CN1892219A - 生物分子固定化基片、生物芯片及生物传感器 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新的生物分子固定化基片或生物芯片，该基片或芯片中，采用亲水性单分子膜和脂双层将生物分子固定于芯片基片上。在本发明的生物芯片中，在透明的芯片基片(21)上形成含有Au微粒的金属层(22)。在该金属层(22)上面，利用自体组织化形成含有X－(CH₂)n－OH(X为巯基)的单分子膜(23)。在单分子膜(23)的上面，利用自体组织化形成含有磷脂的脂双层(24)。单分子膜(23)和脂双层(24)以氢键较柔性地结合。在此脂双层(24)的上面通过生物识别分子(27)固定有受体(28)。

Description

生物分子固定化基片、生物芯片及生物传感器

技术领域

本发明涉及生物分子固定化基片、生物芯片以及生物传感器。更具体地，本发明涉及采用亲水单分子膜和脂双层将生物分子固定于基片。

背景技术

(关于生物传感)

对于将生物分子二维排列在芯片基片上的生物芯片、量子芯片，目前正在探索其在医疗-环境领域、电子领域及其它领域的应用。特别是在治疗-诊断领域以及生物体机理的研究中，芯片基片上二维排列着为数众多的蛋白质分子(protein)的蛋白质芯片对于疾病诊断、健康诊断、个体鉴定、生物体系统解析等用途是非常必要的。

例如，为了了解生物体系统，必须要明确了解细胞内表达的蛋白质分子间的相互作用网络以及此网络随时间的变动情况。为此，能够高通量解析表达蛋白质的相互作用的蛋白质芯片的构建就显得尤其必要。

在蛋白质芯片中，将各种各样的探针(蛋白质)二维地排列固定在芯片基片上。若将样品与蛋白质芯片相接触，则样品中只有特异性的靶物质(蛋白质)与探针相结合，这是由于探针的特性所决定的。因此，若能检测出由于探针与靶的结合所致的探针的特性变化，将其转换为光、电等信号，以此读出特性变化的有无、靶物质的量等，则可对作为靶物质的蛋白质的种类进行鉴定、对蛋白质的表达或相互作用进行解析。

例如，若采用将某种抗体二维固定在芯片基片上的蛋白质芯片，使血液等样品与此蛋白质芯片相接触，则只有特定的抗原(例如，炭疽菌、天花病毒等特定的病毒抗原)与该抗体反应，被吸附于蛋白质芯片上，由此可通过蛋白质芯片检出是否存在特定抗原。或者，也可以计测出被蛋白质芯片上的抗体所吸附的抗原量或者样品中抗原的减少量。因此，通过这样的方法，可以诊断出特定细菌感染的有无或疾病的程度等。

而且，蛋白质芯片也有望在疑难疾病的特效药物的开发、没有副作用的医疗药品的开发、预防医药的实现等方面发挥作用。

另外，作为如上所述的用于生物传感技术中的蛋白质芯片，有下述几种：(1)将抗体、疑似抗体、适体、噬菌体展示文库固定于基片的蛋白质芯片；(2)将由cDNA表达的蛋白质固定于基片的蛋白质芯片；(3)将从细胞或组织中精制的蛋白质固定于基片的蛋白质芯片等。

(关于脂双层)

在这种生物芯片(蛋白质芯片)中，为了将抗体固定在芯片基片上，需要首先在芯片基片的表面形成脂双层，然后再在其上固定抗体等蛋白质。脂双层是生物膜的基本构造，通过在脂双层上嵌入或结合蛋白质，可得到生物膜的基本骨架。因此，若在芯片基片上形成人工的脂双层，将蛋白质固定在脂双层的表面，或将蛋白质嵌入脂双层中，则蛋白质就能够表达本来的生理机能。因此，现有技术中已提出多种在芯片基片表面形成人工脂双层的方法。

特开平6-90736号公报(专利文献1)中公开了一种生物传感器，其中，将记录电极配置在芯片基片(Teflonblock)内，在该电极上以存在大量水层的方式形成脂双层，再在其上形成参照电极。脂双层通过含亲水性间隔(spacer)分子的架桥系留分子而附着于记录电极上。

这里作为架桥系留分子，使用与末端具有巯基或硫醚残基的聚氧化烯链键合的磷脂酰乙醇胺。或者，采用PE-NH-(CH₂-CH₂-O)n-CH₂-CH₂-SH(n为约7～约24，PE-NH为磷脂酰乙醇胺的残基)。架桥系留分子末端的巯基或硫醚残基附着于记录电极的表面，架桥系留分子与脂双层通过共价键结合。

特开平9-236571号公报(专利文献2)所公开的生物传感器中，在表面形成有Au膜的芯片基片上隔着间隔分子形成脂双层，在脂双层中嵌入受体。

在这里，作为间隔分子，使用含有肽的分子(具体来说，该分子含有1分子的乙醇胺、4～20个由C₂-C₁₀-α-氨基酸形成的螺旋结构或折叠片结构的寡肽、以及反应性基团，该反应性基团参与间隔分子与芯片基片的化学或物理化学结合)。在该间隔分子中，乙醇胺与脂双层的磷酸基通过共价键(酯键)结合。

但是，在专利文献1、专利文献2所记载的生物传感器中，脂双层和架桥系留分子或间隔分子(含有肽的分子)通过共价键强烈地结合，因而脂双层和芯片基片通过架桥系留分子或间隔分子直接进行固定，脂双层的固定化没有柔性。因此，在这些生物传感器中，脂双层有可能失活，而且，脂双层的寿命也很短。

另外，生物分子在流动的介质中具有活动性，与之相反，若使用架桥系留分子或者间隔分子，则脂双层以及与之相结合的生物分子的流动性均消失了，因而生物分子原本的功能和活动受到限制，有可能不能观察到生物分子原本的功能和活动。另外，芯片基片通常采用Au膜因而价格高昂，并且希望芯片基片能重复使用，但是，若采用架桥系留分子或间隔分子，则脂双层以很强的结合力结合于芯片基片，因而难以重复使用芯片基片。

另外，专利文献2所记载的生物传感器中，磷脂的亲水性部位与乙醇胺分子结合，然后将4～20个α-氨基酸键合在乙醇胺的N原子上，形成间隔分子和磷脂的单分子膜。然后，利用间隔分子的HS部位将含有间隔分子的二磷脂酰化合物固定于芯片基片上，在其中添加脂质体(liposome)溶液，使脂膜间互相融合，从而在芯片基片上形成脂双层。

可是，这种脂双层形成方法中，不论是形成间隔分子和磷脂的单分子膜的工序，还是形成脂双层的工序，都是非常耗时的程序，效率低下。

在特开平10-510277号公报(专利文献3)中公开了一种生物传感器，在该生物传感器中，在芯片基片上，通过具有亲水性羟基的肽分子形成脂双层，肽分子的羟基和脂双层通过氢键结合，这里，肽用R-A-B-C-D-E-OH表示。A为选自由Ala、Gly和Leu组成的组中的氨基酸的残基，B为选自由Ala、Ser、Gly-Gly和Ser-Ser组成的组中的氨基酸残基或二肽残基，C为选自由Ala、Ala-Ala、Leu-Leu、Ala-Ala-Ala、Arg-Gly-Asp和Leu-Leu-Leu组成的组中的氨基酸或二肽或三肽的残基，D为选自由Ala和Ser组成的组中的氨基酸的残基，E为选自由Ala、Leu和Pro-Lys组成的组中的氨基酸或二肽基，R为H、HS-烷基-CO、HS-烷基-CO-NH-烷基’-CO-、Trt-S-烷基-CO-、Trt-S-烷基-CO-NH-烷基’-CO-或者1，2-二硫环戊烷-3-(CH₂)₄-CO-(其中，若A、B、C、D和E中至少之一不是Ala，则R可以为H；各烷基与烷基’之间没有关系，分别是碳原子数为1～11的亚烷基，Trt为三苯甲基)及它们的盐。

专利文献3所记载的生物传感器中，脂双层和肽分子通过氢键结合，这样，脂双层通过肽分子以比较弱的结合力被系留在芯片基片上，因而能够防止固定于脂双层上的生物分子的失活，同时能够将膜蛋白质固定在脂双层上。另外，在该生物传感器中，作为使芯片基片与脂双层相结合的手段，采用了具有导电性的肽，可通过肽分子传导电信号，因而可通过生物传感器的电气变化检测出生物分子的变化等。

可是，在这种生物传感器中，鉴于肽分子构造上的原因，肽分子不能在芯片基片上达到高密度，因而难以将脂双层紧密地系留在芯片基片上，容易产生脂双层的剥落。而且，由于肽稳定性低且很柔软，因而通过肽系留的脂双层容易随时间产生变化。

进一步，在采用肽分子的生物传感器中，控制肽分子的膜厚恒定是很困难的，也很难自由设定脂双层与在芯片基片上形成的电极的距离，这样，通过光学传感方法，特别是通过SPR(表面等离子共振，surfaceplasmon resonance)测定脂双层上固定的生物分子时，测定精度也不稳定。而且，肽分子很难保持均一膜厚，在通过SPR对生物分子进行测定时，噪音增加且测定精度降低。

另外，在专利文献3所记载的生物传感器中，首先合成肽分子(R-A-B-C-D-E-OH)，使其R基与电极结合，形成肽分子单分子膜，然后，含有磷脂(该磷脂具有磷脂酰胆碱或磷脂酸-NH₂基)的脂质体(liposome)与肽分子融合，将脂双层固定于电极。可是，这种脂双层的形成方法中，不论是形成肽分子单分子膜的工序，还是形成脂双层的工程，均属于非常耗时的程序，效率低下。

专利文献1：特开平6-90736号公报(第3213341号专利)

专利文献2：特开平9-236571号公报

专利文献3：特开平10-510277号公报

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的在于提供新的生物分子固定化基片或生物芯片等，所述生物分子固定化基片或生物芯片中，采用亲水性单分子膜和脂双层将生物分子固定于芯片基片上。

本发明的生物分子固定化基片是在基片上系留脂双层的生物分子固定化基片，其中，所述生物分子固定化基片具有单分子膜和脂双层，所述单分子膜是将以X-(CH₂)n-OH(X为巯基)表示的分子排列在基片上的单分子膜；所述脂双层通过氢键与所述单分子膜连接，据此使该脂双层系留在所述基片上。

在本发明的生物分子固定化基片中，脂双层与单分子膜通过氢键以比较弱的力结合，柔性地系留于基片上，因而脂双层不易失活，寿命也较长；而且，由于脂双层柔性地系留于基片上，因而脂双层或与其结合的生物分子的流动性不易受到阻碍，可以在保持生物分子原本的功能或活动性的情况下对其进行观察。

而且，在本发明的生物分子固定化基片中，作为单分子膜使用X-(CH₂)n-OH，因而可以使单分子膜的膜厚保持均一，其膜厚可以控制在单位的水平。进一步，在其上形成的脂双层的膜厚也是均一的，因而可以很容易地将生物识别分子和受体在脂双层上排列整齐和进行定向，从而使受体的结合部位朝向上方。而且，利用该脂双层能够防止非特异性的检体被生物识别分子和受体吸附，提高检体的测定精度和可信性。

进一步，在专利文献3的生物芯片中，难以使肽分子的分子密度高于1mol(摩尔)/nm²，但在本发明的生物分子固定化基片中，单分子膜的分子密度可以大于或等于1mol/nm²，因此，根据本发明的生物分子固定化基片，可以增大单分子膜的分子密度、可以增强脂双层与基片的连接强度，因而可以使脂双层稳定，并可减小脂双层随时间变化。

而且，本发明的生物分子固定化基片中，可以利用例如表面活性剂来解离单分子膜和脂双层间的氢键，因而在使用后可以剥离脂双层，形成新的脂双层，据此可将生物分子固定化基片再生，从而使生物分子固定化基片的再利用成为可能。

本发明的生物芯片具有单分子膜、脂双层、生物识别分子、以及受体，所述单分子膜是将以X-(CH₂)n-OH(X为巯基)表示的分子排列在基片上的单分子膜；所述脂双层通过氢键与所述单分子膜连接，据此使该脂双层系留在所述基片上；所述生物识别分子固定于所述脂双层；所述受体固定于所述生物识别分子并与特定的蛋白质特异性地结合。例如，生物识别分子含有结合于脂双层的生物素以及与该生物素相结合的抗生物素蛋白，受体为生物素化的抗体。

本发明的生物传感器具备本发明的生物芯片并具有测定装置，所述测定装置用于检出是否存在作为检测对象的检体、检体的量、或者结合特异性等反应状态。更具体地，其是一种利用表面等离子共振的生物传感器。具体来说，其优选为下述生物传感器：在基片表面形成的Au薄膜(金属层)的膜厚或者Au粒子的直径为40nm～50nm，单分子膜的膜厚为小于等于1nm，脂双层的膜厚为5nm～10nm，用于表面等离子共振的光的波长为可见光。

本发明的生物芯片和生物传感器具有本发明的生物分子固定化基片同样的作用效果。进一步，在本发明的生物芯片和生物传感器中，由于单分子膜、脂双层的膜厚均一，因而可使受体与金属层的距离均一，在通过表面等离子共振等对检体进行测定时，可以减少噪音、提高测定精度。

本发明的生物分子固定化基片的制备方法是用于制备在基片上系留脂双层的生物分子固定化基片的方法，即具有在基片上形成单分子膜的工序和将脂双层系留在所述基片上的工序，所述在基片上形成单分子膜的工序中，将以X-(CH₂)n-OH(X为巯基)表示的分子利用其自体组织化排列在基片上，从而在基片上形成单分子膜；所述将脂双层系留在所述基片上的工序中，将脂质利用其自体组织化进行排列，以此形成脂双层，该脂双层通过氢键与所述单分子膜连接，据此使该脂双层系留在所述基片上。

用于本发明的生物分子固定化基片的单分子膜和脂双层均具有自体组织化的功能，因此，在制作生物分子固定化基片时，只要利用其自体组织化的功能得到单分子膜和脂双层，就会很容易地制备出生物分子固定化基片。

另外，本发明的上述说明的构成要素可以尽其可能地任意组合。

附图说明

图1为概略表示本发明的生物芯片的构成的图。

图2为表示单分子膜中所包含的亚甲基链的数目与单分子膜的膜厚的关系的图。

图3(a)-图3(f)说明在芯片基片表面上形成单分子膜的工序。

图4为示意性表示磷脂囊球的图。

图5(a)～图5(d)说明制备磷脂囊球的工序。

图6(a)和图6(b)说明将磷脂囊球附着于芯片基片上制备脂双层的工序。

图7为表示本发明的生物传感器的构造的概略图。

图8表示随着改变入射光的入射角，反射率所发生的变化，该变化通过生物传感器测定。

图9表示模拟中所用的模型。

图10为用表1的值表示反射率变化的图。

图11为用表2的值表示反射率变化的图。

图12为用表3的值表示反射率变化的图。

附图标记说明：

11生物芯片

12生物分子固定化基片

13生物传感器

21芯片基片

22金属层

23单分子膜

24脂双层

25磷脂

25a亲水性部分

25b疏水性部分

27生物识别分子

28受体

29生物素

30抗生物素蛋白

31检体

32生物素部位

51棱镜

52发光装置

53受光装置

具体实施方式

以下，根据附图详细说明本发明的实施例。

实施例1

图1为示意表示本发明的生物芯片11(即固定了受体的生物分子固定化基片12)的构成的图。在生物分子固定化基片12中，如以下的详细描述，其通过亲水性的单分子膜23将脂双层24系留在表面形成有金属层22的芯片基片21上。另外，生物芯片11在生物分子固定化基片12的脂双层24的上面固定生物识别分子27，受体28固定在生物识别分子27上。

芯片基片21是由玻璃、石英等具有透光性的材料形成的薄板。芯片基片21的上面固定有多个金属微粒，形成金属层22。

形成金属层22的金属微粒是直径为数10nm(特别是40～50nm)的Au、Ag等的纳米水平的无机金属微粒，几乎无凝集，以互相分离的状态固定。金属微粒的配置不需要有规则，随机分散即可。金属微粒之间的间隔(相邻的微粒表面之间的最小距离)优选为金属微粒直径的2倍～4倍。例如，如果金属微粒的密度约为每1平方微米370个微粒，则换算为被覆率约为0.17。

在金属层22的上面，分子通过自体组织化进行排列，形成亲水性单分子膜23，在其上系留脂双层24。该单分子膜23是以X-(CH₂)n-OH(X为巯基)表示的分子(间隔分子)通过自体组织化进行排列而形成的膜。各分子的巯基X固定于金属层22(或者芯片基片21)。这种构成亲水性单分子膜23的分子可以表示为硫代烷醇基：HS(CH₂)nOH。单分子膜23的膜厚优选小于等于1nm，越薄越好。

对于脂双层24，其中两亲性的磷脂25通过疏水性部分25b朝向内侧相互对向而排列成2层。脂双层24与单分子膜23通过氢键进行连接，从而系留在芯片基片21的表面。但是，脂双层24并不直接与单分子膜23通过氢键结合，而是借助于脂双层24与单分子膜23之间的媒介26的水分子而互相结合。即，单分子膜23通过将巯基X附着于金属层22而固定于芯片基片21，单分子膜23的羟基-OH与水分子以氢键结合，并且水分子与脂双层24的亲水性部分(磷脂25的亲水性部分25a)以氢键结合，其结果就是，脂双层24通过单分子膜23系留于芯片基片21。脂双层24的膜厚度优选为5～10nm，优选膜厚度薄。

这样，由于脂双层24与单分子膜23通过氢键以比较弱的力结合，因而脂双层24柔性地系留在芯片基片21上，所以，在此生物芯片11中，脂双层24不易失活，脂双层24的寿命也增长。而且，由于脂双层24柔性地系留在芯片基片21上，因而脂双层以及与其结合的生物分子的流动性不易受到阻碍，可以在维持生物分子原本的功能或活动性的情况下对其进行观察。

上述单分子膜23的分子密度优选为每1平方纳米1摩尔(lmolecules/nm²)或更高。在论文“表面固定化的人工亮氨酸拉链蛋白的pH依赖性行为(pH-Dependent Behavior of Surface-immobilized ArtificialLeucine Zipper Protains)(Molly M.Stevens等，Langmuir 2004，20，7747-7752 American Chemical Society)的第7749页中，记载了将肽以708ng/cm²的密度固定在Au膜上，将此值换算为摩尔密度为0.5mol/nm²。这被认为是在Au膜上形成的肽的摩尔密度的最大值。然而，根据论文“硫代链烷醇自体组织化膜”(Deboirs L.H.& Nuzzo，R.G.(1992)Annu.Rev.Phys.Chem.43：437)，作为硫代链烷醇中的一种的HS-(CH₂)₁₁-OH(Mw＝204.37)的密度为157ng/cm²，换算为摩尔密度为4.8mol/nm²。

因此，如果采用亲水性的单分子膜23，则可使分子以高于专利文献3中的肽分子密度的高密度进行排列，特别是可以以每1平方纳米1摩尔(1mol/nm²)或更高的密度进行排列。这样，根据本发明的生物芯片11，可以使单分子膜23的分子密度增大，通过增大单分子膜23的分子密度，可以增强脂双层24与金属层22的结合强度，因而可使脂双层24稳定，并且使脂双层24的随时间的变化也减小。或者说，通过调整单分子层23的分子密度，使得调整脂双层24的结合强度成为可能。

另外，在论文“肽衍生的自我装配单层结构：N-硬脂酰L-半胱氨酸甲基酯在金上的吸附”(Peptide-derived Self-assembled Monolayers：Adsorption of N-Stearoyl L-Cysteine Methyl Ester on Gold)(Susan L.Dawson和David A.Tirrell：Journal of Molecular Recognition，Vol.，10，18-25(1997))中，报告了肽分子在Au膜上的肽层积膜中的无序性(disorder)。因此，专利文献3中记载的肽分子的单分子膜中，很难将肽分子的膜厚控制为恒定值。

与此相对，在本发明单分子膜23中，可以使膜厚保持均一，并且可将膜厚控制在单位的水平。附图2为从论文“有机硫醇从溶液向金的自发性装配所形成的单层膜”(Formation of Monolayer Films by theSpontaneous Assembly of Organic Thiols from Solution onto Gold)(Collin D.Bain等，J.Am.Chem.Soc.1989，111，321-335)转载的一个表，该表显示了将HS(CH₂)nOH₃化学吸附在Au薄膜上时的单分子膜的膜厚的试验值，其中采用椭圆偏振仪进行计测。在附图2中，横轴表示单分子膜中的亚甲基链的数目n，纵轴表示单分子膜的膜厚。从图2可以获知，亚甲基链的数目n与单分子膜的膜厚之间在级别上被认为是呈线性变化的。因此，根据本发明的生物芯片11，通过控制构成单分子膜23的X-(CH₂)n-OH中的亚甲基链的数目n，可以得到具有均一膜厚的单分子膜23，同时可以对单分子膜23的膜厚进行自由地调节。

脂双层24上固定的生物识别分子27含有生物素29和抗生物素蛋白30。生物素29固定于脂双层，抗生物素蛋白30与生物素29相结合。或者，若使用的脂双层含有生物素化的磷脂，则抗生物素蛋白可直接固定于脂双层。

受体28选择与特定的检体31(蛋白质)特异性结合的抗体，该受体被生物素化。此受体28的生物素部位32与生物识别分子27的抗生物素蛋白30相结合，受体28据此固定于生物识别分子27。

根据本发明的生物芯片11，如上述，由于可使单分子膜23的膜厚保持均一，因而在其上形成的脂双层24的膜厚也是均一的。由此很容易将脂双层上的生物识别分子27和受体28排列整齐和进行定向，可以使受体28的结合部位朝向上方。其结果就是，可以防止非特异性的检体被生物识别分子27、受体28吸附，从而提高生物芯片11的测定精度和可信性。

接下来，根据附图3～6说明上述生物芯片11的制备方法。首先，如图3(a)所示，在100％乙醇溶液41中加入硫代烷醇42(HS(CH₂)₁₁OH)，如图3(b)那样将硫代烷醇42溶解于乙醇溶液41。

接下来，如图3(c)所示，将单面覆有金属层22(膜厚为40～50nm的Au薄膜)的芯片基片21置于上述乙醇溶液41中浸渍1小时。一旦将芯片基片21浸渍到乙醇溶液41中，如图3(d)所示，溶解于乙醇溶液41中的硫代烷醇42就会在金属层22的表面进行自体组织化并析出。然后，如图3(e)所示，在金属层22的上面形成含有硫代烷醇42的单分子膜23。

然后，将芯片基片21从乙醇溶液41中取出，进行清洗，然后进行干燥，如图3(f)示，在芯片基片21上得到目的单分子膜23。这样得到的单分子膜23中，各硫代烷醇42的巯基固定于金属层22上，已知各硫代烷醇42以数十度倾斜的状态互相平行排列。

接下来制备磷脂囊球43。所谓囊球(vesicle)，是指磷脂的疏水性部分互相会合，亲水性部分与水溶液层接触形成双层，其双层呈如图4所示的闭合球状。

制备囊球43时，如图5所示，在烧瓶等中装入磷脂25。作为磷脂，例如采用纯度高的1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。将此磷脂25在干燥的Ar气体氛围气中进行干燥，然后进一步进行2小时的真空干燥。这样，如图5(b)所示，磷脂25被干燥，然后加入水使磷脂25混悬，如图5(c)所示，进行超声波处理使磷脂25得到充分搅拌成为均质。接下来，如图5(d)所示，超速离心取上清液，将上清液保存于4℃。此上清液包含直径为数10nm或以下的磷脂25的囊球43。

接下来，如图6(a)所示，将包含囊球43的悬浊液滴加在表面形成有单分子膜23的芯片基片21的规定区域，或者将芯片基片21浸渍在包含囊球43的悬浊液中。这样，囊球43在单分子膜23的上面破裂散开，连锁发生所破裂的脂双层24间的融合，并自体组织化，如图6(b)所示，在芯片基片21的单分子膜23的上面形成脂双层24。另外，在图6(a)、图6(b)中，芯片基片21上由光致抗蚀剂形成隔壁44。其用于固定各种不同受体、实现各种不同受体的阵列化。

若如上制备生物分子固定化基片12，则由于单分子膜23和脂双层24均通过自体组织化在芯片基片21上很容易地形成，因而可以容易地制备得到生物芯片11。

接下来，根据图7说明采用本实施例的生物芯片11的生物传感器13，其可以利用表面等离子共振通过光学理论检测出是否存在作为检测对象的检体31、检体的量、或者结合特异性等反应状态。

该生物传感器13含有上述生物芯片11和测定装置。测定装置由直角三角形的棱镜51、发光装置52和受光装置53组成。棱镜51与生物芯片11的芯片基片21的下面紧密接合。发光装置52发射可见光区(例如波长为635nm)的激光束，其位于棱镜51的斜下方，与一个棱镜斜面对向配置。受光装置53位于棱镜51的斜下方，与另一个棱镜斜面对向配置，将其配置为可以接收下述光，所述光由发光装置52发出，透过棱镜51和芯片基片21、并经金属层22反射。而且，发光装置52和受光装置53由于棱镜的旋转而可以移动，通过移动发光装置52可以变化调节对生物芯片11的光入射角度。

对生物芯片11进行设置，使得受体28与分析样品液的流路直接接触。因此，若在此分析样品液中包含有与受体28特异性结合的检体31，则该检体31与固定于生物芯片11上的受体28特异性地结合，从而固定于生物芯片11的表面。检体31一旦被固定于受体28，金属层22附近的折光率就会随着所固定的检体31的量而发生变化。

该生物传感器13可以利用表面等离子共振检测出是否存在检体31、与受体28结合的检体31的量、或者结合特异性等反应状态。也即，从发光装置52发射激发光，该激发光以在芯片基片21和金属层22的界面的入射角大于在该界面中全反射的临界角的角度进行发射。透过棱镜51和基片21的激发光在金属层22和芯片基片21的界面全反射。此时在金属层22的上面产生瞬逝光(evanescent light)，瞬逝光的电场透过金属层22、受体28，沿着金属层22的上面扩展。

由于瞬逝光不向金属层22的上方射出，而只局限于金属层22上面的极狭小的区域，所以，瞬逝光与结合于受体28的检体31相互作用，而不与未固定于受体28的检体31相互作用。

因此，受光装置53接收的反射光会随着固定于受体28上的检体31的量或密度等而变化。由此可通过分析受光装置53接收的光的反射率来测定固定于受体28的特异性的检体的量、密度等。

例如，移动发光装置52使得射向生物芯片11的光的入射角变化，同时由受光装置53测定反射光的强度，测定入射角和反射率的变化，则观察到如图8所示的曲线。然后，由这个共鸣角(反射率最小时的入射角)以及共鸣角中的反射率的值等可以得到有关检体31的信息。

在这种生物传感器13中，如前述，由于生物芯片11的单分子膜23和脂双层24的膜厚可以保持均一，因而受体28和金属层22间的距离也可以达到均一，当通过表面等离子共振检测检体时，可以使噪音变小、测定精度提高。而且，由于可将单分子膜23的膜厚控制在单位水平，因而可以调整单分子膜的膜厚(特别是使单分子膜的厚度变薄)，以使受体、检体位于生物传感器13的检测灵敏度高的位置，从而可以制备出S/N比良好的生物传感器13。

因此，采用这样的生物传感器可以用于例如调查血液中是否存在病原体、以及医疗或健康诊断等用途。而且，可以对食品中所包含的蛋白质的种类等进行检测，也可用于食品检测和环境监测等用途。进一步，可以通过核对个人特异性的检体，而用于安全保卫或个人识别的用途。

而且，对于这种生物芯片11，可以通过表面活性剂将其单分子膜23和脂双层24之间的结合解离。作为表面活性剂，例如可以采用SDS：十二烷基硫酸钠H₃C-(CH₂)₁₀-CH₂OSO₃-Na⁺，将使用后的生物芯片11浸渍于SDS溶液中，就可以将单分子膜23与脂双层24解离。由此，可以很容易地将脂双层24从使用后的生物芯片11上剥离掉，通过重新在单分子膜23上形成新的脂双层24可以使生物芯片11再生，从而使生物芯片11的再利用成为可能。

最后，对本发明的生物传感器性能的模拟结果进行说明。模拟中使用的模型如图9所示。芯片基片21用折射率为1.52的透明的基片制作。金属层22用膜厚为50nm的Au层制备。单分子膜23的折射率为1.5，膜厚为2nm。脂双层24的折射率为1.49，膜厚为5nm。而且，生物识别分子27的折射率为1.57，膜厚为10nm。另外，包含检体的样品溶液的折射率为1.33。

以这样的模型为基础，使单分子膜23的膜厚在2nm和0.1nm之间变化，研究共鸣角和反射率的变化。另外，使脂双层24的膜厚在10nm和5nm之间变化，研究共鸣角和反射率的变化。还使金属层22的膜厚在80nm和30nm之间变化，研究共鸣角和反射率的变化。但是，入射光的波长为635nm，入射光的入射角在20°至90°之间变化。

下述表1求出了单分子膜23的膜厚变化为2nm、1nm、0.1nm时共鸣角和反射率的变化结果。图10为用表1的值表示反射率变化的图。由表1和图10的结果可以获悉，随着单分子膜23的膜厚逐渐变薄，共鸣角和反射率也逐渐变小，特别是反射率相对于单分子膜23的膜厚呈线性变化。因为反射率变小，测定精度提高，所以优选将单分子膜23的膜厚变薄。

表1

单分子膜的膜厚	共鸣角	反射率
			0.1nm	75.94°	1.379383944％
1nm	76.2°	1.507965971％
			2nm	76.5°	1.666544391％
最大值-最小值	0.56°	0.287160447％

下述表2求出了将脂双层24的膜厚变化为10nm、8nm、5nm时共鸣角和反射率的变化结果。图11为用表2的值表示反射率变化的图。由表2和图11的结果可以获悉，随着脂双层24的膜厚逐渐变薄，共鸣角和反射率也逐渐变小，特别是反射率相对于脂双层24的膜厚呈线性变化。因为反射率变小，测定精度提高，所以优选将脂双层24的膜厚变薄。

表2

脂双层的膜厚	共鸣角	反射率
			5nm	75.94°	1.379383944％
8nm	76.77°	1.826131443％
			10nm	77.35°	2.211593916％
最大值-最小值	1.41°	0.832209972％

下述表3求出了将金属层22的膜厚变化为80nm、55nm、50nm、45nm、40nm、30nm时共鸣角和反射率的变化的结果。图12为用表3的值表示反射率变化的图。由表3和图12的结果可以获悉，随着金属层22的膜厚逐渐变薄，共鸣角也逐渐变小。而与此相对，如图12所示，反射率在金属层22的膜厚为80nm和30nm之间显示出最小值。由此可知，金属层22的膜厚存在一最适值(在该模拟中约为45nm)，金属层22的膜厚优选在这个最适值附近。

表3

金属层的膜厚	共鸣角	反射率
			30nm	74.21°	39.60166653％
40nm	75.16°	8.377147983％
			45nm	75.58°	0.748002477％
50nm	75.94°	1.379383944％
			55nm	76.23°	9.35319202％
80nm	76.91°	68.60292934％
			最大值-最小值	2.7°	67.85492687％

Claims (10)

1、一种生物分子固定化基片，其是将脂双层系留在基片上的生物分子固定化基片，其中，所述基片包含：

单分子膜，其是将以X-(CH₂)n-OH表示的分子排列在基片上的单分子膜，上式中的X为巯基；和

脂双层，该脂双层通过氢键与所述单分子膜连接，据此系留在所述基片上。

2、如权利要求1所述的生物分子固定化基片，其特征在于，所述单分子膜的分子密度是大于或等于1mol/nm²。

3、如权利要求1所述的生物分子固定化基片，其特征在于，所述基片具有含Au或Ag等无机材料的薄膜。

4、如权利要求1所述的生物分子固定化基片，其特征在于，所述单分子膜和脂双层之间的氢键能够解离。

5、一种生物芯片，其包含：

单分子膜，其是将以X-(CH₂)n-OH表示的分子排列在基片上的单分子膜，上式中的X为巯基；

脂双层，该脂双层通过氢键与所述单分子膜连接，据此系留在所述基片上；

生物识别分子，其固定于所述脂双层；和

受体，其固定于所述生物识别分子并与特定的蛋白质特异性地结合。

6、如权利要求5所述的生物芯片，其特征在于，所述生物识别分子含有生物素和抗生物素蛋白，所述生物素与脂双层相结合，所述抗生物素蛋白与该生物素相结合；所述受体是生物素化的抗体。

7、一种生物传感器，其具备权利要求5所述的生物芯片和测定装置，所述测定装置用于检出是否存在作为检测对象的检体、检体的量、或者结合特异性等反应状态。

8、如权利要求7所述的生物传感器，其特征在于，所述测定装置为采用表面等离子共振的装置。

9、如权利要求7所述的生物传感器，其特征在于，

在所述基片的表面形成Au薄膜，

所述Au薄膜的膜厚或者Au粒子的直径为40nm～50nm；

所述单分子膜的膜厚小于或等于1nm；

所述脂双层的厚度为5nm～10nm；

用于表面等离子共振的光的波长为可见光。

10、一种生物分子固定化基片的制作方法，其是用于制备在基片上系留脂双层的生物分子固定化基片的方法，所述方法包括：

在基片上形成单分子膜的工序，在该工序中，将以X-(CH₂)n-OH表示的分子利用其自体组织化排列在基片上，从而在基片上形成单分子膜，上式中的X为巯基；和

将脂双层系留在所述基片上的工序，在该工序中，将脂质利用其自体组织化进行排列，以此形成脂双层，该脂双层通过氢键与所述单分子膜连接，据此使该脂双层系留在所述基片上。

Images