CN102301960A - 一种建立康地6号油葵再生体系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种向日葵康地6号再生体系方法。通过将康地6号自交系子叶接种到附加不同激素组合的诱导培养基上诱导胚性愈伤，将诱导的胚性愈伤转接到分化培养基上高频分化不定芽，待不定芽生长到一定程度再将其转入到生长培养基上中进一步生长，最后再生植株进行嫁接移植；诱导培养基配方采用MS培养基、IAA1.2mg/L和6-BA 4.5mg/L；分化培养基配方采用MS培养基+IAA 0.01mg/L和6-BA 0.04mg/L；生长培养基配方采用2/5MS培养基。该发明对向日葵康地6号自交系具有再生频率极高、操作简单、周期较短等特性，具有重要应用价值。

Description

一种建立康地6号油葵再生体系的方法

发明领域

本发明涉及生物技术领域，具体说，本发明具体涉及一种建立油葵再生体系的技术领域。

背景技术

向日葵(Helianthus annuus L.)是世界四大油料作物之一，也是我国北方地区的主要油料作物，其作为油料或蛋白质资源日益受到人们的重视。组织培养不仅可生产大量的优良无性系，也可打破种属间的界限，克服远缘杂交及不亲和性障碍在向日葵新品种的培育和种性的改良中和基因工程技术的发展和应用中有着巨大的潜力。尽管向日葵植株再生方法已经得到长足发展，各种技术也已有报道，由于向日葵属于难培养植物，有许多因素制约着向日葵的植株再生。

幼胚培养技术在向日葵获得成功的报道越来越多。李映红等(李映红、郭仲琛、王伏雄.Immature embryo culture of sunflower[J].Acta BotanicaYunnanica(云南植物研究)，1998，10(1)：79-86)、Finer(Finer J J.Directsomatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos ofhybrid sunflower(Helianthus annuus L.)on a high sucrose containingmedium[J].Plant Cell Rep.，1987，6：372-374)、Freyssin等(Freyssinet M，Freyssinet G.Fertile plant regeneration from sunflower(Helianthusannuus L.)immature embryos[J].Plant Sci.，1988，56：177-181)、宋英凯等(宋英凯，张天星，崔国惠，等.向日葵未成熟胚培养中不定芽的发生〔J).华北农学报，1993，8(2)：112-115.〕刘海学(刘海学，季静，王萍，等.向日葵未成熟胚组织培养及再生芽的研究(J).内蒙古民族大学学报(自然科学版)，2003，18(5)：411-414.)都报道了在向日葵幼胚培养中体细胞胚胎的发生，从未成熟的合子中诱导出愈伤组织再由愈伤组织发生体细胞胚胎的间接途径，但再生器官的发生率不是很高，一般在2·5％-12％，而且形成的芽不易生长成植株，并且幼胚的获得还限制与生长季节，如在冬季使用温室将增加很多管理和种植成本。并且直到现在利用幼胚向日葵植株体细胞胚胎的再生仍然很困难，即使能再生重复前人试验也特别难。

在向日葵器官培养方面，Baker利用子叶(Baker M C，Munoa-FernandezN，Carter C D.Improved shoot development and rooting from maturecotyledons of sunflower[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1999，58：39-49.)建立向日葵再生体系，包括无菌苗种到1/2MS培养基附加15g/L蔗糖+6g/L琼脂。取无菌苗切取子叶节接到MS培养基附加0.5mg/L NAA+1mg/L6BA诱导愈伤4周，芽诱导利用MS培养基附加0.5mg/L NAA+1mg/L6 BA，然后转移到MS培养基上分化，MS培养基附加0.5mg/L BA+0.01mg/L NAA。最高能产生平均87％不定芽分化，每个子叶节最高产生5.4个芽。生根培养基利用1/2MS并附加少量的NAA和炭粉。Puniam等利用MS培养基附加0.5mg/L BA+0.05mg/LNAA组合诱导出向日葵子叶节，叶片，茎尖，下胚轴等不同外置体愈伤，继而在MS培养基附加0.5mg/L BA+0.1mg/L GA3+500mg/L CA分化培养基上得到分化不定芽，分化频率不同品种在5-80％不等，最后通过无激素MS培养基生根得到全苗。上述国外报道都利用不同的材料和激素配比，所得的结果也不尽相同，我们也利用过自己材料及其上述报道培养基无法得到相似的结果。而且有些向日葵品种生根非常困难。因此国外的向日葵再生体系由于所用材料不同很难加以有效利用。

在向日葵器官培养方面，国内最早卫志明报道利用MS培养基附加2，4-D 0.5mg/L和6BA0.5mg/L进行愈伤诱导，愈伤组织转入分化时，每升附加0.2mg/L的NAA和1mg/L的6BA；诱导生根的培养基为不加任何激素的1/2MS培养基，得到最高60％的分化率(卫志明，许智宏.向日葵组织培养和植株再生[J].植物生理学通讯，1983(5)：42-45.)。马雪霞等利用6苄基腺嘌呤(6BA)和IAA之比为5∶1时，诱导出最大芽率在为62.5％(马雪霞，蓝海燕，宋荣，等.向日葵的组织培养及芽分化的研究〔J).新疆农业科学，2002，39(1)：23-24.)。刘海学等(刘海学，季静，王萍，等.向日葵未成熟胚组织培养及再生芽的研究(J).内蒙古民族大学学报(自然科学版)，2003，18(5)：411-414)利用向日葵未成熟胚进行诱导，在MS+0.03mg/L的IAA+1.2mg/L的6-BA的培养基上最高诱导出芽为73％。总体上诱导出芽的频率与特定基因型有关，而且受各种因素影响芽不易长成植株，如：早熟、早开花、玻璃化现象和褐化现象严重、生根率低等，这些都影响其培养效果。

综上所述，现有技术在向日葵的组织培养方面做了大量的工作，但还存在一些问题，到目前为止建立一个成熟的再生体系，仍是向日葵组培工作的一个研究重点。因此在今后的研究中，应继续探索建立高效的再生体系，缩短培养时间，提高再生频率，以利于向日葵的育种及利用基因工程进行向日葵的品种改良。

发明内容

尽管向日葵植株再生方法已经得到长足发展，但是由于向日葵属于难培养植物，有许多因素制约着向日葵的植株再生。本发明目的在于建立一种康地6号油葵再生体系的方法，该发明对向日葵康地6号自交系具有高频再生率，获得的再生植株时间较短且再生植株成活率较高等特性。

本发明的技术方案：通过将向日葵康地6号自交系接种到附加不同激素组合的诱导培养基上，将诱导的向日葵不定芽转接到分化培养基上高频分化再生苗，再将再生苗转入到生长培养基上中进一步生长，得到再生植株，对再生植株嫁接优化，再生植株成活率高。

具体的，本发明提供了一种建立康地6号油葵再生体系的方法，具体步骤如下：

(1)无菌油葵幼苗获得：取康地6号油葵种子，用70％的酒精溶液浸泡10min，用10％的过氧化氢溶液消毒30min，再无菌水冲洗2遍，最后接种于无激素的1/2MS培养基上，培养室温度为26℃-28℃，光照时间16h，光强2000LX，生长3天。

(2)油葵愈伤组织的诱导：选取生长健壮的无菌苗于靠近生长点1-2mm处切取子叶，将子叶切口处插入培养基中5mm深度，诱导2-3周，诱导出的大量的愈伤组织；诱导培养基配方为：MS培养基+IAA1.2mg/L+6-BA 4.5mg/L；

(3)不定芽分化进程：将外植体愈伤，其3-4mm厚，颜色为淡黄色，连同子叶和愈伤转入分化培养基诱导其分化，愈伤面接触培养基；2-3周内在接触培养基的愈伤表面，会分化出许多小的不定芽；当不定芽伸长到1cm时，及时从愈伤块上切下来，转至葡萄糖减半的MS培养基上培养；分化培养基配方为：MS培养基、IAA 0.01mg/L、6-BA 0.04mg/L；

(4)不定芽生长：当不定芽进一步伸长到3cm时，再转至无激素的生长培养基上培养，再生苗可很快生长成苗；生长培养基配方为：2/5MS培养基；

(5)再生植株的嫁接：选用生长发育良好的具有1片真叶的实生苗做砧木，4片真叶的再生苗基部削尖作接穗，采用劈接法把接穗插入砧木，用韧性良好的塑料带绑缚结合部位；嫁接后，用塑料薄膜罩好保湿，放于通风并有散射光的地方，七天后揭罩通风解除绑绳进行常规管理。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下技术效果：

1.本发明中取康地6号油葵种子，用70％的酒精溶液浸泡，再用10％的过氧化氢溶液消毒30min，获得无菌苗基本无污染，生活力强。

2.建立康地1号油葵再生体系的方法，不定芽诱导率在90-98％之间，每个子叶诱导不定芽个数5-10个不等。并且三个多月内就能得到长势较好的再生苗，操作简便快捷。

3.本发明中省去生根步骤，获得再生苗直接嫁接成活，其成活率极高，节约时间，并且可以收获到后代种子，嫁接苗成活率可达90％，长势良好。

附图说明

图1所示为康地6号油葵3-4日龄无菌苗幼胚接到诱导培养基图。

图2所示为向日葵子叶接种到诱导培养基诱导2周多的愈伤图。

图3所示为诱导的向日葵愈伤接到分化培养基上分化1周多时间的不定芽图。

图4所示为向日葵不定芽进一步伸长到3cm时生长图。

图5所示为向日葵再生苗嫁接图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有：

主要原辅材料：康地6号油葵种子是由新疆康地种业公司提供。

主要试剂：70％的酒精(分析纯)，10％的过氧化氢，MS培养基、IAA、6-BA；NAA；灭菌水

主要仪器：SW-CJ＝18V型医用超净工作台，苏州净化设备安装公司；AEL-200电子天平，日本SHIMADZU公司；LRH-150-G型光照培养箱，上海仪器厂；医用高压蒸汽灭菌锅，上海医用核子仪器厂。

实施例一：

(1)无菌油葵幼苗获得：取康地6号油葵种子，用70％的酒精溶液浸泡10min，无菌水冲洗2遍，用10％的过氧化氢溶液消毒30min，再无菌水冲洗2遍，胚端朝上接种于无激素的1/2MS培养基上，培养室温度为26℃-28℃，光照时间16h，光强2000LX，生长3天。参见附图1

(2)油葵愈伤组织的诱导：选取生长健壮的无菌苗于靠近生长点1-2mm处切取子叶，将子叶切口处插入培养基中大约5mm深度，诱导2-3周，诱导出的大量的愈伤组织，90％外置体可以获得愈伤组织；诱导培养基配方为：MS培养基+IAA1.2mg/L+6-BA 4.5mg/L；参见附图2

(3)不定芽分化进程：将外植体愈伤，其大小约3-4mm厚，颜色为淡黄色，连同子叶和愈伤转入分化培养基诱导其分化，愈伤面接触培养基。2-3周内在接触培养基的愈伤表面，会分化出许多小的不定芽(5-10个)。当不定芽伸长到1cm时，及时从愈伤块上切下来，转至葡萄糖减半的MS培养基上培养；高达90％愈伤可以分化不定芽。分化培养基配方为：MS培养基、IAA 0.01mg/L、6-BA0.04mg/L；参见附图3

(4)不定芽生长：当不定芽进一步伸长到3cm时，参见附图5，再转至无激素的2/5MS生长培养基上培养，再生苗可很快生长成苗；生长培养基配方为：2/5MS培养基；参见附图4

(5)再生植株的嫁接：选用生长发育良好的具有1片真叶的实生苗做砧木，4片真叶的再生苗基部削尖作接穗，采用劈接法把接穗插入砧木，用韧性良好的塑料带绑缚结合部位；嫁接后，用塑料薄膜罩好保湿，放于通风并有散射光的地方，七天后揭罩通风解除绑绳进行常规管理，80％以上嫁接苗可以成活。参见附图5

实施例二：

详细的再生体系建立过程如下：无菌油葵幼苗获得：取康地6号油葵种子，用70％的酒精溶液浸泡10min，无菌水冲洗2遍，用0.1％的升汞溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗2遍，胚端朝上接种于无激素的1/2MS培养基上，培养室温度为26℃-28℃，光照时间16h，光强2000LX，生长3天左右，长出的无菌苗比较弱小，部分种子不能萌发。油葵愈伤组织的诱导：选取萌发的无菌苗于靠近生长点1-2mm处切取子叶，将子叶切口处插入诱导培养基中大约5mm深度，诱导2-3周，诱导出愈伤组织；可能由于升汞对材料的杀伤，愈伤组织量较少，诱导率大约为45％。诱导培养基配方为：MS培养基+IAA1.2mg/L+6-BA 4.5mg/L。不定芽分化进程：将外植体愈伤，其大小约3-4mm厚，颜色为淡黄色，连同子叶和愈伤转入分化培养基诱导其分化，愈伤面接触培养基。2-3周内在接触培养基的愈伤表面，会分化出许多小的不定芽。当不定芽伸长到1cm时，及时从愈伤块上切下来，转至葡萄糖减半的MS培养基上培养；分化苗较弱，分化率大约为72％。分化培养基配方为：MS培养基、IAA 0.01mg/L、6-BA 0.04mg/L。分化苗生长：当不定芽进一步伸长到大约3cm时，再转至无激素的2/5MS培养基上培养，可很快生长成苗。再生植株的嫁接：选用生长发育良好的具有1片真叶的实生苗做砧木，4片真叶的再生苗基部削尖作接穗，采用劈接法把接穗插入砧木，用韧性良好的塑料带绑缚结合部位。嫁接后，用塑料薄膜罩好保湿，放于通风并有散射光的地方。一星期后揭罩通风解除绑绳进行常规管理。通过这种方式的嫁接苗成活率大约73％，长势一般。

实施例三：

本发明包括无菌油葵幼苗获得，油葵愈伤组织的诱导、不定芽分化和分化苗生根以及嫁接成活。详细的再生体系建立过程如下：无菌油葵幼苗获得：取康地6号油葵种子，用70％的酒精溶液浸泡10min，无菌水冲洗2遍，再用10％的过氧化氢溶液消毒30min，最后用无菌水冲洗2遍，胚端朝上接种于无激素的1/2MS培养基上，培养室温度为26℃-28℃，光照时间16h，光强2000LX，生长3天左右，无菌苗长势较健壮。油葵愈伤组织的诱导：选取生长健壮的无菌苗于靠近生长点1-2mm处切取子叶，将子叶切口处插入诱导培养基中大约5mm深度，诱导2-3周，诱导出的大量的愈伤组织；诱导培养基配方为：MS培养基+不同激素浓度的MS培养基中(见下表)，观察不同激素浓度配比下外植体的愈伤发生情况。

结果对2，4-D来说与KT或6-BA的不同浓度组合，效果都不好，虽然诱导出的愈伤量很大，但多表现为蓬松的白色，有时透明状，这样的愈伤很难分化出不定芽。对IAA来说，其IAA1.2mg/L+6-BA 4.5mg/L，对愈伤的诱导效果最好，高达90％。

不定芽分化进程：将IAA1.2mg/L+6-BA 4.5mg/L诱导的外植体愈伤，其大小约3-4mm厚，颜色为淡黄色，连同子叶和愈伤转入分化培养基诱导其分化，愈伤面接触培养基。2-3周内在接触培养基的愈伤表面，会分化出许多小的不定芽。当不定芽伸长到1cm时，及时从愈伤块上切下来，转至葡萄糖减半的MS培养基上培养；分化培养基配方为：MS培养基、IAA 0.01mg/L、6-BA 0.04mg/L。分化苗生长：当不定芽进一步伸长到大约3cm时，再转至无激素的2/5MS培养基上培养，可很快生长成苗。再生植株的嫁接：选用生长发育良好的具有1片真叶的实生苗做砧木，4片真叶的再生苗基部削尖作接穗，采用劈接法把接穗插入砧木，用韧性良好的塑料带绑缚结合部位。嫁接后，用塑料薄膜罩好保湿，放于通风并有散射光的地方。一星期后揭罩通风解除绑绳进行常规管理。通过这种方式的嫁接苗成活率可达90％，长势良好。

Claims (1)

1.一种建立康地6号油葵再生体系的方法，其特征在于，所述的具体方法步骤如下：

(1)无菌油葵幼苗获得：取康地6号油葵种子，用70％的酒精溶液浸泡10min，再用10％的过氧化氢溶液消毒30min，最后接种于无激素的1/2MS基本培养基上，培养室温度为26℃-28℃，光照时间16h，光强2000LX，生长3天；

(2)油葵愈伤组织的诱导：选取生长健壮的无菌苗于靠近生长点处切取子叶插入培养基中培养；诱导2-3周，导出大量的愈伤组织；诱导培养基配方采用MS培养基、IAA1.2mg/L和6-BA 4.5mg/L；

(3)不定芽分化进程：将外植体愈伤，转入分化培养基诱导其分化，2-3周在接触培养基的愈伤表面，会分化出许多小的不定芽；分化培养基配方采用MS培养基+IAA 0.01mg/L和6-BA 0.04mg/L；当不定芽伸长到1cm时，及时从愈伤块上切下来，转至葡萄糖减半的MS培养基上培养；

(4)不定芽生长：当不定芽进一步伸长到3cm时，再转至无激素的生长培养基上培养，再生苗可很快生长成苗；生长培养基配方采用2/5MS培养基；

(5)再生植株的嫁接：选用生长发育良好的具有1片真叶的实生苗做砧木，4-6片真叶的再生苗基部削尖作接穗，采用劈接法把接穗插入砧木，用韧性良好的塑料带绑缚结合部位；嫁接后，用塑料薄膜罩好保湿，放于通风并有散射光的地方，一星期后揭罩通风解除绑绳进行常规管理。

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