HU200797B - Process for producing l-lysine - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás L—lizin előállítására fermentációval.

Az L-lizin egyike az esszenciális aminosavaknak, amelyet széles körben alkalmaznak különböző célokra, pl. gyógyszerek gyártásához, élelmiszer- és takarmányadalékokhoz, stb. A lizin gyártására ismeretesek fermentációs eljárások bizonyos mikroorganizmusok közé tartozó indukált mutáns törzsekkel, amelyek pl. aCorynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus, stb. nemzetségbe tartoznak. Az ilyen mutáns törzsek közt találhatók olyan mutáns törzsek, amelyek pl. (1) homoszerint, vagy (2) metionlnt és treonlnt, stb. igényelnek növekedésükhöz, valamint olyan mutáns törzsek, amelyek különböző anyagokra rezisztensek.

Az ismert, L-lizlnt-termelő fermentációs eljárások között a 4993/84 számú japán közzétételi irat egy L-lizin gyártó eljárást ismertet, amelyet az jellemez, hogy Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó lizin-termelő mutáns törzset tápközegben tenyésztenek, hogy L—lizin képződjék és halmozódjék fel, és az így keletkezett llzlnt a tápközegből kinyerik, ahol az említett mutáns törzs rezisztens lizin analógokra, valamint legalább egy kinon- vagy kinolin-vázas vegyűletre.

A technika állását képező fenti irodalmi helyen a kifejezések az alábbiakat jelentik:

(A) A „lizin analóg” kifejezés pl. S-(2-amino—etil)—L—ciszteint, alfa-halogén kaprolaktámot, gamma-metil-lizint és hasonló vegyületeket Jelent, amelyek az alábbi Jellemzőkkel bírnak:

— (1) kémiai szerkezetűk a lizin kémiai szerkezetéhez hasonló;

— (2) képesek gátolni a Brevibacterium, Corynebacterium és hasonló nemzetségekbe tartozó mikroorganizmusok növekedését; és — (3) a fentebb említett gátlás L-lizinnek a tápközegbe való hozzáadásakor eltűnik.

(B) A kinon- vagy kinolin vázzal rendelkező vegyületekre példák a 8-hldroxi-kinolln-5szulfonsav; 5,8-dioxi-6-amino-7-klór-klnolln; 1,4-naftokinon; 1,2-naftokinon; 2,3-diklór-naftokinon; 5-karboxi-3’-tia-6’-aza-2,3-ciklohexen-naftalin-1,4-kinon; 6’-(S)-karboxi-3’-tia-7’-aza-2,3-ciklohepten-naftalin-1,4-kinon; Να,Νε-blSZ (3—klór— 1,4—nafto—2—kinőni!)—L—IIzln, és a granaticin; ezek a következő jellemzőket mutatják:

— (1) képesek a Brevibacterium és Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok növekedésének gátlására; és — (2) ez a gátlás legalábbis részben felfüggeszthető L-leucin hozzáadásával a tápközeghez.

Állandó Igény van arra, hogy L-lizin előállítására olyan eljárás jöjjön létre, amely ipari méretekben olcsóbb, mint az ismertek, mivel tény, hogy az L-lizin gyakorlati célokra nagyon fontos anyag.

A jelen találmány azon a felismerésen alapul, hogy az L—llzlnt nagyobb kitermeléssel kaphatjuk, ha Corynebacterium, Brevibacterium, Mlc2 robacterlum vagy Arthrobacter nemzetségbe tartozó olyan mutánst alkalmazunk, amelyet béta-naftokinolinra rezisztenssé tettünk.

Röviden az alábbiakban foglalhatjuk össze a találmány szerinti eljárást. A Jelen találmány L-lizin előállítására szolgáló fermentációs eljárással foglalkozik, amely abban áll, hogy Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium vagy Arthrobacter nemzetségbe tartozó, L—IIzlnt termelő mutáns törzset alkalmas tápközegben tenyésztünk, hogy L-llzIn képződjék és halmozódjék fel a tápközegben, és az így keletkezett L-lizint kinyerjük a tápközegből.

A jelen találmány szerinti eljárás azzal Jellemezhető, hogy az említett mutáns törzs bóta-naftokinollnra rezisztens.

Úgy találtuk, hogy a mikroorganizmus növekedésének gátlását nem lehet felfüggeszteni olyan módon, hogy L-leuclnt adunk a tápközeghez, ellentétben azokkal a kinon- és kinolin-típusú vegyületekkel, amelyek a 4993/84 számú japán közzétételi iratban le vannak írva. Ebből nyilvánvaló, hogy a béta-naftokinolin nem ekvivalens azokkal a különböző ismert típusú kinonokkal és kinollnokkal, amelyeket a fenti japán irodalmi helyen Ismertettek, legalábbis az L-lizin-termelő mikroorganizmusok növekedésének gátlása szempontjából.

A Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium vagy Arthrobacter nemzetségbe tartozó mikroorganizmusokra, amelyeket szülő mikroorganizmusként lehet alkalmazni a Jelen találmány szerinti mutáns törzsek létrehozásához, példák lehetnek természetben előforduló vagy mutáns törzsek, és ide tartoznak olyan mikroorganizmusok is, amelyek különböző tápanyagokat Igényelnek (pl. legalább egyet az alábbiak közül: homoszerin, metionin, treonin, hisztidin, prolin, alanin, leucin, Izoleucin, valin, szerin, glutaminsav, pantoténsav, nlkotlnsavamld, ecetsav, adenin, hipoxantin vagy inozit), vagy olyan mikroorganizmusok, amelyek rezisztensek különböző aminosavanalógokra (pl. legalább egyre az alábbiak közül: lizin, treonin, metionin, leucin, Izoleucin, valin, aszparaginsav, triptofán vagy hisztidin analógjai), vagy olyan mikroorganizmusok, amelyek különböző más anyagokra rezisztensek (pl. legalább egyre az alábbiak közül: antibiotikumok, szulfa-gyógyszerek, különböző szerves savak, Ismert típusú kinon-vegyületek és klnolin-vegyületek).

A jelen találmány szerinti célokra felhasználható mutáns törzset kaphatunk olyan módon, hogy béta-naftokinolin rezisztenciát adunk át a fentebb említett, L-lizin termelésére képes szülőtözseknek. Egy másik módszer szerint a kívánt jelen találmány szerinti, L—lizin termelésére képes mutáns törzset úgy kaphatjuk meg, hogy a fentebb említett, különböző tápanyagokra való rezisztenciákat vagy különböző más anyagokra való rezisztenciákat vezetünk be egy béta-naftikinolin-rezisztens mikroorganizmusba.

-2HU 200797 Β

A mikroorganizmusokra, amelyeket szülő törzsként alkalmazhatunk a jelen találmány szerinti mutáns törzsek kialakításához, előnyös példák lehetnek a Corynebacterlum glutamlcum ATCC 13032, Corynebacterlum glutamlcum H-3149 (FERM BP-158), Corynebacterlum acetoacldophllum ATCC 13870, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869,és Brevibacterium flavum ATCC 14067; mindezek a törzsek fermentációval L-lizin termelésére képesek.

Azokat a mutáns törzseket, amelyeket a jelen találmány céljaira fel lehet használni, olyan hagyományos módokon lehet kialakítani, amelyeket mutáns törzsek kialakítására általában alkalmazni szoktak, ilyenek pl. besugárzás ultraibolya sugarakkal, kémiai kezelés pl. N-metil-N’-nltro-N-nitrozo-guanldint alkalmazva, stb. A kívánt mutáns törzseket a mutációnak kitett mikroorganizmusoktól olyan módon lehet elkülöníteni, hogy megfelelő tápközegben, pl. bóta-naftoklnolint tartalmazó minimál tápközegen agar lemezen növekvő mutáns törzseket gyűjtünk, ahol a béta-naftokinolin olyan koncentrációban van Jelen, amely a szülőtörzs növekedésének gátlásához elegendő (pl. több, mint 40 p.g/ml), és ezeket átvizsgáljuk bóta-naftokinolin-rezisztenciára és L-lizin termelésre.

A Corynebacterlum glutamicum H-4412 mikrobiális mutáns törzset, amely béta-naftoklnollnra rezisztens, és amelyet a természetben előforduló H-3149 szülőtörzs mutálásával alakítottunk ki, letétbe helyeztük a Bikoken-nél [Fermentation Research Institute, Agency of Industrlal Science and Technology of the Japanese Government (A Japán Kormány Fermentációs Kutatóintézete, Ipari Tudományos és Technológiai Ügynökség)], és ez a törzs a FERM BP-1069 letéti számot kapta 1986. 05. 27-én.

A jelen találmány szerinti eljárás kivitelezéséhez tápközegként alkalmazhatunk mind szintetikus, mind szerves tápközegeket, amelyek megfelelő mennyiségben asszmilálható szénás nitrogénforrást, szervetlen anyagot és más olyan tápanyagokat tartalmaznak, amelyek a mikroorganizmusok növekedéséhez szükségesek.

Az előnyös szénforrások között található pl. a glükóz, fruktóz, szorbit, glicerin, szacharóz, keményítő, keményítőhidrollzátum, melasz, gyümölcs-kivonatok, és különböző más szénhidrátok, ecetsav, fumársav, tejsav, maleinsav és különböző más' szerves savak, bár, ha kívánatos, lehet alkalmazni etanolt, metanolt és más alkoholokat Is.

Az előnyös nitrogénforrások között található pl. az ammónia, ammónium-klorid, ammónium-szulfát, ammónlum-acetát, ammónium-foszfát és további különböző szervetlen savak ammónlum-sói, karbamld, aminok, és más nitrogén-tartalmú vegyűletek, pepton, húskivonat, élesztőkivonat, kukoricalekvár, kazeinhidrolizátum, szójallszt-hidrolizátum, fermentált mikroorganizmusok sejttömege és ezek hidrolizátumai, stb.

Az előnyös szervetlen anyagokra példák lehetnek az alábbiak; kálium-monofoszfát, kálium-difoszfát, magnézium-foszfát, magnézium-szulfát, nátrium-klorid, vas(ll)-szulfát, kal⁵ clum-karbonát, stb.

A tápközeg, kívánt esetben, tartalmazhat megfelelő mennyiségben olyan tápanyagokat, amelyek az alkalmazott mikroorganizmusok növekedéséhez speciálisan szükségesek. Bl¹⁰ zonyos esetekben ezek a tápanyagok jelen vannak a fentebb említett, természetben előforduló nitrogénforrásokban. Bizonyos esetekben az L-lizin termelékenység úgy is javítható, hogy a tápközegekhez bizonyos adalékokat ¹⁵ adunk, pl. különböző antibiotikumokat, alfa-amino-tejsavat, clszteint, leuclnt tartalmazó fermentlevet, aszparaglnsavat, glutamlnsavat és hasonlókat.

A tenyésztést aerob körülmények között ²⁰ hajthatjuk végre, rázatással vagy szubmerz tenyésztéssel levegőztetés és rázatás mellett, általában 20°C—40’C hőmérsékleten, 3 és 9 közti pH tartományban (előnyösen semleges pH körül), bár a tenyésztést más körülmények közt Is végre lehet hajtani, ahol a mikroorganizmus növekedni képes. A tápközeg pH-ját pl. kalcium-karbonát, karbamld, sav- vagy lúgoldat, stb. hozzáadásával, vagy pH szabályozóval ₃₀ lehet beállítani. A tenyésztést általában 1—6 napig folytatjuk, amely általában elegendő L-lizin képződésére és felgyülemlésére a tenyószközegben.

Miután a tenyésztés teljessé vált, előnyös a ₃₅ mikroorganizmus sejttömeget és egyéb csapadékot eltávolítani a tenyészléből. Az L-llzint a felülúszóból hagyományos módon nyerjük ki, pl. ioncserélő gyantával való kezeléssel, koncentrálással, adszorpcióval, kisózással és ha40 sonlókkal. Kívánt esetben az L-lizin a mikroorganizmus sejttömegétől is kinyerhető, hagyományos módon.

A különböző kísérletek azt mutatták, hogy az L-lizín kitermelésében mintegy 10—25 % növekedés érhető el a Jelen találmány szerinti módszerrel.

A következő példák, amelyek nem korlátozzák a találmány oltalmi körét, részletesebben bemutatják a jelen találmányt.

1. példa

L-lizin-termelő és béta-naftokinon-rezlsztens Corynebacterlum glutamicum törzset [H-4412(FERM BP-1069)] kapunk a következő módon.

Corynebacterlum glutamicum H-3149 törzset (FERM BP-158; természetben előforduló mikroorganizmus; tializin-rezisztens, rifampicin-rezisztens, streptomlcln-rezisztens, és 6azauracil-rezisztens), amelyet szűlőtörzskónt alkalmazunk, 0,1 n triszmaleinsav pufferolt oldatban (pH=6,0) szuszpendálunk 10® sejt/ml koncentrációban, ehhez N-metil-N’-nitro-Nnitrozo-guanidint adunk 0,2 mg/ml végső koncentrációig. A sejtszuszpenziót szobahőmér3

-3HU 200797 Β sókleten 30 percen át állni hagyjuk, ezt követően az alább ismertetett összetételű minimál tápközeggel készült agar lemezre szélesztjük, amely tartalmaz még béta-naftokinolint is olyan koncentrációban, amely elegendő a szülőtörzs 5 növekedésének gátlására (40 μg/ml).

30’C hőmérsékleten 3 napon át végzett tenyésztés után a kívánt mutáns törzset a kinövő telepekből elkülönítjük a béta-naftokinolinra való rezisztencia alapján, és ezt Corynebacte- 1 θ rium glutamicum H-4412-nek nevezzük. Ez nyilvánvalóan különbözik a H-3149 szülőtörzstől a béta-naftokinolinra való rezisztencia és a nagyobb L-lizin termelékenység szempontjából, amint ezt az alábbi 1. táblázat bemutatja. 15

A minimál tápközeg összetétele (agar lemez): glükóz 10 g/l; NH4CI 1 g/l; karbamid 2 g/l;

KH2PO4 1 g/l; K2HPO4 3 g/l; MgSO₄.7H₂O 0,4 g/l; FeSC>4.7H2010 mg/l; MnSO₄.4H2O 4 mg/l; blotin 50 jxg/l; nikotlnsav 5 mg/l; ZnSO₄-7H2O 20 1 mg/l; CuSO₄.5H2O 1 mg/l; (ΝΗ₄)6Μθ7θ24·4Η2θ 1 mg/l; agar 2% (pH 7,0).

1. TÁBLÁZAT

Béta-naftokinolin _n (pg/ml)

H —3149 törzs ++

H —4412 törzs ++

Megjegyzés: ++ = teljes növekedés;

+ = gyenge növekedés; - «= nincs növekedés

2. példa

Corynebacterium glutamicum H-4412-t (FERM BP-1069) 300 ml-es Erlenmeyer lombikban levő oltó tápközegbe (20 ml) viszünk, ahol a tápközeg összetétele az alábbi: 40 g/l glükóz, ⁴⁰ 3 g/l karbamid, 0,5 g/l K₂HPO₄, 0,5 g/l MgSO₄ 7H2O, 50 mg/l biotin, 20 g/l pepton és 5 g/l élesztőkivonat (pH 7,2).

30’C hőmérsékleten 24 órán át, rázatás mellett (220 fordulat/perc) végzett tenyésztés után ⁴⁵ a tenyészetet (2 ml) átvisszük 300 ml-es Erlenmeyer lombikba, amely 20 ml tápközeget tartalmaz, amelynek összetétele: 100 g/l melasz (glükózra számítva), 40 g/l ammónium-szulfát,

0,5 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄.7H2O, és 30 g/l CaCO3, majd 32’C hőmérsékleten tenyésztünk 4 napon át rázatás mellett. A tenyésztés befejezése után L-lizin halmozódik fel a tenyószközegben 52 g/l koncentrációban, L-lizin-hidrokloridkónt számolva (savas róz/nlnhidrln reakciót alkalmazó színreakciós módszerrel határozva meg). Összehasonlításként a H-3149 szülőtörzset is hasonló módszerrel tenyésztjük, ahogyan fentebb leírtuk, így 44 g/l L-lizIn-hldrokloridot nyerünk.

Az így létrejött tenyészlevet (1 liter) centrifugáljuk, hogy felülúszót kapjunk. Miután a pH-t kénsavval 1,5-re állítottuk be, a felülúszót kapjuk. Miután a pH-t kénsavval 1,5-re állítottuk be, a felülúszót Diaion SK-1 B-vel töltött oszlopon (H⁺ forma; erősen savas Ioncserélő gyanta; a Mitsubishi Kaséi Kogyo K.K., Toklo, kereskedelmi terméke) engedjük át, hogy az L-Ilzlnt a gyantára adszorbeáljuk. Az oszlop vízzel történő mosása után eluálást 2 n vizes ammónia-oldattal hajtjuk végre, ez a művelet L-lizin-tartalmú frakciókat eredményez, amelyeket azután összegyűjtünk, egyesítünk és koncentrálunk. Miután a pH-t 2,0-ra beállítottuk sósavval, a koncentrált oldatot hűtjük, miközben etanolt adunk hozzá; így kristályos L-Ilzlnt kapunk.

Claims (3)

1. Eljárás L-lizin előállítására valamely corynebacterium, Brevibacterlum, Mlcrobacterium vagy Arthrobacter nemzetségbe tartozó, L-lizint termelő mutáns törzs alkalmas tápközegben történő tenyésztésével, és a tápközegben felhalmozódott L-lizin kinyerésével, azzal jellemezve, hogy béta-naftokinolinra rezisztens L-lizint termelő mutáns törzzsel fermentálunk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentálást 20—40’C hőmérsékleten, 3—9 pH-nál 1—6 nap alatt végezzük.

3. Az 1. vagy 2. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként FERM BP-1069 számon deponált Corynebacterium glutamicum H-4412 jelű törzset alkalmazunk.