CN102276590B - 一种金线莲提取物自旋标记类似物及制备与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开金线莲提取物Kinsenoside的自旋标记类似物及制备与用途。本发明所涉及和化合物共有5个。本发明的金线莲提取物Kinsenoside的自旋标记类似物制备方法为：将对应的3-R构型醇或3-S构型醇与对应的自由基酸溶于二氯甲烷中，加入催化量的0.1克N，N-二甲基吡啶，在氮气保护下搅拌反应，然后加入二环己基碳二亚胺，再在氮气保护下搅拌反应，经过滤除去白色沉淀，减压蒸除溶剂后，粗产物经柱层析纯化，用二氯甲烷-丙酮洗脱，得目标产物。本发明的化合物可在制备抗氧化应激干扰药物中应用。

Description

一种金线莲提取物自旋标记类似物及制备与用途

技术领域

本发明涉及一种化合物及这种化合物的制备方法与用途。确切讲本发明所涉及的是金线莲提取物Kinsenoside的自旋标记类似物及制备与用途。 

背景技术

兰科(Orchidaceae)开唇兰属植物金线莲Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.又名金线兰、金蚕等，主要分布于中国南部福建、广东、广西、云南等省区，是我国传统的珍稀药材，具有清热凉血、祛风利湿、强心等多种功效，民间多用于治疗糖尿病、支气管炎、肾炎等多种疾病。目前已有金线莲复方制剂上市使用。Kinsenoside是该植物中的高含量活性成分(J Nat Med，2008，62，132)，其结构式如图1所示。Zhang等研究证明该化合物能够治疗有氧化应激引起的糖尿病，且具有调节抗氧化酶活性，清除自由基，及降低NO因子含量的作用(J.Ethnopharmacology，2007，114，141)。这一结论与台湾Lin Wen-Chuan小组证实台湾金线莲水提物不仅具有抗糖尿病活性还对糖尿病老鼠具有降低氧化应激作用(Clinical and Experimental Pharmacol.Physiol，29，684)相一致。 

氧化应激(oxidative stress)是机体遭受有害刺激时，体内或细胞内自由基的产生与抗氧化防御之间严重失衡，氧化程度超出机体自身清除能力后，活性氧簇(ROS)在体内或细胞内蓄积而引起细胞毒性，导致组织损伤的过程。近期大量的研究表明氧化应激与糖尿病及其并发症、动脉粥样硬化斑块的形成、发展及破裂、高血压等多种疾病的发生、发展相关。由于氧化应激干扰是治疗与氧化应激有关的各种疾病的有效途径，从低毒的天然抗氧化剂中寻找氧化应激干扰药物具有举足轻重的地位。 

发明内容

本发明提供一种将自由基引入金线莲提取物Kinsenoside的自旋标记类似物，同时提供这种化合物的制备方法和用途。 

本发明所涉及和化合物共有5个，其第一个化合物为如式2示的化合物1A或1B， 

其中1A的构型为3-R，1B的构型为3-S。 

第二个化合物为如式3示的化合物2A或2B， 

其中2A的构型为3-R，2B的构型为或3-S。 

第三个化合物为如式4示的化合物3A， 

其构型为3-R。 

第四个化合物为如式5示的化合物4A或4B， 

其中4A的构型为3-R，4B的构型为3-S。 

第五个化合物为如式6示的化合物5A， 

其构型为3-R。 

本发明所述的化合物的制备方法是：将1mmol的与式Ⅰ～Ⅴ的化合物1或2或3或4或5的结构相对应的3-R构型醇或3-S构型的醇与1mmol的与化合物1或2或3或4或5的结构对应的自由基酸溶于20ml干燥的二氯甲烷中，加入催化量的0.1克N，N-二甲基吡啶，在氮气保护下搅拌5分钟，然后加入0.21克二环己基碳二亚胺(DCC)，在氮气保护下搅拌反应2小时，过滤除去白色沉淀，减压蒸除溶剂后，粗产物经柱层析纯化，用体积比为15∶1的二氯甲烷-丙酮洗脱，得目标产物式Ⅰ～Ⅴ所示化合物。 

本发明的化合物可在制备抗氧化应激干扰药物中、或者在制备治疗糖尿病的药物或者在制备治疗高血压的药物中的应用。 

氧化应激(oxidative stress)是机体遭受有害刺激时，体内或细胞内自由基的产生与抗氧化防御之间严重失衡，氧化程度超出机体自身清除能力后，活性氧簇(ROS)在体内或细胞内蓄积而引起细胞毒性，导致组织损伤的过程。近期大量的研究表明氧化应激与糖尿病及其并发症、动脉粥样硬化斑块的形成、发展及破裂、高血压等多种疾病的发生、发展相关。由于氧化应激干扰是治疗与氧化应激有关的各种疾病的有效途径，从低毒的天然抗氧化剂中寻找氧化应激干扰药物具有举足轻重的地位。关于这些内容可参见：“Oxidative Stress，Nitric Oxide，and Diabetes”Manuscript submitted November 6，2009；resubmitted January 11，2010；accepted January 27，2010；“Effect of antioxidants on amelioration of high-risk factors inducing hypertensive disorders in pregnancy”Chin Med J 2010；123(18)：2548-2554；“Oxidative stress as a mediator of cardiovascular disease”Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2：5，259-269；November/December 2009； 

2009 Landes Bioscience；“Pharmacology in Health Foods：Improvement of Vascular Endothelial Function by French Maritime Pine Bark Extract(Flavangenol)” Journal of Pharmacological Sciences J Pharmacol Sci 115，461-465(2011)；“Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease”Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2：5，270-278；November/December。 

体外细胞实验表明，这些化合物具有良好的抗氧化作用的同时，显示出低毒作用，而且相关的实验还表明是本发明的化合物具有较Kinsenoside更强的抗氧化活性，因此本发明在制备抗氧化应激干扰药物及制备由氧化应激引起病症的相关药物中极具前景。 

具体实施方式

一、化合物的制备 

实施例1：kinsenoside衍生物(3-R构型化合物1A，3-S构型化合物1B)的合成 

将1mmol对应的醇(具体为(R)-3-羟基-γ-丁内酯用于制备3-R构型化合物1A，(S)-3-羟基-γ-丁内酯用于制备3-S构型化合物1B)与1mmol的3-羧基-2，2，5，5-四甲基吡咯-氮氧自由基溶于20ml干燥的二氯甲烷中，加入催化量的0.1克N，N-二甲基吡啶，在氮气保护下搅拌5分钟，然后加入0.21克二环己基碳二亚胺(DCC)，在氮气保护下搅拌反应2小时，过滤除去白色沉淀，减压蒸除溶剂后，粗产物经柱层析纯化，用体积比为15∶1的二氯甲烷-丙酮洗脱，得化合物1A或1B。 

反应所得产物检测数据如下： 

1A：C₁₃H₁₈O₅N，yellow powder， 

68.238(c 48.8，CH₃COCH₃)；IR v：2978，1785，1664，1357，1229，1162，1085cm^-1；HR-ESIMS：m/z 286.1527[M+NH₄]⁺，calcd.286.1523 for[C₁₃H₁₈O₅N+NH₄]⁺；EI-MS：m/z(％)＝268[M]⁺(42)，154(100)，139(68)，85(43). 

1B：C₁₃H₁₈O₅N，yellow powder， 

-58.932(c 1.086，EtOH)；IR v：2976，1785，1664，1357，1232，1160，1084cm^-1；HR-ESIMS：m/z 286.1525[M+NH₄]⁺，calcd.286.1523 for[C₁₃H₁₈O₅N+NH₄]⁺；EI-MS：m/z(％)＝268[M]⁺(42)，154(100)，139(70)，85(86). 

实施例2：kinsenoside衍生物(3-R构型化合物2A，3-S构型化合物2B)的合成 

实验步骤与实施例1同，仅以1′-氧基-2′，2′，6′，6′-四甲基-1′，2′，5′，6′-四氢吡啶酸代替3-羧基-2，2，5，5-四甲基吡咯-氮氧自由基。反应所得产物检测数据如下： 

2A：C₁₄H₂₀O₅N，yellow powder， 

19.053(c 16.9，CH₃COCH₃)；IR v：2975，1783，1666，1356，1227，1162，1084cm^-1；HR-ESIMS：m/z 300.1673[M+NH₄]⁺， calcd.300.1680 for[C₁₄H₂₀O₅N+NH₄]⁺；EI-MS：m/z(％)＝282[M]⁺(30)，57(100)，168(98)，107(72)，40(93). 

2B：C₁₄H₂₀O₅N，yellow powder， 

-57.803(c 0.692，EtOH)；IR v：2977，1782，1665，1357，1228，1167，1084cm^-1；HR-ESIMS：m/z 300.1671[M+NH₄]⁺，calcd.300.1680 for[C₁₄H₂₀O₅N+NH₄]⁺；EI-MS：m/z(％)＝282[M]⁺(42)，168(80)，129(90)，107(82)，57(83)，40(100). 

实施例3：kinsenoside衍生物(3-R构型化合物3A)的合成 

实验步骤与实施例1同，仅以1′-氧基-2′，2′，5′，5′-四甲基四氢吡咯酸代替3-羧基-2，2，5，5-四甲基吡咯-氮氧自由基。反应所得产物检测数据如下： 

3A：C₁₃H₂₀O₅N，yellow powder， 50.831(c 30.1，CH₃COCH₃)；IR v：2977，1787，1225，1164，1078cm^-1；HR-ESIMS：m/z 288.1686[M+NH₄]⁺，calcd.288.1680 for[C₁₃H₂₀O₅N+NH₄]⁺；EI-MS：m/z(％)＝270[M]⁺(41)，185(70)，85(100). 

实施例4：kinsenoside衍生物(3-R构型化合物4A，3-S构型化合物4B)的合成 

以N-[(-甲酰-2′，2′，6′，6′-四甲基哌啶-4′-氮氧自由基酰胺基)-L-丙氨酸代替3-羧基-2，2，5，5-四甲基吡咯-氮氧自由基，其余与实施例3相同。反应所得产物检测数据如下： 

4A：C₁₇H₂₇O₇N₂，yellow oil， 

18.072(c 1.66，CH₃COCH₃)；IR v：3326，2978，1786，1362，1241，1173，1071cm^-1；HR-ESIMS：m/z 389.2155[M+NH₄]⁺，calcd.389.2157 for[C₁₇H₂₇O₇N₂+NH₄]⁺. 

4B：C₁₇H₂₇O₇N₂，yellow oil， 

-20.755(c 0.53，CHCl₃)；IR v：3323，2979，1787，1362，1241，1172，1071cm^-1；HR-ESIMS：m/z 372.1901[M+H]⁺，calcd.372.1891 for[C₁₇H₂₇O₇N₂+H]⁺. 

实施例5：kinsenoside衍生物(3-R构型化合物5A)的合成 

以N-[(-甲酰-2′，2′，6′，6′-四甲基哌啶-4′-氮氧自由基酰胺基)-L-色氨酸代替3-羧基-2，2，5，5-四甲基吡咯-氮氧自由基，其余与实施例3相同。反应所得产物检测数据如下： 

5A：C₂₅H₃₂O₇N₃，yellow oil， 33.898(c 1.77，CH₃COCH₃)；IR v：3359，3056，2976，1777，1365，1237，1175，1085，748cm^-1；HR-ESIMS：m/z 488.2381[M+H]⁺，calcd.488.2391 for[C₂₅H₃₂O₇N₃+H]⁺. 

二、抗氧化体外细胞实验及结果： 

(一)具有3-R构型的化合物1A，2A，3A，4A和5A的抗氧化作用实验 

通过3-R化合物1A，2A，3A，4A和5A对H₂O₂诱导PC12细胞损伤细胞 增殖活力影响实验，考察其抗氧化作用。 

PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株，具有神经元的许多相似特征。神经元富含高浓度的多不饱和脂肪酸和脂类，是自由基潜在的反应底物。因神经元细胞的抗氧化酶水平相对较低，容易受到氧化应激的损伤。且PC12细胞具有无限传代，生长条件稳定的特点。因此，PC12细胞除了常被用于神经细胞功能和生物特性研究外，还常被诱导成细胞氧化损伤模型进行抗氧化药物的筛选及作用机制的研究。 

取对数生长期PC12细胞，细胞消化计数后以1×10⁵cells/mL密度接种于96孔板中，培养12h至亚融合状态，更换培养基并分组：正常组，氧化损伤模型组，药物干预组分别加入终浓度为(10，30，50，70，90μg/mL)，每组5个复孔，药物与细胞预孵育1h后，各孔加入10μL H₂O₂(600μmol/L)，放入二氧化碳培养箱常规培养24h后，MTT法检测细胞增殖活性。 

实验结果为： 

3-R构型化合物1A，4A在30μg/mL、50μg/mL、70μg/mL，90μg/mL时，均能显著对抗H₂O₂诱导的PC12细胞增殖活力的损伤，表明化合物1A，4A在30-90μg/mL时均具有明显的抗氧化作用。同理，3-R构型化合物3A在10-90μg/mL时均具有明显的抗氧化作用；3-R构型化合物2A在70-90μg/mL时均具有明显的抗氧化作用。3-R构型化合物5A在10-70μg/mL时均具有明显的抗氧化作用，参见表1。 

表1、3-R型化合物1A，2A，3A，4A，5A对H₂O₂诱导PC12细胞损伤细胞增殖活力的影响 

^**p＜0.01与正常组比有高度显著性差异，^#p＜0.05与模型组比有显著性差异，^##p＜0.05与模型 组比有高度显著性差异. 

(二)具有3-S构型的化合物1B，2B和4B的抗氧化作用 

实验步骤与实施例6同，仅以3-S化合物1B，2B和4B代替3-R化合物1A，2A，3A，4A和5A。通过3-S化合物1B，2B和4B对H₂O₂诱导PC12细胞损伤细胞增殖活力影响实验，考察其抗氧化作用。 

实验结果为：3-S构型化合物1B，2B在10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、70μg/mL，90μg/mL时，均能显著对抗H₂O₂诱导的PC12细胞增殖活力的损伤，表明化合物1B，2B在10-90μg/mL时均具有明显的抗氧化作用。同理，3-S构型化合物4B在70-130μg/mL时均具有明显的抗氧化作用，参见表2。 

表2、3-S型化合物1B，2B，4B对H₂O₂诱导PC12细胞损伤细胞增殖活力的影响 

^**p＜0.01与正常组比有高度显著性差异，^#p＜0.05与模型组比有显著性差异，^##p＜0.05与模型组比有高度显著性差异. 

(三)化合物1A，2A，3A，4A和5A对正常细胞生长的抑制作用 

取对数生长期PC12细胞，细胞消化计数后以1×10⁵cells/mL密度接种于96孔板中，培养12h至亚融合状态，更换培养基并分组，正常组，药物干预组分别加入终浓度为(10，30，50，70，90，110，130μg/mL)，每组5个复孔，培养24h后，MTT法检测细胞增殖活性。 

实验结果：3-R构型化合物1A，2A，3A，5A在10-90μg/mL时，对PC12细胞增殖活力无影响，表明化合物1A，2A，3A，5A在10-90μg/mL对PC12细 胞无毒性作用。同理，3-R构型化合物4A在30-110μg/mL对PC12细胞无毒性作用，参见表3。 

表3、3-R构型化合物1对PC12细胞增殖活力的影响 

(四)化合物1B，2B和4B对正常细胞生长的抑制作用 

实验步骤与实施例8同，仅以3-S化合物1B，2B和4B代替3-R化合物1A，2A，3A，4A和5A，所得实验结果为：3-S构型化合物1B，2B和4B在10-90μg/mL时，对PC12细胞增殖活力无影响，表明化合物1B，2B在10-90μg/mL对PC12细胞无毒性作用。同理，3-S构型化合4B在50-130μg/mL对PC12细胞无毒性作用，参见表4。 

表4、3-S构型化合物1对PC12细胞增殖活力的影响 

Claims (7)

1.一种如式II示的化合物，

其构型为3-R或3-S。

2.一种如式III示的化合物，

其构型为3-R。

3.一种如式V示的化合物，

其构型为3-R。

4.权利要求1或2或3所述的化合物的制备方法，其特征在于将1mmol对应的3-R构型醇或3-S构型醇与1mmol的对应自由基酸溶于20ml干燥的二氯甲烷中，加入催化量的0.1克N，N-二甲基吡啶，在氮气保护下搅拌5分钟，然后加入0.21克二环己基碳二亚胺，在氮气保护下搅拌反应2小时，过滤除去白色沉淀，减压蒸除溶剂后，粗产物经柱层析纯化，用体积比为15∶1的二氯甲烷-丙酮洗脱，得目标产物。

5.权利要求1至3所述的任一化合物在制备抗氧化应激干扰药物中的应用。

6.权利要求1至3所述的任一化合物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。

7.权利要求1至3所述的任一化合物在制备治疗高血压的药物中的应用。