CN1022931C - 一种生产l-赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

大量的L-赖氨酸可由通过培养一种从棒状杆菌属、短杆菌属、微杆菌属和节杆菌属中选出的微生物于一种培养基使其在培养液中累积L-赖氨酸，并从培养液中回收生成的L-赖氨酸的方法获得。该微生物能够产生L-赖氨酸并对β-萘喹啉有抗性。优先的微生物是谷氨酸棒状杆菌H-4412(FERM BP-1069、CCTCC M87053)

Description

本发明是论述用发酵法生产L-赖氨酸的方法。
L-赖氨酸是必需的氨基酸之一，有广泛用途，如用于制药、饲料和食品的添加剂等。由某些微生物诱变得到的突变菌株发酵法生产L-赖氨酸是已知的。这些微生物属于，例如棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、芽孢杆菌属等。这些突变株包括其生长需要例如（1）高丝氨酸或（2）蛋氨酸和苏氨酸等的突变菌株和抗各种物质的突变菌株。
在已知用发酵法生产L-赖氨酸的方法中，日本专利公布的4993/84号公开了一种生产L-赖氨酸的方法，其特点是培养短杆菌属或棒状杆菌属的产生L-赖氨酸突变菌株于一种培养基内，形成并累积L-赖氨酸，和从培养基中回收生成的L-赖氨酸的方法。该突变菌株抗L-赖氨酸结构类似物以及至少抗一种含有醌或喹啉骨架（环）的化合物。
在这种以前的技术文献中：
（A）“赖氨酸结构类似物”一词指，例如，S-（2-氨乙基）-L-半胱氨酸，α-卤代己酰胺，γ-甲基赖氨酸等，这些类似物具有以下特征：
（1）其化学结构与赖氨酸化学结构类似;
（2）它能够抑制短杆菌属，棒状杆菌属等微生物的生长;和
（3）上述抑制作用可通过在培养基中加入L-赖氨酸而消除。
（B）含有醌或喹啉骨架（环）的化合物其例子有8-羟基喹啉;8-羟基喹啉-5-硫酸;5，8-二氧-6-氨基-7-氯喹啉;1，4-萘醌（α萘醌）;1，2-萘醌（β萘醌）;2，3-二氯萘醌;5-羧-3-硫杂-6-氮杂-2，3-环己 烯萘-1，4-醌;6-（S）-羧基-3′-硫杂-7′-氮杂-2，3-环庚炔-1，4-醌;Nα·Nε-双（3-氯-1，4-萘-2-醌基）-L-赖氨酸和石榴皮素等。它们具有以下特征：
（1）能抑制短杆菌属和棒状杆菌属的微生物生长;和
（2）这种抑制作用当加入L-亮氨酸于培养基中时，至少部分地被消除。
鉴于L-赖氨酸有很高的实用价值，人们一直希望有一种成本低的工业生产L-赖氨酸的方法。
本发明是以我们所发现的，利用已经作过对β-萘喹啉有抗性的棒状杆菌属、短杆菌属、微杆菌属或节杆菌属的突变菌株可得到较高产量的L-赖氨酸为基础的。
本发明涉及一种用发酵法生产L-赖氨酸的方法，该方法包括培养产生L-赖氨酸的棒状杆菌属、短杆菌属、微杆菌属或节杆菌属突变菌株于一种培养基中，使其在培养液中形成并累积L-赖氨酸，和从培养液中回收生成的L-赖氨酸等。
本发明的方法其特点是所说的突变菌株对α-萘喹啉有抗性。
曾发现微生物生长的抑制作用，即便加入L-亮氨酸于培养基中也不能消除，与日本专利公布的4993/84号所公开的醌喹啉类化合物相反，由此可见，从抑制产生L-赖氨酸的微生物来看，显然β-萘喹啉并非与日本以前的技术文献中所公开的已知类型醌类或喹啉类等效。
用作诱导产生突变菌株的亲本微生物，属于棒杆菌属、短杆菌属、微杆菌属或节杆菌属微生物的一些实例，根据本发明可以是天然存在的或突变的菌株，并包括，例如需要各种营养物（例如，至少是高丝氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、组氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、泛酸、烟酰胺、醋酸、腺嘌呤、次黄嘌呤和肌醇中的一种）的微生物，对各种氨基酸结构类似物（例如由赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天门冬氨酸、色氨酸和组氨酸选出的至少一类似物）有抗性的微生物以及各种其他物质（例如，由各种抗生素、磺胺类药物、各种有机酸、醌类化合物和已知类型的喹啉类化合物选出的至少一种）有抗性的微生物。
用使上述产L-赖氨酸的亲本菌株带上β-萘喹啉抗性标记的方法，有可能获得用于本发明用途的突变菌株。另外，使抗β-萘喹啉的微生物带上对各种营养物的抗性标记，对各种氨基酸类似物的抗性标记或对各种其它物质的抗性标记也可能获得本发明所期望的产L-赖氨酸突变株。
可用作本发明的作为诱导产生突变菌株的亲本菌株的微生物最好的例子包括谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，谷氨酸棒状杆菌H-3149（FERM    BP-158），嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870，发酵乳糖短杆菌ATCC13869和深黄短杆菌ATCC14067，所有这些菌株用发酵法都能生产L-赖氨酸。
以本发明为目的，能使用的突变菌株可利用常规诱变方法对突变菌株进行诱变，例如，紫外线照射、化学处理，如使用亚硝基胍及其他。从经过突变的微生物中分离所期求的突变菌株，即收集突变菌株于适宜的培养基上，例如，在含有足以抑制亲本菌株生长浓度的β-萘喹啉（如，大于40μg/ml）琼脂平板的基础培养基，筛选β-萘喹啉抗性并产生L-赖氨酸的菌株。
抗β-萘喹啉微生物突变菌株谷氨酸棒状杆菌H-4412是通过诱导-天然存在的亲本菌株H-3149所得到的突变株。该菌株在1986年5月27日寄存在Bikokn（日本政府工业科学技术代办处，发酵研究所），并指定寄存号为FERM-BP1069。该菌株也已于1987年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏登记号为CCTCCNOM87053。
按照本发明，就实行该程序的培养基而言，可使用含有足量且能同化的碳氮源、无机物质和各种对微生物生长所需要的培养物质的合成培养基和有机培养基。
如果需要，使用乙醇、甲醇和其他醇类虽然是可行的，但是最可取的碳源包括，例如，莆萄糖、果糖、山梨糖、甘油、蔗糖、淀粉、淀粉水解物、糖蜜、果汁和各种其他碳水化合物;醋酸、反丁烯二酸、乳酸、顺丁烯二酸和其他有机酸。
最可取的氮源包括，例如，氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵和各种其他无机酸铵盐;尿素、酰胺和其他含氮化合物;蛋白胨、肉浸膏、酵母膏、玉米浆、酪蛋白水解物，大豆粉水解物、发酵的微生物的细胞体以及其水解物等等。
最可取的无机物质可以磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等等为例证。
如果需要，培养基中可以包含适量的对所使用的微生物的生长特别要求的营养物。在某些情况下，这些营养物质存在于上述天然氮源中。而且，在某些情况下，L-赖氨酸的产量，可通过加入某些添加剂，例如，各种抗生素、α-氨基乳酸、胱氨酸、亮氨酸、亮氨酸发酵液、天门冬氨酸、谷氨酸等物质而提高。
就微生物生长而言，在其他条件下进行培养虽然是可行的，但最好在好气条件下进行培养，例如，用振荡或通气振荡深层培养，温度范围通常在20到40℃以内，pH3到9（最好接近中性pH）。可以调节培养基的pH，例如，加入碳酸钙、尿素、酸、碱溶液，pH调节剂等等。通常连续培养1至6天，这样在培养基中足以形成和累积L-赖氨酸。
培养结束后，最好从培养液中除去微生物细胞体和其他沉淀物。L-赖氨酸可从上清液中用常规方法回收，例如，用离子交换树脂处理、浓缩、吸附作用、盐析等方法。如果需要，用常规方法从微生物细胞体中回收L-赖氨酸是可能的。
各种实验表明，用本发明方法可使L-赖氨酸产率提高10-25%。
下面几个非限定例子对本发明进行了阐述。
实例1
用以下方法得到了产生L-赖氨酸和对β萘喹啉抗性的突变菌株谷氨酸棒状杆菌H-4412（FERM    BP-1069）。
谷氨酸棒状杆菌H-3149（FERM BP-158;天然存在的微生物;硫赖氨酸抗性，利福平抗性、链霉素抗性和6氮杂吡啶抗性），作亲本菌株，被悬浮于0.1N三羟甲基氨基甲烷-顺丁烯二酸的缓冲液中（pH＝6.0），细胞浓度为每毫升108个细胞。并向悬液中加入亚硝基胍，使其最终浓度为每毫升0.2毫克。使细胞悬液于室温静止30分钟，然后涂布在含有下列成份基础培养基的琼脂平板上，该平板含有β-萘喹啉的浓度足以抑制亲本菌株的生长（40微克/毫升）。
在30℃培养3天后，从长出的有关抗β-萘喹啉菌落中分离所需要的突变菌株，并指定为谷氨酸棒状杆菌H-4412。如下面表1所示，就对β-萘喹啉抗性和较高的L-赖氨酸产量而言，它显然与亲本菌株H-3149不同。
基础培养基的成分（琼脂平板）
葡萄糖10克/升;NH4Cl 1克/升;尿素2克/升;KH2PO41克/升;K2HPO43克/升;MgSO4·7H2O 0.4克/升;FeSO4·7H2O 10毫克/升;MnSO4·4H2O 4毫克/升;生物素50微克/升;烟酸5毫克/升;ZnSO·7H2O 1毫克/升;CuSO·5H2O 1毫克/升;（NH4）6Mo7O·4H2O 1毫克/升;琼脂2%（pH7.0）。
表1
β-萘喹啉（微克/毫升）    0    30    40
菌株H-3149    ++    +    -
H-4412    ++    ++    +
（注：++＝充分生长;+＝弱生长;-＝不生长。）
实例2
谷氨酸棒状杆菌H-4412（FERM BP-1069）被接种于300毫升锥形瓶内种子培养基（20毫升）中，该培养基的成分有葡萄糖（40克/升，尿素（3克/升），KH2PO4（1.5克/升），K2HPO4（0.5克/升），MgSO4·7H2O（0.5克/升），生物素（50微克/升），蛋白胨（20克/升）和酵母抽提物（5克/升）（pH7.2）。
于30℃振荡（每分钟220转）培养24小时后，将2毫升培养物移接入300毫升锥瓶中，瓶中含有培养基（20毫升;pH7.2），培养基的成分有糖蜜（100克/升;以葡萄糖汁），硫酸铵（40克/升）、KH2PO4（0.5克/升），MgSO4·7H2O（0.5克/升）和CaCO3（30克/升）于32℃振荡（每分钟220转）培养4天。培养结束后，L-赖氨酸累积在培养液中，以盐酸盐L-赖氨酸计（用酸性铜/茚三酮反应的颜色反应测定）为52克/升。为了对比，将亲本菌株H-3149以上述同样方法培养得到44克/升的盐酸盐L-赖氨酸。
将生成的培养液（1升）离心得到上清液，然后用硫酸调pH到1.5， 将上清液通过装有聚苯乙烯Diaion SK-IB（H+型，强酸性离子交换树脂;日本东京Mitsubishi（三菱）Kasei（可政）Kogyo（先行）K.K.商品）使L-赖氨酸吸附在树脂上，用水洗柱后，用2N氨水进行洗脱，得到含L-赖氨酸部分，然后将这部分洗脱液进行收集、合并、浓缩。用盐酸调pH至2.0后，将浓缩的溶液冷却同时加乙醇以便得到L-赖氨酸的结晶（41克）。

Claims (2)

1、一种利用能产生L-赖氨酸的微生物发酵法生产L-赖氨酸的方法，该方法包括使用谷氨酸棒状杆菌H-4412(CCTCC M 87053)，在一种培养基中形成并累积L-赖氨酸于培养液和从培养液中回收生成的L-赖氨酸。
2、依照权利要求1所述的方法，其中培养是在温度20-40℃、pH3-9、时间1-6天条件下进行。
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