa)的氢解反应中，氢解作用可在酸性条件下实施以提高反应速率。使用有机酸(醋酸)，因为其可以在沉淀和离心步骤中容易地从产物中去除。为进一步提高该反应的速率，可以使用更高的氢气压力。使用了6-10psi的氢压力，但是可以使用至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100psi的压力，甚至使用更高的压力，例如200、500、700或1000psi。因此，可使用6-1000psi的压力，或组合任何上述压力数值而产生的区间，例如6-10psi。

本发明还涉及将氨基引入水溶性碳水化合物中的方法，其包括所有步骤I、III)和IV)，其中孵育步骤I)的实施可以不限制pH。因此，该方法在孵育步骤I)中可以在任何pH下实施，优选以上述pH值实施。

因此，本发明涉及在反应混合物中生成胺化的水溶性碳水化合物的方法，所述反应混合物包含水溶性碳水化合物和式R₁NH₂的胺，其中R是可从胺上去除的化学基团。

I)其中孵育所述反应混合物，

II)然后可沉淀所产生的胺化的水溶性碳水化合物，

通过以下来从所述胺上去除所述R₁基团，如苄基，

III)通过以下来氢解所产生的胺化的碳水化合物，

a)将所产生的胺化的碳水化合物溶于水和酸中，并使其在升高的压力下在催化剂存在下与氢气反应，

b)去除所述催化剂，

c)其后可沉淀所述胺化的水溶性碳水化合物产物，或者通过以下从所述胺去除所述R₁基团，如烯丙基，

IV)将所述胺化的碳水化合物异构化为烯胺，并通过酸水解去除所述烯胺。

步骤IV)中胺化的碳水化合物的异构化和水解可通过以下实施：

a)将生成的胺化的碳水化合物溶于水和酸中，并使其在催化剂的存在下进行反应，

b)去除所述催化剂

c)其后可沉淀所述胺化的水溶性碳水化合物产物。

将本说明书中涉及步骤II、III和IV的所有信息和细节加以必要的变更应用于该方法，反之亦然，仅有的区别是步骤I)中可以不限制pH。因此所有步骤II)、III)和IV)可在相同的条件下实施，而无论步骤I)中采用何种pH。

证实了本方法的几个优点，例如，使用小量的苄胺(1-3当量，优选1.5当量)和NaCNBH₃(1-3当量，优选1.5当量)。优选将活性炭上催化量的钯用作氢解步骤的催化剂，而且该催化剂可以重复使用以保护环境并减少该步骤的生产成本。

此外，所述方法包含对转换为大规模情况有益的几个部分。由于反应包含的盐极少，所以试剂可以通过例如蒸发和有机溶剂提取来除去，并且可用标准的工业化规模的装备进行沉淀和离心。

合成可以大规模实施，而且与之前方法相比，合成产率高达75-98％。在将温度升高为55℃时，第一步的反应时间为约18小时，该反应时间与之前所用的约3至20天相比短得多。这是特别突出的，因为这适用于具有高分子量的多糖。

而且步骤I)反应条件的最适pH是5是出人意料的，因为之前的报道称pH应该低于4或为约7-8，产率为89-98％也是出人意料的。与US2006/0242770(WO2004/094646)中的实验(使用pH 4(实施例1中，pH3.85)和pH 4.5(实施例4中，醋酸盐缓冲液)两种pH，并且产率约为40％)相比这更加出人意料。

本发明还涉及分子量至少为2kDa的胺化的半纤维素分子，特别是木葡聚糖分子。本发明尤其涉及通过本文所述方法产生并包含上述胺基的胺化的半纤维素分子。

根据一个实施方案，胺化的半纤维素分子的分子量为至少1kDa、至少1.35kDa、至少1.4kDa、至少2kDa、至少3kDa、至少4kDa或至少10kDa，例如1kDa至15kDa，如1kDa至15kDa、1.35kDa至15kDa、1.4kDa至15kDa、2kDa至15kDa、3kDa至15kDa、4kDa至15kDa、10kDa至15kDa。

本发明还涉及下式的胺化的半纤维素分子：

其中：

R₁是任何化学基团并且其中R是H、半乳糖、阿拉伯糖或岩藻糖。

n大于1，如2至2000之间，并且分子量大于1350Da。

n在2至2000之间

并且分子量大于6500Da。

关于本发明方法所产生胺化半纤维素的分子量的以上描述也适用于上式的分子。

所有引用的出版物作为参考文献并入。

以下非限制性实施例支持本发明。

实施例1-5

使用了XGO并与作为还原剂的氰基硼氢化钠反应，方案2

实施例1

R₁＝苄基(Bn)

在55℃下将XGO(50g，39mmol)溶于MeOH/H₂O(4∶1，700mL)中。加入苄胺(6.4mL，59mmol)和NaCNBH₃(3.7g，59mmol)。然后加入醋酸(7mL)，使pH为5，反应混合物在55℃搅拌过夜。根据TLC(乙腈/H₂O 2∶1)和MALDI-TOF确定反应结束后将反应混合物蒸发以去除甲醇。然后产物在冰乙醇(3L)中沉淀，通过离心收集白色固体。产物用真空干燥以获得49g产物(36mmol，92％)。(R₁＝Bn)。

实施例2

R₁＝烯丙基(All)

将XGO(3g，2.34mmol)溶于25mL MeOH，5mLH₂O和0.30mL醋酸的混合物中。加入NaCNBH₃(0.220g，3.5mmol)和丙烯胺(0.277mL，3.69mmol)，将反应物在55℃搅拌过夜。根据TLC(乙腈/H₂O 2∶1)和MALDI-TOF确定反应结束后将混合物在冰乙醇中沉淀。通过离心收集白色物质，溶于水中并浓缩。冷冻干燥获得2.65mg产物(0.20mmol，85％)。(R₁＝All)。

实施例3

R₁＝4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸(OBA)

将XGO(8.18g，6.4mmol)溶于80mL水中。加入4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸(23.2g，62.7mmol)和NaCNBH₃(2.36g，37.6mmol)，用1M NaOH(15mL)将混合物的pH调节至6。搅拌混合物48小时，然后过滤(玻璃滤器)以去除过量的4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸。向滤出液中加入1M HCl(25mL)，直至pH达到2-3。将混合物经反向硅胶(C-18)塞通过过滤纯化。浓缩并冷冻干燥得到12.57g包含少量未反应的4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸杂质的产物。(R₁＝4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸)。

实施例4

R₁＝4-硝基苯胺

将4-硝基苯胺(55mg，0.40mmol)加入XGO(0.1g，0.08mmol)和甲醇(3mL)的混合物中。加入NaCNBH₃(25mg，0.40mmol)，滴入几滴HCl(1M)使pH至6。将反应物在50℃搅拌72小时，这时MALDI-TOF和TLC(乙腈/H₂O 2∶1)显示转化完全为产物(R₁＝4-硝基苯胺)。

实施例5

R₁＝十二烷基

将XGO(1.0g，0.78mmol)溶于10mL水中。加入NaCNBH₃(74mg，1.17mmol)和十二烷胺(173mg，0.94mmol)。加入醋酸使pH至5，在55℃搅拌反应物48小时。根据MALDI-TOF确定反应完成后，产物在冰乙醇中沉淀，通过离心收集白色物质。将沉淀溶于水中，通过蒸发去除乙醇。冷冻干燥产物以获得0.73g的产物(0.50mmol，64％)(R₁＝十二烷基)。

实施例6-9

采用不同还原剂用苄胺将XGO还原性胺化，方案2

实施例6

还原剂＝三乙酰氧基硼氢化钠，Na(OAc)₃BH

将XGO(1g，0.78mmol)溶于4mL MeOH和1mL水中。加入Na(OAc)₃BH(0.331g，1.56mmol)和苄胺(0.17mL，1.56mmol)。加入醋酸使pH至5，在55℃将反应物搅拌过夜。加入更多的Na(OAc)₃BH(0.331g，1.56mmol)和苄胺(0.17mL，1.56mmol)，在55℃搅拌混合物48小时。根据TLC(乙腈/H₂O 2∶1)和MALDI-TOF确定反应结束后将混合物在冰乙醇中沉淀。通过离心收集白色物质，溶于水并浓缩。产物再次在乙醇中沉淀，重复分离产物。冰冻干燥得到616mg产物(0.48mmol，62％)。(R₁＝Bn)。

实施例7

还原剂＝二甲胺硼烷复合物((CH₃)₂NH BH₃)

将XGO(1g，0.781mmol)溶于8mL MeOH、2mL水和0.1mL醋酸的混合物中。加入苄胺(0.128mL，1.17mmol)和二甲胺硼烷复合物(0.220g，3.5mmol)，30℃搅拌反应物过夜。根据TLC，仅形成了少量产物。将混合物在40℃继续搅拌72小时，根据TLC(乙腈/水2∶1)和MALDI-TOF，再加三次二甲胺硼烷复合物(3×70mg)以完成反应。将混合物浓缩并将产物在冰乙醇中沉淀。离心收集白色物质，溶于水中并浓缩。冷冻干燥以获得788mg产物(0.58mmol，74％)。(R₁＝Bn)。

实施例8

还原剂＝2-甲基吡啶硼烷复合物(C₆H₇N BH₃)

将XGO(1g，0.781mmol)溶于8mL MeOH，2mLH₂O和0.1mL醋酸的混合物中。加入苄胺(0.128mL，1.17mmol)和甲基吡啶硼烷复合物(125mg)，在40℃搅拌反应物过夜。根据TLC，仅剩余了少量起始物质，加入更多的甲基吡啶硼烷复合物(125mg)，将混合物在40℃再次搅拌过夜。TLC(乙腈/H₂O 2∶1)和MALDI-TOF显示转化完全，终止反应。将混合物浓缩并将产物在冰乙醇中沉淀。离心收集白色物质，溶于水中并浓缩。冷冻干燥以获得747mg产物(0.55mmol，70％)。(R₁＝Bn)。

实施例9

还原剂＝连二亚硫酸钠

将0.5g XGO溶于2mL 0.5M NaOAc缓冲液(pH＝5.5)中，随后加入84mg(2当量)苄胺和0.27g(4当量)Na₂S₂O₄。在55℃搅拌反应物，并用TLC监测(水∶乙腈；1∶2)。(R₁＝Bn)。

实施例10-11

苄基和烯丙基的切割，方案4

实施例10

R₁＝H(苄基的氢解)

将XGONHBn(50g，36.6mmol)溶于水(150mL)中，加入醋酸(3mL)使pH至5。加入10％活性炭上的钯(2.5g)，使混合物在6-10psi的压力下氢解。反应用MALDI-TOF监测，72小时后反应完成。离心去除催化剂，然后将澄清溶液浓缩。产物用冰乙醇(3L)沉淀，离心收集白色物质。将沉淀溶于水中，冻干以获得38g产物(R₁＝H)(29.7mmol，81％)。

实施例11

R₁＝H(烯丙基的去除)

将XGONHAll(0.1g，0.076mmol)溶于3mL MeOH，2mLH₂O和40μL醋酸的混合物中。加入一刮勺尖的10％活性炭上的钯，将混合物在60℃搅拌48小时。根据MALDI-TOF确定反应结束后，离心去除活性炭上的钯，将澄清溶液浓缩并冻干以获得85mg产物(R₁＝H)(0.066mmol，87％)。

实施例12-13

使用了分子量为15kD的木葡聚糖，方案2。

实施例12

R₁＝4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸(OBA)

将15kD的木葡聚糖(1g，0.067mmol)溶于20mL水(Milli-Q)中。加入4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸(OBA)(123mg，0.33mmol)和NaCNBH₃(21mg，0.33mmol)。用1M NaOH将pH调整至5。将混合物在55℃搅拌。通过GPC监测反应进程，48小时后所有起始物质耗尽。将混合物离心，浓缩澄清溶液后用NH₃(25％)制成碱性(pH 9)。产物在乙醇(500mL)中沉淀，通过离心(4400rpm)收集沉淀物。重复沉淀以去除所有4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸。然后将产物溶于水并将乙醇蒸发，然后冻干以获得990mg(97％)产物(R₁＝4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸)。

实施例13

R₁＝苄基(Bn)

将15kD的木葡聚糖(1g，0.067mmol)溶于15mL水中。加入苄胺(36μL，0.33mmol)和NaCNBH₃(21mg，0.33mmol)。加入醋酸使反应混合物的pH至5。将混合物在55℃搅拌18小时，产物用乙醇沉淀并通过离心收集，重复沉淀。将产物溶于水并蒸发乙醇，然后冻干以获得900mg(89％)产物(R₁＝Bn)。

实施例14-16

使用了分子量为4kDa(XGO₃)的木葡聚糖，方案2

实施例14

R₁＝4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸(OBA)

将XGO₃(1g，0.25mmol)溶于20mL MeOH/H₂O(2∶1)中。加入4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸(OBA)(463mg，1.25mmol)和NaCNBH₃(79mg，1.25mmol)。用1M NaOH将pH调整至5。在55℃搅拌混合物。通过GPC监测反应进程，18小时后所有起始物质耗尽。将混合物离心，浓缩澄清溶液以去除甲醇。通过添加NH₃(25％)将溶液制成碱性(pH 9)。产物在乙醇(500mL)中沉淀并通过过滤收集沉淀。滤出物用乙醇彻底洗涤，然后溶于水并浓缩。冻干溶液以获得1.0g(98％)产物(R₁＝4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸)。

实施例15

R₁＝苄基(Bn)

将XGO₃(1g，0.25mmol)溶于20mL MeOH/水(2∶1)中。加入苄胺(136μL，1.25mmol)和NaCNBH₃(79mg，1.25mmol)。加入醋酸将反应混合物的pH调整至5。将混合物在55℃搅拌，根据MALDI-TOF确定18小时后反应完全。将混合物浓缩，产物在乙醇(500mL)中沉淀。将混合物过滤，沉淀用乙醇清洗然后溶于水。浓缩后冻干以获得970mg(96％)产物(R₁＝Bn)。

实施例16

R₁＝十二烷基

将XGO₃(1g，0.25mmol)溶于20mL MeOH/水(1∶1)中。加入十二烷胺(140mg，0.75mmol)和NaCNBH₃(50mg，0.75mmol)。加入醋酸将反应混合物的pH调整至5。混合物在55℃搅拌18小时。加入更多的十二烷胺(140mg)和NaCNBH₃(50mg)，在55℃搅拌反应物18小时。根据MALDI-TOF确定反应完全。将混合物浓缩，产物在丙酮中沉淀。离心收集白色物质，溶于水，浓缩并冻干以获得0.71g产物(71％)。(R₁＝十二烷基)。

表1文献中碳水化合物还原性胺化反应概要

^*该文章测试了pH6-9，最佳pH是pH7。根据Schwartz和Gray 1977，最佳pH应为8-9。

BnNH₂＝苄胺

^**ATPS＝8-氨基芘-1，3，6-三磺酸盐 ^***取决于试剂和反应条件 R.T.＝室温 N.P.未给出

Claims (16)

1.在还原条件下在反应混合物中产生胺化的水溶性碳水化合物的方法，所述反应混合物包含水溶性碳水化合物和伯胺，

I)其中使所述反应混合物呈酸性(调整至pH＜7)，然后孵育，

II)然后可沉淀所产生的胺化的水溶性碳水化合物。

2.权利要求1的方法，其中所述伯胺具有式R₁NH₂，其中R₁是可从所述胺上去除或不可去除的化学基团。

3.权利要求1和2中任一项的方法，其还包括去除所述R₁基团并在所述碳水化合物上生成伯胺基团的步骤。

4.权利要求1和2中任一项的方法，其还包括去除所述R₁基团并在所述碳水化合物上生成伯胺基团的步骤，其通过以下来实现：

III)当R₁是苄基时，通过以下步骤使所产生的胺化的碳水化合物氢解，

a)将所产生的胺化的碳水化合物溶于水和酸中，并使其在升高的压力下在催化剂存在下与氢气反应，

b)去除所述催化剂，

c)其后可沉淀所述胺化的水溶性碳水化合物产物。

5.权利要求1和2中任一项的方法，其还包括去除所述R₁基团并在所述碳水化合物上生成伯胺基团的步骤，其通过以下实现：

IV)当R₁基团是烯丙基时，使所产生的胺化的碳水化合物异构化并水解，

a)将所产生的胺化的碳水化合物溶于水和酸中，并使其在催化剂存在下反应，

b)去除所述催化剂，

c)其后可沉淀所述胺化的水溶性碳水化合物产物。

6.权利要求1和2中任一项的方法，其中步骤I)的所述还原条件是氢气氛和催化剂如铂、铂衍生物，或者是还原亚胺和烯胺的还原剂，所述还原剂优选氰基硼氢化钠或连二亚硫酸钠或胺硼烷复合物，如吡啶硼烷、二甲基胺硼烷或2-甲基吡啶硼烷。

7.权利要求1中任一项的方法，其中所述胺是有机伯胺，如苄胺、丙烯胺、十二烷胺、4-硝基苯胺或4，4’-二氨基二苯乙烯-2，2’-二磺酸。

8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述水溶性碳水化合物是半纤维素，如木葡聚糖。

9.权利要求8的方法，其中所述水溶性碳水化合物是木葡聚糖寡糖。

10.权利要求1至9中任一项的方法，其中在步骤I)的反应之前向所述反应混合物中加入醇，如具有1-4个碳原子的醇，例如甲醇。

11.权利要求1至6中任一项的方法，其中将所述I)中反应混合物的pH调整至约5。

12.权利要求1至8中任一项的方法，其中改变步骤II)以在任选地添加醇并且所述反应基本完成后，将所述醇去除。

13.在反应混合物中产生胺化的水溶性碳水化合物的方法，所述反应混合物包含水溶性碳水化合物和式R₁NH₂的胺，其中R是可从胺上去除的化学基团，

I)其中孵育所述反应混合物，

II)然后可沉淀所产生的胺化的水溶性碳水化合物，

通过以下从所述胺上去除所述R₁基团，如苄基，

III)通过以下使所产生的胺化的碳水化合物氢解，

a)将所产生的胺化的碳水化合物溶于水和酸中，并使其在升高的压力下在催化剂存在下与氢气反应，

b)去除所述催化剂，

c)其后可沉淀所述胺化的水溶性碳水化合物产物，

或者通过以下从所述胺去除所述R₁基团，如烯丙基，

IV)使所述胺化的碳水化合物异构化成烯胺，并通过酸水解去除所述烯胺。

14.分子量大于6400Da的胺化的半纤维素分子，特别是木葡聚糖分子。

15.权利要求12的胺化的半纤维素分子，其是分子量至少为1kDa的OBA-木葡聚糖分子。

16.胺化的半纤维素分子，其具有下式：

其中：

R₁是任何化学基团并且其中R是H、半乳糖、阿拉伯糖或岩藻糖。

n大于1，如2至2000之间，并且分子量大于1350Da。

n在2至2000之间

并且分子量大于6500Da。

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