CN102286626B

CN102286626B - 一种天蚕的分子鉴定方法及其遗传标记物、引物和试剂盒

Info

Publication number: CN102286626B
Application number: CN201110253329.5A
Authority: CN
Inventors: 董扬; 卢翌铭; 胡颂军
Original assignee: XIANGTAN TASHIER BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: XIANGTAN TASHIER BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-08-30
Filing date: 2011-08-30
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2031-08-30
Also published as: CN102286626A

Abstract

本发明公开了一种天蚕的分子鉴定方法及其遗传标记物、引物和试剂盒。具体的，本发明提供了3条天蚕特异性的核苷酸序列，是序列表中SEQID NO.1，SEQ ID NO.2，或者SEQ ID NO.3所示序列中的连续的20-483个碱基序列。本发明还提供了以该序列为基础设计的寡核苷酸引物，用这些引物快速特异性检测天蚕的方法，以及所用的试剂盒。在野生天蚕制种前，需要对收集的天蚕样品进行鉴定，使用本发明则可以方便、快速、准确的鉴定天蚕。

Description

一种天蚕的分子鉴定方法及其遗传标记物、引物和试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测领域，特别涉及一种天蚕的分子鉴定方法及其遗传标记物、引物和试剂盒。

背景技术

丝绸是中国古老文化的象征，中国古老的丝绸业为中华民族文化织绣了光辉的篇章，对促进世界人类文明的发展作出了不可磨灭的贡献。中国丝绸以其卓越的品质、精美的花色和丰富的文化内涵闻名于世。

几千年前，当丝绸沿着古丝绸之路传向欧洲，它所带去的，不仅仅是一件件华美的服饰、饰品，更是东方古老灿烂的文明，丝绸从那时起，几乎就成为了东方文明的传播者和象征。目前已知的最早丝织物，是出土于距今约4700年良诸文化的遗址。中国是家蚕丝的发源地，养蚕，缫丝是我国古代在纤维利用上最重要的成就。早在新石器时代，我国已发明丝绸织造以及朱砂染色技术，此后随着织机的不断改进，印染技术的不断提高，丝织品种日益丰富，并形成了一个完整的染织工艺体系，使我国古代的丝绸染织技术领先于世界各国。根据中国“十一五”规划，到2010年，蚕茧产量应达85-90万吨，蚕农年收入达到200亿元；丝产量达17-19万吨，烘茧和丝绸印染等领域的总体耗水耗能比2005年降低10％-20％，丝绸工业年产值2500亿元；真丝绸年出口创汇50-55亿美元，初步实现“丝绸大国”向“丝绸强国”转变的目标。

从本质上讲，丝是绢丝昆虫茧的主要成分。目前世界范围内使用的绝大部分都是桑蚕，即我们通常说的家蚕。此外，柞蚕丝也有少量生产，但由于其品质不足，常常被与麻或者棉混纺。绢丝昆虫种类很多，在脉翅目(Neuroptera)、毛翅目(Trichoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)和鳞翅目(Lepidoptera)中都有吐丝的，统称为绢丝昆虫。在所有绢丝昆虫中，鳞翅目中的蚕蛾科(Bombycidae)和天蚕蛾科(Saturniinae)(也翻译为大蚕蛾科)的应用价值较高，此外还有栎枯叶蛾科(Lasiocampidae)的一种分布于西西里岛和希腊的栎枯叶蛾具有有应用价值。目前所说的野蚕主要是指天蚕蛾科成员。我国比较容易找到到的有柞蚕属、樗蚕属、柳蚕属、樟蚕属、栗蚕属、透目天蚕属、黄目天蚕属七个属。此外其他属我国也有记载：日本锈斑天蚕属、鹿纹天蚕属、惜古比天蚕属、日月天蚕属、丁目天蚕属和合目天蚕属。其中有经济价值且可以人工养殖的至少有以下14种，其中经济价值最高的为小字大蚕蛾、琥珀蚕、天蚕。目前，在我国有野生或养殖记录的为天蚕。

天蚕又称为日本柞蚕。属鳞翅目，大蚕蛾科，又名山蚕，学名Antheraeayamamai Guerin-Meneville。主要分布于中国、朝鲜、韩国、日本等地。天蚕茧色为绿色，能缫丝，丝质优美、轻柔，不需要染色而能保持天然绿色，并具有独特的光泽。织成丝绸色泽艳丽、美观，是高级的丝织品。茧呈长椭圆形，长径45-53cm，短径23-27cm。茧色可深绿、浅绿、深金黄色，但绝大部分为绿色，一侧色较深，一侧较浅。在人工饲养条件下，茧为黄绿色。茧能缫丝，1000粒茧可缫生丝250-300g，一粒茧丝长600-700m。纤度比桑蚕丝粗一倍；伸度约40-50％，比桑蚕丝高1.8倍；强力约为桑蚕丝的2.5倍。织成丝绸色泽艳丽、美观，可与其它纤维混织，是极高级的丝织物。在国外，一些贵族还依然保持古老的传统观念，凡是外国商人来中国购货时都说，他们非常喜欢天蚕丝制品，认为可保平安、吉祥如意，能带来好运。用天蚕丝在服装和饰品上点缀一点点，价格即惊人的昂贵，而且是当吉祥符用。他们把点缀天蚕丝的服装作为世代相传的宝贝珍藏，多把天蚕丝制成神殿里用的缦和帘，用来供养至高无上的神佛。所以我国天蚕丝刚刚被发现，外商就纷纷争相大量抢购，出口价最高时曾卖到人民币3万元/公斤。天蚕的出现也给我国带来了经济的繁荣和昌盛。上个世纪末，日本商人带来的一份报纸报道的新闻消息记载，当时中国长沙马王堆出土了一座千年古墓，其中所有的纺织品都风化成碎片了，只有木乃伊身上的一件衣服还完好，并且有一定的拉力，经化验后，证明是中国一千多年前的天蚕丝制作而成的。因此，国际市场上持续了长时间的天蚕丝热潮，外国商人疯狂地抢购天蚕丝原料。由于野生天蚕丝稀有十分昂贵，我国自己一直没有天蚕丝制成品，那时只出口原料。现在我们天蚕丝珍品已经试制出来了，这是我们纺织丝绸服装业的骄傲。除天蚕丝外，天蚕幼虫、蚕蛹和成蛾都是极其重要的药材和保健品。因此，天蚕本身是既具有经济价值的和开发前景的昆虫资源。

野生天蚕的收集中，面临的最大问题是如何对收集的品种进行鉴定。而本发明开发出天蚕专用的鉴别标记序列，用于野生天蚕制种前的鉴定。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对缺乏有效的天蚕鉴定方法的不足，提供一种天蚕的分子鉴定方法及其遗传标记物、引物和试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

本发明的技术方案一是，一种鉴定天蚕的遗传标记物，它的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，或者SEQ ID NO.3所示序列中的连续的20-483个碱基序列。优选448～483bp个碱基序列；更优选序列表中SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，或者SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸，或者序列表中SEQ ID NO.4～9任一项所示序列的核苷酸。该鉴定天蚕的遗传标记物或者是和序列表中SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，或者SEQ ID NO.3所示序列中的连续的20～483个碱基序列的具有90％以上同源性的序列。在本领域，具有90％同源性的基因一般就被认为是同一个基因。

本发明的技术方案二是，一种鉴定天蚕的引物，所述的引物长度为15-35个核苷酸，且引物的序列与SEQ ID NO.1，或者SEQ ID NO.2，或者SEQ IDNO.3所示的序列相同或者互补。所述的引物优选为序列如SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，或者SEQ IDNO.9所示的核苷酸。

本发明的技术方案三是，一种鉴定天蚕的试剂盒，含有特异性扩增天蚕遗产标记物的引物对，所述的引物长度为15-35个核苷酸，且所述的引物对中，一个引物的序列与SEQ ID NO.1，或者SEQ ID NO.2，或者SEQ ID NO.3所示的序列相同，而另一个引物的序列与SEQ ID NO.1，或者SEQ ID NO.2，或者SEQ ID NO.3所示的序列互补，且扩增产物的长度为40～483bp。较佳的，所述的引物对中，一个引物的序列如SEQ ID NO.4所示，另一个如SEQID NO.5所示；或者，一个引物的序列如SEQ ID NO.6所示，另一个如SEQID NO.7所示；或者，一个引物的序列如SEQ ID NO.8所示，另一个如SEQID NO.9所示。

所述的试剂盒还包括：1)DNA裂解液，2)PCR反应缓冲液，3)dNTP，4)Taq DNA聚合酶。更佳的，还包括阳性对照，所述的阳性对照是天蚕基因组DNA，优选如序列表中SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，或SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸。

本发明的技术方案四是，一种天蚕的分子鉴定方法，包括以下步骤：

(1)抽提样品的DNA；

(2)将抽提的DNA作为模板，用特异性扩增天蚕遗产标记物的引物对进行PCR扩增，其中所述的引物长度为15-35个核苷酸，且所述的引物对中，一个引物的序列与SEQ ID NO.1，或者SEQ ID NO.2，或者SEQ ID NO.3所示的序列相同，而另一个引物的序列与SEQ ID NO.1，或者SEQ ID NO.2，或者SEQ ID NO.3所示的序列互补，且扩增产物的长度为70～300bp；

(3)检测扩增产物的存在，存在扩增产物就表示样品中存在来自天蚕的个体、器官、组织、细胞、基因组DNA或者存在如序列表中SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，或SEQ ID NO.3所示序列中的连续的20-483个碱基序列的核苷酸。

步骤(2)中所述的PCR扩增，较佳的，反应体系为模板DNA 0.016μg/μl，dNTPs各0.02mM，1×Ex Buffer(含镁离子)，正向引物0.4μM，反向引物0.4μM，Ex taq 0.04U/μl；反应程序为：94℃预变性5分钟，然后以94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸60s，进行35个反应循环，最后72℃延伸7分钟。

本发明的技术方案五是，一种如上所述的鉴定天蚕的遗传标记物的用途，用于鉴定天蚕。以能检测到样品中含有该遗传标记物或其片段，表示样品是天蚕。检测到碱基长度为20～448bp的该遗传标记物的片段，也表示样品是天蚕。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：在野生天蚕制种前，需要对收集的天蚕样品进行鉴定，使用本发明则可以方便、快速、准确的鉴定天蚕。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是PCR产物序列7、8、9(从第二道开始从左到右依次开始)琼脂糖电泳图谱。M，分子量标准；1，引物1和2的扩增产物，扩增产物序列是SEQ ID NO.1。2，引物3和4扩增产物，扩增产物序列是SEQ ID NO.2。3，引物5和6扩增产物，扩增产物序列是SEQ ID NO.3。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，从天蚕中发现三段核苷酸序列，它们是天蚕的部分基因，经过序列同源性检索，发现它们和其他物种包括绢丝昆虫的同源性很低，表明它们是天蚕特有的序列，是天蚕特征序列。从这些核苷酸序列中选择一段序列作为引物或探针，具有很好的物种特征性，可用于天蚕的鉴定。因此，进一步的本发明人通过仔细分析和反复实验，在这三段核苷酸序列中寻找到合适的引物对，可以经PCR扩增获得条带清晰的扩增产物，继而用于鉴定天蚕品种，从而完成了本发明。

一、由信息检索可知序列的天蚕特异性

本发明人在研究7种绢丝昆虫——天蚕(Antheraea yamamai；giantsilkworm；Japanese oak silkmoth)、中国柞蚕(Antheraea pernyi；tussah；Chineseoak silkmoth)、琥珀蚕(Antheraea assama；muga silkworm)、蓖麻蚕(SamiaCynthia；eri-silkworm)、清新透目天蚕(Rhodinia newara)、柳蚕(Actias seleneHubner)——的5龄幼虫吐丝器官丝腺转录组的时候，将获得的该7物种的高质量转录组相互之间使用采用blastp程序，并将家蚕基因集纳入分析，设置相似性cutoff为10-8进行相互比对，结果使用solar软件连接起来，将同源基因分类为单拷贝基因(blastp只有一个hit)和多拷贝基因(blastp有多个hit)。在这过程中筛选获得了在天蚕中特异，而在其物种中没有的基因片段，即作为鉴别天蚕的特征序列。这三段序列即序列表中SEQ ID NO.1，SEQID NO.2，和SEQ ID NO.3所示。在本领域，具有90％同源性的基因一般就被认为是同一个基因。

二、野生天蚕资源分子鉴定的PCR试剂盒

本发明提供一种快速检测天蚕的PCR试剂盒，包括：1)DNA裂解液，2)10倍PCR缓冲液，3)dNTPs溶液，4)Taq DNA聚合酶，和5)引物对。

其中，1)～4)可以是本领域常规的PCR试剂盒中的部件。5)引物对，则是本发明特别设计的。所述的引物长度为15-35个核苷酸，且一个引物的序列与SEQ ID NO.1(或者SEQ ID NO.2，或者SEQ ID NO.3)所示的序列相同，而另一个引物的序列与SEQ ID NO.1(或者SEQ ID NO.2，或者SEQID NO.3)所示的序列互补，且扩增产物的长度为40～448bp。较佳的一个例子是，所述的引物对中，一个引物的序列如SEQ ID NO.4所示，另一个如SEQ ID NO.5所示；或者，一个引物的序列如SEQ ID NO.6所示，另一个如SEQ ID NO.7所示；或者，一个引物的序列如SEQ ID NO.8所示，另一个如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一优选方案中，正向引物和反向引物各3pmol，0.2mMdNTPs，1.5U的Taq酶(Takara exTaq)。其中正向引物为SEQ ID NO.4，SEQID NO.6，或者SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；反向引物为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.7，或者SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

较佳的，所述的快速检测天蚕的PCR试剂盒还包括阳性对照。阳性对照较佳的是如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，或者SEQ ID NO.3所示的序列的核苷酸片段。

三、野生天蚕资源分子鉴定的方法

本发明还提供一种野生天蚕资源分子鉴定的方法，包括以下步骤：

1)提取天蚕基因组DNA；

2)以提取的基因组DNA为模板，以本发明的引物对为引物，进行PCR扩增；

3)将PCR产物进行琼脂糖电泳检测。

其中，提取天蚕基因组DNA的方法采用本领域现有技术，可以从粪便、体表、血液中提取DNA。DNA提取可采用多种方法。较佳的用本发明试剂盒提供的裂解液裂解天蚕丝腺，从中提取DNA。

步骤2)所述的PCR扩增条件可以是常规的PCR扩增条件，较佳的，PCR反应体系为：模板DNA 0.016μg/μl，dNTPs各0.02mM，1×Ex Buffer(含镁离子)，正向引物0.4μM，反向引物0.4μM，Ex taq 0.04U/μl。PCR反应程序较佳的为：94℃预变性5分钟，然后以94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸60s，进行35个反应循环，最后72℃延伸7分钟。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下述实施例中未注明的具体技术或条件，均为常规技术或条件，或按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1野生天蚕资源的分子鉴定

对已经有的天蚕提取基因组DNA，可以从粪便、体表、血液中提取DNA，DNA提取可采用多种现有技术中的方法，此处不做特殊说明。采用表1中引物，引物组合对为：引物1和引物2、引物3和引物4、引物5和引物6。按照表2所述的体系进行PCR反应。实验中是使用了TaKaRa Ex Taq^TM HSPCR试剂盒进行PCR扩增。

PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟，然后以94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸60s，进行35个反应循环，最后72℃延伸7分钟。

表1.鉴定天蚕的引物

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，其大小分别为448bp，483bp和460bp。其电泳图谱见图1。可见，该三个引物能够对天蚕基因组DNA进行特异性扩增，得到单一的扩增产物。将PCR扩增产物进行测序，获得的序列分别见序列表中SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

表2.PCR反应体系

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种天蚕的遗传标记物，其特征在于，所述的遗传标记物是序列表中SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸。

2.一种扩增天蚕的遗传标记物的引物对，其特征在于，所述的引物对中，一个引物的序列如SEQ ID NO.4所示，另一个如SEQ ID NO.5所示。

3.一种扩增天蚕的遗传标记物的试剂盒，其特征在于，其含有特异性扩增天蚕遗产标记物的引物对，所述的引物对中，一个引物的序列如SEQ IDNO.4所示，另一个如SEQ ID NO.5所示。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：1）DNA裂解液，2）PCR反应缓冲液，3）dNTP，4）Taq DNA聚合酶。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阳性对照，所述的阳性对照是如序列表中SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸。