CN102307885A - 向物质表面引入功能性官能团的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种向物质表面引入功能性官能团的方法。本发明提供一种将含有功能性官能团的化合物和脂质混合,然后引入到物质表面的方法。本发明所涉及的方法例如包括:将含有功能性官能团的化合物和脂质混合,从而形成脂质体的步骤;以及向上述物质表面引入上述脂质体的步骤。与现有的化学表面处理方法相比,本发明涉及的向物质表面引入功能性官能团的方法不仅工艺简便、缩短了时间,而且在物质表面固定受体,具有高效率及高再生性的效果。此外,不需要使用各种试剂,方法简单,即使是非化学领域技术人员也能够容易掌握。
Description
技术领域
本发明涉及一种表面化学技术,尤其涉及一种向物质表面引入功能性官能团的方法。在此,具有代表性的功能性官能团为固定受体所需的官能团或其本身为具有受体功能的官能团。
背景技术
在利用生物传感器(biosensor)、气体传感器(gas sensor)、纳米(粒子)诊断或纳米给药(drug delivery)领域,脂质体(liposome)诊断或脂质体给药领域,以及色谱分析等多个领域中,向物质(例如固体或颗粒)表面引入含有特定功能的功能性官能团(functional group)非常重要。这些官能团可以用于固定起到受体作用的生物高分子(biologicalmacromolecules),而且其本身也可以用于分子识别(molecularrecognition)。
在脂质体表面固定受体的情况,通常使用较多的是在磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine;PE)的脂质上引入特定官能团的方法。这是由于PE的头部基团(head group)上含有氨基(amino group),从而容易引起化学反应。例如,制备含有PE的脂质体,将该脂质体与N-琥珀酰-3-2-联硫基吡啶-丙酸盐(N-succinimidyl pyridyl dithiopropionate;SPDP)等化合物反应,生成二硫代嘧啶基(dithiopyridyl group)(参照图1)。在这里使含有硫醇基的受体进行反应,进而通过双硫键使受体固定。但是这种在表面引起化学反应的方法会有反应效率低、繁琐、再生性差的缺点。
在生物传感器的金属表面固定受体的情况,通常使用较多的是在金属表面形成自组装单分子层(self-assembled monolayer,SAM)的方法。根据硫原子和金属表面的化学吸附键和烃链之间的疏水性引力,使得一端含有硫醇基的烷基硫醇化合物在金属表面自发地形成自组装单分子层。这时如果在烷基硫醇化合物的含有硫醇基的一端的对立端上含有特定的官能团,可以利用该官能团固定其它分子。
例如,用11-巯基十一烷酸(11-mercapto-1-undecanoic acid,MUA)等化合物制备自组装单分子层后,使得在上述自组装单分子层表面的羧基依次与N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(N-ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide;EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide;NHS)进行反应,在原来羧基的位置引入NHS基,从而使该位置能够与含有氨基的受体分子进行反应(参照图2)。
当受体分子含有硫醇基的情况,用11-氨基-1-十一烷硫醇(11-amino-1-undecanethiol)等化合物制备自组装单分子层后,使自组装单分子层表面的氨基与N-(马来酰亚胺基丁酸)琥珀酰亚胺酯{N-[-Maleimidobutyrtloxy]succinimide;GMBS}反应,在原来氨基的位置引入马来酰亚胺基(maleimide),从而能够固定含有硫醇基的受体分子。
此外,在固定抗体时,使抗体和高碘酸钠(sodium m-periodate)(或碘酸钠)反应,从而在抗体含有的碳水化合物上形成醛基。采用与固定氨基相同的方法,在金属表面引入NHS基,然后与碳酰肼(carbohydrazide)反应,从而引入叠氮基(azide group)。在这里使得含有醛基的抗体进行反应,会形成席夫碱(Schiff’s base),将该席夫碱再与氰基硼氢化物(cyanoborohydride)反应,从而使结合稳定(参照图3)。
综上所述,按照现有方式利用酰肼(hydrazide)官能团固定抗体的情况,如果从形成SAM的传感芯片开始要经过EDC/NHS反应、碳酰肼(carbohydrazide)反应、乙醇胺(ethanolamine)反应、抗体固定反应、氰基硼氢化物反应等5个步骤,总花费时间约为3~4小时。
像这样在SAM上引起化学反应的方法与在脂质体上引起化学反应的情况同样存在反应性低、繁琐、再生性差的问题,因此也使用一些含有固定所需官能团的烷基硫醇化合物。例如,混入端部含有NHS基的二硫基(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)[dithiobis(succinimidyl undecanoate)](参照图4)等化合物形成SAM,不需要附加反应就能够在SAM表面引入能够使含有氨基的分子反应的NHS基。但是像这种含有特定官能团的烷基硫醇化合物难于合成,不仅费用昂贵,而且稳定性差,因此不能够广泛使用。
为了解决这种化学固定法的缺点,以往也会使用固定抗生物素(avidin)蛋白的传感芯片。抗生物素蛋白含有与生物素(biotin)选择性地强烈结合的特性,因此用化学方式将生物素与受体分子进行结合不仅简单,而且如果是抗体的情况,也可以购买事先与生物素结合了的抗体。
并且,将结合了生物素的受体附加在固定有抗生物素蛋白的传感芯片上,能够在短时间内使受体简单地进行固定。但是抗生物素蛋白比较容易变性,因此含有抗生物素蛋白的传感芯片难于保存,并且价格昂贵。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明是为了克服上述现有技术的局限性而完成的,其主要目的在于提供一种不需要经过多个步骤的化学反应,就能够向物质表面引入一种功能性官能团的简单易行的引入官能团的方法。
本发明的另一目的在于,不仅能够容易地引入以往通过化学反应不能够引入或难于引入的官能团,而且通过利用便宜的材料向物质表面引入功能性官能团,从而在有关表面化学技术方面提高经济效益。
解决技术问题的技术手段
根据本发明的向物质表面引入功能性官能团的方法是提供一种将含有功能性官能团的化合物和脂质混合,引入到物质表面的方法。
本发明涉及的方法的特征为,例如包括将含有功能性官能团的化合物和脂质混合,从而形成脂质体的步骤;以及向上述物质表面引入上述脂质体的步骤。
本发明涉及的上述“物质”一般是指金属、陶瓷、脂质体、半导体、高分子中的任何一种。并且,这些物质可以是指生物传感器、气体传感器、纳米物质、色谱分析介质、半导体、高分子、脂质体等构成表面的物质。
在此,功能性官能团应从广义上解释为,为了赋予物质特定的机能所必须的官能团。具有代表性的功能性官能团可以是固定受体所必要的官能团或其本身为具有受体功能的官能团。
并且,上述本发明涉及的“受体”从广义上应理解为直接或间接地连接在物质表面,从而能够与靶物质相互作用的物质。
这些受体中,具有代表性的有用于利用生物传感器、气体传感器、纳米(粒子)诊断或纳米给药,脂质体诊断或给药、色谱分析(chromatography)等多个领域的生物高分子或有机官能团。不仅可以使用抗体或激素等蛋白质,还可以使用核酸或碳水化合物等任何物质来作为生物高分子。可以使用从羧基或氨基到复杂的生物素或叶酸(folicacid)等任何一种形态的官能团来作为有机官能团。
有益效果
与现有方法相比本发明涉及的利用脂质体向固体或粒子表面引入功能性官能团的方法既简便、又缩短了时间,不但在固定受体上具有高效及高再生性的效果,而且能够引入用现有方法不能够引入的官能团。由于上述效果,本发明涉及的方法在向例如生物传感器,气体传感器,色谱分析介质,用于传递药物的纳米物质、用于诊断的纳米物质等表面引入功能性官能团方面是非常有利的。
附图说明
图1示出了根据现有技术制备含有PE的脂质体,然后将该脂质体与SPDP反应生成二硫代嘧啶基(dithiopyridyl group)的方法。
图2示出了根据现有技术由EDC和NHS的连续反应,使SAM的羧基转换成NHS基后,再与蛋白质的氨基进行反应,从而固定蛋白质的方法。
图3示出了根据现有技术,将图2形成的NHS基转换为酰肼基,从而固定抗体的方法。
图4示出了现有技术中二硫基(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)的化学式。
图5为用以对本发明进行说明的脂质(lipid)的构造图。
图6为用以对本发明进行说明的脂质双分子层(lipid bilayer)和脂质体的构造图。
图7为用以对本发明进行说明的在金属表面附加烷基硫醇化合物时形成的自组装单分子层的构造图。
图8为用以对本发明进行说明的在传感器表面的疏水性自组装单分子层上附加脂质体时所形成的脂质单分子层的构造图。
图9为用以对本发明进行说明的生物素-PE(biotin-PE;1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-phosphatidylethanolamine-n-biotinyl)的结构式。
图10为用以对本发明进行说明的将含有固定受体所需官能团的脂质混合到基础脂质上,从而形成脂质体,然后将该脂质体附加到疏水性自组装单分子层上时所形成的脂质单分子层的构造图。
图11为本发明优选实施例中的具有不同用途的脂质构造图,所述脂质含有功能性官能团。
图12为本发明优选实施例中的具有不同用途的几种长链烃结构图,所述长链烃含有功能性官能团。
图13为本发明优选实施例中的脂质单分子层的结构图,所述脂质单分子层的结构是将含有功能性官能团的烃类化合物混合到基础脂质上形成脂质体,然后将该脂质体附加到疏水性自组装单分子层上时所形成的。
图14根据本发明优选的实施例,示出了能够自组装的三种功能性分子,(a)为含有功能性官能团的烃类化合物,(b)为含有功能性官能团的烷基硫醇化合物,(c)为含有功能性官能团的脂质,功能性官能团用R表示。
图15为本发明优选实施例中的气体传感器的表面结构图,该气体传感器的表面是利用含有特定官能团的脂质与基础脂质混合形成脂质体进行涂布的。
图16为本发明优选实施例中的气体传感器的表面结构图,该气体传感器的表面是利用含有特定官能团的烃类化合物与基础脂质混合形成脂质体后,利用该脂质体进行涂布的气体传感器的表面结构。
图17为本发明优选实施例,示出了利用仅由含有特定官能团的脂质构成的脂质体来进行涂布的气体传感器的表面结构。
图18为本发明优选实施例中的利用辛酰肼来固定被氧化抗体的过程中的频率变化图。
为了与图18的结果进行比较,图19为根据现有技术来固定被氧化抗体过程中的频率变化图。
图20为本本发明优选实施例中的频率变化图,该频率变化图表示在利用辛酰肼固定被氧化抗体制备得到的免疫传感芯片中,频率随抗原浓度发生变化的频率变化值。
图21为本本发明优选实施例中的频率变化图,该频率变化图表示在利用辛酰肼固定被氧化抗体制备得到的免疫传感芯片中,反复注入具有相同浓度的抗原时的频率变化值。
图22为本本发明优选实施例中的频率变化图,该频率变化图表示在利用MBP-PE固定含有硫醇基的抗体,从而制备得到的免疫传感芯片中,根据抗原浓度变化的频率变化值和反复注入具有相同浓度抗原时的频率变化值图表。
图23为本发明优选实施例中的频率变化图,该频率变化图表示在利用马来酰亚胺固定含有硫醇基的抗体、制备得到的免疫传感芯片中,反复注入具有相同浓度的抗原时的频率变化。
图24为本发明优选实施例中的频率变化图,该频率变化图表示在利用生物素-PE固定抗生物素蛋白、然后再在其上面固定附有生物素基的抗体、从而制备得到的免疫传感芯片中,根据抗原浓度发生变化的频率变化值。
图25为本发明优选实施例中的三种气体传感器与气态有机化合物进行反应的比较图,所述三种气体传感器为仅用基础脂质的DPPC涂布的气体传感器和将基础脂质分别与生物素-PE、MBP-PE或NBD-PE进行混合涂布的传感器。
图26为本发明优选实施例中的两种气体传感器与气态有机化合物进行反应的比较图,所述两种气体传感器为用3-十二烷基噻吩酮或十二腈与基础脂质DPPC混合制备的脂质体进行涂布的两种气体传感器与有机气体的反应进行比较的图表,乙酸乙酯为3-氯丙酸乙酯。
图27为本本发明优选实施例中的频率变化图,表示利用十八基NTA在生物传感器表面固定Ni2+离子、然后在其上面再结合六组氨酸标记麦芽糖结合蛋白[(His)6-tagged MBP]时的频率变化值。
具体实施方式
下面根据具体实施例对本发明的具体方法来详细说明,但是本发明的权利范围并不仅限于下述这些实施例。首先,参照图5-10对与本发明实施例脂质层的形成有关的基本事项进行说明。
如图5所示,脂质是由极性头部和非极性尾部构成,其构造显示为极性头部具有两个非极性尾部。如图6所示,由于这种脂质的结构特性,使得将脂质放入水溶液环境中时,为了将疏水性尾部向内隐藏,会形成脂质双分子层(lipid bilayer),结果制备得到脂质体(liposome)。
如图7所示,采用十八硫醇(octadecanethiol)制备的自组装单分子层具有疏水性表面,因此如图8所示,将其与形成有脂质双分子层的脂质体反应,会使得脂质体内脂质的疏水性尾部与疏水性表面接触形成脂质单分子层(monolayer)。在这样的脂质中混入含有功能性官能团的脂质能够有效地向生物传感器表面引入功能性官能团。例如,将生物素-PE(参照图9)等脂质与基础脂质混合形成脂质体,如图10所示,使该官能团出现在脂质单分子层表面,从而能够在其上面固定抗生物素蛋白。这里所指的“基础脂质”为不合有功能性官能团的脂质,是指能够与含有功能性官能团的化合物混合形成脂质体的物质。
本发明实施例中含有功能性官能团的化合物可以选自“含有功能性官能团的脂质”或“含有功能性官能团的长链烃”中的任意一个以上。含有功能性官能团的化合物含有能够直接用于受体固定反应的官能团或是含有能够直接用于和其它分子相互反应的官能团,因此能够通过疏水性尾部与脂质混合,从而形成层(layer)。这种含有功能性官能团的化合物例如有生物素-PE,除此之外还有如图11所示的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-二氧磷基乙醇胺-N-[4-(对-马兰酰亚胺苯基)丁酰胺{1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide;MBP-PE}或1,2-二油酰基-sn-甘油基-{[N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚胺基二醋酸]琥珀酰{1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[N(5-amino-1-carboxypentyl)imino diacetic acid]succinyl;DOGS-NTA}等含有功能性官能团的脂质。
并且,如图12所示的具有代表性的含有功能性官能团的化合物例如还有十八基生物素(octadecyl biotin)、十八基酰肼(octadecyl hydrazide)、马来酰亚胺(octadecyl maleimide)、十八基NTA(octadecyl N-nitrilotriacetic acid)等含有功能性官能团的长链烃。含有功能性官能团的长链烃能够与脂质混合形成脂质体。并且如果利用含有功能性官能团长链烃的脂质体在自组装单分子层上形成脂质单分子层,能够向物质表面引入功能性官能团。(图13)。
图14示出了本发明优选实施例中的含有功能性官能团的三种功能性化合物。特别地,图14中的含有功能性官能团的烃(a)与含有功能性官能团的烷基硫醇化合物(b)或含有功能性官能团的脂质(c)相比具有单一的结构,因此与脂质或烷基硫醇化合物相比具有以下优点。一、由于脂肪族链的单一结构,对反应条件的限制少,并且已经存在很多长烃链的化合物,因此能够使用很多种类的含有长烃链的化合物。第二、由于饱和的脂肪族链反应度低下,因此稳定且易于保存。第三、由于上述原因,具有很高的经济效益。
在本发明中,制备脂质体时,使用的含有基础脂质及功能性官能团的化合物,并干燥成膜形态保存到小瓶中,使其能够用于制备脂质体,其中每小瓶(vial)中的量优选为能够涂布一个传感器芯片的量。或者是可以事先制备好脂质体后,分成每份能够涂布一个传感芯片的量,然后以冻结的状态保存使用。这种情况下,优选在使用之前稍进行超声波处理,使脂质体再重新转换为SUV(small unilamella vesicle)。
此外,如上所述的本发明提供的向物质表面引入含有功能性官能团的方法能够应用于如下物质的表面化学领域:已经具有疏水性表面的物质、能够将表面转换为疏水性的所有物质、脂质体等脂质粒子、以及能够使脂质双分子层结合的所有物质等。例如,能够应用于利用表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)原理的生物传感器或构成石英晶体微量天平(quartz crystal microbalance)生物传感器表面的物质(一般为金属)。
除了如上述石英晶体微量天平具有金属表面之外,其他例如,碳纳米管气体传感器、半导体方式气体传感器、纳米线FET(nanowire FET)气体传感器、电化学式气体传感器等各种传感器的表面也可以用脂质层进行涂布。因此,如图15或图16所示,用包含功能性官能团的化合物的脂质体进行涂布,能够制备得到表面化学性能不同的多种传感器。根据表面化学性能的不同传感器与有机气体发生的反应也不同,因此可以用作特异性的气体传感器。
并且,在气体传感器的情况,由于分析对象物质为分子量较小的有机化合物,因此为了使得传感器表面的化学性能均匀,如图17所示,可以仅用一种含有功能性官能团的脂质来进行涂布。将多种气体传感器适当地进行组合最终能够构成电子鼻(e-nose)。
由于C18硅胶的表面具有疏水性,因此可以涂布脂质层,通过本发明的方法还可以用作引入了多种官能团的色谱分析介质(chromatographymedia)。例如将十八基NTA与脂质体混合后进行涂布能够制备得到具有组氨酸标记(histidine tag)的能够分离蛋白质的物质。
并且,由于脂质体为脂质双分子层,因此能够直接引入含有功能性官能团的化合物。在制备脂质体时,加入适当的含有功能性官能团的化合物来制备,从而能够向脂质体容易地引入以抗体为首的靶标配体(targeting ligand)。这种具有靶标配体的脂质体能够用于治疗物质的传递或诊断。
疏水性聚(二甲基硅氧烷)[poly(dimethylsiloxane);PDMS]表面能够用单分子层进行涂布,与此相反,如果将PDMS表面用等离子进行氧化,转换为亲水性,就能够用脂质双分子层进行涂布。由此,通过上述多种方法能够向PDMS表面引入功能性官能团。
纳米物质可以用于超灵敏度的生物传感器诊断、治疗物质传递、生命科学研究等方面,这种应用的核心技术就是生物因子功能化(biofunctionalization)。本发明的方法也能够用于纳米物质的生物因子功能化。
例如,用三辛基氧化磷(trioctylphosphine oxide;TOPO)稳定量子点(TOPO-stabilized quantum dot)的情况下,利用TOPO具有疏水性表面的性质,能够在其上面直接形成单分子层。特别地,该方法不是采用替代TOPO层的方法,而是在其上面附加一层的方法,因此具有不会使量子点露出敏感的表面的优点。可以采用与QCM或SPR表面相同的方法在金或银等纳米粒子的表面利用烷基硫醇来形成疏水性SAM,然后在其上面形成脂质单分子层,最近还有直接用脂质包围来合成纳米粒子的方法的相关报道。由于碳纳米管具有疏水性表面,因此可以在其表面形成脂质层。因此,根据本发明的方法向物质表面引入功能性官能团,其结果为能够赋予纳米物质生物功能性。
下面基于上述说明,参照图18-26,通过本发明的优选实施例,对多个向物质表面引入功能性官能团的实验例进行详细说明。
实施例1利用辛酰肼将抗体固定于生物传感器表面
准备用于生物传感器的测定装置
石英晶体微量天平(quartz crystal microbalance,QCM)购自日本晶体生命阳光(Crystal Sunlife)公司。石英晶体微量天平呈四角形,大小为8X8mm,圆形金电极的直径为5mm,石英晶体微量天平的固有频率为10MHz。由于石英晶体微量天平的频率随着质量的增加,成比例地减小,因此如果在石英晶体微量天平的表面固定有能够与分析对象物质结合的受体,就能够利用频率随着分析对象物质的结合变化的原理将其用作生物传感器。使用的石英晶体微量天平生物传感器为本研究室制作。
本发明中,在石英晶体微量天平上同时使用了井状气孔(well cell)和流动型气孔(flow cell)。所述井状气孔具有能够添加溶液的井,所述流动型气孔形成为溶液通过管子流动,以使得液体与石英晶体微量天平电极接触。首先在井状气孔中使能够与检测物质进行特异结合的受体蛋白固定,然后用流动型气孔代替,使缓冲溶液通过泵注入,需要检测的试样用注入阀(injection valve)注入。分析物质通过设置在井状流动型气孔上面的QCM的表面与抗体结合,这样质量会发生变化,从而振动频率会发生变化,频率测定装置测定出该频率,能够通过电脑发送来对数据进行分析。
自组装单分子层(SAM)的形成
为了对石英晶体微量天平的表面进行洗涤,将石英晶体微量天平浸泡于60℃的食人鱼洗液(piranha solution)(H2SO4∶H2O2=7∶3)1分钟,然后用蒸馏水和乙醇冲洗后,用氮气进行干燥。然后将石英晶体微量天平放入到将1-十八硫醇(1-octadecanethiol,Sigma-Aldrich,USA)以2mM的浓度溶于乙醇中的溶液中进行12-15小时搅拌,以使得电子表面形成自组装单分子层(self-assembled monolayer,SAM)。然后取出形成了SAM的传感芯片用乙醇进行冲洗,然后用氮气进行干燥后装入到气孔(cell)中。
由此,通过加入烷基硫醇分子,例如十八硫醇(octadecanethiol)等含有硫醇基(thiol group)的烃类化合物会使得硫原子通过化学吸附附着到金属表面,由疏水性碳氢链之间的引力作用制备得到如图7所示的SAM。
脂质体的制备
制备与上述SAM结合的脂质体。本实施例中以2∶1的摩尔比将二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoyl phosphatidyl cholin;DPPC)和辛酰肼进行混合制备得到脂质体。在此,DPPC用作形成脂质体的基础脂质,辛酰肼用作含有功能性官能团的烃类化合物,以使得脂质体上具有酰肼基。辛酰肼含有如图12所示的与十八基酰肼相同的官能团,具有仅是烃链长度短的结构。
使用装有事先干燥为膜形态脂质的小瓶制备脂质体,每瓶的量能够在一个传感芯片上固定受体,在该种情况下,在装有脂质膜的小瓶中加入120μL的pH值调至7.0的0.1M的4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙硫磺酸[4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane sulfonic acid;HEPES]缓冲溶液,轻缓地展开膜,充填氮气后挡住上面,然后进行超声波处理,使其呈小型单层水泡(small unilamella vesicle;SUV)。
超声波处理的方法有两种。第一种为使小瓶漂在水温调为50-60℃左右的超声波洗涤装置中,处理1小时左右。第二种方法为在500ml的烧杯中加入3分之2的水,然后在小瓶浮在水上的状态下,用超声波高速搅拌器(ultrasonic homogenizer)进行20分钟左右超声波处理。是否形成SUV可通过由不透明的白色变为灰白的亮色来判断。在脂质薄膜小瓶中加入缓冲溶液,开始会形成几层层叠形成的多层板小泡(multilamellavesicle;MLV),呈不透明的白色。在此附加超声波能会使得脂质之间的引力被破坏,发生重组,从而达到平衡。结果为形成呈稍微灰白透明颜色的小的脂质体SUV。
上述脂质体与自组装单分子层的结合
用下述方法将上述制备得到的脂质体和形成有自组装单分子层的传感芯片进行反应。将形成有SAM的QCM用1-十八硫醇附着到井状气孔中。将由1-十八基硫醇形成的SAM表面用100μL的辛基葡萄糖苷(octylglucoside)冲洗3次,然后立即加入100μL的脂质体溶液,于50℃下放置30-60分钟。将上述井状气孔连接到频率测定装置上,然后去除脂质体溶液,放入0.1M的100μL氢氧化钠(NaOH)溶液,放置30秒。然后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)冲洗3次。由此来确定制备得到的用于固定抗体的生物传感器的抗体是否被固定。
抗体的氧化
在将抗体(抗山羊免疫球蛋白G抗体,anti-goat IgGAb)固定于QCM表面之前,通过氧化反应在抗体中包括的碳水化合物部分来形成醛基。由于醛基与酰肼基反应形成共价键,因此能够将抗体以一定的方向进行固定。在抗体(anti-goat IgG Ab)以0.5mg/mL的浓度溶于PBS的溶液中加入0.2ml高碘酸钠溶液,然后在暗处反应30分钟。没有反应的高碘酸钠通过对缓冲溶液A(100mM sodium acetate buffer,pH5.5)透析来去除掉。
抗体的固定及确认
将依次结合有自组装单分子层和脂质单分子层的QCM表面用pH值为5.5的100mM醋酸钠缓冲溶液冲洗3次后,加入用高碘酸钠氧化的抗体反应1小时。然后用超纯水洗涤3次,为了双键的还原加入0.1M100μL的氰硼氢化物(cyanoborohydride)反应1小时后,使得含有醛基的受体固定稳定。最后,为了防止蛋白质的非特异性吸附用封闭缓冲液(blocking buffer;1mM EDTA,0.25%bovine serum albumin,0.1%sodium azide,0.05%Tween-20 in PBS)对QCM表面处理30分钟。
图18为固定抗体过程中频率的变化图。在此能够看出当加入氧化的抗体进行反应时频率渐渐地减小,这说明根据抗体的结合,使得QCM表面的质量增加了。但是加入NaCNBH3反应的情况几乎没有质量的变化,因此能够看出频率仍旧没有变化。使用该方法共需要150分钟。该方法包括两个步骤的化学反应和为了抑制非特异性吸附的用BSA涂布的过程。
但是由图18可以看出抗体固定反应在30分钟内基本完成,并且根据NaCNBH3的还原反应进行得也非常快,因此将形成脂质单分子层的时间包括在内整体上可以将时间缩短至90分钟以内。与此相反,如图2和图3所示的现有方法的情况,如图19所示需要进行5个步骤的化学反应,因此即使将时间最大限度地缩短也得需要3小时以上。不仅如此,与现有方法中需要进行4步的反应相比,本发明设计的方法只需要进行两步的反应,因此能够使得固定效率或再生性更高。并且不需要使用多种试剂,使得即使是非化学领域的技术人员也能够容易掌握。
然后为了确认通过上述方法固定的抗体(anti-goat IgG antibody)是否发挥了作为受体的功能,依次注入了不同浓度的抗原(goat IgG),结果观察到了如图20所示的与浓度呈比例的频率变化。此时,加入一种浓度的抗原观察频率变化后,注入离解溶液(0.2M Glycine-HCl,pH2.3+1%DMSO),使得结合的抗原被完全去除掉,然后再加入下个浓度的抗原。然后以5μg/mL的相同的浓度反复注入,测定频率变化的结果为如图21中所示,由此能够体现很高的再生性。
石英晶体微量天平不仅根据浓度频率发生变化,而且还可以反复进行使用。由此可知作为受体的抗体通过化学结合被稳定固定了。在此仅示出了辛酰肼的实验结果,但使用碳链长度更长的月桂酸酰肼或十八基酰肼时也能够得到相同的结果。
实施例2:在生物传感器表面利用MBP-PE固定抗体
准备用于生物传感器的测定装置
采用的生物传感器测定装置同实施例1。
形成自组装单分子层(SAM)
形成自组装单分子层的方法同实施例1。
制备脂质体
制备与上述SAM结合的脂质体。本实施例中将DPPC和MBP-PE两种脂质混合制备得到脂质体。在这里DPPC用于形成脂质体的基础脂质,MBP-PE用于脂质体上形成马来酰亚胺(maleimide)基。利用三氯甲烷∶甲醇=1∶2的溶剂制备得到12mg/mL浓度的DPPC溶液。将MBP-PE以8.2mg/mL的浓度溶于三氯甲烷。在200μL的DPPC溶液中加入200μL的MBP-PE溶液,然后将其中的40μL在玻璃小瓶底部均匀展开。轻轻地吹入氮气,使得脂质溶液干燥形成薄片。不需要立即使用的小瓶用氮气填充后置于-20℃或-70℃的低温下保存。剩余的采用与实施例1相同的方法处理。
上述脂质体与自组装单分子层的结合
上述脂质体和自组装单分子层的结合方法同实施例1。
确认含有硫醇基的受体是否被固定
在肽上附加半胱氨酸残基,从而可以简单地引入硫醇基。蛋白质的情况可以和克劳特试剂(Traut′s reagent;2-iminothiolane-HCl)反应,从而能够引入硫醇基。将100μL通过克劳特试剂引入硫醇基的抗体(anti-goat IgG antibody,浓度为50μg/mL)附加到依次结合有自组装单分子层和脂质单分子层的QCM表面,反应1小时。然后取出抗体溶液用PBS冲洗3次。加入50μg/mL的100μL牛血清白蛋白(bovine serumalbumin;BSA)溶液反应30分钟。用上述方法在石英晶体衡量天平上固定含有硫醇基的抗体后,依次注入不同浓度的抗原(goat IgG),结果观察到了如图22中实线所示的与浓度呈比例的频率变化。
此时,注入一种浓度的抗原观察频率变化,然后注入离解溶液使结合的抗原完全被去除掉,然后注入下一个浓度的抗原。并且用25μg/mL的同一浓度反复注入抗原时,如图22的虚线所示,保持一定的频率、变化值。像这样石英晶体微量天平不仅频率根据浓度呈比例变化,而且还能够反复使用,由此可知通过化学结合,作为受体的抗体被稳定固定了。
实施例3在生物传感器表面利用马来酰亚胺固定抗体
准备用于生物传感器的测定装置
采用的生物传感器测定装置同实施例1。
形成自组装单分子层(SAM)
形成自组装单分子层的方法同实施例1。
制备脂质体
除了用十八基马来酰亚胺代替辛酰肼外,其余采用和实施例1相同的方法。十八基马来酰亚胺的结构为图12所示。
上述脂质体与自组装单分子层结合
上述脂质体和自组装单分子层的结合方法同实施例1。
确认含有硫醇基的受体是否被固定
采用与实施例2相同的方法,在石英晶体微量天平的表面固定含有硫醇基的抗体(山羊anti-goat IgG antibody)后,为了确定抗体是否被固定,反复注入100μg/mL浓度的抗原(goat IgG)。观察注入抗原后的频率变化,然后注入离解溶液使结合的抗原完全被去除掉,然后再重新注入抗原。结果如图23中所示,观察到频率变化值保持一定。
实施例4固定有抗生物素蛋白的生物传感器的制备
形成自组装单分子层(SAM)
形成自组装单分子层采用与实施例1相同的方法。
制备脂质体
脂质体的制备除了用溶于三氯甲烷的浓度为0.5mg/mL的生物素-PE代替MBP-PE,用蛋黄卵磷脂(egg lecithin)代替DPPC外,其余采用和实施例1相同的方法。制备得到脂质体后,分成够一次使用的量,然后于-80℃下保存。
上述脂质体与自组装单分子层结合
用和实施例1相同的方法实施。
确认抗生物素蛋白是否被固定
在依次结合有自组装单分子层和脂质单分子层的QCM表面附加50μg/mL的抗生物素蛋白溶液反应10分钟。用上述方法在石英晶体衡量天平上固定抗生物素蛋白后,在该抗生物素蛋白上再加入结合有生物素的抗体(anti-rabbit IgG antibody)。抗生物素蛋白能够与4个生物素结合,因此与石英晶体微量天平表面的生物素结合的抗生物蛋白还能够再与和抗体结合的生物素进行结合,从而可以将抗体固定于石英晶体微量天平表面。
这样在固定有抗体的石英晶体微量天平上依次注入不同浓度的抗原(rabbit IgG)。此时注入一种浓度的抗原后,观察其频率变化,然后注入离解溶液使得结合的抗原完全被去除掉,然后再注入另一种浓度的抗原。结果如图24所示,观察到了频率与抗原浓度呈比例变化。由此判断抗体以稳定地形态被固定住了。
实施例5利用脂质的气体传感器的制备
形成自组装单分子层(SAM)
形成自组装单分子层采用与实施例1相同的方法。
制备脂质体
制备了以DPPC为基础脂质的4种用于气体传感器的脂质体。一种是仅用基础脂质来制备脂质体,剩下的三种是在基础脂质中分别以24∶1的质量比混合生物素-PE,MBP-PE和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并灭草定-4-基){1,2-Di oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)}(NBD-PE)。制备脂质体的方法与实施例1的方法相同。
上述脂质体与自组装单分子层结合
按照与实施例1相同的方法实施。
电子鼻(e-nose)的制备
将采用上述方法制备的含有多个官能团的传感器用数组排列制备电子鼻。
除了本实施例实施的方法以外,从本领域人员的角度也可以仅使用1个气体传感器,还可以将其他多个传感器进行排列制备出为了分析更多种化合物的电子鼻。多个气体传感器与不同的有机化合物进行反应产生不同的图案,因此通过分析这种图案能够确定有机化合物的种类。
将本实验的4个石英晶体微量天平分别用DPPC、生物素-PE、MBP-PE及NBD-PE等4种脂质进行涂布,从而制备得到4种气体传感器,由此测定对气体状态的有机化合物的反应。结果如图25所示,能够确认根据气体种类的不同反应也不同。
实施例6利用含有两种功能性官能团的长链烃的QCM气体传感器
形成自组装单分子层(SAM)
形成自组装单分子层采用与实施例1相同的方法。
制备脂质体
以蛋黄卵磷脂作为基础脂质制备得到两种用于气体传感器的脂质体。
一个是以2∶1(摩尔比)的比率将基础脂质与3-烷基硫代甲酮进行混合,另一种是以2∶1的比率与十二腈进行混合。制备脂质体的方法同实施例1使用的方法。
上述脂质体与自组装单分子层的结合
按照与实施例1相同的方法实施。
对不同有机气体的反应调查
将采用上述方法制备得到的两种气体传感器放入一个小室(chamber)内,依次流入不同的有机气体,测定频率变化。此时,运载气体采用氮气,流速为100ccm(cc per min)。流入有机气体后,流入氮气,从而使得结合在传感器表面的有机气体分子脱落,以使得基线恢复。有机气体的浓度采用室温下该物质的蒸汽压。
结果可以确认两种气体传感器在水和己烷中发生了类似的反应,但对于甲苯、乙酸乙酯、3-氯丙酸乙酯等三种气体表现出了不同的反应。(参照图26)。这样的结果说明根据涂布于QCM表面的FAC官能团种类的不同,对特定有机气体的反应也不同。上述方法对以QCM为首的多种传感器进行涂布,由此将能够制备得到很多各种各样的气体传感器。
实施例7在生物传感器表面利用十八基NTA固定融合蛋白。
自组装单分子层(SAM)的形成
形成自组装单分子层采用与实施例1相同的方法。
制备脂质体
制备脂质体时除了用十八基NTA代替辛酰肼,作为基础脂质用蛋黄卵磷脂代替DPPC之外,其余同实施例采用的方法。
上述脂质体与自组装单分子层的结合
按照与实施例1相同的方法实施。
确认生物传感器表面与融合蛋白结合
向依次结合有自组装单分子层和脂质单分子层的QCM表面流入0.1M NiCl2溶液,以使得Ni2+离子与NTA上的三个羧基进行共价结合来固定。然后以20g/ml的浓度注入六个组氨酸残基连在一起的含有(His)6-tag的麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)。结果如图27所示,由于His)6-tagged MBP的结合引起频率变化。但是,不移入NICl2溶液,注入(His)6-tagged MBP时,频率几乎不发生变化。这样的结果表明(His)6-tagged MBP是由与生物传感器表面的NTA共价结合的Ni2+离子来进行固定的,更进一步地可知在生物传感器表面引入了官能团。
Claims (11)
1.一种向物质表面引入功能性官能团的方法,其特征在于,所述方法为将含有功能性官能团的化合物与脂质混合后引入到物质表面。
2.根据权利要求1所述的向物质表面引入功能性官能团的方法,其特征在于,所述方法包括将含有功能性官能团的化合物和脂质混合,从而形成脂质体的步骤;以及向所述物质表面引入所述脂质体的步骤。
3.根据权利要求1或2任一项所述的向物质表面引入功能性官能团的方法,其特征在于,所述功能性官能团为固定受体所需的官能团或其本身为具有受体功能的官能团。
4.根据权利要求2所述的向物质表面引入功能性官能团的方法,其特征在于,所述方法为向所述物质表面以单分子层或双分子层引入所述脂质体。
5.根据权利要求1或2任一项所述的向物质表面引入功能性官能团的方法,其特征在于,所述含有功能性官能团的化合物选自含有功能性官能团的脂质或含有功能性官能团的长链烃中的任意一个以上。
6.根据权利要求1或2任一项所述的向物质表面引入功能性官能团的方法,其特征在于,所述物质选自金属、陶瓷、脂质体、半导体、高分子中的任何一种。
7.根据权利要求5所述的向物质表面引入功能性官能团的方法,其特征在于,所述含有功能性官能团的长链烃选自十八基生物素(octadecyl biotin)、十八基酰肼(octadecyl hydrazide)、十八基马来酰亚胺(octadecyl maleimide)、十八基氮川三乙酸钠(octadecyl NTA)中的任意一种或它们的混合物。
8.根据权利要求6所述的向物质表面引入功能性官能团的方法,其特征在于,所述物质为构成生物传感器或气体传感器中的任意一种表面的物质。
9.根据权利要求6所述的向物质表面引入功能性官能团的方法,其特征在于,所述物质为色谱分析介质。
10.根据权利要求6所述的向物质表面引入功能性官能团的方法,其特征在于,所述物质为纳米物质。
11.根据权利要求6所述的向物质表面引入功能性官能团的方法,其特征在于,所述方法包括在所述物质表面形成自组装单分子层(SAM)的步骤;将含有所述功能性官能团的化合物与脂质混合形成脂质体的步骤;以及将所述脂质体与所述自助装单分子层结合的步骤。
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