CN102268441A - 油菜生长调节因子基因grf2及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种油菜生长调节因子基因GRF2及应用，其碱基序列为SEQID NO：1所示的核苷酸序列，同时包括其它作物中与SEQ ID NO：1所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列；还包括在添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的突变体等位基因或衍生物。研究结果证实，该类基因在油菜高油亲本及高油F2混合群体中表达量高于低油亲本及低油F2混合群体。利用拟南芥作为受体的转基因结果证实，此类基因的过量表达不但提高了转基因拟南芥的含油量，同时也增加了种子的千粒重。一种油菜生长调节基因BnGRF2在提高拟南芥等植物种子千粒重、含油量中的应用。因此，此类基因在油菜及其他油料作物的产油量育种中具有很好的应用前景。

Description

油菜生长调节因子基因GRF2及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，更具体涉及一种油菜生长调节因子基因GRF2，同时还涉及一种油菜生长调节因子基因GRF2的应用。

背景技术

油料作物生产不仅在国民经济和社会发展中占有重要地位，也是促进中国农业可持续发展的主要因素之一。目前中国的植物油生产量仅能满足国内1/2-2/3的消费需求，大量依赖进口。例如2005年中国进口植物油600多万吨，同时还进口大豆2,400万吨，为世界上最大的油料进口国。随着人口数量的增长和人民生活水平的提高，预计到2010年中国食用植物油消费量将增加到2,500万吨，按目前的生产规模，缺口将非常巨大。从食物安全和增加农民收入的角度考虑，急需较大幅度增加单位面积油料作物的产出量。增加中国植物油脂产量最直接的办法是大幅度扩大种植面积，但中国耕地面积有限，进一步大幅度扩大油料作物种植面积是不现实的。因此，申请人必须通过提高油料作物单产，或提高种子中油分和蛋白的含量，达到高产高效。同时植物油还是许多重要工业原料的很好来源，从能源作物油，工业原料油的角度看植物油具有更大的社会意义。

油菜是中国最主要的油料作物之一，菜籽油在中国的食用油约占40％。中国油菜年种植面积700万公顷，菜籽产量超过1,000万吨，面积和总产均为世界第一位，分别占全世界的1/3。目前经过几代育种学家的努力，通过传统育种途径已经使油菜单产提高了许多，从上世纪50年代的70多斤提高到现在的300多斤，提高了4倍多，进一步通过传统育种途径大幅度提高产量的难度很大。但中国的菜籽比其它国家生产的含油量低，长江流域油菜质量普查结果显示，2004年油菜商品籽含油量为39.1％，比同年加拿大商品籽(42.6％)的低3.5个百分点。因此，大幅提高中国油菜含油量成为油菜育种的主要目标，也是解决中国对菜籽油需求量增加最有效的途径之一。油菜种子含油量属数量性状，其遗传受微效多基因控制，并且环境影响很大，在传统育种方法上有一定难度。现在人们越来越多地把重点放在含油量相关功能基因的分离上，并利用这些基因进行相关的基因工程品种改良争取从根本上改善种子的品质，提高油含量。无论是中国还是其他发达国家，寻找和克隆与含油量相关基因都是首要任务。而中国拥有自主知识产权的基因很少，这严重制约了中国农业生物技术产业的发展，并直接威胁着中国农业产业经济的安全。所以分离调控油脂合成的未知功能基因不仅将确保中国拥有一批自主知识产权的油菜基因资源；并且通过这些基因资源进行基因工程改良，发展中国有自主知识产权的转基因油菜产品在很大程度上可以缓解中国油脂产量不足的压力。

脂肪酸和油脂的生物合成途径在植物体内研究的已较为透彻，从不同物种中已经有相当多的相关基因得到分离和鉴定，研究也表明不同物种脂肪酸和油脂合成的化学途径基本上是相同的(Lung and Weselake 2006，Snyder 2009)。种子油脂合成的主要前体包括乙酰辅酶A，NAD(P)H和ATP。这些合成前体的来源和调控直接影响油脂积累的速率和数量(Voelker 2001)。它们的来源也一直被重点研究，但由于代谢途径的复杂性和冗余性，它们的具体来源仍还存在许多争议(Rawsthorne 2002)。乙酰辅酶A是所有脂肪酸碳骨架合成的最初底物，同样也是许多细胞代谢的重要中间产物，在细胞中大量合成也大量消耗。叶绿体内的丙酮酸脱氢酶，乙酰辅酶A合成酶，肉碱乙酰转移酶以及细胞质的ATP柠檬酸裂合酶都有可能参与了乙酰辅酶A的合成(Neuhaus and Emes 2000)。Schwender等(2004)的研究证明油菜油脂合成所需的丙酮酸并不像以前所认为的全部是通过糖酵解途径产生，而是核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)在菜籽中独立于Calvin循环(光合作用的暗反应)发挥作用，使从胚珠光合作用产物中制造的脂肪酸更多，暗示CO2在油脂合成过程可能也起着很重要的前体作用。脂肪酸合成所需的ATP和NAD(P)H，在光照条件下一般认为是由光反应提供(Ruuska等2004)，但也存在一定争议，如Eastmond(1998)证明在脂肪酸合成中所需ATP和NAD(P)H仅靠光的贡献是不够的，还需要从细胞质中获得。在黑暗中及缺乏叶绿体的组织中，磷酸戊糖氧化途径是还原态NAD(P)H最有可能的来源，但也有研究表明同时还需要其他几个途径如糖酵解等才能提供足够的还原力(Schwender等2003)。最近在油菜和拟南芥中的研究结果显示，种子内的光合作用对含油量的贡献率在40％左右(Fernando 2005，Setsuko 2008)。而对磷酸戊糖途径的抑制反而增加了种子的含油量，表明相对于其提供用于脂肪酸合成的还原力NADPH，抑制磷酸戊糖途径来增加碳源可以更有效的增加油脂含量(Setsuko 2008)。

虽然单一的改变脂肪酸和油脂合成途径中的一系列酶如ACCase，GPAT，DGAT等可以调控含油量的变化(Roesler 1997，Jain 2000，Weselake 2008，Zheng2008)，但也有一些基因能够在代谢途径的上游位置以一种更有效的方式来对脂肪酸和油脂的合成进行整体的调控。最近研究表明，植物胚胎发育相关的转录因子通过影响一系列的生化途径包括糖酵解、脂肪酸代谢、蛋白质合成等中的众多酶类，来调控种子成熟过程中储藏产物的增加(Gutierrez 2007，Verdier andThompson 2008，Santos 2008)。通过对模式植物拟南芥突变体的筛选，鉴定了一系列调控种子油脂积累的转录因子如LEC1、LEC2、WRI1、GLABRA2等(Shen 2006，Baud 2007b，Mu 2008)。然而，由于多数转录因子的功能丰余性增加了研究其调控油脂含量的复杂性，目前为止仍有一些转录因子的作用机制未知(To 2008，Gao 2009)。

虽然上述研究通过对脂肪酸代谢途径部分关键酶的遗传操作在理论上对提高含油量进行了有益的探索，但在生产实践上尚有一定距离。应该认识到油菜含油量是由多个基因相互作用调控的，仅靠改变其中的某个或少数基因来提高含油量是很难奏效的，而必须同时对控制性状的多个编码基因，甚至调控基因进行遗传转化，并使它们在转基因植株及其后代中稳定地表达和遗传才能达到预期的目的。培育一个优良的转基因品系，选用合适的功能基因是重中之重的环节。一直以来不同生物物种优势功能基因的挖掘、分离和克隆都是世界各国优先研究的课题。

在本发明中申请人通过分析油菜含油量差异显著的两亲本及F2代分离群体混合样本的基因表达差异，筛选出一类在亲本及F2代极端分离材料中同时存在表达差异的基因。通过基因全长的克隆，表达载体的构建以及模式植物拟南芥的转化，最终获得一个可调控含油量变化的基因。同时，该基因在拟南芥中的过量表达还提高了种子千粒重。将其应用到作物育种中，可以最大幅度的增加油料作物的产油量。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种油菜生长调节因子基因GRF2，本发明提供了这个基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示的DNA序列，也包括与SEQ IDNO：1所示的DNA序列至少有70％同源性的本物种及其它物种中的基因序列。该基因属于生长调节因子家族中的一员，具有核定位区域，促进转录激活。在拟南芥中该基因的突变可导致叶片变小，证实该基因可在叶片发育中发挥作用。

本发明的另一个目的是在于提供了一种油菜生长调节因子基因GRF2在提高油料植物产油量中的应用。因此，若将此基因应用于油料作物，不但可以提高油料作物种子的含油量，同时可增加作物的产量，最大限度的提高油料作物的产油量。

本发明的再一个目的是在于提供了一种油菜生长调节基因BnGRF2在提高拟南芥植物种子千粒重中的应用。通过模式植物拟南芥证实BnGRF2基因不但可调控种子含油量的变化，同时还增加了千粒重。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术措施：

一、基因的来源：

以高低含油量品系zy036与y817(含油量分别为51％和35％)杂交构建F₂代群体共得到169个后代单株为材料；分别收集各F2单株开花后25天左右的角果(带角果皮和胚珠)；各单株成熟种子进行含油量检测，将含油量检测大于47％和小于38.5％的单株的角果分别取等量200mg混合组成两极端含油量混合样本分别编号H和L。其中含油量大于47％的有11株，含油量小于38.5％的有11株；两个混样平均含油量相差11.1％。分析两亲本及两混样表达基因，找出亲本与F2代混样表达量同时表现差异的基因，BnGRF2基因即源于此。本研究中所用的亲本材料zy036和Y817，均由中国农科院油料所生物技术育种课题组技术人员在王汉中研究员带领下育成。zy036品系是由中双4号、中双7号、中双9号、华双3号、油研9号构建轮回选择群体，轮回选择两代后选优良单株进行小孢子培养轮回选择第三代，最终经高油定向选择得到。Y817是杂交品种中油杂1号的保持系(中油杂一号制种技术研究与应用，农村经济与科技，2001年第10期)。

二、基因的全长克隆：

通过筛选基因表达差异，发现GRF2基因在油菜高油亲本及高油F2混合群体中表达量高于低油亲本及低油F2混合群体。因此申请人利用拟南芥GRF2基因的序列比对获得油菜该基因的EST序列，利用申请人自己的测序数据库，寻找与之同源的油菜基因组序列拼接，并设计基因编码区序列的两侧引物。以亲本zy036cDNA第一链为模板进行RT-PCR扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得BnGRF2基因的编码区序列，同时扩增拟南芥中同源基因AtGRF2序列。为一种油菜生长调节基因BnGRF2，其碱基序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。为一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

三、转基因载体的构建、转化及验证：

通过上述方法获得了油菜BnGRF2基因，采用一种提高油菜基因表达活性的转基因拟南芥，其特征在于比受体对照(非转基因植株)相比，转基因植物表现为基因表达量增加。其具体措施是：

一种PCR8/GW/TOPO质粒(invitrogen公司购买)，可以与表达载体质粒重组构建基因表达质粒的实验方法(invitrogen公司购买)。

一种质粒表达载体Pearleygate100(invi trogen公司购买)，它含有35S启动子和翻译控制件。

一种可在植物中表达的宿主菌(如GV3101，LBA4404等)，本发明优选的是农杆菌(GV3101，invitrogen公司购买)。

一种能够过量表达某基因的转基因拟南芥，其特征在于拟南芥中所转基因表达量增加。其应用过程包括下列步骤：

1)将克隆得到的油菜基因与PCR8/GW/TOPO质粒连接，利用PCR8/GW/TOPO质粒与质粒表达载体Pearleygate100可以体外重组的特性将油菜基因转移至表达载体；

2)将步骤1)中制备的表达载体转入根癌农杆菌GV3101，再导入拟南芥植株中。

3)转基因阳性植株PCR鉴定，除草剂(Bar，草苷膦)筛选后正常条件生长并收获种子测定含油量。结果表明，转基因拟南芥种子的含油量与对照拟南芥相比有较大幅度的提高。

本发明中所用的术语“转基因植物”是指含有导入的基因并能够稳定地增强或抑制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。克隆本发明中所述的油菜基因的方法是本领域中所常采用的方法如：利用CTAB法提取植物叶片DNA，提取mRNA的方法也有多种成熟的技术，如采用TRIzol Reagent，Invetrogen公司或Total RNA extraction，qiagen公司，可从商业途径获得。构建cDNA文库也是常用的分子生物学技术。构建本发明中所述的载体和将载体转染入植株也是本领域中所常采用的方法。其中所涉及的质粒(入门载体PCR8/GW/TOPO，质粒表达载体Pearleygate100)，转染用媒体(如根癌农杆菌GV3101和所用试剂(蔗糖等)可从商业途径获得。聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子标记的多态性分析的最常用手段，所有试剂如丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺等均可从商业途径获得。

四、转基因拟南芥分析：

通过在野生拟南芥中过量表达BnGRF2、AraGRF2基因，转基因拟南芥植株叶片和种子外观与野生型有明显区别(图3、图4)。收获种子后通过脉冲式核磁共振仪测定含油量，结果表明转基因植株与对照相比，含油量均有不同程度的提高。上述结果表明，不仅油菜基因可以提高种子含油量，与此类油菜基因序列有70％同源性的其它物种的基因同样可以提高含油量。

本发明的优点效果是：本发明中油菜BnGRF2基因为首次报导与种子含油量相关。通过在拟南芥中的实验证实，此类基因确实可以提高种子含油量，同时还可以增加种子千粒重。研究结果表明，转基因拟南芥种子含油量与野生型拟南芥相比有明显提高(见表1)，最高幅度可达20％以上。而千粒重的增加幅度最高可达40％。此类基因可以应用于油菜高含油量育种，通过使用组成型启动子35S在油菜品种中超量表达此类基因，得到含油量提高且千粒重增加的油菜新品种，加快油菜含油量育种的步伐。同时，将其扩展到其他油料作物如大豆、花生、芝麻等的育种应用中，最大限度的提高油料作物的产油量。

表1过量表达BnGRF2、AraGRF2基因的拟南芥含油量及千粒重测定结果

附图说明

图1转BnGRF2基因拟南芥表达载体示意图

图2转BnGRF2拟南芥T1代的转基因鉴定结果。1，2，3，5，6，11样为转基因植株，WT为对照野生植株。

图3转基因植株与野生型对照叶片的比较，其中左图为转基因株系的叶片，右图为野生对照。

图4转基因植株与野生型对照种子的大小比较，其中左图为转基因株系的种子，右图为野生对照。

具体实施方式

实施例1：BnGRF2、AraGRF2cDNA编码区序列

在NCBI数据库中检索已发表的拟南芥基因序列，BLAST到油菜EST序列并比对申请人已测序的油菜基因组序列，设计基因编码序列的两侧引物(BnGRF2F：正向引物：[5’-atggatcttgggtcggtaactgg-3’]，反向引物：[5’-TCAGGTTGTGTAATGAAAGTA-3’]用来从油菜叶片cDNA中扩增对应序列。拟南芥中的扩增引物分别为：AraGRF2正向引物：[5’-atggatattggtgttcatgttc-3’]，反向引物：[5’-TCAGGTTGTGTAATGAAAGTAAT-3’]，直接在拟南芥叶片cDNA中扩增。

1、提取油菜、拟南芥mRNA。

RNA的提取(TRIZOL TM Kit提取RNA)，液氮研磨100mg材料。

A.加1mlTRIZOL，室温(20-25℃，以下相同)放置5min。

B.加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min。

C.12000g，15min，4℃，取上清至新管中，加入500ul异丙醇，混匀后室温放置15min。

D.12000g，15min，4℃，去上清，加入1ml70％(体积比)乙醇。

E.7500g，7min，4℃，去上清，空气干燥。

F.DEPC-H₂O溶解。

2、cDNA第一链的反转录采用RevertAid H Minus First Strand cDNA SynthesisKit(Fermentas)，操作参照所用试剂盒说明进行。

3、以cDNA为模板进行PCR扩增，得到了BnGRF2及AraGRF2基因序列如：一种油菜生长调节基因BnGRF2，其碱基序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所示以及如数据库中(NM_100614、NM_125364)拟南芥序列所示。

实施例2：转基因表达载体的构建及拟南芥的转化：

将PCR扩增得到的基因序列与TOPO入门载体(invitrogen公司)连接后，转化到感受态细胞DH5α(invitrogen公司)中，壮观酶素筛选，载体引物(T7引物)与基因引物(基因上游引物)扩增鉴定正向插入克隆，质粒经小量制备后与Pearleygate100(invitrogen公司)进行重组，并转化到感受态细胞DH5α中，卡那霉素筛选，其插入片段经载体引物(35S启动字序列引物)与基因引物(基因下游引物)PCR鉴定，示意图见图1。

拟南芥的转化过程：

试剂配制：

渗透培养基(1L)：1/2xMurashige-Skoog；5％(质量比)蔗糖；0.5克MES；用KOH调至pH5.7；再加：10微升1mg/ml的6-BA(6-苄氨基嘌呤)母液；200微升Silwet L-77。

转化步骤：

(1)制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液O.D600当在1.2到1.6之间。

(2)室温5000rpm离心15分钟。

(3)弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使O.D600在0.8左右。

(4)将整个植株直接浸泡至农杆菌悬浮液30s。

(5)避光培养过夜，然后正常培养至结子。

实施例3：转基因拟南芥的筛选和验证：

转化子的筛选：

将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩上。两天后光照，三天后揭膜。

人工培养室条件：相对湿度80％，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8h黑暗、16h光照培养。一周左右，喷除草剂(草苷膦)筛选阳性植株。

PCR鉴定：

(1)用于PCR的转化植株总DNA的提取：

A.70％(体积比)乙醇擦洗叶片，称取大约100mg

B.加入600ul抽提缓冲液(0.2M Tris-Cl，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5％(质量比)SDS，pH 7.5)，室温快速研磨。

C.1.5ml Ependorff管中涡旋混匀5-10s。

D.12000rpm，25min，室温。取上清，加等体积异丙醇，-20摄氏度沉淀过夜。

E.12000rpm，15min，室温。加入70％(体积比)乙醇200ul泡洗DNA沉淀。

F.12000rpm，15min，室温。去乙醇。倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净。

G.加无菌水100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度计测定或电泳估测其浓度。

H.以总DNA为模板，进行PCR。

(2)PCR程序：

PCR反应混合液的配比同质粒PCR鉴定，依据植物表达载体中35S启动子序列和BnGRF2基因下游引物[5’-tcagccagagatctggatag-3’]，5’--3’反应的时间和温度如下：

94℃3min

94℃45s，

59℃45s

72℃2min 30s，30cycles

72℃5min

检测结果显示，大多数转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带，而阴性对照则没有，表明转基因拟南芥基因组中已经含有外源基因DNA片段，BnGRF2结果如图2示。

实施例4.：转基因拟南芥种子含油量及千粒重检测：

转基因纯合株系生长于21-23℃温室中，收获种子后测其含油量及千粒重的变化(图3)。结果显示，转基因拟南芥种子含油量与野生型拟南芥相比有明显提高(见表1)，最高幅度可达20％以上。而千粒重也有所增加，增加幅度最高达40％。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>油菜生长调节因子基因GRF2及应用

<130>油菜生长调节因子基因GRF2及应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1467

<212>DNA

<213>油菜

<400>1

atggatcttg ggtcggtaac tggcaatgtt aacgggtcac cgggtctaaa agagcttaga    60

ggatccaaac aagacagatc cggattcgac ggtgaggatt gcttgcaaca aagctcgaag    120

ctagctagaa caatagctga agacaaacac ttgccttcct cttacgcagc ttatagcaga    180

ccaatgtcgt ttcatcaagg cattcctctt acaagatctg cttctcttct ctcctctgac    240

tctcgccggc aagaacacat gcttagcttc tcagataaac cagaagcttt cgacttcagt    300

aaatacgtcg gtttggataa caacaagaac tctctctcgc cgtttcttca ccagcttcca    360

cctccttatt gtagaagccc aggaggatat ggttctggtg gaatgatgat gagcatgcaa    420

gggaaagggc cttttacatt gactcaatgg gctgagttag agcaacaggc cttgatctat    480

aagtatatca cagccaatgt ccctgttcct tctagtttgc tcatctctat ccaaaagtcc    540

ttttaccctt atagatcatt tcctcccagt tcctttggat ggggaacatt ccatctaggt    600

ttcgcaggag gtaaaatgga tcctgagcca gggagatgcc gtagaacaga cggtaagaaa    660

tggcggtgct caaaagacgc tgttcctgaa cagaagtact gcgaaagaca catcaacaga    720

ggccgtcacc gttcaagaaa gcctgtggaa gtccaacctg gccaaaccgc tgcgtccaaa    780

gcggttgcat cgcgtaacac tgcatcacaa atacctagca acaggtatat atatatacat    840

aacgtatctt ttcaatactt tggcatgttg ttaatagctt gcttacatat tattattgca    900

aaaaacagag tccagaatgt gatatatcca tccaacgtta acttgcaacc caaggaacag    960

agaaacaacg acaacagccc ttttgggttt ggtcacgtga cctcttcctc attgctcaca    1020

tcttcgtacc tagactttag cagcaaccaa gagaagcctt cggggaatca tcacaaccag    1080

agctcttggc ctgaagagct gaaatcggat tggacgcagc tttcaatgtc aattccagtt  1140

gcatcatcat ctccttcctc caccgctcaa gacaaaaccg cactctcgcc tctcaggcta  1200

gacttaccga tccaaagcca gcaggagaca ctggagtctg cgagaaaggt gaatacgtgg  1260

ataccaatct catgggggaa ctccttagga ggtcctttag gggaagtact taacagcaca  1320

acgagtagtc ccacgttggg atcttctcct acaggtgttt tgcagaagtc cacgttttgc  1380

tcgctttcta acagcagctc tgtaaccagc cccattgcgg acaacaacag aaacaacaat  1440

gttgactact ttcattacac aacctga                                      1467

<210>2

<211>488

<212>PRT

<213>油菜

<400>2

Met Asp Leu Gly Ser Val Thr Gly Asn Val Asn Gly Ser Pro Gly Leu

1               5                   10               15

Lys Glu Leu Arg Gly Ser Lys Gln Asp Arg Ser Gly Phe Asp Gly Glu

            20                  25                  30

Asp Cys Leu Gln Gln Ser Ser Lys Leu Ala Arg Thr Ile Ala Glu Asp

        35                  40                  45

Lys His Leu Pro Ser Ser Tyr Ala Ala Tyr Ser Arg Pro Met Ser Phe

    50                  55                  60

His Gln Gly Ile Pro Leu Thr Arg Ser Ala Ser Leu Leu Ser Ser Asp

65                  70                  75                  80

Ser Arg Arg Gln Glu His Met Leu Ser Phe Ser Asp Lys Pro Glu Ala

                85                  90                  95

Phe Asp Phe Ser Lys Tyr Val Gly Leu Asp Asn Asn Lys Asn Ser Leu

            100                 105                 110

Ser Pro Phe Leu His Gln Leu Pro Pro Pro Tyr Cys Arg Ser Pro Gly

        115                 120                 125

Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Met Met Met Ser Met Gln Gly Lys Gly Pro

    130                 135                 140

Phe Thr Leu Thr Gln Trp Ala Glu Leu Glu Gln Gln Ala Leu Ile Tyr

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Ile Thr Ala Asn Val Pro Val Pro Ser Ser Leu Leu Ile Ser

                165                 170                 175

Ile Gln Lys Ser Phe Tyr Pro Tyr Arg Ser Phe Pro Pro Ser Ser Phe

            180                 185                 190

Gly Trp Gly Thr Phe His Leu Gly Phe Ala Gly Gly Lys Met Asp Pro

        195                 200                 205

Glu Pro Gly Arg Cys Arg Arg Thr Asp Gly Lys Lys Trp Arg Cys Ser

    210                 215                 220

Lys Asp Ala Val Pro Glu Gln Lys Tyr Cys Glu Arg His Ile Asn Arg

225                 230                 235                 240

Gly Arg His Arg Ser Arg Lys Pro Val Glu Val Gln Pro Gly Gln Thr

                245                 250                 255

Ala Ala Ser Lys Ala Val Ala Ser Arg Asn Thr Ala Ser Gln Ile Pro

            260                 265                 270

Ser Asn Arg Tyr Ile Tyr Ile His Asn Val Ser Phe Gln Tyr Phe Gly

        275                 280                 285

Met Leu Leu Ile Ala Cys Leu His Ile Ile Ile Ala Lys Asn Arg Val

    290                 295                 300

Gln Asn Val Ile Tyr Pro Ser Asn Val Asn Leu Gln Pro Lys Glu Gln

305                 310                 315                 320

Arg Asn Asn Asp Asn Ser Pro Phe Gly Phe Gly His Val Thr Ser Ser

                325                 330                 335

Ser Leu Leu Thr Ser Ser Tyr Leu Asp Phe Ser Ser Asn Gln Glu Lys

            340                 345                 350

Pro Ser Gly Asn His His Asn Gln Ser Ser Trp Pro Glu Glu Leu Lys

        355                 360                 365

Ser Asp Trp Thr Gln Leu Ser Met Ser Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser

    370                 375                 380

Pro Ser Ser Thr Ala Gln Asp Lys Thr Ala Leu Ser Pro Leu Arg Leu

385                 390                 395                 400

Asp Leu Pro Ile Gln Ser Gln Gln Glu Thr Leu Glu Ser Ala Arg Lys

                405                 410                 415

Val Asn Thr Trp Ile Pro Ile Ser Trp Gly Asn Ser Leu Gly Gly Pro

            420                 425                 430

Leu Gly Glu Val Leu Asn Ser Thr Thr Ser Ser Pro Thr Leu Gly Ser

        435                 440                 445

Ser Pro Thr Gly Val Leu Gln Lys Ser Thr Phe Cys Ser Leu Ser Asn

    450                 455                 460

Ser Ser Ser Val Thr Ser Pro Ile Ala Asp Asn Asn Arg Asn Asn Asn

465                 470                 475                 480

Val Asp Tyr Phe His Tyr Thr Thr

                485

Claims (4)

1.一种油菜生长调节基因BnGRF2，其碱基序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.权利要求1或2所述的一种油菜生长调节基因BnGRF2在提高拟南芥植物种子千粒重中的应用。

4.权利要求1或2所述的一种油菜生长调节基因BnGRF2在提高拟南芥植物种子含油量中的应用。

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