CN102293979B

CN102293979B - 一种中药组合物在制备抗病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN102293979B
Application number: CN 201110249260
Authority: CN
Inventors: 刘剑; 胡松谋
Original assignee: YUNHE PHARAMCEUTICAL CO Ltd YUNNAN
Current assignee: YUNNAN YUNHE PHARMACEUTICALS Inc
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2031-08-26
Also published as: CN102293979A

Abstract

本发明公开了一种中药组合物在制备抗柯萨奇病毒COX-V和肠道病毒EV-71的药中的应用。其中所述的中药组合物由蜘蛛香250份、木香70份、草果100份和糯米80份重量份的原料药组成，将所述重量份的糯米粉碎为细粉；草果与蜘蛛香、木香混合均匀，粉碎为粗粉，将粗粉加入到乙醇溶液中进行加热回流提取、滤过，得到的滤液在减压条件下浓缩为稠膏后与糯米细粉混匀后干燥即得。试验数据表明该中药组合物具有抗肠道病毒的作用，从而为该药治疗EV-71、COX-V病毒感染的疾病奠定了基础，扩大了该药的临床适用范围。

Description

一种中药组合物在制备抗病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于治疗病毒感染的药物技术领域，具体地讲，涉及一种以蜘蛛香、木香、草果以及糯米为原料制备成的中药组合物在抗病毒中的应用。

背景技术

致病病毒通常是一种结构简单的核酸颗粒，因其缺乏酶系统而只能依赖宿主细胞复制自身的核酸和蛋白质，然后装配成病毒颗粒进行增殖。各种病毒感染是引起人类疾病的主要因素之一，严重危害着人们的健康和生命。

据不完全统计，约有60％的流行性传染病是由病毒感染引起的。迄今为止，人类已发现的致病病毒已超过3000种，其中有1200多种病毒可引起各类病毒性疾病。如发病率高、危害大的乙肝病毒(HBV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒(HSV、HZV)、流感病毒(甲、乙、丙)等等，临床上常用的药物主要有：抑制病毒复制的抗病毒药；增强机体免疫功能的免疫调节剂；针对临床症状的止咳、镇痛、解热、消炎的治疗药物；防止继发性感染的抗感染药；预防病毒感染的疫苗及阻断病毒传播的消毒药等等。但这些药物仍缺乏专属性，在某种意义上说仅起到抑制病毒的作用，抑制病毒的繁殖，使宿主免疫系统抵御病毒侵袭，修复被破坏的组织达到缓和病情、不出现临床症状的效果；迄今为止，尚无令人满意的抗病毒药问世。加紧研制高效、低毒、选择性高且价格便宜、使用方便的抗病毒药，仍是一艰巨的任务。

肠道病毒EV-71和柯萨奇病毒COX-V也是两种致病性很高、很严重的病毒。目前已知EV71感染可以导致手足口病、疱疹性咽颊炎、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病。COX-V感染可以导致许多疾病，从较轻的呼吸道感染到比较严重的心肌炎、心包炎及神经系统的一些疾病(脑膜炎、轻度麻痹)、手足口病，甚至可以引起婴幼儿死亡。因此，寻找抗此类病毒的药物更是当务之急。

在采用中药抗病毒的研究中，大多集中于抗柯萨奇B组病毒、埃可病毒，而且多为单味药，如金银花、连翘、黄芪及甘草等等，尚未见到利用中药组合物在抵抗上述EV-71和COX-V两种病毒病毒的研究与应用，属现有技术中需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以蜘蛛香、木香、草果和糯米为原料制备成的中药组合物在抗病毒中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为质量百分数。

一种中药组合物在制备抗柯萨奇病毒COX-V和肠道病毒EV-71药物中的应用，其中所述中药组合物的原料为蜘蛛香250份、木香70份、草果100份和糯米80份。

所述中药组合物通过下述方法制备而成：

(1)按照下述重量份称取各原料药备用：蜘蛛香250份、木香70份、草果100份和糯米80份，备用；

(2)将所述重量份的糯米粉碎过100目筛为辅料细粉备用；

(3)将所述重量份的草果，与蜘蛛香和木香混合均匀，备用；

(4)将所述混合均匀的蜘蛛香、木香和草果粉碎过20目筛得混合粗粉；用浓度为70％的乙醇溶液充分湿润后，再加入三倍于粗粉重量的浓度为70％的乙醇溶液，加热回流提取两次，每次时间为2小时，合并提取液，滤过；

(5)将滤液在减压条件下浓缩成相对密度为1.10～1.20的稠膏；

(6)加入糯米细粉并充分混匀，于60℃温度下干燥，粉碎即得中药组合物。

所述药物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊、滴丸剂。

应用所述中药组合物时，以常规的制剂工艺，与其他药物辅料配合制备成临床上可以使用的不同剂型，如颗粒剂、片剂、胶囊剂和滴丸剂等，可有效地治疗肠道病毒引起的疾病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

目前以蜘蛛香、木香、草果和糯米为原料制成的药物制剂，如香果健消片、香果健消胶囊，在国家批准的质量标准中及临床应用中仅为健胃消食用药。本发明发现了其在抗肠道病毒的作用，从而为该药治疗EV-71、COX-V病毒感染的疾病奠定了基础，扩大了该药的临床适用范围。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，首先制备得到中药组合物片剂，然后用该片剂的体内外药效学试验结果来说明其在抗萨科奇病毒和爱克病毒的功效作用。

实施例1

按照下述重量份称取各原料药备用：蜘蛛香250份、木香70份、草果100份和糯米80份，备用；将所述重量份的糯米粉碎过100目筛为细粉，作为辅料备用；将所述重量份的草果，与蜘蛛香和木香混合均匀，备用；将所述混合均匀的的蜘蛛香、木香和草果粉碎过20目筛得混合粗粉；用浓度为70％的乙醇溶液充分湿润后，再加入三倍于粗粉重量的浓度为70％的乙醇溶液，加热回流提取两次，每次时间为2小时，合并提取液，滤过；将滤液在减压条件下浓缩成相对密度为1.10～1.20的稠膏，加入糯米细粉并充分混匀，于60℃温度下干燥，粉碎即得中药组合物(又称香果健消浸膏)。

将制得的中药组合物，加入适量辅料混匀，经过制粒、烘干、整粒、压片，或填囊或分装，即得所需的片剂、胶囊剂、颗粒剂或将中药组合物按照制备滴丸剂的常规方法制备滴丸剂。

试验例1抗EV-71和Cox-V病毒的体外药效学试验

1实验材料和方法

1.1药物选择实施例1制备的中药组合物为本次的抗病毒实验药物。

1.2细胞株Vero-E6细胞，中国科学院武汉病毒研究所病毒资源中心保存

1.3病毒株肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV-71)、柯萨奇A组5型(Coxsackievirus，Cox-V)，中国科学院武汉病毒研究所病毒资源中心保存。

1.4主要试剂：培养基IMDM为美国Sigma公司产品；胎牛血清长春生物制品研究所产品；胰蛋白酶日本生产上海化学试剂厂分装。

1.5病毒TCID₅₀滴定：

分别将2种病毒(EV-71，Cox-V)病毒进行10倍递减稀释为10^-1，10^-2，10^-3......10^-6不同稀释度，并将各种不同稀释度的病毒感染Vero-E6细胞，用96孔板单层培养。观察细胞病变，测定各病毒半数致细胞病变剂量(TCID₅₀)。

结果判定及计算方法：以能使50％细胞孔发生CPE的最高稀释度作为终点，用karber法计算病毒滴度。

病毒TCID₅₀效价：EV-71TCID₅₀＝10^-4.8；Cox-V TCID₅₀＝10^-5.2公式

Log {TCID}_{50} = XM + \frac{1}{2} d - d \frac{ΣPi}{100}

其中，TCID₅₀：50％组织细胞感染量

XM：病毒最高浓度稀释度的对数

d：稀释度系数(倍数)的对数

∑pi：每个稀释度病变百分数的总和

1.6阳性对照药物：利巴韦林，郑州卓峰制药有限公司，国药准字H41023268，100mg/ml，生产批号：9101741。.

2方法

2.1细胞毒性试验

药物配制：取实施例1制备的中药组合物，以pH7.4的PBS为稀释液，采用倍比稀释法配制药物，即2²，2³，.....2¹⁰，经0.45μm滤膜过滤除菌，置4℃保存。

药物对细胞毒性测定：Vero-E6细胞培养，生长成单层细胞培养法，Vero-E6细胞接种于96孔板，待细胞长成单层后，加入不同浓度药物，培养4-6天，观察细胞毒性，每个浓度做2孔，重复2次，采用平均数值。同时设正常细胞对照。每天显微镜下观察细胞病变(CPE)。72h后，用MTT法检测细胞存活率，测定570nm波长OD值(A值)，以Probit回归方法计算药物半数中毒浓度(TD₅₀)。

细胞存活率＝药物组平均A组值/细胞对照组A值×100％

利巴韦林对Vero E6细胞的最大无毒浓度为100ug/ml(参考文献MurphyME，Kariwa H，Mizutani T，Tanabe H，Yoshimatsu K，Arikawa J，TakashimaI.Characterization of in vitro and in vivo antiviral activity of lactoferrin andribavirin upon hantavirus.J Vet Med Sci.2001Jun；63(6)：637-45.

不同浓度药物对细胞毒性测定结果：

(1)采用细胞病变法(CPE)和MTT染色法，检测药物对细胞存活率的影响。

细胞病变(CPE)判断，细胞增殖缓慢，胞质颗粒增多，形态改变呈不规则。

(2)MTT染色法检测细胞存活率测定，MTT染色法以活细胞代谢物还原剂3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下生成蓝色结晶，结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。结晶可在含50％的N，N-二甲基甲酰胺和20％的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm OD值，反映出活细胞数目。

(3)结果见表1

药物对细胞半数中毒浓度(TD₅₀)＝2⁴；药物最大无毒浓度(TD₀)＝2⁵，

表1不同浓度的药物致Vero-E6细胞病变和细胞存活率

2.2药物对细胞毒性结果

1)药物对细胞半数中毒浓度(TD₅₀)＝2⁴；药物最大无毒浓度(TD₀)＝2⁵。

2)稀释2^～4的药物抑制细胞生长并对细胞有毒性作用，随着浓度的降低，实施例1制备的中药组合物对细胞的毒性逐渐减小，并且细胞存活率大于1，显示低浓度的实施例1制备的中药组合物对细胞生长具有促进作用。

3药物体外抗病毒药效实验

Vero-E6细胞接种于96孔板，待细胞长成单层后，倾出培养液，分别加入EV-71TCID₅₀＝10^-4.8，Cox-V TCID₅₀＝10^-5.2病毒液50μl/孔，37℃吸附30’吸出病毒液，选用药物2⁴、2⁵、2⁶、2⁷、2⁸、2⁹、2¹⁰稀释液配置的细胞维持液，每个浓度做复孔(2孔)，加入病毒感染和对照的细胞孔内。置37℃培养，每天显微镜下观察细胞病变(CPE)。72h后，用MTT法检测细胞存活率

实验对照：

1)利巴韦林，PBS稀释为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml。

2)正常细胞

3)病毒+感染细胞

药物及阳性对照药物浓度

抗病毒药效实验结果

1)药物对EV-71病毒的细胞病变(CPE)和病毒抑制率(MTT)

2)药物对Cox-V病毒的CPE和病毒抑制率(MTT)

结论：

1、实施例1制备的中药组合物在2^-4～6浓度时，对体外细胞中EV-71病毒有明显的抑制作用，随药物浓度的降低药效作用减弱。

2、实施例1制备的中药组合物在2^-4～6浓度时，对体外细胞中Cox-V病毒有明显的抑制作用，随药物浓度的降低药效作用减弱。

3、实施例1制备的中药组合物稀释液对细胞生长具有促进作用。

试验例2抗EV-71和Cox-V病毒的体内药效学试验

1主要实验材料

1.3病毒株EV-71湖北株、柯萨奇A组5型病毒(Coxsackievirus，Cox-V)，中国科学院武汉病毒研究所病毒资源中心保存。

1.5实验动物：

SPF级ICR小鼠，3-7日龄乳鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证号SCXK(京)2007-0001)。用于EV-71病毒小鼠感染模型。

SPF级Balb/c小鼠，6周龄，体重16±1g，购自武汉大学实验动物中心。用于Cox-V小鼠感染模型。

1.6病毒TCID₅₀效价：EV-71TCID₅₀＝10^-6.8；Cox-V病毒TCID₅₀＝10^-7.2

1.7阳性对照药物：利巴韦林，郑州卓峰制药有限公司，国药准字H41023268

100mg/ml，生产批号9101741。

2方法

2.1药物对ICR乳鼠药毒耐受量测定

分别将实施例1制备的中药组合物做1/5，1/10，1/20，1/30，1/40倍稀释，分5组实验，7-8只/组，不同浓度株分别各组小鼠灌胃，0.3ml/次，1次/d，连续6d，追踪观察15d，记录动物异常症状和死亡。

实验结果：观察14天后不同稀释度的5组实验小鼠未表现异常。

2.2药物对ICR小鼠体内抑病毒实验

实验共设8个实验组(8窝)。分别为药物5个不同浓度组，利巴韦林组(10mg/kg/d)配置0.2mg/0.4ml/只/d；另设病毒阳性对照组、生理盐水阴性对照组。病毒剂量采用致死剂量(100LD₅₀)0.5ml/只，经腹腔注射接种。24h后灌胃给药，疗程6d。观察动物的临床症状和死亡时间，死亡数。所有动物用药后15d，收集各组动物治疗后的标本，包括脑、肺、肝组织样本，制成10％组织匀浆，混合进行病毒滴度测定，接种Vero-E6细胞，37℃培养，每天观察CPE，进行病毒TCID₅₀滴定。

2.3实验观察

小鼠感染病毒后，经过短暂潜伏期(1d)，便进入发病状态。出现厌食、呆滞和嗜睡等精神症状开始，继而出现畏寒(隆身、群聚)、发热(盗毛、耳部末梢血管充血)腹泻，症状递进致死亡。动物感染病毒和治疗过程中情况分为3种，一是感染后出现发病症状，几天后衰竭死亡；二是是出现发病症状，治疗后又恢复正常；三是感染后不出现任何症状，与未感染病毒的对照鼠一样，发育正常。从存活率和平均存活时间看，各组动物间已显示出明显差异。

2.4实验结果

(1)实施例1制备的中药组合物对EV-71病毒感染小鼠存活率和组织中病毒滴度(TCID₅₀)(见下表)

(2)实施例1制备的中药组合物对Cox-V病毒感染小鼠存活率和组织中病毒滴度(TCID₅₀)(见下表)

结论：实施例1制备的中药组合物在1//5～1/20倍稀释时，对EV-71病毒感染的ICR乳鼠有抗病毒药效，抗病毒作用随着药物浓度的降低药效作用减弱。

2、实施例1制备的中药组合物在1//5～1/20倍稀释时，对Cox-V病毒感染的ICR乳鼠有抗病毒药效，随着药物浓度的降低药效作用减弱。

Claims

1.一种中药组合物在制备抗柯萨奇病毒COX-Ⅴ和肠道病毒EV-71药物中的应用，其中所述中药组合物的原料药为：蜘蛛香250份、木香70份、草果100份和糯米80份。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述药物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊、滴丸剂。