CN102256614A - 宿主防御的合成模拟物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供芳基酰胺化合物以及制备和作为抗生素使用它们的方法。

Description

宿主防御的合成模拟物及其用途
技术领域
本发明部分涉及芳基酰胺化合物及其生产和使用方法。
背景技术
抗菌肽(AMP)代表了许多物种防御微生物的第一道防线。AMP通常是小的(12-80个氨基酸)阳离子两亲物。有两类AMP，包括核糖体合成的肽和非核糖体合成的肽。已鉴定出超过700种AMP，并且一般是α-螺旋(马加宁(magainin)和杀菌肽(cecropin))或富含二硫键的β-片层(牛白细胞抗菌肽(bactenecin)和防卫素(defensin))。尽管这些肽由许多不同的序列组成，但是它们的理化性质非常相似。它们具有两亲结构，带正电荷的基团被隔离在二级结构的一面，而疏水基团在相反的一面。在哺乳动物中，这些肽由皮肤、粘膜表面和嗜中性粒细胞产生和分泌，并在局部对感染作出响应。这些整体理化性质正是这些肽的生物学活性的主要原因。
宿主防御蛋白的一些抗菌活性与直接的细胞毒性作用和对内在的免疫系统的调节相关。据推测它们的直接抗菌活性涉及膜作用和非膜作用二者。在进化进程中抗菌肽始终是抵抗细菌感染的有效武器，表明它们的作用机制阻碍导致对毒性物质产生抗性的细菌反应。这一假设得到直接试验数据的支持，这些数据显示在低于致死浓度的这些肽的存在下，多次连续细菌传代后，未出现可观察到的对抗菌肽作用的抗性。
急需研发攻击新靶点的新的抗菌药物以解决限制了许多抗生素使用的耐药性问题。而且，这些新的药物应当通过细菌不能有效抵抗的机制发挥它们的抗菌活性。已开发了一系列的非肽类似物，由于它们的尺寸小从而增加了稳定性并且增强了组织分布以及能够精细地调节它们的物理性质以最优化功效和安全性，所以与肽相比具有许多优点。已发现模拟抗菌肽结构性质的一系列的芳基酰胺化合物具有有效的抗菌活性和对哺乳动物细胞的宽选择系数。
发明内容
本发明提供式I化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0000070030420000021
其中：每个A独立地是-C＝O、-C＝S或-CH2；每个D独立地是O或S；每个R1独立地是氢、C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或卤代C1-3烷基，每个R2独立地是氢、C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或卤代C1-3烷基；每个R3独立地是氢、C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤素或卤代C1-4烷基；并且每个R4独立地是氢、C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或卤代C1-3烷基。
在一些实施方式中，每个A均是-C＝O。
在一些实施方式中，每个D均是O。
在一些实施方式中，每个R1独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R1独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R1独立地是氢、甲基或甲氧基。在一些实施方式中，每个R1均是氢。
在一些实施方式中，每个R2独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R2独立地是氢、甲基、甲氧基或卤素。在一些实施方式中，每个R2均是氢。
在一些实施方式中，每个R3独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R3独立地是甲基、甲氧基、卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R3独立地是卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R3独立地是卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R3均是三氟甲基。
在一些实施方式中，每个R4独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R4独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R4独立地是氢、甲基、甲氧基或卤素。在一些实施方式中，每个R4均是氢。
在一些实施方式中，每个A独立地是-C＝O、-C＝S或CH2；每个D独立地是O或S；每个R1独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素、卤代甲基或卤代乙基；每个R2独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代甲基；每个R3独立地是C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或卤代烷基；并且每个R4独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素、卤代甲基或卤代乙基。
在一些实施方式中，每个A独立地是-C＝O或-C＝S；每个D独立地是O或S；每个R1独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代甲基；每个R2独立地是氢、卤素或卤代甲基；每个R3独立地是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素、卤代甲基或卤代乙基；并且每个R4独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素、卤代甲基或卤代乙基。
在一些实施方式中，每个A均是-C＝O；每个D均是O；每个R1独立地是氢、卤素或卤代甲基；每个R2独立地是氢或卤素；每个R3独立地是甲基、甲氧基、卤素或卤代甲基；并且每个R4独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代甲基。
在一些实施方式中，每个A均是-C＝O；每个D均是O；每个R1独立地是氢或卤素；每个R2独立地是氢或卤素；每个R3独立地是甲基、卤素或卤代甲基；并且每个R4独立地是氢、甲基、卤素或卤代甲基。
在一些实施方式中，每个A均是-C＝O；每个D均是O；每个R1独立地是氢或卤素；每个R2独立地是氢或卤素；每个R3独立地是卤素或卤代甲基；并且每个R4独立地是氢或卤素。
在一些实施方式中，每个A均是-C＝O；每个D均是O；每个R1独立地是氢或卤素；每个R2独立地是氢或卤素；每个R3独立地是甲基、卤素或卤代甲基；并且每个R4独立地是氢、甲基、卤素或卤代甲基。
在一些实施方式中，所述化合物是：
Figure BDA0000070030420000031
化合物A
或其药学上可接受的盐。
本发明还提供了包含一种或多种上述化合物或任何上述化合物的盐和药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明还提供了包含一种或多种上述化合物的制剂，其中所述制剂包含盐水、水、环糊精溶液或pH3-9的经缓冲的溶液。在一些实施方式中，所述制剂为口服的非吸收性制剂。在一些实施方式中，所述制剂包含选自以下的赋形剂：纯化水、丙二醇、聚乙二醇400(PEG400)、甘油、DMA、乙醇、苯甲醇、柠檬酸/柠檬酸钠(pH3)、柠檬酸/柠檬酸钠(pH5)、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(pH7.0)、0.9％盐水和1.2％盐水，或它们的任意组合。在一些实施方式中，所述制剂包含选自丙二醇、纯化水和甘油的赋形剂。在一些实施方式中，所述制剂包含选自以下的赋形剂：盐水中20％w/v丙二醇、盐水中30％w/v丙二醇、盐水中40％w/v丙二醇、盐水中50％w/v丙二醇、纯化水中15％w/v丙二醇、纯化水中30％w/v丙二醇、纯化水中50％w/v丙二醇、纯化水中30％w/v丙二醇和5w/v乙醇、纯化水中15％w/v甘油、纯化水中30％w/v甘油、纯化水中50％w/v甘油、纯化水中20％w/vKleptose、纯化水中40％w/v Kleptose以及纯化水中25％w/v Captisol。
本发明还提供了制备化合物A的方法，包括：
a)使(R)-(-)-N-Boc-3-吡咯烷醇与强碱反应形成混合物；然后使所述混合物与2-氯-5-(三氟甲基)-1，3-二硝基苯反应形成具有式II的化合物：
b)在氢存在下，使式II化合物与醇和过渡金属催化剂反应形成式III的化合物：
Figure BDA0000070030420000042
c)将所述式III化合物和嘧啶-4，6-二羧酸加入2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪和N-甲基吗啉的混合物中以形成式IV的化合物：
Figure BDA0000070030420000051
d)使式IV的化合物与N-Boc-胍丁酸反应形成式V的化合物
Figure BDA0000070030420000052
e)将式V的化合物脱保护以产生化合物A。在一些实施方式中，a)中的强碱是NaH；并且b)中的过渡金属催化剂是Pd/C而所述醇是乙醇。
本发明还提供制备化合物A的可选择的方法，包括：
a)将(R)-3-羟基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯脱保护，并使所得的化合物与2-氯-1，3-二硝基-5-三氟甲基苯反应形成(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；
b)在醇、过渡金属催化剂和氢存在下，还原(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯形成(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；
c)在1-[(3-(二甲基氨基)丙基)]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在下，使(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯与嘧啶-4，6-二羧酸偶联形成嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}；
d)在三氯氧磷存在下，使嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧)-5-三氟甲基苯基]酰胺}与({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚胺基]甲基}氨基)戊酸反应形成嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚胺基]甲基}氨基)戊酰基氨基)-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-酰胺}；
e)将嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚胺基]甲基}氨基)-戊酰基氨基)-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)-吡咯烷-3-基氧)-5-三氟甲基-苯基]-酰胺}脱保护形成粗嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-胍基-戊酰基氨基)-2-((R)-吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-酰胺}四盐酸盐；以及
f)通过例如反相色谱法纯化粗嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-胍基-戊酰基氨基)-2-((R)-吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-酰胺}四盐酸盐。
本发明还提供了制备化合物A的第二种可选择的方法，包括：
a)将(R)-3-羟基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯脱保护，并进一步使所得的化合物与2-氯-1，3-二硝基-5-三氟甲基苯反应以形成(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；
b)在醇、过渡金属催化剂和氢存在下，还原(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯形成(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；
c)在1-[(3-(二甲基氨基)-丙基)]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在下，使(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯与嘧啶-4，6-二羧酸偶联形成嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}；
d)在亚硫酰氯存在下，使嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]酰胺}与N-Cbz酸(N-苄氧羰基酸)反应；
e)在醇、过渡金属催化剂和氢存在下，还原d)所得的化合物；
f)使e)所得的化合物与二-Boc(叔丁氧基羰基)吡唑反应；以及
g)将f)所得的化合物脱保护以产生化合物A。
本发明还提供了制备化合物A的药学上可接受的盐的方法，包括：
a)使(R)-(-)-N-Boc-3-吡咯烷醇与强碱反应形成混合物；然后使所述混合物与2-氯-5-(三氟甲基)-1，3-二硝基苯反应形成具有式II的化合物：
Figure BDA0000070030420000061
b)在氢存在下，使式II的化合物与醇和过渡金属催化剂反应形成式III的化合物：
Figure BDA0000070030420000071
c1)将所述式III的化合物和嘧啶-4，6-二羧酸加入2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪和N-甲基吗啉的混合物中以形成式IV的化合物：
Figure BDA0000070030420000072
c2)将所述式III的化合物和嘧啶-4，6-二羧酸加入1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]-碳二亚胺盐酸盐(EDCl)和无水吡啶的混合物中以形成式IV的化合物：
Figure BDA0000070030420000073
d)将式IV的化合物和N-Cbz酸加入包含无水吡啶、二甲基氨基丙胺并包含亚硫酰氯、POCl3、(EtO)2POCl或草酰氯中任一种的溶液中以形成式Va的化合物：
Figure BDA0000070030420000081
e)水解式Va的化合物的Cbz(苄氧羰基)基团以产生式VI的化合物：
f)保护式VI的化合物以产生式VII的化合物
Figure BDA0000070030420000083
g)将式VII的化合物脱保护以产生化合物A的药学上可接受的盐。
本发明还提供了抑制微生物生长的方法，包括使所述微生物与任何上述化合物或其药学上可接受的盐接触。
本发明还提供了治疗患有细菌感染的哺乳动物的方法，包括给予对此有需要的哺乳动物抗菌有效量的任何上文所述的化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述微生物或微生物感染是革兰氏阴性好氧菌、革兰氏阳性好氧菌、革兰氏阴性厌氧菌、革兰氏阳性厌氧菌、分枝杆菌或酵母。在一些实施方式中，所述革兰氏阴性好氧菌是大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、多变柠檬酸杆菌、克氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、摩氏摩根菌、斯氏普罗威登斯菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、粘质沙雷菌、溶血不动杆菌、琼氏不动杆菌、鲁菲不动杆菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌或铜绿假单胞菌。在一些实施方式中，所述革兰氏阳性好氧菌是粪肠球菌、屎肠球菌、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、Staphylococcus colmii、松鼠葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌、无乳链球菌、化脓性链球菌、咽峡炎链球菌、缓症链球菌或口腔链球菌。在一些实施方式中，所述革兰氏阴性厌氧菌是脆弱拟杆菌。在一些实施方式中，所述革兰氏阳性厌氧菌是艰难梭菌或产气荚膜梭菌。在一些实施方式中，所述分枝杆菌是结核分枝杆菌或田鼠分枝杆菌。在一些实施方式中，所述酵母是白色念珠菌或克鲁斯氏念珠菌。
本发明还提供了任何上述化合物用于治疗微生物感染。
本发明还提供了任何上述化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗微生物感染的药物中的应用。
本发明还提供了任何上述化合物或其药学上可接受的盐在用于抑制微生物生长中的应用。
本发明还提供了任何上述化合物或其药学上可接受的盐在治疗哺乳动物微生物感染中的应用。
附图说明
图1A和图1B显示化合物A对金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC27660的随时间-杀菌试验(图1B是图1A的放大图)。
图2显示了金黄色葡萄球菌传代与诺氟沙星的关联，对于MSSA和MRSA二者，第三代时MIC值显著升高(4次倍比稀释(4doublingdilutions))。
图3显示了在小鼠大腿感染模型中，化合物A对金黄色葡萄球菌的功效。
图4显示了在大鼠大腿感染模型中，与万古霉素相比，化合物A对金黄色葡萄球菌的功效。
图5显示了在小鼠败血症模型中，化合物A对金黄色葡萄球菌的功效。
具体实施方式
如本文所使用的，术语“约”表示其描述的数值±5％。例如，约100表示从95至105。
如本文所使用的，术语“C1-3烷基”、“C1-4烷基”和“(CH2)1-7”分别表示具有1-3个碳原子、1-4个碳原子和1-7个碳原子的饱和、单价无分支或分支的烃链。烷基的实例包括但不限于(C1-C7)烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2-甲基-1-戊基、2，2-二甲基-1-丙基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2，2-二甲基-1-丁基、3，3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基以及庚基。烷基可以是未取代的或被一个或两个适合的取代基取代。
如本文所使用的，术语“C1-3烷氧基”和“C1-4烷氧基”表示-O-烷基，其中烷基如上文所定义。烷氧基可以是未取代的或被一个或两个适合的取代基取代。烷氧基的烷基链的长度是1-3或1-4个碳原子。
如本文所使用的，术语“卤素”表示卤原子，例如氟、氯、溴或碘。
如本文所使用的，术语“卤代C1-3烷基”和“卤代C1-4烷基”表示如上定义的烷基，其中一个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)氢被如上定义的卤素取代。
如本文所使用的，“分离的”表示例如通过常规技术将式I的化合物与(a)天然来源例如细胞，如细菌培养物，或(b)合成有机化学反应混合物的其他组分分离，从而使式I的化合物被纯化。
如本文所使用的，术语“哺乳动物”表示啮齿动物(即小鼠、大鼠或豚鼠)、猴子、猫、狗、牛、马、猪或人。在一些实施方式中，所述哺乳动物是人。
如本文所使用的，术语“微生物”表示细菌、真菌、原生动物或病毒。
如本文所使用的，短语“药学上可接受的盐”包括但不限于酸性或碱性基团的盐。
如本文所使用的，术语“纯化的”表示当被分离时，所述分离物包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％该分离物重量的式I的化合物。
如本文所使用的，短语“适合的取代基”表示不破坏式I的化合物或用于制备它们的中间体的合成或药学用途的基团。适合的取代基的实例包括但不限于：(C1-C4)烷基、(C1-C4)烯基、(C1-C4)炔基、(C1-C4)烷氧基、-CN、-OH、氧基、卤素、-NO2、-CO2H、-NH2、-NH((C1-C4)烷基)、-N((C1-C4)烷基)2、-CHO、-CO((C1-C4)烷基)和-CO2((C1-C4)烷基)。本领域技术人员可基于式I化合物的稳定性以及药理学和合成活性选择适合的取代基。
如本文所使用的，短语包含式I的化合物的“抗菌有效量”是通过该化合物的抗菌有效性测量的。在一些实施方式中，抗菌有效量将特定微生物的生长抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方式中，“抗菌有效量”还是“治疗有效量”，所述化合物藉此减少或清除哺乳动物上的微生物的至少一种有害作用。
本发明提供式I化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0000070030420000111
其中：
每个A独立地是-C＝O，-C＝S或CH2；
每个D独立地是O或S；
每个R1独立地是氢、C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或卤代C1-3烷基；
每个R2独立地是氢、C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或卤代C1-3烷基；
每个R3独立地是氢、C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤素或卤代C1-4烷基；并且
每个R4独立地是氢、C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或卤代C1-3烷基。
在一些实施方式中，至少一个A是-C＝O。在一些实施方式中，每个A均是-C＝O。
在一些实施方式中，至少一个D是O。在一些实施方式中，每个D均是O。
在一些实施方式中，每个R1独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R1独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R1独立地是氢、甲基或甲氧基。在一些实施方式中，至少一个R1是氢。在一些实施方式中，每个R1均是氢。
在一些实施方式中，每个R2独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R2独立地是氢、甲基、甲氧基或卤素。在一些实施方式中，至少一个R2是氢。在一些实施方式中，每个R2均是氢。
在一些实施方式中，每个R3独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R3独立地是甲基、甲氧基、卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R3独立地是卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R3独立地是卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，至少一个R3是三氟甲基。在一些实施方式中，每个R3均是三氟甲基。
在一些实施方式中，每个R4独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R4独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代C1-3烷基。在一些实施方式中，每个R4独立地是氢、甲基、甲氧基或卤素。在一些实施方式中，至少一个R4是氢。在一些实施方式中，每个R4均是氢。
在一些实施方式中，每个A独立地是-C＝O或-C＝S；每个D独立地是O或S；每个R1独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素、卤代甲基或卤代乙基；每个R2独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代甲基；每个R3独立地是C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或卤代烷基；并且每个R4独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素、卤代甲基或卤代乙基。
在一些实施方式中，每个A独立地是-C＝O或-C＝S；每个D独立地是O或S；每个R1独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代甲基；每个R2独立地是氢、卤素或卤代甲基；每个R3独立地是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素或卤代甲基或卤代乙基；并且每个R4独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素、卤代甲基或卤代乙基。
在一些实施方式中，每个A均是-C＝O；每个D均是O；每个R1独立地是氢、卤素或卤代甲基；每个R2独立地是氢或卤素；每个R3独立地是甲基、甲氧基、卤素或卤代甲基；并且每个R4独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代甲基。
在一些实施方式中，每个A均是-C＝O；每个D均是O；每个R1独立地是氢或卤素；每个R2独立地是氢或卤素；每个R3独立地是甲基、卤素或卤代甲基；并且每个R4独立地是氢、甲基、卤素或卤代甲基。
在一些实施方式中，每个A均是-C＝O；每个D均是O；每个R1独立地是氢或卤素；每个R2独立地是氢或卤素；每个R3独立地是卤素或卤代甲基；并且每个R4独立地是氢或卤素。
在一些实施方式中，每个A均是-C＝O；每个D均是O；每个R1独立地是氢或卤素；每个R2独立地是氢或卤素；每个R3独立地是甲基、卤素或卤代甲基；并且每个R4独立地是氢、甲基、卤素或卤代甲基。
在一些实施方式中，每个A均是-C＝O；每个D均是O；每个R1独立地是氢或卤素；每个R2独立地是氢或卤素；每个R3独立地是卤素或卤代甲基；并且每个R4独立地是氢、卤素或卤代甲基。
在一些实施方式中，所述化合物是化合物A：
Figure BDA0000070030420000131
或其药学上可接受的盐。
适合的盐的实例包括但不限于盐酸和三氟乙酸(的盐)。
式I化合物可包含一个或多个手性中心和/或双键，并因此以立体异构体存在，例如双键异构体(即几何异构体)、对映异构体或非对映异构体。根据本发明，本文描述的化学结构以及式I化合物因此包括所有的对应化合物的对映异构体和立体异构体，即纯的立体异构体(例如几何异构纯、对映异构纯或非对映异构纯)以及对映异构和立体异构混合物。对应异构和立体异构体混合物可通过公知的方法分离成它们组成的对映异构体或立体异构体，所述公知的方法例如手性相气体色谱法、手性相高效液相色谱法、以手性盐络合物结晶的所述化合物或在手性溶剂中结晶所述化合物。还可通过公知的非对称合成法从立体异构或对映异构纯的中间体、试剂和催化剂获得对映异构体和立体异构体。
式I的化合物进一步包括水合物和溶剂合物。
包含胺官能的化合物还可形成N-氧化物。本文提及包含胺功能的化合物还包括N-氧化物。当化合物包含若干胺官能时，一个或多于一个的氮原子可被氧化形成N-氧化物。N-氧化物的实例包括叔胺或含氮的杂环的氮原子的N-氧化物。可通过用氧化剂例如过氧化氢或过酸(例如过氧羧酸)处理对应的胺形成N-氧化物(参见，Advanced Organic Chemistry，Jerry March，第4版，Wiley Interscience)。
在一些实施方式中，所述式I化合物是分离的和/或纯化的。
本发明还提供包含一种或多种上述化合物或一种或多种其盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。
适合的组合物包括但不限于口服非吸收性的组合物。适合的组合物还包括但不限于盐水、水、环糊精溶液和pH3-9的缓冲溶液。
可将包括化合物A在内的本文所述的化合物或其药学上可接受的盐与许多赋形剂一起配制，所述赋形剂包括但不限于纯化水、丙二醇、PEG400、甘油、DMA、乙醇、苯甲醇、柠檬酸/柠檬酸钠(pH3)、柠檬酸/柠檬酸钠(pH5)、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(pH7.0)、0.9％盐水和1.2％盐水，以及它们的任意组合。在一些实施方式中，所述赋形剂选自丙二醇、纯化水和甘油。
在一些实施方式中，所述赋形剂是多组分系统，其选自盐水中20％w/v丙二醇、盐水中30％w/v丙二醇、盐水中40％w/v丙二醇、盐水中50％w/v丙二醇、纯化水中15％w/v丙二醇、纯化水中30％w/v丙二醇、纯化水中50％w/v丙二醇、纯化水中30％w/v丙二醇和5％w/v乙醇、纯化水中15％w/v甘油、纯化水中30％w/v甘油、纯化水中50％w/v甘油、纯化水中20％w/v Kleptose、纯化水中40％w/v Kleptose以及纯化水中25％w/vCaptisol。在一些实施方式中，所述赋形剂选自纯化水中50％w/v丙二醇、纯化水中15％w/v甘油、纯化水中20％w/v Kleptose、纯化水中40％w/vKleptose以及纯化水中25％w/v Captisol。在一些实施方式中，所述赋形剂选自纯化水中20％w/v Kleptose、纯化水中20％w/v丙二醇以及纯化水中15％w/v甘油。
在一些实施方式中，所述制剂包含纯化水中20％w/v Kleptose(罗盖特生产的β-环糊精)中的50mg/mL化合物A。
在一些实施方式中，可将所述制剂冻干成固体并在使用前用例如水复溶。
当向哺乳动物给药时(例如给予动物用作兽药或给予人用于临床用途)，可以分离的形式给予式I化合物。或者，可将式I化合物与其他抗生素一起给药(即以组合制剂或以分开的制剂)，所述抗生素例如：1)蛋白质合成抑制剂，包括但不限于阿米卡星、茴香霉素、安普霉素、阿奇霉素、灭瘟素S、布雷菲德菌素A、布替罗星、氯霉素、金霉素、克林霉素、克霉唑、亚胺环己酮、地美环素、地贝卡星、双氢链霉素、多西环素、耐久霉素、依米丁、红霉素、夫西地酸、G418、庆大霉素、烟曲霉酸、潮霉素B、交沙霉素、卡那霉素、黄色霉素、林可霉素、甲氯环素、美帕曲星、麦迪霉素、米诺环素、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、诺尔丝菌素、竹桃霉素、土霉素、巴龙霉素、嘌罗霉素、雷怕霉素、核糖霉素、利福平、利福霉素、罗沙米星、西索米星、大观霉素、螺旋霉素、链霉素、四环素、甲砜霉素、硫链丝菌素、妥布霉素、衣霉素、泰洛星、紫霉素和维吉霉素；2)DNA合成干扰药物，包括但不限于喜树碱、10-脱乙酰基巴卡丁III、氮胞苷、7-氨基放线菌素D、8-喹啉醇、9-二氢-13-乙酰基巴卡丁III、阿柔比星、放线菌素D、放线菌素I、放线菌素V、巴佛洛霉素A1、博来霉素、卷曲霉素、色霉素、西诺沙星、环丙沙星、顺二氯二氨基钯(II)、香豆霉素A1、L(+)-乳酸、细胞松弛素B、细胞松弛素D、达卡巴嗪、柔红霉素、偏端霉素A、多柔比星、棘霉素、恩氟沙星、依托泊苷、氟甲喹、间型霉素、烟曲霉素、更昔洛韦、胶霉毒素、洛美沙星、甲硝唑、光辉霉素A、丝裂霉素C、萘啶酸、纺锤菌素、呋喃妥因、诺拉霉素、无活菌素、新生霉素、氧氟沙星、奥索利酸、紫杉醇、奋乃静、腐草霉素、吡哌酸、蝴蝶霉素、西奈芬净、链黑菌素、链脲佐菌素、琥珀磺胺噻唑、磺胺、磺胺喹恶啉、精制磺胺胍、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺、磺胺喹噁啉、柳氮磺吡啶、磺胺噻唑、甲氧苄啶、杀结核菌素、5-氮杂胞苷、虫草素以及间型霉素A；3)细胞壁合成干扰药物，包括但不限于(+)-6-氨基青霉烷酸、7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸、阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、杆菌肽、羧苄西林、头孢克洛、头孢孟多、头孢唑林、头孢美唑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢磺啶、头孢曲松、头孢氨苄、头孢菌素C、头孢噻吩、头孢拉定、氯唑西林、D-环丝氨酸、双氯西林、D-青霉胺、益康唑、乙胺丁醇、溶葡球菌酶、头孢羟羧氧酰胺、萘夫西林、尼柯霉素Z、呋喃妥因、苯唑西林、青霉酸、青霉素G、苯氧乙基青霉素、苯氧甲基青霉素酸、磷霉素、吡哌酸、哌拉西林、瑞斯托霉素以及万古霉素；4)细胞膜渗透性干扰药物(离子载体)，包括但不限于2-巯基吡啶、4-溴卡西霉素A23187、丙甲菌素、两性霉素B、卡西霉素A23187、氯己定、克霉唑、粘菌素、益康唑、氢化可的松、菲律宾菌素、胶霉毒素、短杆菌肽A、短杆菌肽C、伊屋诺霉素、拉沙洛西A、罗奴霉素A、莫能星、N-(6-氨基己基)-5-氯-1-萘磺酰胺、甲基盐霉素、尼日利亚菌素、尼生素、无活菌素、制霉菌素、奋乃静、那他霉素、多粘菌素B、DL-青霉胺、多粘霉素B、吡喹酮、沙利霉素、表面活性素以及真菌霉素；5)酶抑制剂，包括但不限于(+)-松萝酸、(±)-咪康唑、(S)-(+)-喜树碱、1-脱氧甘露糖野尻霉素、2-庚基-4-羟基喹啉N-氧化物、虫草素、1，10-二氮菲、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、8-喹啉醇、抗霉素、抗痛素、子囊霉素、偶氮丝氨酸、巴弗洛霉素、浅蓝菌素、氯喹、西诺沙星、环丙沙星、美伐他汀、刀豆素A、刀豆素C、香豆霉素A1、L(+)-乳酸、环孢霉素A、益康唑、恩氟沙星、依托泊苷、氟甲喹、间型霉素A、呋喃唑酮、镰刀菌酸、格尔德霉素、胶霉毒素、短杆菌肽A、短杆菌肽C、除莠霉素A、吲哚美辛、氯苯酚、洛美沙星、霉酚酸、粘噻唑、N-(6-氨基己基)-5-氯-1-萘磺酰胺、萘啶酸、纺锤菌素、氯硝柳胺、尼柯霉素、N-甲基-1-脱氧野尻霉素、诺拉霉素、无活菌素、新生霉素、氧氟沙星、竹桃霉素、寡霉素、奥索利酸、杀粉蝶霉素A、吡哌酸、根赤壳菌素、雷怕霉素、蝴蝶霉素、西奈芬净、十字孢碱、stigmatellin、琥珀磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嗪、磺胺胍、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺、磺胺喹噁啉、柳氮磺吡啶、磺胺噻唑、triacsin C、甲氧苄啶以及酒色霉素A1；以及6)膜改性剂，包括但不限于paracelsin。
在一些实施方式中，术语“药学上可接受的”表示由联邦政府或州政府的管理机构批准或列于美国药典或其他被普遍认可的药典中用于动物特别是人中的。术语“载体”指与式I化合物一起给药的稀释剂、辅剂或赋形剂。此类药物载体可以是液体，例如水和油类，包括动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。所述药物载体还可以是盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、脲等。另外，可使用辅剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。当给予人时，所述式I的化合物和药学上可接受的载体可以是无菌的。当静脉内给予式I的化合物时，水是适合的载体。盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射液。适合的药学上可接受的载体还包括赋形剂例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。该组合物还可视需要可包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。
本文所述组合物可以是溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、小丸剂、胶囊剂、含液体的胶囊剂、粉末剂、缓释制剂、栓剂、气雾剂、喷雾剂或任何其他适合使用的形式。适合的药物载体的实例记载于Remington’sPharmaceutical Sciences，A.R.Gennaro(Editor)Mack Publishing Co。
在一个实施方式中，根据常规操作将式I的化合物配制成适合向人类给药的药物组合物。通常，式I化合物是无菌等渗缓冲液中的溶液。必要时，所述组合物可包含增溶剂。用于静脉内给药的组合物可任选包含局部麻醉剂例如利多卡因以减少注射部位的疼痛。一般而言，所述成分可单独包装提供或混合在一起包装于单位剂型中，例如，以冻干粉末或无水浓缩物包装于熔封容器例如标明活性物质的量的安剖或药囊中。当通过输注给予本发明化合物时，例如可用包含无菌制药级水或盐水的输液瓶配药。当通过注射给予式I的化合物时，可提供一安剖的无菌注射用水或盐水以在给药前将所述成分混合。
式I的化合物以及包含它们的组合物可以口服给药。用于口服递送的化合物和组合物可以是例如片剂、锭剂、水或油混悬剂、颗粒剂、粉末剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂或酏剂的形式。口服给药的组合物可包含一种或多种任选的物质，例如甜味剂如果糖、阿斯巴甜或糖精；芳香剂例如薄荷、东青油或樱桃味；着色剂；和防腐剂，以提供药学适口的制剂。此外，当是片剂或丸剂形式时，可将所述化合物包衣以延迟崩解和在胃肠道的吸收，由此提供在较长时间内的缓释作用。包裹渗透压活性驱动化合物的选择性渗透膜也适用于口服给予式I的化合物。口服组合物可包含标准的溶媒例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。此类溶媒应适当地为制药级。
所述药物组合物可以是单位剂型形式。在此类形式中，可以将所述组合物分成包含适量活性组分的单位剂量。所述单位剂型可以是被包装的制剂，所述包装包含不连续量的制剂，例如包装的片剂、胶囊剂和管形瓶或安剖中的粉末。所述单位剂型还可以是胶囊剂、扁囊剂或片剂本身，或者可以是适当数量的任何这些包装形式。
本发明还提供制备化合物A的方法，包括：
1a)使(R)-(-)-N-Boc-3-吡咯烷醇与强碱反应形成混合物；进一步使所述混合物与2-氯-5-(三氟甲基)-1，3-二硝基苯反应形成具有式II的化合物：
Figure BDA0000070030420000171
1b)在氢存在下，使式II的化合物与醇和过渡金属催化剂反应形成式III的化合物：
Figure BDA0000070030420000172
1c)将所述式III的化合物和嘧啶-4，6-二羧酸加入2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪和N-甲基吗啉的混合物中以形成式IV的化合物：
Figure BDA0000070030420000181
1d)使式IV的化合物和N-Boc-胍丁酸反应形成式V的化合物：
Figure BDA0000070030420000182
1e)将式V的化合物脱保护产生化合物A。
在一些实施方式中，a)中的强碱是NaH；b)中的过渡金属催化剂是Pd/C而所述醇是乙醇。具体而言，该方法详细描述于实施例1中。
本发明还提供了制备化合物A的可供选择的方法，包括：
a)将(R)-3-羟基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯脱保护，并使所得的化合物与2-氯-1，3-二硝基-5-三氟甲基苯反应形成(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；
b)在醇、过渡金属催化剂和氢存在下，还原(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯形成(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；
c)在1-[(3-(二甲基氨基)丙基)]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在下，使(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯与嘧啶-4，6-二羧酸偶联形成嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}；
d)在三氯氧磷存在下，使嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}与({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚胺基]甲基}氨基)戊酸反应形成嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚胺基]甲基}氨基)戊酰基氨基)-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}；
e)将嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚胺基]甲基}氨基)戊酰基氨基)-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}脱保护以形成粗制的嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-胍基戊酰基氨基)-2-((R)-吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}四盐酸盐；以及
f)通过反相色谱法，纯化粗制的嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-胍基戊酰基氨基)-2-((R)-吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}四盐酸盐。
在一些实施方式中，b)中的过渡金属催化剂是Pd/C并且所述醇是乙醇。具体而言，该方法详细描述于实施例2。
本发明还提供制备化合物A的第二种可选择的方法，包括：
a)将(R)-3-羟基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯脱保护，并进一步使所得的化合物与2-氯-1，3-二硝基-5-三氟甲基苯反应形成(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；
b)在醇、过渡金属催化剂和氢存在下，还原(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯形成(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；
c)在1-[(3-(二甲基氨基)-丙基)]3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在下，使(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯与嘧啶-4，6-二羧酸偶联形成嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}；
d)在亚硫酰氯存在下，使嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}与N-CbZ酸反应；
e)在醇、过渡金属催化剂和氢存在下，还原d)所得的化合物；
f)使e)所得的化合物与二-Boc吡唑反应；以及
g)将f)所得的化合物脱保护以产生化合物A。
在一些实施方式中，b)和e)中的过渡金属催化剂是Pd/C并且所述醇是乙醇。具体而言，该方法详细描述于实施例3中。
本领域技术人员能够用适合的试剂取代本文所述方法中列出的试剂以产生化合物A和另外的式I的化合物。
本发明还提供了制备化合物A的药学上可接受的盐的方法，包括：
a)使(R)-(-)-N-Boc-3-吡咯烷醇与强碱反应形成混合物；进一步使所述混合物与2-氯-5-(三氟甲基)-1，3-二硝基苯反应形成具有式II的化合物：
Figure BDA0000070030420000201
b)在氢存在下，使式II的化合物与醇和过渡金属催化剂反应形成式III的化合物：
c1)将所述式III的化合物和嘧啶-4，6-二羧酸加入2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪和N-甲基吗啉的混合物中以形成式IV的化合物：
Figure BDA0000070030420000203
c2)将所述式III的化合物和嘧啶-4，6-二羧酸加入1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCl)和无水吡啶的混合物中以形成式IV的化合物：
d)将式IV的化合物和N-Cbz酸加入含无水吡啶、二甲基氨基丙胺并包含亚硫酰氯、POCl3、(EtO)2POCl或草酰氯中任一种的溶液中以形成式Va的化合物：
Figure BDA0000070030420000212
e)水解式Va的化合物的Cbz基团以产生式VI的化合物：
f)保护式VI的化合物以产生式VII的化合物：
Figure BDA0000070030420000214
Figure BDA0000070030420000221
g)将式VII的化合物脱保护以产生化合物A的药学上可接受的盐。
式I化合物的制备可涉及各种化学基团的保护和脱保护。本领域技术人员能够容易地确定对保护和脱保护的需要，以及对适当的保护基团的选择，保护基团的化学变化可参见例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley & Sons，Inc.，NewYork(1999)，其整体内容通过引用并入本文。
本发明还提供了抑制微生物生长的方法，包括使一种或多种上述化合物或其药学上可接受的盐与微生物接触。在一些实施方式中，式I的化合物可充当用于清洁例如厨房和浴室表面的消毒剂。在这些实施方式中，可通过技术人员公知的操作配制式I的化合物用于此类用途。
本发明还提供了治疗患有微生物感染的哺乳动物的方法，包括向有此需要的哺乳动物给予抗菌有效量的一种或多种上述化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中，可在治疗前预诊断所述哺乳动物患有微生物感染。在一些实施方式中，未进行正式的诊断；在此类实施方式中，所述哺乳动物疑似患有认为需要治疗的微生物感染。
在一实施方式中，“治疗(treatment)”或“处治(treating)”指改善微生物感染或至少其一种可辨识的症状，或改善至少一种患者不一定能够辨识的可测量的生理学参数；或抑制微生物感染的发展；或延迟微生物感染的发作。
在一些实施方式中，所述微生物或微生物感染是由革兰氏阴性好氧菌、革兰氏阳性好氧菌、革兰氏阴性厌氧菌、革兰氏阳性厌氧菌或酵母引起。在一些实施方式中，所述革兰氏阴性好氧菌选自，但不限于，大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、多变柠檬酸杆菌、克氏柠檬酸杆菌；阴沟肠杆菌、粪肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、产酸克雷伯氏菌、摩氏摩根菌、斯氏普罗威登斯菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、粘质沙雷菌、溶血不动杆菌、琼氏不动杆菌、鲁菲不动杆菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌和铜绿假单胞菌。在一些实施方式中，所述革兰氏阳性好氧菌选自，但不限于，粪肠球菌、屎肠球菌、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、Staphylococcus colmii、松鼠葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌、无乳链球菌、化脓性链球菌、咽峡炎链球菌、缓症链球菌和口腔链球菌。在一些实施方式中，所述革兰氏阴性厌氧菌是脆弱拟杆菌。在一些实施方式中，所述革兰氏阳性厌氧菌是艰难梭菌或产气荚膜梭菌。在一些实施方式中，所述分枝杆菌是结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏分枝杆菌或田鼠分枝杆菌。在一些实施方式中，所述酵母选自但不限于白色念珠菌或克鲁斯念珠菌。
在一些实施方式中，所述微生物是细菌的耐抗生素菌株，例如下文实施例中引用的那些。
式I化合物或其药学上可接受的盐和包含它们的组合物可以经多种途径给药，例如通过输液或快速注射(bolus injection)，并且可与另一种生物活性药物例如另一种抗生素一起给药。给药可以是全身的或局部的。各种递送系统是已知的，例如包封于脂质体、微粒、微胶囊、胶囊等，并且可用于给予式I的化合物。给药途径包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口腔、舌下、鼻内、大脑内、阴道内、经皮、经直肠、肺、通过吸入给药，或为局部给药，特别是给药至耳、鼻、眼或皮肤。在一些实施方式中，适合的给药途径包括静脉内、局部和皮下给药。所需要的给药途径由医疗从业者决定并部分取决于微生物感染的位点和被治疗的哺乳动物或人的健康状况。在绝大多数条件下，给药引起式I化合物释放进入血液。
在一些实施方式中，可能期望向需要治疗的区域局部给予一种或多种式I化合物或其药学上可接受的盐。这可通过例如但不限于手术中局部输注、与例如手术后的创伤敷料一起局部敷用、通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物达到，其中所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜例如sialastic膜，或纤维。
在特定微生物感染的治疗中有效的式I化合物或其药学上可接受的盐的量视疾病的性质或健康状况而定并可通过标准临床技术确定。另外，可任选采用体外或体内测定法以辅助确定最佳剂量范围。组合物中使用的精确剂量还取决于给药途径以及感染的严重度，并且应根据从业者的判断和每一位患者的情况确定。然而，用于给药的适合的剂量范围一般是约0.001毫克至约200毫克每公斤体重。在一些实施方式中，所述剂量是约0.01毫克至约70毫克每公斤体重，或约0.1毫克至约50毫克每公斤体重，或约0.5毫克至约20毫克每公斤体重，或约1毫克至约10毫克每公斤体重。在一些实施方式中，所述剂量是约5毫克每公斤体重。本文所述剂量指总给药量；即如果给药多于一种的式I化合物，该剂量对应于所给药的式I化合物的总量。组合物可包含10％至95％重量的活性成分。可以从体外或动物模型检测系统获得的量效曲线推算有效剂量。此类动物模型和系统是本领域公知的。
本发明还提供了一种或多种上述化合物或其药学上可接受的盐，或包含一种或多种上述化合物的组合物，用于治疗微生物感染。
本发明还提供了一种或多种上述化合物或其药学上可接受的盐，或包含一种或多种上述化合物的组合物，用于制备治疗微生物感染的药物。
本发明还提供了一种或多种上述化合物或其药学上可接受的盐，或包含一种或多种上文所述化合物的组合物在抑制微生物生长中的用途。
本发明还提供了一种或多种上述化合物或其药学上可接受的盐，或包含一种或多种上述化合物的组合物在治疗哺乳动物微生物感染中的用途。
为了更有效地理解本文公开的发明，提供以下实施例。应理解这些实施例仅用于说明目的，不应理解为以任何形式限制本发明。除非另外指明，在所有这些实施例中，分子克隆反应和其他的标准重组DNA技术都是根据Maniatis等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor Press(1989)中描述的方法使用可商购的试剂进行。
实施例
简而言之，由下文实施例产生的结果表明化合物A对金黄色葡萄球菌属和其他的革兰氏阳性和革兰氏阴性生物具有活性。例如，用对其他抗菌药具有确定的抗菌敏感性的金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌的150个分离株进行敏感性筛选。总体上，在对150株葡萄球菌生物的筛选中获得0.5至2.0μg/ml的MIC90值，并且不受其他抗生素的敏感性表型的影响。在0.5x MIC浓度下，对金黄色葡萄球菌的甲氧西林敏感菌株(MSSAATCC29213)和其耐受菌株(MRSA ATCC 33591)进行17次连续传代未引起MIC值的任何变化。总体上，化合物A是杀菌的，杀菌时间为30分钟至6小时。
化合物A在小鼠大腿感染模型中对MSSA 29213和MRSA 33591体内有效，并且在小鼠腹膜炎/败血症模型中对MSSA27660体内有效。在MSSA27660的小鼠大腿感染模型中，与未处理的、未感染的对照小鼠相比，在重复剂量毒性试验中可良好耐受的剂量下，化合物A达到感染后24小时最多410减少。因此，在小鼠大腿感染负荷模型中观察到对MSSA和MRSA的强效功效并在大鼠大腿感染模型和小鼠腹膜炎模型中观察到对MSSA的强效功效。化合物A在血浆和从多个物种分离的肝细胞的存在下是稳定的。
当通过IV输注给药时化合物A在急性毒性试验中的耐受性更好。化合物A在小鼠中的MTD(IV推注)(30mg/kg)显著高于大腿感染模型中的静态有效剂量(2-4mg/kg)。
化合物A目前正处于I期人体临床试验用于开发IV泛-葡萄球菌药物(pan-Staphylococcal agent)。
实施例1：化合物A的合成
步骤1：
Figure BDA0000070030420000251
在室温下将氢化钠(1.12g，矿物油中60％，28mmol)分批加入(R)-(-)-N-Boc-3-吡咯烷醇(5.0g，27.6mmol)的无水DMF(24mL)溶液中。将所得混合物另搅拌15分钟。然后于0℃将该混合物逐滴加入2-氯-5-(三氟甲基)-1，3-二硝基苯(7.45g，27.6mmol)的DMF(20mL)溶液中。在室温下将所得深红色溶液搅拌4小时。用冰水终止该反应并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水和水洗涤并用Na2SO4干燥。除去溶剂后通过闪蒸塔纯化残留物(乙酸乙酯/己烷＝1/4，v/v)。产率为54％。
步骤2：
Figure BDA0000070030420000252
将(R)-3-(4-(三氟甲基)-2，6-二硝基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(4.84g，9.8mmol)、Pd/C(0.78g，碳上10％)和乙醇(140mL)置于Parr瓶中。将该混合物在氢气下闪蒸(flash)三次并在室温下于40psi氢气下搅拌过夜。用硅藻土过滤该混合物。用乙醇洗涤滤饼两次(2x20mL)。在真空下蒸发滤液。获得类白色固体并用于后续反应。产率为100％。
步骤3：
Figure BDA0000070030420000253
在无水THF(200mL)中搅拌2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪(5.97g，34mmol)。加入N-甲基吗啉(7.5ml，68mmol)。在室温下将所得混合物搅拌30分钟。然后加入(R)-3-(2，6-二氨基-4-(三氟甲基)苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(10.84g，30mmol)和嘧啶-4，6-二羧酸(2.48g，14.8mmol)。在室温下将该混合物搅拌24小时。在真空下完全蒸发溶剂。加入水(250mL)并将该混合物搅拌4小时。过滤后，用水洗涤黄色的滤饼(3x100mL)并在水(250mL)中搅拌4小时。将过滤和洗涤操作重复两次。将固体在空气中干燥并在二氯甲烷(20mL)中搅拌30分钟，然后超声处理1小时。过滤后，用冷二氯甲烷(2x10mL)快速洗涤该黄色滤饼。将所得产物(10.0g，产率：79.1％)用于后续反应。
步骤4：
Figure BDA0000070030420000261
于0℃在无水吡啶(40mL)中搅拌起始材料(6.5g，7.6mmol)、N-Boc胍丁酸(10.9g，30.4mmol)。逐滴加入吡啶(4mL)中的POCl3(2.78mL，30.4mmol)。于0℃，将所得混合物搅拌1.5小时。真空蒸发该反应混合物。向残留物中加入水(140mL)。用乙酸乙酯(260mL)萃取该混合物。将有机层用盐水(100mL)洗涤并用Na2SO4干燥。蒸发后，用柱子(洗脱液：乙酸乙酯/己烷/二氯甲烷＝1/1/1，v/v/v，然后用二氯甲烷中2％～4％甲醇)纯化残留物。该产率为29.1％。所得Rf与通过NMR表征的标准品相同。
步骤5：
Figure BDA0000070030420000262
于室温下在二噁烷(34mL)中的4N HCl内将起始材料(3.4g，2.3mmol)搅拌过夜。真空除去溶剂。向残留物中滴加醚。将该固体过滤并用C18反相C18柱纯化。获得为产物的淡黄色固体，纯度为98％(HPLC)；LC-MS(M+1)：937。产率：51％。
实施例2：化合物A的合成
Figure BDA0000070030420000271
步骤1：在四氢呋喃(THF)中用叔丁醇钾(KOtBu)将(R)-3-羟基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯去质子化。使所得阴离子与2-氯-1，3-二硝基-5-三氟甲基苯在叔丁基甲基醚(MTBE)/THF中反应。当反应结束时，用水终止该反应混合物并用更多的MTBE对其分配。将有机层用盐水和水洗涤并在旋转蒸发仪上浓缩。将固体浓缩物重新溶解于甲醇并用水再次沉淀。将所得沉淀过滤并干燥得到(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，其不需进一步纯化即可用于下一步骤中。
步骤2：将来自于步骤1的产物溶解于甲醇并在10％Pd/C存在下于100-200psi和30-50℃下氢化，直至通过HPLC判断该反应结束。用硅藻土过滤该反应混合物。将滤液浓缩并干燥得到(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)吡啶-1-羧酸叔丁酯，其无需进一步纯化可用于下一步骤中。
步骤3：于环境温度下，在惰性气氛中，在吡啶中，在1-[(3-(二甲基氨基)丙基)]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)存在下，使来自步骤2的产物与嘧啶-4，6-二羧酸偶联。当反应结束时，用水稀释该反应混合物。分离所得沉淀并重新溶解于MTBE。将该MTBE溶液用水、0.2N HCl和盐水洗涤并用无水硫酸钠干燥、分离并稀释于庚烷中。将所得沉淀过滤分离并干燥得到嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}，其无需进一步纯化可用于下一步骤中。
步骤4：在约-5至-10℃的温度下，在三氯氧磷存在下，使来自步骤3的产物与2.5-3摩尔当量的({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚胺基]甲基}氨基)戊酸在吡啶中反应。于15℃的温度下，用水终止反应。将上清从无定形沉淀中分离，将所述沉淀重新溶解于MTBE，用水和盐水洗涤，在无水硫酸钠上干燥，分离并稀释于庚烷中。将所得沉淀过滤分离并干燥得到嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚氨基]甲基}氨基)戊酰基氨基)-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}，其无需进一步纯化将可用于下一步骤中。
步骤5：在环境温度下，在甲酸中用4M HCl/1，4-二噁烷将来自步骤4的产物脱保护(除去六个叔丁氧基羰基)。用1，4-二噁烷稀释该反应混合物。过滤所得沉淀，用1，4-二噁烷洗涤并干燥得到粗嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-胍基戊酰基氨基)-2-((R)-吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}(粗制的化合物A)。通过用THF(50℃至环境温度)从甲醇中再沉淀和/或在环境温度下用THF从水/甲醇中再沉淀进一步纯化的该粗制产品。
步骤6(色谱纯化)：通过反相色谱法(RP-HPLC)完成化合物A的最终纯化，所述色谱法使用湿法填充至ProChrom动态轴向压缩色谱柱的YMCODS-AQ相，50微米，120埃。流动相是溶剂A中的溶剂B梯度，其中溶剂A是含0.05％三氟乙酸(TFA)的水而溶剂B是含0.05％TFA的乙腈。通过旋转蒸发浓缩含纯化产物的组分得到作为三氟乙酸盐的化合物A。通过将所述三氟乙酸盐的水/甲醇溶液通过Dowex 1x2-400(Cl-型)离子交换柱，收集含API的洗出液，浓缩并干燥重新生成最终的盐酸盐形式。
将化合物A原料药于2-8℃避光、隔绝空气保存于琥珀色HDPE容器中或纤维筒内的双层聚乙烯袋子中。
实施例3：化合物A的合成
Figure BDA0000070030420000301
步骤1：在四氢呋喃(THF)中，用叔丁醇钾(KOtBu)将(R)-3-羟基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯去质子化。使所得阴离子与2-氯-1，3-二硝基-5-三氟甲基苯在叔丁基甲基醚(MTBE)/THF中反应。当反应结束时，用水终止该反应混合物并用更多的MTBE对其分配。将有机层用盐水和水洗涤并在旋转蒸发器上浓缩。将固体浓缩物重新溶解在甲醇中并用水再次沉淀。将所得沉淀过滤并干燥得到(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，其无需进一步纯化可用于下一步骤中。以使用4.2Kg化合物2的量进行该反应。
步骤2：将化合物21溶于甲醇并在10％Pd/C存在下，于100-200psi和30-50℃下氢化直到通过HPLC判断该反应结束。用硅藻土过滤该反应混合物。将滤液浓缩并干燥得到HPLC纯度为92.2％的(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)吡啶-1-羧酸叔丁酯(化合物22)。将该反应进行四个批次，每批次的量为1.64kg化合物21。
Figure BDA0000070030420000312
步骤3：在环境温度下，在惰性气氛中，在吡啶中，在1-[(3-(二甲基氨基)丙基)]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)存在下，使化合物22与嘧啶-4，6-二羧酸(化合物8)偶联。当反应结束时，用水稀释该反应混合物。分离所得沉淀并重新溶解于MTBE。将该MTBE溶液用水、0.2N HCl和盐水洗涤并在无水硫酸钠上干燥、分离并稀释于庚烷中。将所得沉淀过滤分离并干燥得到嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基苯基]酰胺}(化合物23)，其无需进一步纯化可用于下一步骤中。以使用3.15kg化合物22的量进行该反应。
Figure BDA0000070030420000321
步骤4：将3.66gDMAP在60ml无水吡啶中的溶液，用冰浴冷却至0℃。缓慢加入3.60g亚硫酰氯。将所得溶液搅拌10分钟。将起始材料N-Cbz酸(7.53g，30mmol)、Cpd 23(8.54g，10mmol)分别加入该溶液中。将所得混合物于RT搅拌4小时。加入水(500mL)。将该混合物于室温下剧烈搅拌2小时后，过滤固体并用250mL水洗涤。将该固体溶于乙酸乙酯(300mL)。将有机层用10％柠檬酸溶液(100mL)和盐水(100mL)洗涤并在Na2SO4上干燥。蒸发后，将残渣溶于40mLDCM中，然后加入250mL己烷。收集沉淀并真空干燥。获得纯度为95％的13.20g产物。产率：100％。
步骤5：将化合物26(13.20g)与2当量的1N HCl一起溶于MeOH中，并加入催化剂Pd/C(10％)1.0g。将该反应混合物置于Parr氢化器中并在60psi氢下振摇2小时。LCMASS显示无任何进展，另加入1.0g催化剂。将该反应混合物置于Parr氢化器中并在60psi氢下振摇3小时。用硅藻土过滤该混合物以除去催化剂。于30℃在旋转蒸发仪上浓缩滤液至干燥。获得纯度为95％的11.50g产物。产率：100％。
Figure BDA0000070030420000323
步骤6：将化合物27(11.50g，10mmol)溶于60ml甲醇和DCM(1∶1)中。然后加入4.04g三乙胺(40mmol)。加入二-Boc吡唑9.3克(30mmol)并在室温下将所得混合物搅拌1小时。除去95％溶剂后，加入300mL水并将该混合物剧烈搅拌2小时。过滤固体并用300mL水洗涤。将该固体溶于300mL乙酸乙酯中并在Na2SO4上干燥。蒸发溶剂后，将该固体溶于40mL DCM，然后用500mL己烷沉淀出产物。收集所述固体并真空干燥。以85％产率获得13.0克产物(90％纯度)。
步骤7：在80硅胶柱上用DCM中10-88％EtOAc梯度纯化化合物28(1.5g)。收集纯度高于95％的组分，真空蒸发并干燥。回收率为50-60％。在室温(22℃)下将纯度为95％的化合物28(0.3g)溶解于乙酸乙酯(3mL)并搅拌。向该溶液鼓入HCl气体20分钟。随着鼓气的进行该溶液的颜色变成深黄色。固体在15分钟内开始破碎。在室温下将该溶液另搅拌1小时。由于乙酸乙酯的损失向该反应混合物中加入另外4mL乙酸乙酯。向该混合物中鼓入HCl气体10分钟。搅拌该混合物2.5小时。将三分之一的混合物过滤并用乙酸乙酯洗涤。在室温下将三分之二的混合物搅拌过夜。然后向该混合物中加入30mL乙酸乙酯。过滤后，用乙酸乙酯洗涤滤饼两遍(2x140mL)并干燥。将该固体浸入乙酸乙酯中并保存于冰箱中。使该反应过程进行4小时。过夜搅拌未显示明显变化。终产品的纯度是98％，主要杂质为1.2％。
实施例4：化合物A的合成
Figure BDA0000070030420000341
步骤1：向经过氮气吹扫的4-颈12L RBF中加入305.32g化合物2，边搅拌边加入700mL MTBE，并将该混合物在冰/水浴中冷却。将化合物20(212.43g)溶解于叔丁醇钾(1.31L THF中的1M溶液)中，得到略微混浊的混合物。在86分钟内边搅拌边将该混合物加入化合物21在RBF的溶液中，同时保持内部温度＜9.0℃。30分钟后将该反应混合物从冰浴移开并在环境温度下搅拌15.5小时。搅拌后，加入少量冰块使温度从21.4℃降低至18.4℃。然后加入水(1.5L)和MTBE(1.5L)并且将该混合物搅拌10分钟。使该混合物相分离并在6L的分离漏斗中进行分离。用MTBE(500mL)重新萃取水层。合并有机层并用2∶1水/饱和盐水(3x 900mL)洗涤，减压浓缩得到红色/锈色固体。将该固体溶于2.45L MeOH并将该溶液转移至4L锥形瓶中。然后边搅拌边分批加入水(1L)，得到稠浆。将该混合物覆盖并在冰箱(1-5℃)中放置16小时。过滤收集固体并真空干燥。干燥产物是浅黄色粉末。产量：395.3g，HPLC纯度94.0％。
可用例如任何醇盐、氢化钠、氢化钾或任何能够将化合物20的羟基去质子化的碱代替所述叔丁醇钾。化合物2可在2位上被任意卤化物取代。
Figure BDA0000070030420000351
步骤2：向不锈钢2加仑Parr搅拌装置中加入催化剂Pd/C(10wt％，20g)、来自步骤1的化合物21(394.37g)，然后边涡旋边小心地加入2LMeOH。向该容器内充入氢气并换两次气。然后在82psi氢气下开始搅拌该混合物；将压力降低至0psi。将该容器分别重复充气至62psi、28psi和36psi。每一次均使压力回复至0psi(在51分钟内总共吸收208psi)。内部温度起始于16℃，该混合物逐渐但是快速地放热至最高38℃。将内部温度保持在33-38℃。将该容器加压至49psi带有吸收的23psi。经过1小时将该容器加压至90psi带有吸收的12psi。经过6小时将该容器加压至120psi带有吸收的82psi。然后经过14.33小时将该容器重新加压至51psi带有吸收的37psi，(总氢气吸收为362psi)。将该反应器拆除并用经过MeOH预润湿的硅藻土545垫(11.0cm直径布氏漏斗)过滤所述混合物。用MeOH润洗所述反应器和过滤垫，并抽吸过滤垫直至出现缓慢滴落的且无色的滤液(总体积～3.0L)。用槽形滤纸盘进一步过滤所述滤液用以除去一些微细的黑色粉末。将澄清的滤液转移至5L RBF中并浓缩至橙色/棕色的粘稠的油，将其于3-4℃过夜冷冻，在此期间所述材料部分固化/结晶。将该材料加温并继续减压抽滤以形成固体锈色/棕色的胶状/蜡状硬固块。向RBF中加入庚烷(2x 700mL)和MTBE(700mL)。用顶置式机械搅拌，将该混合物搅拌3.5小时。倾倒来自固体的液体层，将块状物破碎成小片，将所述液体重新装入RBF并将所得混悬液剧烈搅拌16.75小时。然后用玻璃搅拌棒的末端将剩余的小片压碎并将该混合物剧烈搅拌70分钟。用配衡的多孔玻璃漏斗过滤所述混悬液，用滤液完成转移。将该漏斗覆盖并在低温加热下(41℃)干燥4小时，得到为淡粉色/浅褐色粉末的产物。产量270.60g，HPLC纯度98.5％。
可用例如任何适合用于硝基氢化的催化剂代替所述Pd/C催化剂。
Figure BDA0000070030420000361
步骤3(选择1)：在无水THF(60mL)中搅拌2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪(4.0g)。加入N-甲基吗啉(4.4g)。在室温下将所得混合物搅拌30分钟。然后加入化合物22(7.2g)和嘧啶-4，6-二羧酸(1.68g)。在室温下将该混合物搅拌24小时。在真空下完全蒸发溶剂。加入水(250mL)并将所得混合物搅拌4小时。过滤后，用水洗涤黄色的滤饼(3x100mL)并再次在水(250mL)中搅拌4小时。将过滤和洗涤操作重复两次。然后将固体在空气中干燥。将该固体溶于15mL DCM∶己烷∶丙酮(5∶5∶1)溶液中。将该混合物在室温下放置2天。过滤该固体并用10mL DCM∶己烷(1∶1)溶液洗涤两遍。再重复一次重结晶操作得到浅黄色固体。产率70％。HPLC纯度100％。
Figure BDA0000070030420000362
步骤3(选择2)：在无水吡啶(60mL)中搅拌EDCI(6.0g)。然后加入化合物22(7.2g)和化合物9(0.56g)。将该混合物在室温下搅拌2小时。然后加入另一份嘧啶-4，6-二羧酸(0.56g)。将该混合物在室温下继续搅拌2小时后，加入第三份嘧啶-4，6-二羧酸(0.56g)。将所得混合物在室温下搅拌24小时。然后在真空下完全蒸发溶剂。加入水(250mL)并将该混合物搅拌4小时。过滤后，用水洗涤黄色滤饼(3x100mL)并再次在水中(250mL)搅拌4小时。将过滤和洗涤操作重复两次。然后将固体在空气中干燥。将该固体溶于15mL DCM∶己烷∶丙酮(5∶5∶1)溶液中。将该混合物在室温下放置2天。过滤该固体并用10mL DCM∶己烷(1∶1)溶液洗涤两遍。再重复一次重结晶操作得到浅黄色固体。产率70％，HPLC纯度100％。
可用例如生成酸酐或活化酯的任何酰胺偶联剂例如CDI、DCC、HOBt、HOAt、POCl3代替EDCI。
Figure BDA0000070030420000371
步骤4：将DMAP(3.66g)在60ml无水吡啶中的溶液用冰浴冷却至0℃。缓慢加入亚硫酰氯(3.60g)。将所得溶液搅拌10分钟。将起始材料N-Cbz酸(7.53g，30mmol)、Cpd 23(8.54g，10mmol)分别加入该溶液中。将所得混合物在室温下搅拌4小时。然后加入水(500mL)。将该混合物于室温下剧烈搅拌2小时后，过滤固体并用250ml水洗涤。将该固体溶于乙酸乙酯(300mL)。将有机层用10％柠檬酸溶液(100mL)和盐水(100mL)洗涤并在Na2SO4上干燥。蒸发后，将残渣溶于40mLDCM中，然后加入250mL己烷。收集沉淀并真空干燥。获得13.20g产物，纯度为95％。产率：100％。
可用例如POCl3、(EtO)2POCl或草酰氯代替亚硫酰氯。
Figure BDA0000070030420000372
步骤5：将化合物26(13.20g)与2当量的1NCl一起溶于MeOH中，并加入催化剂Pd/C(10％)1.0g。将该反应混合物置于Parr氢化器中并在60psi氢气下摇动2小时。LCMASS显示无任何进展，另加入1.0g催化剂。将该反应混合物置于Parr氢化器并在60psi氢气下摇动3小时。用硅藻土过滤该混合物以除去催化剂。于旋转蒸发器中于30℃浓缩滤液至干燥。获得11.50g产物，纯度为95％。产率：100％。
可用例如适合用于CBZ基团氢解的任何催化剂代替Pd/C催化剂。
Figure BDA0000070030420000381
步骤6：将化合物27(11.50g，10mmol)溶于60ml甲醇和DCM(1∶1)中。然后加入4.04g三乙胺(40mmol)。加入二-Boc吡唑9.3g(30mmol)并在室温下将所得混合物搅拌1小时。除去95％溶剂后，加入300mL水并将该混合物剧烈搅拌2小时。过滤固体并用300mL水洗涤。将该固体溶于300mL乙酸乙酯中并用Na2SO4干燥。蒸发溶剂后，将该固体溶于40mL DCM，然后用500mL己烷沉淀出产物。收集固体并真空干燥。以85％产率获得13.0g产物(95％纯度)。
可用例如异脲或二-Boc异脲代替二-Boc吡唑。
Figure BDA0000070030420000382
步骤7：将化合物28(1.17kg，0.76mol)溶于24L EtOAc中，然后加入281mL水。将HCl气体加入该溶液中，同时通过调节加入速度将反应温度控制低于45℃。总反应时间为5小时，其中1.5小时是HCl加入时间。HPLC表明起始材料少于1％并通过在氮气下过滤收集沉淀的产物。将该固体用EtOAc润洗，用MeOH/THF(1∶1)研磨并真空干燥。产率为84％。
可用例如HCl/二噁烷代替HCl/EtoAC。
实施例5：对革兰氏阳性临床分离物(表1A)和革兰氏阴性临床分离物(表1B)的抗菌活性
根据针对本试验中检测的生物体(好氧、厌氧或酵母)的确定的CLSI文献体外评价化合物A。将氨苄西林、头孢他啶、头孢呋辛、环丙沙星、利奈唑胺和万古霉素作为用于好氧细菌的活性对照药物一起检测；将克林霉素和甲硝唑作为用于厌氧菌的活性对照药物检测；将氟康唑作为用于酵母分离物的活性对照药物检测。在二甲基亚砜(DMSO)中制备化合物A的储备液。根据各自的生产商指南制备氨苄西林、头孢他啶、头孢呋辛、环丙沙星、利奈唑胺、万古霉素、甲硝唑、克林霉素和氟康唑。
微生物(M7-A7)1
根据CLSI指导原则M7-A7通过培养基微稀释法测定表示为μg/ml的最低抑菌浓度。除了用添加了2-5％裂解马血经阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤检测葡萄球菌属外使用Mueller-Hinton肉汤培养基检测所有好氧菌。结果显示于表1A和表1B中。
表1A
Figure BDA0000070030420000391
*根据标准CLSI指南进行肉汤微稀释测定。
表1B
Figure BDA0000070030420000392
Figure BDA0000070030420000401
*根据标准CLSI指南进行肉汤微稀释测定。
化合物A显示出对革兰氏阳性病原体的宽覆盖性，其中金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌属显示出最低的MIC。化合物A对革兰氏阴性病原体具有活性，但是整体覆盖性低于革兰氏阳性生物。
实施例6：具有确定的耐药性表型的葡萄球菌属的MIC
根据CLSI文献M7-A7使用Mueller-Hinton肉汤培养基通过肉汤微稀释法体外进行化合物A对所选分离物的敏感谱的评价。根据CLSI文献M100-S17的指导，在适用时应用CLSI解释折点(breakpoint)。结果显示于表2。
表2
Figure BDA0000070030420000402
*根据标准CLSI指南进行肉汤微稀释测定。
OXA-R：苯唑西林耐药；VRSA：万古霉素耐药金黄色葡萄球菌；VISA：万古霉素介导金黄色葡萄球菌(vancomycin intermediate S.aureus)；LZD-NS：利奈唑胺不敏感；DAP-NS：达托霉素不敏感。
化合物A对所有的金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌的分离物具有体外活性，包括对达托霉素、利奈唑胺和万古霉素(治疗耐药性金黄色葡萄球菌例如MRSA的最后一线药物)具有已确定的耐药性的金黄色葡萄球菌的分离物。对于金黄色葡萄球菌分离物，与敏感分离物相比，对耐药性分离物的活性无变化。对凝固酶阴性葡萄球菌，活性未受到对甲氧西林的耐药性的影响。
实施例7：细胞毒性和选择性
用转化的人肝细胞系(HepG2，HB-8065)和小鼠胚胎细胞系(NIH/3T3细胞，CRL-1658)在比色测定中，评价化合物A的细胞毒性。该测定法测量活细胞作用下新的四唑盐化合物至可溶性甲产物的生物还原。使用前24小时以2x104细胞/孔，将HepG2细胞接种至96孔板中含10％胎牛血清(FBS)的MEM培养基中。使用前24小时以2x 104细胞/孔将NIH/3T3细胞接种至96孔板中含10％小牛血清(BCS)的DMEM培养基中。在无血清培养基中洗涤细胞单层并在无血清培养基中与化合物A孵育一小时。温育后，用添加血清的培养基替换该培养基并使用Cell Titer 96AqueousNon-Proliferation试剂盒(Promega，Madison，WI)测定活细胞。用四参数逻辑斯谛方程：Y＝最小值+(最大值-最小值)/(1+10^((LogEC50-X)*斜坡斜率))计算EC50值。
还使用人血红细胞在溶血测定中评价化合物A的细胞毒性。将合并的人全血离心以分离血红细胞(RBC)。在经Tris缓冲的盐水(TBS缓冲液，pH7.4)中将分离的RBCs润洗并稀释以获得0.22％RBC储备悬液。将5μL化合物A储备液加入45μL RBC悬液并于37℃振摇温育1小时。温育时间结束时，将样品离心并将30μL上清加入100μL水中。读取OD414测量值用于计算血红蛋白浓度。将蜂毒肽蜂毒素用作阳性对照。如上所述测定EC50值。结果显示于表3。
表3
Figure BDA0000070030420000412
化合物A显示出强大的整体选择性。
实施例8：对金黄色葡萄球菌(ATCC 27660)的时间-杀菌关系
通过测量将起始接种物减少3log单位所需的时间，在标准方案中测定化合物A对大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌(实验室菌株)D31和金黄色葡萄球菌ATCC27660的时间-杀菌试验。将20μL冷冻的细菌原种接种到3ml经阳离子调节的Mueller-Hinton培养基并在摇床上(250rpm)于37℃培养过夜。将该悬液稀释至约5x105cfu/mL，并用2x、5x、10x和20xMIC(MIC＝1μg/mL)处理。在DMSO中以10mg/mL制备化合物A储备液。于各时间点采集并在18小时培养后在MH琼脂板上计数活细菌。以2x MIC浓度检测化合物A对金黄色葡萄球菌ATCC 27660的时间-杀菌动力学的试验，显示在5小时内出现起始接种物减少31og10单位。1x MIC浓度下经过72小时，未观察到培养物的再生长。参见图1A和图1B。
实施例9：MSSA(ATCC 29213)和MRSA(ATCC 33591)的连续传代耐药性
将金黄色葡萄球菌ATCC29213或甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA ATCC 33591)的冰冻的细菌原种(20μL)接种至3ml经阳离子调节的Mueller-Hinton培养基并在摇床上(250rpm)于37℃培养过夜。将该悬液稀释至约5x105cfu/mL并接种至聚丙烯(Costar)96-孔圆底板(90μL体积)。在DMSO中，制备化合物A和诺氟沙星(Sigma Aldrich，St.Louis，MO；Catalogue#N9890)的化合物储备液并且以10μL/孔直接在聚丙烯板孔中在0.01％乙酸、0.2％胎牛血清中进行化合物的系列二倍稀释。化合物A的终浓度为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.19、0.098、0.049和0.024μg/mL。诺氟沙星的终浓度范围为100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.19、0.098和0.049μg/mL。本测定中DMSO浓度未超过1％。所有样品均一式三份进行。于37℃温育24小时后，通过观察由CLSI定义为≥2mm菌蕾或明显浑浊的“可接受生长”的存在评价细胞生长。MIC孔被定义为未观察到可接受生长的最低浓度。对于系列传代，从3个0.5x MIC的复制孔中的两个取50μL并与900μL新鲜的经阳离子调节的Mueller-Hinton培养基混合。测定OD600并以约5x105cfu/mL将细胞悬液接种至聚丙烯96孔圆底板中(90μL体积)。之前向孔中加入10uL化合物储备液以达到上文所述的各化合物的浓度范围。所有样品均一式三份进行。将板子于37℃温育24小时。将该过程总共重复共17代并记录每一代的MIC值。
具有诺氟沙星的金黄色葡萄球菌的传代在第3代时(四次倍比稀释(4doubling dilutions))MIC值显著升高，第15次传代时，MSSA和MRSA分别达到128倍和64倍增加。相反，在整个17次传代中，化合物A对MSSAATCC 29213或MRSAATCC 33591的MIC无变化。参见图2。
实施例10：化合物A的体外代谢稳定性-血浆
于37℃将化合物A(5μM)与来自于人(混合性别)、大鼠(混合品系和性别)以及犬(混合品系和性别)的合并血浆样品温育0和60分钟(一式两份样品)。通过加入冰冷的沉淀溶剂(乙腈∶冰醋酸，9∶1v/v)终止温育。用等体积的0.1％甲酸稀释上清并通过HPLC-MS/MS进行分析。将血浆稳定性报告为相对于0分钟时母体化合物的量的60分钟时母体化合物的％。结果显示于表4。
表4
Figure BDA0000070030420000431
37℃温育1小时后，人、大鼠和犬血清中仅有很少的或无化合物A损失，表明高血浆稳定性。在人、短尾猴和兔子中也仅有很少的或无化合物A损失(数据未显示)。
实施例11：小鼠大腿感染模型中化合物A的功效
在用金黄色葡萄球菌(ATCC 13709)肌肉内接种前4天和1天用环磷酰胺(150mg/kg，i.p.)使雌性6-7周龄CD-1小鼠的中性白细胞减少。通过将菌落从18-20小时的胰酶大豆琼脂(TSA)培养基转移至无菌PBS制备金黄色葡萄球菌接种物。在分光光度计的辅助下将密度调节至约106cfu/mL并通过稀释平板计数法测定接种物浓度。通过向每一后大腿注射0.1mL接种物接种小鼠。如表5所示在接种后1和5、1和9、或1和13小时通过1或2mg/kg/剂量的静脉内推注剂量将化合物A给予不同组的小鼠(4只雌性/组)。由4只小鼠组成的单独对照组接受未经抗生素处理的接种物。将化合物A溶解于50％/50％v/v无菌USP纯化水/PBS中。接种后25小时取大腿。将大腿肌肉和骨组织匀浆，将系列稀释的等分试样铺板至TSA并于37℃温育20小时，获得菌落计数以计算cfu/大腿。参数显示于表5。
表5
在接种后1和5或1和9小时后，当以2mg/kg/剂量给药时，化合物A在减少接种大腿的菌群方面是最有效的。这两个组中的细菌减少分别比接种的对照组低3.96log和3.93log。参见表3。
实施例12：在大鼠大腿感染模型中与万古霉素相比的功效
对于每一项试验，在用金黄色葡萄球菌(ATCC 13507)肌肉内接种前4天和1天用环磷酰胺(150mg/kg，i.p.)，使雌性8-9周龄股静脉插管的Crl:CD(SD)小鼠的中性白细胞减少。从过夜培养获得的菌落制备金黄色葡萄球菌悬液，置于PBS中并在分光光度计的辅助下调节至107cfu/mL。将0.2mL的接种物注射入每一只大鼠的右后腿的大腿肌肉。接种后25小时，取大腿并进行处理以测定cfu/大腿。在接种后不同时间，通过静脉推注至尾静脉或经股静脉导管通过1-小时静脉输液或4-小时静脉输液给予化合物A。每一项试验中包括单独的接种对照组，在第一个和第二项试验中包括作为活性对照药物的万古霉素组。每一组由4只大鼠组成，包括对照药物和参比药物组。
与接种对照相比，化合物A静脉推注(10mg/kg/剂量，20mg/kg总剂量)和1小时静脉输液(10mg/kg/剂量，20mg/kg总剂量)分别将细菌负荷减少3.2log和3.0log。与感染后1小时的接种物水平相比，分别减少约2.2log至2.0log。功效与万古霉素是相当的。参见，图4。
实施例13：小鼠败血病模型(金黄色葡萄球菌感染)中化合物A的功效
腹膜内注射金黄色葡萄球菌(ATCC 13709，5％粘蛋白中5x107cfu/mL，0.5mL/小鼠)后1和7小时将无菌盐水、万古霉素或化合物A给予不同组的8周龄雌性CD-1小鼠(8只小鼠/组)。将化合物A溶于50％/50％v/v无菌USP纯化水/TBS中。用从TSA板转移至无菌PBS中的菌落制备金黄色葡萄球菌悬液。将一份储备悬液加入5％粘蛋白至终浓度约5x 107cfu/mL。试验设计和剂量显示于表6。在接种后6天，观察小鼠的死亡。
表6
观察到化合物A的剂量依赖性功效并与万古霉素治疗组相当。所有未治疗的小鼠在治疗第一天内死亡。在2x 5和2x 10mg/kg剂量的化合物A时，用化合物A达到完全保护。参见图5。
实施例14：急性毒性试验-最大耐受剂量
在小鼠和大鼠的递增/递减剂量试验中，确定最大耐受剂量(MTD)。通过在小鼠和大鼠的尾静脉内静脉内推注或经大鼠股静脉的导管通过静脉内输液给予化合物A。每一个剂量下，将化合物给药至两只至三只动物并在4-7天的时间内记录临床体征。试验结束时进行肉眼尸检。结果显示于表7。
表7
Figure BDA0000070030420000452
当通过静脉输液1小时给药时，大鼠中化合物A的MTD＞24mg/kg。
实施例15：大鼠中化合物A的药物代谢动力学
以指定剂量通过静脉推注向Crl:CD(SD)大鼠给药化合物A。从28小时内的9个时间点(n＝3)采集的血样制备血浆。通过HPLC-MS/MS测定化合物水平。给所有动物装两个颈静脉插管(JVC)，分别用于剂量给药和血液采集。每一种给药途径以N＝3进行给药。动物可自由获取商购的啮齿动物食物和水。每一只大鼠从给药日的零时开始，经适合的给药途径接受推注剂量。采血时间显示于表8。
经JVC采集每一血样并置于包含EDTA作为抗凝剂的冰冷的聚丙烯管中。于4℃室温和13,000rpm的速度下，将样品离心5分钟。整个处理过程中保持样品冰冷。然后将各血浆样品转移至标记的聚丙烯管中，置于干冰上并保存于设定为保持-60℃至-80℃的冰箱中。
用之前研究的方法萃取血浆试验样品并分析。用含0.1％甲酸的DMSO萃取单一标准曲线样品和三个浓度的质量控制样品的六个重复。将血浆样品(50μL)加入150μL溶剂中并离心。用Perkin Elmer系列200微泵和PE Sciex API4000电喷雾质谱仪通过LC/MSMS分析上清。在浓度10000、5000、1000、500、250、100、50和25ng/mL制备标准曲线。在浓度5000、500和50ng/mL制备质量控制样品。从单独制备的储备液制备标准曲线样品和质量控制样品。至少5/8的标准品的精确度应在±15％内，除了在LLOQ处，±20％是可接受的。三分之二的批次QC必须具有额定量±15％内的精确度，每一水平必须至少有一个QC超出以使该轮是可接受的。
用药物代谢动力学程序WinNonlin v4.1对化合物A的单个血浆浓度对时间的数据进行非隔室模型分析。将低于定量限(25ng/ml)的血浆浓度设定为数值零用以进行药物代谢动力学分析。在所有计算中使用额定剂量浓度。
表8
结果显示于下表9
表9
Figure BDA0000070030420000462
大鼠血浆中化合物A的血浆半衰期显著较长并且消除数值低。
实施例16：制剂
于25℃研究化合物A在各种赋形剂中的饱和溶解度并将结果报告于表10(为游离碱的化合物A的饱和溶解度)
表10
Figure BDA0000070030420000471
N/A：由于制剂形成粘稠的黄色凝胶而无法获得。
前期研究表明苯甲醇、乙醇和DMA是化合物A的较差的溶媒，饱和溶解度分别是1.83、1.13和0.60mg/mL。另一方面，在丙二醇、纯化水和甘油中达到了良好的饱和溶解度90mg/mL、65mg/mL和53mg/mL。在pH 3和7.4获得了良好的溶解度数值，分别为65.5和61.4mg/ml。然而该溶解度显示出在pH5时降低了12.1mg/mL的值。由于制剂形成粘稠的黄色凝胶，所以未能检测化合物A在0.9％和1.2％氯化钠溶液中的饱和溶解度。
于25℃在各种多组分系统中研究化合物A的饱和溶解度并将结果报告于表11(作为游离碱的化合物A的饱和溶解度)。
表11
Figure BDA0000070030420000472
Figure BDA0000070030420000481
N/A：由于制剂形成粘稠的黄色凝胶而无法获得。
*：制剂在离心过程中凝胶化，但是放置后又液化。
显示出合适结果的制剂包括纯化水中50％w/v丙二醇和15％w/v甘油，25℃的饱和溶解度分别是74.7mg/mL和63.5mg/mL。用各种络合剂也达到了良好的饱和溶解度，20％w/v Kleptose、40％w/v Kleptose和25％w/v Captisol的数值分别是79.7、102.0和64.3mg/mL。结果还表明将化合物A加入盐水中20-50％w/v丙二醇引起粘稠的黄色凝胶的形成并因此不能通过UV分析。然而，胶凝现象是浓度依赖的并且在制剂中的化合物A浓度接近该药物的饱和溶解度的制剂中可观察到的。另外，可通过加入小体积的赋形剂制剂或数滴乙醇容易地将胶凝过程逆转。向制剂中加入5％w/v乙醇并不能抑制胶凝现象，但是它仍然是容易逆转的并可通过UV分光光度法分析。评价了前期的赋形剂筛选数据后，选择三种适合的制剂用于进一步开发。这些制剂是20％w/v Kleptose溶液、纯化水中20％w/v丙二醇和纯化水中15％w/v甘油。选择20％w/v Kleptose中50mg/mL化合物A的制剂用于I期临床试验。另外，可将化合物A在水、Kleptose和甘露醇中的溶液分装并冻干成固体。可在使用前用水将该固体复溶。
除了本文所述的那些变化，本领域技术人员从之前的说明书可显而易见本发明的各种变化。这些修改也欲落在所附权利要求的范围。本申请要求于2008年10月27日提交的序列号为61/108,595的美国临时专利申请的优先权.，其整体通过引用结合于此。本发明得到美国政府的资助(NIHGrant Nos.AI74866和1R43AI058407)，因此美国政府对本发明享有一定的权利。

Claims (51)

1.式I的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0000070030410000011
其中：
每个A独立地是-C＝O、-C＝S或-CH2；
每个D独立地是O或S；
每个R1独立地是氢、C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或卤代C1-3烷基；
每个R2独立地是氢、C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或卤代C1-3烷基；
每个R3独立地是氢、C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤素或卤代C1-4烷基；并且
每个R4独立地是氢、C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或卤代C1-3烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物或盐，其中每个A均是-C＝O。
3.根据权利要求1或2所述的化合物或盐，其中每个D均是O。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物或盐，其中每个R1独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素或卤代C1-3烷基。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物或盐，其中每个R1独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代C1-3烷基。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物或盐，其中每个R1独立地是氢、甲基或甲氧基。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物或盐，其中每个R1均是氢。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的化合物或盐，其中每个R2独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素或卤代C1-3烷基。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的化合物或盐，其中每个R2独立地是氢、甲基、甲氧基或卤素。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的化合物或盐，其中每个R2均是氢。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的化合物或盐，其中每个R3独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素或卤代C1-3烷基。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的化合物或盐，其中每个R3独立地是甲基、甲氧基、卤素或卤代C1-3烷基。
13.根据权利要求1-10中任一项所述的化合物或盐，其中每个R3各自独立地是卤素或卤代C1-3烷基。
14.根据权利要求1-10中任一项所述的化合物或盐，其中每个R3各自独立地是卤代C1-3烷基。
15.根据权利要求1-10中任一项所述的化合物或盐，其中每个R3均是三氟甲基。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的化合物或盐，其中每个R4独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或卤代C1-3烷基。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的化合物或盐，其中每个R4独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代C1-3烷基。
18.根据权利要求1-15中任一项所述的化合物或盐，其中每个R4独立地是氢、甲基、甲氧基或卤素。
19.根据权利要求1-15中任一项所述的化合物或盐，其中每个R4均是氢。
20.根据权利要求1所述的化合物或盐，其中：
每个A独立地是-C＝O或-C＝S；
每个D独立地是O或S；
每个R1独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素、卤代甲基或卤代乙基；
每个R2独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代甲基；
每个R3独立地是C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或卤代烷基；且
每个R4独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素、卤代甲基或卤代乙基。
21.根据权利要求1所述的化合物或盐，其中：
每个A独立地是-C＝O或-C＝S；
每个D独立地是O或S；
每个R1独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代甲基；
每个R2独立地是氢、卤素或卤代甲基；
每个R3独立地是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素、卤代甲基或卤代乙基；并且
每个R4独立地是氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤素、卤代甲基或卤代乙基。
22.根据权利要求1所述的化合物或盐，其中：
每个A均是-C＝O；
每个D均是O；
每个R1独立地是氢、卤素或卤代甲基；
每个R2独立地是氢或卤素；
每个R3独立地是甲基、甲氧基、卤素或卤代甲基；并且
每个R4独立地是氢、甲基、甲氧基、卤素或卤代甲基。
23.根据权利要求1所述的化合物或盐，其中：
每个A均是-C＝O；
每个D均是O；
每个R1独立地是氢或卤素；
每个R2独立地是氢或卤素；
每个R3独立地是甲基、卤素或卤代甲基；并且
每个R4独立地是氢、甲基、卤素或卤代甲基。
24.根据权利要求1所述的化合物或盐，其中：
每个A均是-C＝O；
每个D均是O；
每个R1独立地是氢或卤素；
每个R2独立地是氢或卤素；
每个R3独立地是卤素或卤代甲基；并且
每个R4独立地是氢或卤素。
25.根据权利要求1所述的化合物或盐，其中：
每个A均是-C＝O；
每个D均是O；
每个R1独立地是氢或卤素；
每个R2独立地是氢或卤素；
每个R3独立地是甲基、卤素或卤代甲基；并且
每个R4独立地是氢、甲基、卤素或卤代甲基。
26.化合物
Figure FDA0000070030410000051
或其药学上可接受的盐。
27.一种药物组合物，包含根据权利要求1-26中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
28.一种包含根据权利要求1-26中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的制剂，其中所述制剂包含选自以下的赋形剂：纯化水、丙二醇、PEG400、甘油、DMA、乙醇、苯甲醇、柠檬酸/柠檬酸钠(pH3)、柠檬酸/柠檬酸钠(pH5)、三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐(pH7.0)、0.9％盐水以及1.2％盐水或它们的任意组合。
29.一种包含根据权利要求1-26中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的制剂，其中所述制剂包含选自丙二醇、纯化水和甘油的赋形剂。
30.一种包含根据权利要求1-26中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的制剂，其中所述制剂包含选自以下的赋形剂：盐水中20％w/v丙二醇、盐水中30％w/v丙二醇、盐水中40％w/v丙二醇、盐水中50％w/v丙二醇、纯化水中15％w/v丙二醇、纯化水中30％w/v丙二醇、纯化水中50％w/v丙二醇、纯化水中30％w/v丙二醇和5w/v乙醇、纯化水中15％w/v甘油、纯化水中30％w/v甘油、纯化水中50％w/v甘油、纯化水中20％w/v Kleptose、纯化水中40％w/vKleptose以及纯化水中25％w/v Captisol。
31.一种包含根据权利要求1-26中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的制剂，其中所述制剂包含选自以下的赋形剂：纯化水中50％w/v丙二醇、纯化水中15％w/v甘油、纯化水中20％w/vKleptose、纯化水中40％w/v Kleptose以及纯化水中25％w/vCaptisol。
32.一种包含根据权利要求1-26中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的制剂，其中所述制剂包含选自纯化水中20％w/vKleptose、纯化水中20％w/v丙二醇以及纯化水中15％w/v甘油的赋形剂。
33.一种在纯化水中20％w/v Kleptose中包含
Figure FDA0000070030410000061
或其药学上可接受的盐的制剂。
34.根据权利要求33所述的制剂，其中所述化合物以50mg/mL存在。
35.一种制备根据权利要求26所述的化合物的方法，包括：
a)使(R)-(-)-N-Boc-3-吡咯烷醇与强碱反应形成混合物；进一步使所述混合物与2-氯-5-(三氟甲基)-1，3-二硝基苯反应形成具有式II的化合物
Figure FDA0000070030410000071
b)在氢存在下，使式II的化合物与醇和过渡金属催化剂反应形成式III的化合物
Figure FDA0000070030410000072
c)将所述式III的化合物和嘧啶-4，6-二羧酸加入2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪和N-甲基吗啉的混合物中以形成式IV的化合物
IV；
d)使式IV的化合物与N-Boc-胍丁酸反应形成式V的化合物
Figure FDA0000070030410000081
e)将式V的化合物脱保护以产生权利要求26的所述化合物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中：
步骤a)中的强碱是NaH；并且
步骤b)中的过渡金属催化剂是Pd/C而所述醇是乙醇。
37.一种制备根据权利要求26所述的化合物的方法，包括：
a)将(R)-3-羟基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯脱保护，并使所得化合物与2-氯-1，3-二硝基-5-三氟甲基苯反应形成(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；
b)在醇、过渡金属催化剂和氢存在下，还原(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯形成(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；
c)在1-[(3-(二甲基氨基)-丙基)]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在下，使(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯与嘧啶-4，6-二羧酸偶联形成嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]酰胺}；
d)在三氯氧磷存在下，使嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]酰胺}与({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚胺基]甲基}氨基)戊酸反应形成嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚胺基]甲基}氨基)-戊酰基氨基)-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)-吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-酰胺}；
e)将嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚胺基]甲基}氨基)-戊酰基氨基)-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)-吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-酰胺}脱保护形成粗制的嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-胍基-戊酰基氨基)-2-((R)-吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-酰胺}四盐酸盐；以及
f)通过反相色谱法纯化粗制的嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-(5-胍基戊酰基氨基)-2-((R)-吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-酰胺}四盐酸盐。
38.一种制备根据权利要求26所述的化合物的方法，包括：
a)将(R)-3-羟基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯脱保护并进一步使所得化合物与2-氯-1，3-二硝基-5-三氟甲基苯反应形成(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；
b)在醇、过渡金属催化剂和氢存在下，还原(R)-3-(2，6-二硝基-4-三氟甲基苯氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯形成(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；
c)在1-[(3-(二甲基氨基)-丙基)]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在下，使(R)-3-(2，6-二氨基-4-三氟甲基苯氧基)-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯与嘧啶-4，6-二羧酸偶联形成嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]酰胺}；
d)在亚硫酰氯存在下，使嘧啶-4，6-二羧酸双-{[3-氨基-2-((R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]酰胺}与N-Cbz酸反应；
e)在醇、过渡金属催化剂和氢存在下，还原d)所得的化合物；
f)使e)所得的化合物与二-Boc吡唑反应；
g)将f)所得的化合物脱保护以产生权利要求26的化合物。
39.一种制备根据权利要求26所述的化合物的药学上可接受的盐的方法，包括：
a)使(R)-(-)-N-Boc-3-吡咯烷醇与强碱反应形成混合物；进一步使所述混合物与2-氯-5-(三氟甲基)-1，3-二硝基苯反应形成具有式II的化合物：
b)在氢存在下，使式II的化合物与醇和过渡金属催化剂反应形成式III的化合物：
Figure FDA0000070030410000102
c1)将所述式III的化合物和嘧啶-4，6-二羧酸加入2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪和N-甲基吗啉的混合物中以形成式IV的化合物：
Figure FDA0000070030410000111
c2)将所述式III的化合物和嘧啶-4，6-二羧酸加入1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]-碳二亚胺盐酸盐(EDCl)和无水吡啶的混合物中以形成式IV的化合物：
Figure FDA0000070030410000112
d)将式IV的化合物和N-Cbz酸加入包含无水吡啶、二甲基氨基丙胺并包含亚硫酰氯、POCl3、(EtO)2POCl或草酰氯中任一种的溶液中以形成式Va的化合物：
Figure FDA0000070030410000113
e)水解式Va的化合物的Cbz基团以产生式VI的化合物：
Figure FDA0000070030410000121
f)保护式VI的化合物以产生式VII的化合物：
Figure FDA0000070030410000122
g)将式VII的化合物脱保护以产生根据权利要求26所述的化合物的药学上可接受的盐。
40.一种抑制微生物生长的方法，包括使所述微生物与根据权利要求1-26中任一项所述的化合物接触。
41.一种治疗患有微生物感染的哺乳动物的方法，包括给予对此有需要的哺乳动物抗菌有效量的根据权利要求1-26中任一项所述的化合物。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述微生物或微生物感染是革兰氏阴性好氧菌、革兰氏阳性好氧菌、革兰氏阴性厌氧菌、革兰氏阳性厌氧菌或酵母。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述革兰氏阴性好氧菌是大肠杆菌(Escherichia coli)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、多变柠檬酸杆菌(Citrobacter diverus)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、粪肠杆菌(Enterobacterfaecalis)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumonia)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)、溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)、琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)、鲁菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)或铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述革兰氏阳性好氧菌是粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faeciun)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎葡萄球菌(Staphylococcuspneumoniae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生性葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、Staphylococcus colmii、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus Sciuri)、瓦氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)或口腔链球菌(Streptococcusoralis)。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述革兰氏阴性厌氧菌是脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述革兰氏阳性厌氧菌是艰难梭菌(Clostridium difficile)或产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。
47.根据权利要求42所述的方法，其中所述酵母是白色念珠菌(Candidaalbicans)或克鲁斯念珠菌(Candida krusei)。
48.根据权利要求1-26中任一项所述的化合物，用于治疗微生物感染。
49.根据权利要求1-26中任一项所述的化合物在用于制备治疗微生物感染的药物中的应用。
50.根据权利要求1-26中任一项所述的化合物在抑制微生物生长中的应用。
51.根据权利要求1-26中任一项所述的化合物在治疗哺乳动物微生物感染中的应用。
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